Регламент Ради (ЄС) N 440/2008 "Що встановлює методи тестування відповідно до Регламенту Європейського Парламенту та Ради (ЄС) N 1907/2006 про реєстрацію, оцінку, авторизацію і обмеження хімічних речовин та препаратів (REACH)"

Регламент

Номер: 440/2008
Прийняття: 30.05.2008
Видавники: Європейське співтовариство

Регламент Ради (ЄС) N 440/2008 "Що встановлює методи тестування відповідно до Регламенту Європейського Парламенту та Ради (ЄС) N 1907/2006 про реєстрацію, оцінку, авторизацію і обмеження хімічних речовин та препаратів (REACH)" від 30 травня 2008 року

(Текст має значення для ЄЕП)

КОМІСІЯ ЄВРОПЕЙСЬКИХ СПІВТОВАРИСТВ,

Беручи до уваги Договір про заснування Європейського Співтовариства ( 994_017 ),

Беручи до уваги Регламент Європейського Парламенту та Ради (ЄС) N 1907/2006 від 18 грудня 2006 року про реєстрацію, оцінку, авторизацію і обмеження хімічних речовин та препаратів (REACH), яким засновується Європейське Агентство хімічних речовин і препаратів, вносяться зміни до Директиви 1999/45/ЄС і скасовуються Регламент Ради (ЄЕС) N 793/93 і Регламент Комісії (ЄС) N 1488/94, а також Директива Ради 76/769/ЄЕС і Директиви Комісії 91/155/ЄЕС, 93/67/ЄЕС, 93/105/ЄС і 2000/21/ЄС(1), та зокрема, частину 3 його статті 13,

----------------

(1) OB L 396, 30.12.2006, C. 1, з виправленнями, внесеними OB L 136, 29.5.2007, C. 3.

Оскільки:

(1) Відповідно до Регламенту (ЄС) N 1907/2006 методи тестування мають бути ухвалені на рівні Співтовариства для цілей тестування речовин у випадку, якщо необхідно отримати інформацію про основні властивості таких речовин.

(2) Директивою Ради 67/548/ЄЕС від 27 червня 1967 року щодо наближення законів, підзаконних актів та адміністративних положень про класифікацію, упакування та маркування небезпечних речовин(2) встановлено, в Додатку V, методи для визначення фізико-хімічних властивостей, токсичності та екотоксичності речовин і препаратів. Додаток V до Директиви 67/548/ЄЕС видалений Директивою Європейського Парламенту та Ради 2006/121/ЄС, що набирає чинності з 1 червня 2008 року.

----------------

(2) OB L 196, 16.8.1967, C. 1. Директива з останніми змінами, внесеними Директивою Європейського Парламенту та Ради 2006/121/ЄС (OB L 396, 30.12.2006, C. 850, з виправленнями, внесеними OB L 136, 29.5.2007, C. 281).

(3) Методи тестування, передбачені Додатком V до Директиви 67/548/ЄЕС, мають бути включені до цього Регламенту.

(4) Цим Регламентом не виключається використання інших методів тестування, за умови, що їх використання відповідає частині 3 статті 13 Регламенту 1907/2006.

(5) Принципи заміни, скорочення та удосконалення процедури використання тварин під час досліджень мають бути повністю враховані при розробці методів тестування, зокрема у випадку, коли відповідні затверджені методи стають доступними для заміни, скорочення або вдосконалення процедури тестування на тваринах.

(6) Положення цього Регламенту відповідають висновку Комітету, заснованому відповідно до статті 133 Регламенту (ЄС) N 1907/2006.

УХВАЛИЛА ЦЕЙ РЕГЛАМЕНТ:

Стаття 1

Методи тестування, що мають застосовуватися для цілей Регламенту 1907/2006/ЄС, передбачені в Додатку до цього Регламенту.

Стаття 2

Комісія переглядає, за необхідності, методи тестування, передбачені цим Регламентом, з метою заміни, скорочення або вдосконалення тестування на хребетних тваринах.

Стаття 3

Всі посилання на Додаток V до Директиви 67/548/ЄЕС мають розглядатися як посилання на цей Регламент.

Стаття 4

Цей Регламент набуває чинності на наступний день після його публікації в Офіційному віснику Європейського Союзу.

Цей Регламент застосовується з 1 червня 2008 року.

Вчинено в Брюсселі 30 травня 2008 року.

За Комісію                                          Stavros DIMAS

Член Комісії

Додаток

ЧАСТИНА А: МЕТОДИ ВИЗНАЧЕННЯ ФІЗИКО-ХІМІЧНИХ ВЛАСТИВОСТЕЙ

ЗМІСТ

А.1. ТЕМПЕРАТУРА ПЛАВЛЕННЯ/ЗАТВЕРДІННЯ

А.2. ТЕМПЕРАТУРА КИПІННЯ

А.3. ВІДНОСНА ГУСТИНА

А.4. ПРУЖНІСТЬ ПАРИ

А.5. ПОВЕРХНЕВЕ НАТЯГНЕННЯ

А.6. РОЗЧИННІСТЬ У ВОДІ

А.8. КОЕФІЦІЄНТ РОЗПОДІЛУ

А.9. ВИЗНАЧЕННЯ ТЕМПЕРАТУРИ СПАЛАХУ

А.10. ЗАЙМИСТІСТЬ (ТВЕРДІ РЕЧОВИНИ)

А.11. ЗАЙМИСТІСТЬ (ГАЗИ)

А.12. ЗАЙМИСТІСТЬ (КОНТАКТ З ВОДОЮ)

А.13. ВЛАСТИВІСТЬ САМОЗАПАЛЕННЯ ТВЕРДИХ ТІЛ ТА РІДИН

А.14. ВИБУХОНЕБЕЗПЕЧНІСТЬ

А.15. ТЕМПЕРАТУРА САМОЗАПАЛЕННЯ (РІДИНИ ТА ГАЗИ)

А.16. ВІДНОСНА ТЕМПЕРАТУРА САМОЗАПАЛЕННЯ ДЛЯ ТВЕРДИХ ТІЛ

А.17. ВЛАСТИВОСТІ ОКИСЛЕННЯ (ТВЕРДІ ТІЛА)

А.18. СЕРЕДНЯ МОЛЕКУЛЯРНА МАСА ТА МОЛЕКУЛЯРНО-МАСОВИЙ РОЗПОДІЛ ПОЛІМЕРІВ

А.19. СКЛАД НИЗЬКОМОЛЕКУЛЯРНИХ ПОЛІМЕРІВ

А.20. ОСОБЛИВОСТІ ПОВЕДІНКИ ПОЛІМЕРУ В ВОДІ ПРИ РОЗЧИНЕННІ/ВИОКРЕМЛЕННІ

А.21. ОКИСЛЮВАЛЬНІ ВЛАСТИВОСТІ РІДИН

А.1. ТЕМПЕРАТУРА ПЛАВЛЕННЯ/ЗАТВЕРДІННЯ

1. МЕТОДИКА

Більшість описаних методів ґрунтуються на Рекомендаціях ОЕСР з тестування (1). Основні принципи наведені в посиланнях (2) та (3).

1.1. ВСТУП

Описані методи та засоби мають застосовуватися для визначення температури плавлення речовин, без будь-яких обмежень стосовно ступеня їх чистоти.

Вибір методу залежить від природи речовини, що має тестуватися. Для результату обмежуючим фактором є те, чи може рідина бути розпиленою з легкістю, важко або взагалі не може бути розпилена.

Для деяких речовин визначення температура загусання або затвердіння є більш доцільною, при цьому стандарти для такого визначення були також включені до цього методу.

Якщо внаслідок особливих властивостей речовини жоден з вищеназваних параметрів не може бути виміряний належним чином, може бути доцільним визначення точки втрати текучості.

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ ТА ОДИНИЦІ

Температура плавлення визначається як температура, при якій фазовий перехід з твердого до рідкого стану відбувається при атмосферному тиску і така температура ідеально відповідає температурі затвердіння.

Оскільки фазовий перехід багатьох речовин відбувається в межах певного температурного діапазону, він часто описується як діапазон плавлення.

Перетворення одиниць (з К у град.С)

t = T - 273,15

t: температура за Цельсієм, градусів Цельсія (град.С)

T: абсолютна температура, Кельвіни (К)

1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ

При дослідженні будь-якої нової речовини немає потреби застосовувати еталонні речовини. Головним чином, вони мають слугувати для періодичної перевірки застосування методу, а також порівняння з результатами, отриманими за допомогою інших методів.

Деякі калібрувальні речовини перераховані в посиланнях (4).

1.4. ПРИНЦИП ЗАСТОСУВАННЯ МЕТОДУ ТЕСТУВАННЯ

Визначається температура (температурний діапазон) фазового переходу з твердого стану у рідкий або з рідкого стану у твердий. На практиці під час нагрівання/охолодження зразка тестової речовини при атмосферному тиску визначаються температури первинного плавлення/затвердіння та кінцева стадія плавлення/затвердіння. Описано п'ять типів методів, а саме: капілярний метод, методи високих температур, визначення температури затвердіння, методи термічного аналізу, а також визначення точки втрати текучості (згідно розробок для нафтових масел).

У деяких випадках може бути доцільним замість температури плавлення вимірювати температуру затвердіння.

1.4.1. Капілярний метод

1.4.1.1. Прилади з рідинною ванною для визначення температури плавлення

Невелика кількість дрібно розмеленої речовини поміщається в капілярну трубку та щільно закривається. Трубка нагрівається разом з термометром, при цьому зростання температури налаштовується на менш, ніж 1 К/хв. протягом всього плавлення. Визначаються початкова та кінцева температури плавлення.

1.4.1.2. Прилади з металевим блоком для визначення температури плавлення

Згідно підпункту 1.4.1.1., за виключенням того, що капілярна трубка та термометр розміщуються у нагрітому металевому блоці, при цьому через отвори в блоці за ними може проводитись спостереження.

1.4.1.3. Виявлення з допомогою фотоелементів

Зразок у капілярній трубці автоматично нагрівається в металевому циліндрі. Пучок променів світла направляється через речовину за допомогою отвору в циліндрі на точно калібрований фотоелемент. Під час плавлення оптичні властивості більшості речовин змінюються від непрозорих до прозорих. Інтенсивність світла, що досягає фотоелемента, зростає і ним надсилається сигнал про зупинку до цифрового індикатора, що зчитує температуру з платинового термометра опору, розташованого в камері нагріву. Цей метод не підходить для деяких інтенсивно забарвлених речовин.

1.4.2. Високотемпературні дослідження

1.4.2.1. Стержень розжарення Кофлера

Стержень розжарення Кофлера складається з двох частин металу різної теплопровідності, що нагріваються електричним шляхом, зі стержнем, сконструйованим таким чином, щоб температурний градієнт був майже лінійним по всій його довжині. Температура стержня розжарення може варіюватися від 283 до 573 К, що визначається спеціальним приладом для зчитування температурних показників, включаючи бігунок з покажчиком та перемикачем, розробленими спеціально для стержня. Для визначення температури плавлення речовина поміщається тонким шаром безпосередньо на поверхню стержня розжарювання. Через кілька секунд з'являється чітка лінія розподілу між рідкою та твердою фазами. Температура на лінії розподілу зчитується шляхом прилаштування покажчика до стержня на цій лінії.

1.4.2.2. Мікроскоп для визначення температури плавлення

Деякі мікроскопи для високотемпературних досліджень використовуються для визначення температур плавлення при дуже малих кількостях матеріалу. В більшості нагрівальних приладів температура вимірюється чутливим термоелементом, але іноді застосовуються ртутні термометри. Типовий прилад для визначення температури плавлення складається з камери нагрівання, що містить металеву пластину, на яку тонким шаром поміщається зразок. В центрі металевої пластини міститься отвір, що дозволяє проходити пучкам світла з освітлювального дзеркала мікроскопа. При використані камера закривається скляною пластинкою для виключення виходу повітря з зони зразка.

Нагрівання зразка регулюється реостатом. Для надточних вимірювань на оптично анізотропних речовинах може застосовуватися поляризоване світло.

1.4.2.3. Менісковий метод

Цей метод застосовується спеціально для поліамідів.

Температура, за якої зміщується меніск силіконового масла, розташованого між стержнем розжарювання та покривним склом, підтримуваним дослідним зразком поліаміду, визначається візуально.

1.4.3. Метод визначення температури затвердіння

Зразок вводиться в спеціальну пробірку та поміщається в прилад для визначення температури затвердіння. Зразок постійно обережно перемішується протягом охолодження, а температура вимірюється через відповідні проміжки часу. Коли температура матиме однакові значення протягом кількох послідовних вимірювань, така температура (скоригована з урахуванням похибки, передбаченої для термометра) фіксується в якості температури затвердіння.

Слід уникати надмірного охолодження шляхом підтримання рівноваги між твердою та рідкою фазами.

1.4.4. Термічний аналіз

1.4.4.1. Диференціальний термічний аналіз (ДТА)

Цим методом фіксується різниця температур між речовиною та еталонним матеріалом як функція температури під час того, як речовина та еталонний матеріал піддаються однаковій терморегулюючій програмі. Коли в зразку відбувається перехід, що спричиняє зміну тепловмісту, ця зміна вказується ендотермічним (плавлення) або екзотермічним (затвердіння) відхиленням від базової лінії температурних показників.

1.4.4.2. Диференціальна скануюча калориметрія (ДСК)

Цим методом фіксується різниця споживаної енергії речовини та еталонного матеріалу як функція температури під час того, як речовина та еталонний матеріал піддаються однаковій терморегулюючій програмі. Ця енергія є енергією, необхідною для встановлення нульової температурної різниці між речовиною та еталонним матеріалом. Коли в зразку відбувається перехід, що спричиняє зміну тепловмісту, ця зміна вказується ендотермічним (плавлення) або екзотермічним (затвердіння) відхиленням від базової лінії показників теплового потоку.

1.4.5. Точка втрати текучості

Цей метод розроблено для використання в роботі з мінеральними маслами, при цьому він підходить для використання з маслянистими речовинами за низьких температур плавлення.

Після попереднього нагрівання зразок охолоджується зі встановленою швидкістю, при цьому з інтервалом у 3 К перевіряються характеристики потоку. Найнижча температура, при якій спостерігається рух речовини, фіксується як точка втрати текучості.

1.5. КРИТЕРІЇ ЯКОСТІ

Застосовність та точність різних методів, що використовуються для визначення температури плавлення/температурного діапазону плавлення, вказуються в наступній таблиці:

ТАБЛИЦЯ: МОЖЛИВІСТЬ ЗАСТОСОВУВАННЯ МЕТОДУ

А. Капілярний метод

--------------------------------------------------------------------------------
|    Метод    |  Речовини,   |  Речовини,   |Температурний| Точність | Існуючі |
| вимірювання |  які можуть  | що не можуть |   діапазон  |розрахунку|стандарти|
|             |подрібнюватись|    легко     |             |   (1)    |         |
|             |              |подрібнюватися|             |          |         |
|-------------+--------------+--------------+-------------+----------+---------|
|Прилади з    |      так     |  лише деякі  |  273-573 К  | +- 0,3 К |  JIS К  |
|рідинною     |              |              |             |          |  0064   |
|ванною для   |              |              |             |          |         |
|визначення   |              |              |             |          |         |
|температури  |              |              |             |          |         |
|плавлення    |              |              |             |          |         |
|-------------+--------------+--------------+-------------+----------+---------|
|Прилади з    |      так     |  лише деякі  |   від 293   | +- 0,5 К |ISO 1218 |
|металевим    |              |              |  до > 573 К |          |   (Е)   |
|блоком для   |              |              |             |          |         |
|визначення   |              |              |             |          |         |
|температури  |              |              |             |          |         |
|плавлення    |              |              |             |          |         |
|-------------+--------------+--------------+-------------+----------+---------|
|Виявлення з  |      так     |  декілька з  |  253-573 К  | +- 0,5 К |         |
|допомогою    |              |застосуванням |             |          |         |
|фотоелементів|              |   приладів   |             |          |         |
--------------------------------------------------------------------------------

----------------

(1) Залежно від типу інструменту та ступеня чистоти речовини.

В. Високотемпературні дослідження та методи визначення температури затвердіння

--------------------------------------------------------------------------------
|    Метод    |  Речовини,   |  Речовини,   |Температурний| Точність | Існуючі |
| вимірювання |  які можуть  | що не можуть |   діапазон  |розрахунку|стандарти|
|             |подрібнюватись|    легко     |             |   (1)    |         |
|             |              |подрібнюватися|             |          |         |
|-------------+--------------+--------------+-------------+----------+---------|
|Стержень     |      так     |      ні      |   від 283   |  +- 1 К  |ANSI/ASTM|
|розжарення   |              |              |  до > 573 К |          |D 3451-76|
|Кофлера      |              |              |             |          |         |
|-------------+--------------+--------------+-------------+----------+---------|
|Мікроскоп    |      так     |  лише деякі  |   від 273   | +- 0,5 К |DIN 53736|
|для          |              |              |  до > 573 К |          |         |
|визначення   |              |              |             |          |         |
|температури  |              |              |             |          |         |
|плавлення    |              |              |             |          |         |
|-------------+--------------+--------------+-------------+----------+---------|
|Менісковий   |      ні      |спеціально для|   від 293   | +- 0,5 К |ISO 1218 |
|метод        |              |  поліамідів  |  до > 573 К |          |   (Е)   |
|-------------+--------------+--------------+-------------+----------+---------|
|Температура  |      так     |      так     |  223-573 К  | +- 0,5 К |напр. BS |
|затвердіння  |              |              |             |          |  4695   |
--------------------------------------------------------------------------------

----------------

(1) Залежно від типу інструменту та ступеня чистоти речовини.

С. Термічний аналіз

--------------------------------------------------------------------------------
|    Метод    |  Речовини,   |  Речовини,   |Температурний| Точність | Існуючі |
| вимірювання |  які можуть  | що не можуть |   діапазон  |розрахунку|стандарти|
|             |подрібнюватись|    легко     |             |   (1)    |         |
|             |              |подрібнюватися|             |          |         |
|-------------+--------------+--------------+-------------+----------+---------|
|Диференціаль-|      так     |      так     | 173-1273 К  | до 600 К |  ASTM Е |
|ний          |              |              |             |+- 0,5 К, |  537-76 |
|термічний    |              |              |             |до 1273 К |         |
|аналіз (ДТА) |              |              |             |+- 2,0 К  |         |
|-------------+--------------+--------------+-------------+----------+---------|
|Диференціаль-|      так     |      так     | 173-1273 К  | до 600 К |  ASTM Е |
|на скануюча  |              |              |             |+- 0,5 К, |  537-76 |
|калориметрія |              |              |             |до 1273 К |         |
|(ДСК)        |              |              |             | +- 2,0 К |         |
--------------------------------------------------------------------------------

----------------

(1) Залежно від типу інструменту та ступеня чистоти речовини.

D. Точка втрати текучості

--------------------------------------------------------------------------------
|    Метод    |  Речовини,   |  Речовини,   |Температурний| Точність | Існуючі |
| вимірювання |  які можуть  | що не можуть |   діапазон  |розрахунку|стандарти|
|             |подрібнюватись|    легко     |             |   (1)    |         |
|             |              |подрібнюватися|             |          |         |
|-------------+--------------+--------------+-------------+----------+---------|
|Точка        |      для     |      для     |  223-323 К  | +- 0,3 К |  ASTM D |
|втрати       |  мінеральних |  мінеральних |             |          |  97-66  |
|текучості    |   масел та   |   масел та   |             |          |         |
|             |  маслянистих |  маслянистих |             |          |         |
|             |    речовин   |    речовин   |             |          |         |
--------------------------------------------------------------------------------

----------------

(1) Залежно від типу інструменту та ступеня чистоти речовини.

1.6. ОПИС МЕТОДІВ

Порядок проведення практично всіх методів тестування був описаний у міжнародних та національних стандартах (див. Додаток 1).

1.6.1. Методи з застосуванням капілярної трубки

Піддаючись повільному зростанню температури, подрібнені речовини зазвичай проходять етапи плавлення, наведені на малюнку 1.

Малюнок 1 ( 994_b14 )

Протягом визначення температури плавлення температурні показники фіксуються на початковому та кінцевому етапі плавлення.

1.6.1.1. Прилади з рідинною ванною для вимірювання температури плавлення

На малюнку 2 показано тип стандартизованого приладу для вимірювання температури плавлення, виготовленого зі скла (JIS K 0064); всі специфікації вказані в міліметрах.

Малюнок 2 ( 994_b14 )

Рідина в ванні:

Має бути обрана відповідна рідина. Вибір рідини залежить від температури плавлення, що має бути визначена, наприклад, вазелінове масло - для температур плавлення не більше 473 К, силіконове масло - для температур плавлення не більше 573 К.

Для температур плавлення вище 523 К може використовуватися суміш, що складається з трьох частин сірчаної кислоти та двох частин сульфату калію (у масових пропорціях). У випадку використання подібних сумішей має бути вжито відповідних заходів безпеки.

Термометр:

Слід користуватися лише такими термометрами, які відповідають вимогам наступних стандартів або їх еквівалентів:

ASTM E 1-71, DIN 12770, JIS K 8001.

Порядок визначення:

Суха речовина мілко подрібнюється в ступці та висипається в капілярну трубку, запаяну з одного боку, таким чином, щоб рівень наповнення складав близько 3 мм після його ущільнення. Для отримання зразка з однорідним ущільненням капілярна трубка має бути опущена з висоти близько 700 мм через скляну трубку вертикально на скло спостереження.

Наповнена капілярна трубка розміщується в ванні таким чином, щоб середня частина голівки ртутного стовпчика термометра торкалася капілярної трубки у частині, де розміщено зразок. Зазвичай капілярна трубка встановлюється в приладі за температури, що приблизно на 10 К нижча температури плавлення.

Рідина в ванні нагрівається таким чином, щоб підвищення температури відбувалося зі швидкістю близько 3 К/хв. Рідину слід помішувати. За температури близько 10 К нижче очікуваної температури плавлення швидкість підвищення температури встановлюється на максимальному рівні 1 К/хв.

Розрахунок:

Розрахунок температури плавлення відбувається наступним чином:

Т = Т + 0,00016 (T - T ) n D D E

де:

Т = скоригована температура плавлення в К

T = температурний показник термометра D в К

T = температурний показник термометра Е в К

n = кількість поділок на виступаючому стовпчику ртуті у термометрі D.

1.6.1.2. Прилади з металевим блоком для вимірювання температури плавлення

Прилад

Складається з наступних деталей:

- циліндричний металевий блок, верхня частина якого відкрита і має вигляд камери (див. мал. 3),

- металева пробка з одним чи двома отворами, через які в металевий блок вводяться трубки,

- система нагрівання для металевого блоку, забезпечена, наприклад, електричним опором, вбудованим у металевий блок,

- реостат для регулювання вхідної потужності, якщо використовується електричне нагрівання,

- чотири отвори з жаростійкого скла на бокових стінках камери, діаметрально розташовані під прямими кутами одне до одного. Навпроти одного з цих отворів вбудовано окуляр для спостереження за капілярною трубкою. Інші три отвори використовуються для освітлення внутрішньої частини камери лампами,

- капілярна трубка з жаростійкого скла, закрита з одного кінця (див. 1.6.1.1).

Термометр:

Див. стандарти, вказані в підпункті 1.6.1.1. Можуть також застосовуватися прилади для термоелектричного вимірювання з аналогічним рівнем точності.

Малюнок 3 ( 994_b14 )

1.6.1.3. Виявлення з допомогою фотоелементів

Прилад та порядок вимірювання:

Прилад складається з металевої камери з автоматизованою системою нагрівання. Три капілярні трубки наповнюються відповідно до підпункту 1.6.1.1. та поміщаються в термокамеру.

Для калібрування приладу можливі кілька лінійних підвищень температури, при цьому відповідне підвищення температури встановлюється електричними засобами на рівні, що знаходиться перед обраним постійним та лінійним показником. Самописці вказують фактичну температуру термокамери та температуру речовини в капілярних трубках.

1.6.2. Високотемпературні дослідження

1.6.2.1. Стержень розжарення Кофлера

Див. Додаток.

1.6.2.2. Мікроскоп для визначення температури плавлення

Див. Додаток.

1.6.2.3. Менісковий метод (поліаміди)

Див. Додаток.

Швидкість нагрівання до температури плавлення має бути менше 1 К/хв.

1.6.3. Методи визначення температури затвердіння

Див. Додаток.

1.6.4. Термічний аналіз

1.6.4.1. Диференціальний термічний аналіз

Див. Додаток.

1.6.4.2. Диференціальна скануюча калориметрія

Див. Додаток.

1.6.5. Визначення точки втрати текучості

Див. Додаток.

2. ДАНІ

В деяких випадках необхідне коригування даних термометра.

3. ЗВІТНІСТЬ

Звіт про результати дослідження, по можливості, включає наступну інформацію:

- використана методика,

- точна специфікація речовини (особливості та домішки) та попередні заходи очищення, якщо такі були,

- оцінка точності показників.

У якості температури плавлення вказується середнє значення щонайменше двох вимірювань, що лежать у межах діапазону з урахуванням похибки (див. таблиці).

Якщо різниця між температурою на початковому та кінцевому етапі плавлення знаходиться в межах заданої точності методу, температура кінцевого етапу плавлення приймається як температура плавлення; в іншому випадку зафіксовуються обидва температурні показники.

Якщо речовина розпадається або сублімується до досягнення температури плавлення, слід вказати температуру, за якої спостерігається таке явище.

Вся інформація та примітки, що стосуються пояснення результатів, мають бути відображені в звіті, особливо щодо домішок та фізичного стану речовини.

4. ПОСИЛАННЯ

(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 102, Decision of the Council С(81) 30 final.

(2) IUPAC, B. Le Neindre, B.Vodar, eds. Experimental thermodynamics, Butterworths, London 1975, vol. II, p. 803-834.

(3) R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VII.

(4) IUPAC, Physicochemical measurements: Catalogue of reference materials from national laboratories, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, p. 505-515.

Додаток

Для отримання додаткових технічних даних можуть бути використані, наприклад, наступні стандарти

1. Капілярні методи

1.1. Прилади з рідинною ванною для визначення температури плавлення

ASTM E 324-69 Стандартний метод тестування для відносної первинної та кінцевої точок, а також для температурного діапазону плавлення органічних хімічних речовин

BS 4634             Метод визначення точки плавлення та/або
                         температурного діапазону плавлення

DIN 53181           Визначення температурних інтервалів
                         плавлення смол за капілярним методом

JIS K 00-64         Методи тестування для визначення точки
                         плавлення хімічних продуктів

1.2. Прилади з металевим блоком для визначення температури плавлення

DIN 53736 Візуальне визначення температури частково кристалічних пластмас

ISO 1218 (E) Пластмаси - поліаміди - визначення "точки плавлення"

2. Високотемпературні дослідження

2.1. Стержень розжарення Кофлера

ANSI/ASTM D 3451-76 Стандартні рекомендовані правила тестування покриттів з полімерних порошків

2.2. Мікроскоп для визначення температури плавлення

DIN 53736 Візуальне визначення температури частково кристалічних пластмас

2.3. Менісковий метод (поліаміди)

ISO 1218 (E) Пластмаси - поліаміди - визначення "точки плавлення"

ANSI\ASTM D 2133-66 Стандартна специфікація для поліформальдегідних матеріалів для виливання та штампування

NF T 51-050 Поліамідні смоли. Визначення "точки плавлення" за методом меніску

3. Методи визначення температури затвердіння

BS 4633             Метод визначення точки кристалізації

BS 4695             Метод визначення точки плавлення
                         нафтового парафіну (Крива охолодження)

DIN 51421           Визначення точки замерзання авіаційного
                         палива, карбюраторного палива та
                         моторного бензолу

ISO 2207            Нафтовий віск: визначення температури
                         затвердіння

DIN 53175           Визначення точки затвердіння жирних
                         кислот

NF T 60-114 Точка плавлення парафінів

NF T 20-051 Метод визначення точки кристалізації (точки затвердіння)

ISO 1392            Метод визначення точки затвердіння

4. Термічний аналіз

4.1. Диференціальний термічний аналіз

ASTM Е 537-76 Стандартні методи оцінки температурної стійкості хімічних речовин методами диференціального термічного аналізу

ASTM Е 473-85 Стандартні визначення термінів, що стосуються термічного аналізу

ASTM Е 472-86 Стандартні правила фіксації даних термічного аналізу

DIN 51005 Термічний аналіз, Поняття

4.2. Диференціальна скануюча калориметрія

ASTM Е 473-85 Стандартні визначення термінів, що стосуються термічного аналізу

ASTM Е 472-86 Стандартні правила фіксації даних термічного аналізу

DIN 51005 Термічний аналіз, Поняття

5. Визначення точки втрати текучості

NBN 52014 Відбір проб та аналіз нафтопродуктів: температура помутніння та точка втрати текучості

ASTM D 97-66 Стандартний метод тестування для визначення точки втрати текучості мінеральних масел

ISO 3016            Мінеральні масла - визначення точки
                         втрати текучості

А.2. ТЕМПЕРАТУРА КИПІННЯ

1. МЕТОДИКА

1.1. ВСТУП

Описані методи та засоби можуть застосовуватися до рідких речовин та таких, що мають низьку температуру плавлення, за умови, що вони не піддаються хімічній реакції за температури нижчої, ніж температура кипіння (наприклад, автоокислення, перегрупування, розщеплення тощо). Методи можуть застосовуватися до рідких речовин без обмежень стосовно ступеня їх чистоти.

Наголос зроблено на методах виявлення з допомогою фотоелементів та термічному аналізі, оскільки ці методи дозволяють визначення температур плавлення, а також кипіння. Крім того, вимірювання можуть виконуватися автоматизовано.

"Динамічний метод" має ту перевагу, що він може бути застосований для визначення пружності пари, при цьому необов'язково коригувати температуру кипіння відносно нормального тиску (101,325 кПа), оскільки нормальний тиск регулюється маностатом під час вимірювання.

Примітки:

Вплив домішок на визначення температури кипіння великою мірою залежить від характеру домішок. У випадку, якщо у зразку є летучі домішки, що можуть вплинути на результати, речовина може очищатися.

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ ТА ОДИНИЦІ

Нормальна температура кипіння визначається як температура, при якій пружність пари рідини становить 101,325 кПа.

Якщо температура кипіння вимірюється не при нормальному атмосферному тиску, залежність температури від пружності пари може бути описана рівнянням Клаузіуса-Клапейрона:

дельта H
                                         v
                         log p = ---------
                                  2,3RT

де:

p = пружність пари речовини в паскалях

-1 дельта H = її теплота пароутворення в Дж·моль v

R = універсальна молярна газова константа = -1 -1

8,314 Дж·моль  ·К

T = термодинамічна температура в К

Температура кипіння вказується з урахуванням зовнішнього тиску протягом вимірювання.

Перетворення:

Тиск (одиниці: кПа)

100 кПа = 1 бар = 0,1 МПа

("бар" ще дозволяється, але не рекомендується)

133 Па = 1 мм рт.ст. = 1 Торр

(одиниці "мм рт.ст." та "Торр" не дозволяються)

1 атм = стандартна атмосфера = 101 325 Па

(одиниця "атм" не дозволяється)

Температура (одиниці: К)

t = T - 273,15

t: температура за Цельсієм, градусів Цельсія (град.С)

T: абсолютна температура, Кельвіни (К)

1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ

Деякі калібрувальні речовини наведені в методах, перерахованих у Додатку.

1.4. ПРИНЦИП ЗАСТОСУВАННЯ МЕТОДУ ТЕСТУВАННЯ

П'ять методів визначення температури кипіння (температурного діапазону кипіння) ґрунтуються на вимірюванні температури кипіння, інші - на термічному аналізі.

1.4.1. Визначення з використанням ебуліометра

Ебуліометри спочатку були розроблені для визначення молекулярної маси підвищенням температури кипіння, але вони також підійшли для визначення точної температури кипіння. Дуже простий прилад описано в стандарті ASTM D 1120-72 (див. Додаток). Рідина нагрівається в цьому приладі за умови рівноваги при атмосферному тиску до початку кипіння.

1.4.2. Динамічний метод

Характеристикою цього методу є вимірювання температури повторної конденсації пари відповідним термометром в рефлюксі під час кипіння. У цьому методі тиск може змінюватися.

1.4.3. Метод перегонки для температури кипіння

Характерними для цього методу є перегонка рідини та вимірювання температури повторної конденсації пари, а також визначення об'єму речовини для перегонки.

1.4.4. Метод Сиволобова

Зразок нагрівається в трубці для зразка, що занурюється в рідину ванни з підігрівом. Запаяна капілярна трубка, що містить повітряну бульбашку у нижній частині, опускається в трубку для зразка.

1.4.5. Виявлення з допомогою фотоелементів

Відповідно до принципу застосування методу Сиволобова здійснюється автоматичне фотоелектричне вимірювання з використанням бульбашок, що піднімаються.

1.4.6. Диференціальний термічний аналіз

Цим методом фіксується різниця температур між речовиною та еталонним матеріалом як функція температури під час того, як речовина та еталонний матеріал піддаються однаковій терморегулюючій програмі. Коли в зразку відбувається перехід, що спричиняє зміну тепловмісту, ця зміна вказується ендотермічним відхиленням (кипіння) від базової лінії температурних показників.

1.4.7. Диференціальна скануюча калориметрія

Цим методом фіксується різниця вхідної енергії речовини та еталонного матеріалу як функція температури під час того, як речовина та еталонний матеріал піддаються однаковій терморегулюючій програмі. Ця енергія є енергією, необхідною для встановлення нульової температурної різниці між речовиною та еталонним матеріалом. Коли в зразку відбувається перехід, що спричиняє зміну тепловмісту, ця зміна вказується ендотермічним відхиленням (кипіння) від базової лінії показників теплового потоку.

1.5. КРИТЕРІЇ ЯКОСТІ

Застосовність та точність різних методів, що використовуються для визначення температури кипіння/температурного діапазону кипіння, вказуються в таблиці 1.

Таблиця 1

Порівняння методів

------------------------------------------------------------------
|  Метод вимірювання  | Передбачена точність | Існуючий стандарт |
|                     |                      |                   |
|---------------------+----------------------+-------------------|
|Ебуліометр           |+- 1,4 К (до 373 К)   |ASTM D 1120-72(1)  |
|                     |(1) (2)               |                   |
|                     |+- 2,5 К (до 600 К)   |                   |
|                     |(1) (2)               |                   |
|---------------------+----------------------+-------------------|
|Динамічний метод     |+- 0,5 К (до 600 К)(2)|                   |
|---------------------+----------------------+-------------------|
|Процес перегонки     |+- 0,5 К (до 600 К)   |ISO/R 918, DIN     |
|(діапазон кипіння)   |                      |53171, BS 4591/71  |
|---------------------+----------------------+-------------------|
|Відповідно до        |+- 2 К (до 600 К)(2)  |                   |
|Сиволобова           |                      |                   |
|---------------------+----------------------+-------------------|
|Виявлення з допомогою|+- 0,3 К (до 373 К)(2)|                   |
|фотоелементів        |                      |                   |
|---------------------+----------------------+-------------------|
|Диференціальний      |+- 0,5 К (до 600 К)   |ASTM E 537-76      |
|термічний аналіз     |+- 2,0 К (до 1 273 К) |                   |
|---------------------+----------------------+-------------------|
|Диференціальна       |+- 0,5 К (до 600 К)   |ASTM E 537-76      |
|скануюча калориметрія|+- 2,0 К (до 1 273 К) |                   |
------------------------------------------------------------------

----------------

(1) Вказана точність дійсна лише для простого приладу, як, наприклад, описано в ASTM D 1120-72; вона може бути підвищена за рахунок удосконалених ебуліометричних приладів.

(2) Показники дійсні лише для чистих речовин. Використання за інших умов має обґрунтовуватися.

1.6. ОПИС МЕТОДИК

Порядок проведення деяких методів тестування був описаний у міжнародних та національних стандартах (див. Додаток).

1.6.1. Ебуліометр

Див. Додаток.

1.6.2. Динамічний метод

Див. метод тестування А.4 для визначення пружності пари.

Фіксується температура кипіння, що спостерігається при застосуванні тиску в розмірі 101,325 кПа.

1.6.3. Процес перегонки (температурний діапазон кипіння)

Див. Додаток.

1.6.4. Метод Сиволобова

Зразок нагрівається у приладі для визначення температури плавлення, в трубці для зразка діаметром близько 5 мм (малюнок 1).

На малюнку 1 показано тип стандартизованого приладу для вимірювання температури плавлення та кипіння (JIS K 0064) (виготовлено зі скла; всі специфікації вказані в міліметрах).

Малюнок 1 ( 994_b14 )

У трубці для зразка розміщується капілярна трубка (трубка кипіння), що спаяна на відстані близько 1 см над нижнім кінцем. Рівень, на який додається тестова речовина, є таким, щоб спаяна частина трубки знаходилася нижче рівня рідини. Трубка для зразка, що містить капілярну трубку, кріпиться до термометра гумовою стрічкою або фіксується збоку (див. малюнок 2).

Малюнок 2 ( 994_b14 )

Малюнок 3 ( 994_b14 )

Рідина в ванні обирається відповідно до температури кипіння. Для температур до 573 К може використовуватися силіконове масло. Вазелінове масло застосовується лише для температур не більше 473 К. Спочатку швидкість нагрівання рідини в ванні має бути встановлена на рівні 3 К/хв. Рідину у ванні необхідно помішувати. При температурі близько 10 К нижче очікуваної температури кипіння швидкість нагрівання знижується таким чином, щоб вона становила менше 1 К/хв. При наближенні до температури кипіння з капілярної трубки починають швидко виділятися бульбашки.

Температура кипіння - це така температура, за якої, при миттєвому охолодженні, потік бульбашок припиняється і по трубці починає підніматися рідина. Відповідний показник термометра є температурою кипіння речовини.

У модифікованому принципі (малюнок 3) температура кипіння визначається у капілярній трубці для встановлення температури плавлення. Вона витягується близько на 2 см в довжину (а), при цьому всмоктується невелика кількість зразка. Відкритий кінець потоншення закупорюється плавленням таким чином, щоб на кінці розміщувалась невелика повітряна бульбашка. Під час нагрівання в приладі для встановлення температури плавлення (b) повітряна бульбашка розширюється. Температура кипіння відповідає температурі, при якій закупорка в речовині досягає рівня поверхні рідини в ванні (с).

1.6.5. Виявлення з допомогою фотоелементів

Зразок нагрівається в капілярній трубці всередині металевого блоку з підігрівом.

Промінь світла спрямовується, через відповідні отвори в блоці, крізь речовину на чітко калібрований фотоелемент.

Під час зростання температури зразка з капілярної трубки з'являються поодинокі повітряні бульбашки. При досягненні температури кипіння кількість повітряних бульбашок значно зростає. Це спричиняє зміну інтенсивності світла, що фіксується фотоелементом, та є сигналом зупинки для індикатора, який зчитує температурні показники з платинового термометра опору, розташованого в блоці.

Цей метод особливо корисний, оскільки він дозволяє визначення температур нижчих кімнатної та до 253,15 К (- 20 град.С) без будь-яких змін у приладі. Інструмент лише має занурюватися в ванну для охолодження.

1.6.6. Термічний аналіз

1.6.6.1. Диференціальний термічний аналіз

Див. Додаток.

1.6.6.2. Диференціальна скануюча калориметрія

Див. Додаток.

2. ДАНІ

При малих відхиленнях від нормального тиску (макс. +- 5 кПа) температури кипіння нормалізуються до T шляхом наступного n

рівняння Сіднея Янга для числових значень:

T = Т + (f · дельта p)

n T

де:

дельта p = (101,325 - p) (зверніть увагу на знак)

Р = вимірювання тиску в кПа

f = ступінь зміни температури кипіння в залежності від тиску

в К/кПа

Т = виміряна температура кипіння в К

T = температура кипіння, скоригована відповідно до

нормального тиску в К

Коефіцієнти корекції температури, f , та рівняння для їх T

наближення,  включено до міжнародних та  національних  стандартів,
вказаних вище для багатьох речовин.

Наприклад, у методі DIN 53171 вказуються наступні приблизні показники корекції для розчинників, включаючи в лакофарбових матеріалах:

Таблиця 2:

Температура - коефіцієнти корекції f T

------------------------------------------------------------------
|    Температура Т (К)    |    Коефіцієнт корекції f  (К/кПа)    |
|                         |                         T            |
|-------------------------+--------------------------------------|
|          323,15         |                 0,26                 |
|-------------------------+--------------------------------------|
|          348,15         |                 0,28                 |
|-------------------------+--------------------------------------|
|          373,15         |                 0,31                 |
|-------------------------+--------------------------------------|
|          398,15         |                 0,33                 |
|-------------------------+--------------------------------------|
|          423,15         |                 0,35                 |
|-------------------------+--------------------------------------|
|          448,15         |                 0,37                 |
|-------------------------+--------------------------------------|
|          473,15         |                 0,39                 |
|-------------------------+--------------------------------------|
|          498,15         |                 0,41                 |
|-------------------------+--------------------------------------|
|          523,15         |                  0,4                 |
|-------------------------+--------------------------------------|
|          548,15         |                 0,45                 |
|-------------------------+--------------------------------------|
|          573,15         |                 0,47                 |
------------------------------------------------------------------

3. ЗВІТНІСТЬ

Звіт про результати тестування, по можливості, включає наступну інформацію:

- використана методика,

- точна специфікація речовини (особливості та домішки) та попередні заходи очищення, якщо такі були,

- оцінка точності показників.

У якості температури кипіння вказується середнє значення щонайменше двох вимірювань, що лежать у межах діапазону з урахуванням похибки (див. таблицю 1).

Вказуються виміряні температури кипіння та їхнє середнє значення, при цьому показник(и) тиску, що було використано для вимірювань, наводиться в кПа. Бажано, щоб тиск був наближеним до нормального атмосферного тиску.

4. ПОСИЛАННЯ

(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 103, Decision of the Council С(81) 30 final.

(2) IUPAC, B. Le Neindre, B.Vodar, editions. Experimental thermodynamics, Butterworths, London 1975, vol. II.

(3) R. Weissberger edition: Technique of organic chemistry, Physical methods of organic chemistry, Third Edition, Interscience Publications, New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VIII.

Додаток

Для отримання додаткових технічних даних можуть бути використані, наприклад, наступні стандарти

1. Ебуліометр

1.1. Прилади з рідинною ванною для визначення температури плавлення

ASTM D 1120-72 Стандартний метод тестування для визначення точки кипіння антифризів двигунів

2. Процес перегонки (температурний діапазон кипіння)

ISO/R 918 Метод тестування для перегонки (розмір виходу та температурні межі відбору фракцій)

BS 4349/68 Метод визначення перегонки нафтопродуктів

BS 4591/71 Метод визначення фракційного складу

DIN 53171 Розчинники для лакофарбових матеріалів, визначення фракційного складу

NF T 20-608 Перегонка: визначення виходу та температурного діапазону перегонки

3. Диференціальний термічний аналіз та диференціальна скануюча калориметрія

ASTM Е 473-85 Стандартні визначення термінів, що стосуються термічного аналізу

ASTM Е 472-86 Стандартні правила фіксації даних термічного аналізу

DIN 51005 Термічний аналіз, Поняття

А.3. ВІДНОСНА ГУСТИНА

1. МЕТОДИКА

Описані методи ґрунтуються на Рекомендаціях ОЕСР з тестування (1). Основні принципи наведені в посиланні (2).

1.1. ВСТУП

Описані методи для визначення відносної густини застосовуються до твердих та рідких речовин, без будь-яких обмежень стосовно ступеня їх чистоти. Різноманітні методи, що можуть використовуватися, перераховані в таблиці 1.

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ ТА ОДИНИЦІ

20 Відносна густина D твердих та рідких речовин є 4

співвідношенням між масою об'єму речовини, що має бути досліджена,
яка визначається при 20 град.С, та масою такого ж об'єму води, яка
визначається при 4 град.С. Відносна густина не має розмірності.

Густина, ро, речовини є співвідношенням маси, m, та її об'єму, v.

Густина, ро, в системі одиниць CI вимірюється в кг/куб.м.

1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ (1) (3)

ПРИНЦИП ЗАСТОСУВАННЯ МЕТОДІВ

1.4. Використовується чотири класи методів.

1.4.1. Методи на основі Архімедової сили

1.4.1.1. Гідрометр (для рідких речовин)

Достатньо точні та швидкі результати вимірювання можна отримати через використання плаваючих гідрометрів, що дозволяють вирахувати густину рідини з глибини занурення через показники градуйованої шкали.

1.4.1.2. Гідростатичні терези (для рідких та твердих речовин)

Різниця між вагою тестового зразка, виміряною на повітрі та у відповідній рідині (наприклад, воді), може бути використана для визначення його густини.

У випадку твердих речовин виміряна густина є репрезентативною лише для окремого застосованого зразка. Для визначення густини рідин тіло відомого об'єму, v, спершу зважується на повітрі, а потім - у рідині.

1.4.1.3. Метод занурення тіла (для рідких речовин) (4)

У цьому методі густина рідини визначається з різниці між результатами зважування рідини до та після занурення тіла відомого об'єму у тестову рідину.

1.4.2. Методи з застосуванням пікнометра

Для твердих або рідких речовин можуть застосовуватися пікнометри різноманітних форм та з відомими об'ємами. Густина вимірюється з різниці у вазі між повним і пустим пікнометром та його відомим об'ємом.

1.4.3. Газопорівняльний пікнометр (для твердих речовин)

Густина твердої речовини будь-якої форми може вимірюватися при кімнатній температурі газопорівняльним пікнометром. Об'єм речовини вимірюється на повітрі або в інертному газі у циліндрі змінного каліброваного об'єму. Для розрахунку густини вимірювання маси проводиться після завершення вимірювання об'єму.

1.4.4. Осцилюючий денситометр (5) (6) (7)

Густина рідини може вимірюватися осцилюючим денситометром. Механічний осцилятор, виготовлений у формі трубки U-подібної форми, вібрує на резонансній частоті осцилятора, що залежить від його маси. Введення зразка змінює резонансну частоту осцилятора. Прилад має бути відкалібрований двома рідкими речовинами відомої густини. Бажано відібрати такі речовини, щоб їхня густина охоплювала діапазон, в межах якого знаходиться густина тестового зразка.

1.5. КРИТЕРІЇ ЯКОСТІ

Застосовність різних методів, що використовуються для визначення відносної густини, наводиться в таблиці.

1.6. ОПИС МЕТОДІВ

У Додатку у якості прикладів наведено стандарти, які можуть використовуватися для отримання додаткових технічних даних.

Тестування має проводитися при 20 град.С, при цьому має бути виконано щонайменше два заміри.

2. ДАНІ

Див. стандарти.

3. ЗВІТНІСТЬ

Звіт про результати тестування, по можливості, включає наступну інформацію:

- використана методика,

- точна специфікація речовини (особливості та домішки) та попередні заходи очищення, якщо такі були.

20 Відносна густина, D , вказується таким чином, як 4

передбачено  пунктом  1.2,  разом  з  фізичним  станом вимірюваної
речовини.

Таблиця

Можливість застосування методів

------------------------------------------------------------------
|     Метод    |       Густина       | Максимально |   Існуючі   |
|  вимірювання |---------------------|   можлива   |  стандарти  |
|              |    Тверда    |Рідина|  динамічна  |             |
|              |   речовина   |      |  в'язкість  |             |
|--------------+--------------+------+-------------+-------------|
|1.4.1.1.      |              | так  |    5 Па с   |ISO 387,     |
|Гідрометр     |              |      |             |ISO 649-2,   |
|              |              |      |             |NF T 20-050  |
|--------------+--------------+------+-------------+-------------|
|1.4.1.2.      |     так      | так  |    5 Па с   |ISO 1183 (А) |
|Гідростатичні |              |      |             |ISO 901 та   |
|терези        |              |      |             |758          |
|(a) тверді    |              |      |             |             |
|речовини      |              |      |             |             |
|(b) рідини    |              |      |             |             |
|--------------+--------------+------+-------------+-------------|
|1.4.1.3.      |              | так  |   20 Па с   |DIN 53217    |
|Метод         |              |      |             |             |
|занурення тіла|              |      |             |             |
|--------------+--------------+------+-------------+-------------|
|1.4.2.        |      так     | так  |  500 Па с   |ISO 3507     |
|Пікнометр     |              |      |             |ISO 1183(В)  |
|(a) тверді    |              |      |             |NF T 20-053  |
|речовини      |              |      |             |ISO 758      |
|(b) рідини    |              |      |             |             |
|--------------+--------------+------+-------------+-------------|
|1.4.3.        |      так     |      |             |DIN 55990    |
|Газо-         |              |      |             |Розділ 3,    |
|порівняльний  |              |      |             |DIN 53243    |
|пікнометр     |              |      |             |             |
|--------------+--------------+------+-------------+-------------|
|1.4.4.        |              | так  |    5 Па с   |             |
|Осцилюючий    |              |      |             |             |
|денситометр   |              |      |             |             |
------------------------------------------------------------------

4. ПОСИЛАННЯ

(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 109, Decision of the Council С(81) 30 final.

(2) R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Chapter IV, Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I.

(3) IUPAC, Recommended reference materials for realization of physico-chemical properties, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, p. 508.

(4) Wagenbreth, H., Die Tauchkugel zur Bestimmung der Dichte von Flussigkeiten, Technisches Messen tm, 1979, vol. II, p. 427-430.

(5) Leopold, H., Die digitale Messung von Flussigkeiten, Elektronik, 1970, vol. 19, p. 297-302.

(6) Baumgarten, D., Fullmengenkontrolle bei vorgepackten Erzeugnissen - Verfahren zur Dichtebestimmung bei flussigen Produkten und ihre praktische Anwendung, Die Pharmazeutische Industrie, 1975, vol. 37, p. 717-726.

(7) Riemann, J., Der Einsatz der digitalen Dichtemessung im Brauereilaboratorium, Brauwissenschaft, 1976, vol. 9, p. 253-255.

Додаток

Для отримання додаткових технічних даних можуть бути використані, наприклад, наступні стандарти

1. Методи на основі Архімедової сили

1.1. Гідрометр

DIN 12790, ISO 387 Гідрометр, загальні інструкції

DIN 12791 Частина I: Гідрометри для вимірювання густини; будова, налаштування та використання Частина II: Гідрометри для вимірювання густини; стандартні розміри, призначення Частина III: Використання та тестування

ISO 649-2 Лабораторний скляний посуд: Гідрометри для вимірювання густини загального призначення

NF T 20-050 Хімічні продукти для промислового використання - Визначення густини рідин - Аерометричний метод

DIN 12793 Лабораторний скляний посуд: Гідрометри з визначенням діапазону показників

1.2. Гідростатичні терези

Для твердих речовин

ISO 1183 Метод А: Методи визначення густини та відносної густини пластмас, за виключенням пінопластів

NF T 20-049 Хімічні продукти для промислового використання - Визначення густини твердих речовин інших, ніж порошки та пористі матеріали - Метод гідростатичних терезів

ASTM-D-792 Питома вага та густина пластмас через витіснення

DIN 53479 Тестування пластмас та еластомерів; визначення густини

Для рідких речовин

ISO 901             ISO 758

DIN 51757           Тестування мінеральних масел та суміжних
                         матеріалів; визначення густини

ASTM D 941-55, ASTM D 1296-67 ASTM D 1481-62

ASTM D 1298 Густина, питома вага або густина в градусах AHI для продуктів з неочищеної нафти та рідких нафтопродуктів за допомогою гідрометричного методу

BS 4714             Густина, питома вага або густина в
                         градусах AHI для продуктів з неочищеної
                         нафти та рідких нафтопродуктів за
                         допомогою гідрометричного методу

1.3. Метод занурення тіла

DIN 53217 Тестування фарб, лаків та подібних матеріалів для покриття; визначення густини; метод занурення тіла

2. Методи з застосуванням пікнометра

2.1. Для рідких речовин

ISO 3507            Пікнометри

ISO 758             Рідкі хімічні продукти; визначення
                         густини при температурі 20 град.С

DIN 12797           Пікнометр Гей-Люссака (для нелетучих
                         рідин, що не є занадто в'язкими)

DIN 12798           Пікнометр Липкіна (для рідин з
                         кінематичною в'язкістю менше
                               -6       -1
                         100 10   кв.м с   при 15 град.С)

DIN 12800           Пікнометр Шпренгеля (для рідин,
                         передбачених DIN 12798)

DIN 12801           Пікнометр Рейсхауера (для рідин з
                         кінематичною в'язкістю менше
                               -6       -1
                         100 10   кв.м с   при 20 град.С, що
                         застосовується, зокрема, також до
                         вуглеводнів і водних розчинів та
                         до рідин з вищою пружністю пари,
                         близько 1 бару при 90 град.С)

DIN 12806           Пікнометр Хаббарда (для в'язких рідин
                         всіх типів, для яких характерна невисока
                         пружність пари, а також, зокрема, для
                         фарб, лаків та бітумів)

DIN 12807           Пікнометр Бінгама (для рідин,
                         передбачених DIN 12801)

DIN 12808           Пікнометр Джолмеса (зокрема, для
                         етаноло-водної суміші)

DIN 12809           Пікнометр з прилаштованим термометром та
                         боковою капілярною трубкою (для рідин, що
                         не є занадто в'язкими)

DIN 53217           Тестування фарб, лаків та подібних
                         матеріалів; визначення густини
                         пікнометром

DIN 51757           Пункт 7: Тестування мінеральних масел та
                         суміжних матеріалів; визначення густини

ASTM D 297          Розділ 15: Гумові матеріали - хімічний
                         аналіз

ASTM D 2111 Метод С: Галогеновані органічні сполуки

BS 4699             Метод визначення питомої ваги та густини
                         нафтопродуктів (на основі використання
                         градуйованого бікапілярного пікнометра)

BS 5903             Метод визначення відносної густини та
                         густини нафтопродуктів з використанням
                         пікнометра, закритого капілярною трубкою

NF T 20-053         Хімічні продукти для промислового
                         використання - Визначення густини твердих
                         порошкоподібних речовин та рідин -
                         Пікнометричний метод

2.2. Для твердих речовин

ISO 1183            Метод В: Методи визначення густини та
                         відносної густини пластмас, за
                         виключенням пінопластів

NF T 20-053         Хімічні продукти для промислового
                         використання - Визначення густини твердих
                         порошкоподібних речовин та рідин -
                         Пікнометричний метод

DIN 19683 Визначення густини ґрунтів

3. Газопорівняльний пікнометр

DIN 55990 Тестування лакофарбових матеріалів та подібних матеріалів для покриття; Порошкові покриття; Визначення густини

DIN 53243 Лакофарбові матеріали; Хлористі полімери; Тестування

А.4. ПРУЖНІСТЬ ПАРИ

1. МЕТОДИКА

1.1. ВСТУП

Для проведення тестування доцільно мати попередню інформацію про структуру, температуру плавлення та температуру кипіння речовини.

Не існує єдиного методу вимірювання, що міг би застосовуватися до всього діапазону показників пружності пари. Проте деякі методи рекомендуються до застосування для вимірювання -4

пружності пари в діапазоні від < 10   до 105 Па.

Зазвичай домішки впливають на показник пружності пари, при цьому великою мірою це залежить від типу домішок.

Якщо у зразку містяться летучі домішки, які могли б вплинути на результат вимірювання, речовина може очищатися. Також може бути доцільним вказати пружність пари технічного матеріалу.

У деяких описаних далі методах використовується прилад з металевими деталями; це має враховуватися при тестуванні корозійно-активних речовин.

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ ТА ОДИНИЦІ

Пружність пари речовини визначається як тиск насиченої пари над твердою або рідкою речовиною. При термодинамічній рівновазі пружність пари чистої речовини є лише функцією температури.

Одиницею пружності в системі CI, яка має використовуватися, є паскаль (Па).

Одиниці, що використовувалися історично, разом з їхніми перевідними коефіцієнтами, є такими:

2 1 Торр (= 1 мм рт.ст.) = 1,333 · 10 Па

5 1 атмосфера = 1,013 · 10 Па

5 1 бар = 10 Па

Одиницею температури в системі CI є кельвін (К).

-1 -1 Універсальна молярна газова константа R - 8,314 Дж·моль ·К

Залежність температури від пружності пари описується рівнянням Клаузіуса-Клапейрона:

дельта H
                                    v
                    log p = --------- + const.
                              2,3RT

де:

p = пружність пари речовини в паскалях

-1 дельта Н = її теплота пароутворення в Дж·моль v

-1 -1 R = універсальна молярна газова константа в Дж·моль ·К

T = термодинамічна температура в К

1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ

1.4. ПРИНЦИП ЗАСТОСУВАННЯ МЕТОДІВ ТЕСТУВАННЯ

Для визначення пружності пари пропонується сім методів, що можуть застосовуватися у різноманітних діапазонах показників пружності пари. У кожному з методів пружність пари визначається за різних температур. В обмеженому температурному діапазоні логарифм пружності пари чистої речовини є лінійною функцією, оборотною до температури.

1.4.1. Динамічний метод

В динамічному методі вимірюється температура кипіння, що відповідає вказаній пружності.

Рекомендований діапазон:

3      5
     від 10  до 10  Па.

Цей метод також рекомендовано для визначення температури кипіння за нормальних умов, при цьому він може застосовуватися з цією метою для температури до 600 К.

1.4.2. Статичний метод

В статичному процесі, при термодинамічній рівновазі, пружність пари, встановлена в закритій системі, визначається за обумовленої температури. Цей метод підходить для одно- та багатокомпонентних твердих і рідких речовин.

Рекомендований діапазон:

5 від 10 до 10 Па.

Цей метод може також використовуватися в межах діапазону від 1 до 10 Па, за умов дотримання безпеки.

1.4.3. Ізотенископ

Цей стандартизований метод є також статичним методом, але, як правило, не підходить для багатокомпонентних систем. Додаткову інформацію можна отримати в характеристиці методу ASTM D-2879-86.

Рекомендований діапазон:

5 від 100 до 10 Па.

1.4.4. Ефузіометричний метод: Вирівнювання тиску пари

В умовах вакууму визначається кількість речовини, що виходить з камери за одиницю часу через отвір відомого розміру, при цьому об'єм речовини, що повертається в камеру, незначний (наприклад, шляхом вимірювання імпульсу, що генерується на чутливі терези струменем пари, або вимірюванням зменшення ваги).

Рекомендований діапазон:

-3
     від 10   до 1 Па.

1.4.5. Ефузіометричний метод: Через зменшення ваги або вловлювання випаруваної речовини

Метод ґрунтується на оцінці маси тестової речовини, що витікає за одиницю часу з камери Кнудсена (4) в формі пари через мікроотвір за умов ультра-вакууму. Маса пари, що витекла, може бути отримана або визначенням зменшення маси камери, або конденсацією пари при низькій температурі та визначенням розміру випаруваної речовини, застосувавши для цього хроматографічний аналіз. Пружність пари розраховується з застосуванням формули Герца-Кнудсена.

Рекомендований діапазон:

-3
     від 10   до 1 Па.

1.4.6. Метод газонасичення

Потік інертного газу-носія пропускається через речовину таким чином, що він насичується її парою. Кількість матеріалу, що переноситься відомою кількістю газу-носія, вимірюється або відбором у відповідний вловлювач, або з застосуванням аналітичних методів. Цей матеріал далі використовується для розрахунку пружності пари при заданій температурі.

Рекомендований діапазон:

-4
     від 10   до 1 Па.

Цей метод може також використовуватися в межах діапазону від 1 до 10 Па, за умов дотримання безпеки.

1.4.7. Оборотний ротор

У вимірювачі оборотного ротора фактичним вимірювальним елементом є невелика металева куля, що підвішена у магнітному полі та обертається з високою швидкістю. Пружність газу визначається з залежного від тиску уповільнення руху металевої кулі.

Рекомендований діапазон:

-4
     від 10   до 0,5 Па.

1.5. КРИТЕРІЇ ЯКОСТІ

Різноманітні методи визначення пружності пари різняться між собою з огляду на можливість їх застосування, повторюваність, відтворюваність, діапазон вимірювання, існуючі стандарти. Все це наведено в наступній таблиці.

Таблиця:

Критерії якості

-------------------------------------------------------------------------------------------
|     Метод     |     Речовини     |  Очікувана   |   Очікувана   |Рекомендований|Існуючий|
|  вимірювання  |------------------|повторюваність|відтворюваність|   діапазон   |стандарт|
|               |   Тверді  |Рідини|     (1)      |      (1)      |              |        |
|               |  речовини |      |              |               |              |        |
|---------------+-----------+------+--------------+---------------+--------------+--------|
|1.4.1.         |легкоплавкі|  так |    До 25%    |    До 25%     |      3       |    -   |
|Динамічний     |           |      |              |               |від 10  Па до |        |
|метод          |           |      |              |               |      3       |        |
|               |           |      |              |               |2 · 10  Па    |        |
|               |           |      |              |               |          3   |        |
|               |           |      |     1-5%     |     1-5%      |від 2 · 10  Па|    -   |
|               |           |      |              |               |     5        |        |
|               |           |      |              |               |до 10  Па     |        |
|---------------+-----------+------+--------------+---------------+--------------+--------|
|1.4.2.         |    так    |  так |     5-10%    |     5-10%     |від 10 Па до  |NFT 20- |
|Статичний      |           |      |              |               |  5           |048(5)  |
|метод          |           |      |              |               |10  Па(2)     |        |
|---------------+-----------+------+--------------+---------------+--------------+--------|
|1.4.3.         |    так    |  так |     5-10%    |     5-10%     |      2       |ASTM-D  |
|Ізотенископ    |           |      |              |               |від 10  Па до |2879-86 |
|               |           |      |              |               |  5           |        |
|               |           |      |              |               |10  Па        |        |
|---------------+-----------+------+--------------+---------------+--------------+--------|
|1.4.4.         |    так    |  так |     5-20%    |     5-50%     |      -3      |NFT 20- |
|Ефузіометричний|           |      |              |               |від 10   Па до|047(6)  |
|метод:         |           |      |              |               |1 Па          |        |
|Вирівнювання   |           |      |              |               |              |        |
|тиску пари     |           |      |              |               |              |        |
|---------------+-----------+------+--------------+---------------+--------------+--------|
|1.4.5.         |    так    |  так |    10-30%    |       -       |      -3      |    -   |
|Ефузіометричний|           |      |              |               |від 10   Па до|        |
|метод: Через   |           |      |              |               |1 Па          |        |
|зменшення ваги |           |      |              |               |              |        |
|або вловлювання|           |      |              |               |              |        |
|випаруваної    |           |      |              |               |              |        |
|речовини       |           |      |              |               |              |        |
|---------------+-----------+------+--------------+---------------+--------------+--------|
|1.4.6. Метод   |    так    |  так |    10-30%    |     До 50%    |      -4      |    -   |
|газонасичення  |           |      |              |               |від 10   Па до|        |
|               |           |      |              |               |1 Па(2)       |        |
|---------------+-----------+------+--------------+---------------+--------------+--------|
|1.4.7.         |    так    |  так |    10-20%    |       -       |      -4      |    -   |
|Оборотний ротор|           |      |              |               |від 10   Па до|        |
|               |           |      |              |               |0,5 Па        |        |
-------------------------------------------------------------------------------------------

----------------

(1) В залежності від ступеня чистоти.

(2) Ці методи можуть також використовуватися в межах діапазону від 1 до 10 Па, за умов дотримання безпеки.

1.6. ОПИС МЕТОДІВ

1.6.1. Динамічне вимірювання

1.6.1.1. Прилад

Прилад для вимірювання зазвичай складається з реактора, сполученого з камерою охолодження, що виготовлена зі скла або металу (мал. 1), обладнання для вимірювання температури і обладнання для регуляції та вимірювання тиску. Типовий прилад для вимірювання, показаний на малюнку, виготовляється з жаростійкого скла та складається з п'яти частин:

Широка труба частково з подвійними стінками складається з пришліфованого з'єднання з кожухом, охолоджувача, охолоджувальної ємності та вхідного каналу.

Скляний циліндр, з насосом Котрела, вбудований у ту частину труби, де відбувається кипіння, та має шорстку поверхню з грануляту скла для уникнення сплесків при кипінні.

Температура вимірюється відповідним термодатчиком (наприклад, термометром опору, ізольованою термопарою), зануреним у прилад до точки вимірювання (N 5 на мал. 1) через відповідний отвір (наприклад, пришліфоване з'єднання з зовнішньою різьбою).

Виконуються необхідні сполучення з обладнанням для регуляції тиску та вимірювання.

Балон, що слугує для буферного об'єму, з'єднується з вимірювальним приладом з допомогою капілярної трубки.

Ємність для випарювання нагрівається нагрівальним елементом (наприклад, патронним нагрівачем), вмонтованим у скляний прилад знизу. Необхідний тепловий потік подається та регулюється через термопару.

2 5 Необхідний вакуум у межах між 10 Па та близько 10 Па забезпечується вакуумним насосом.

Відповідна установка використовується для вимірювання повітря або азоту з метою регуляції тиску (діапазон вимірювання становить 2 5

приблизно від 10  до 10  Па) та вентиляції.

Тиск вимірюється манометром.

1.6.1.2. Порядок проведення вимірювання

Пружність пари вимірюється шляхом визначення температури кипіння зразка за різних обумовлених показників тиску в діапазоні 3 5

приблизно  10   -  10   Па.  Стала температура за постійного тиску
вказує,  що  було  досягнуто  температури  кипіння.  Речовини,  що
піняться, не можуть вимірюватися з використанням цього методу.

Речовина поміщається в чистий сухий посуд для проведення дослідів. З не порошковими твердими речовинами може виникнути проблема, але іноді її можна вирішити нагріванням охолоджувального кожуха. Після наповнення ємності прилад запечатується на фланці і речовина вакуумується. Далі встановлюється найнижчий передбачений тиск і вмикається нагрівач. Водночас до самописця приєднується термодатчик.

Рівновага досягається, коли фіксується постійна температура кипіння при постійному тиску. Слід бути особливо обережним, щоб уникнути "сплесків" при кипінні. Крім того, в охолоджувачі має відбутися цілковита конденсація речовини. При визначенні пружності пари легкоплавких твердих речовин слід бути обережним для уникнення блокування конденсатора.

Після того, як була зафіксована точка рівноваги, встановлюється більш високий тиск. Процес продовжується таким 5

чином  до  досягнення  10    Па   (всього   близько   5-10   точок
вимірювання).   У   якості   контролю,   точки   рівноваги   мають
повторюватися при зростаючих показниках тиску.

1.6.2. Статичне вимірювання

1.6.2.1. Прилад

Прилад складається з контейнера для зразка, нагрівальну та охолоджувальну системи для регулювання температури зразка, а також вимірювання температури. Прилад також включає інструменти для встановлення та вимірювання тиску. На малюнках 2a та 2b проілюстровані основні принципи, що застосовуються.

Камера для зразка (мал. 2а) розмежована з одного боку відповідним високовакуумним клапаном. U-подібна трубка з належною манометричною рідиною приєднана з іншого боку. Один кінець U-подібної трубки відгалужується до вакуумного насоса, циліндра з азотом або вентиляційного клапана, та до манометра.

Замість U-подібної трубки може бути використано вимірювач тиску разом з індикатором тиску (мал. 2b).

З метою регуляції температури зразка посуд для зразка разом з клапаном та U-подібною трубкою або вимірювачем тиску поміщається в ванну, у якій витримується постійна температура з точністю +- 0,2 К. Заміри температури проводяться на зовнішній стінці ємності зі зразком або безпосередньо у цій ємності.

Вакуумний насос з вловлювачем висхідного потоку охолодження використовується для вакуумування приладу.

У методі 2а пружність пари речовини вимірюється опосередковано з використанням нульового індикатора. В цьому випадку враховується той факт, що густина рідини в U-подібній трубці змінюється при суттєвій зміні температури.

Наступні рідини підходять для використання в якості нульових індикаторів для U-подібної трубки в залежності від діапазону показників тиску та хімічних характеристик тестової речовини: кремнійорганічні рідини, фталати. Тестова речовина не повинна бути схильна до суттєвого розчинення в рідині U-подібної трубки або вступати з нею в реакцію.

Для манометра може бути використана ртуть у діапазоні 2

показників   нормального   тиску   повітря  до  10   Па,  тоді  як
кремнійорганічні рідини та фталати  можуть  використовуватися  при
                   2
показниках  від  10   Па і нижче до 10 Па.  Манометри з мембраною,
стійкою  до  нагрівання,  можуть  використовуватися   навіть   при
                   -1
показниках нижче 10   Па. Є також інші вимірювачі тиску, що можуть
                                   2
використовуватися в умовах нижче 10  Па.

1.6.2.2. Порядок проведення вимірювання

Перед вимірюванням всі компоненти приладу, зображеного на мал. 2, мають бути ретельно вимиті та висушені.

Для методу 2а наповніть U-подібну трубку обраною рідиною, що має бути вакуумована при підвищеній температурі перед зніманням показників.

Тестова речовина поміщається в прилад, який потім закривається і температура знижується на рівень, достатній для вакуумування. Температура має бути достатньо низькою для забезпечення того, щоб повітря було висмоктане, але - у випадку багатокомпонентної системи - вона не повинна змінювати склад матеріалу. За необхідності рівновага може бути встановлена швидше помішуванням.

Зразок може бути надмірно охолодженим, наприклад, рідким азотом (слід вжити заходів для уникнення конденсації повітря або робочої рідини насоса) або сумішшю етанолу та сухого льоду. Для низькотемпературних вимірювань використовуйте ванну з регулятором температури, з'єднану з ультракріостатом.

Клапаном над відкритим посудом для зразка протягом кількох хвилин здійснюється вакуум-відсмоктування для видалення повітря. Після цього клапан закривається і температура зразка знижується до найнижчого передбаченого рівня. За необхідності операція з вакуумування має бути повторена кілька разів.

При нагріванні зразка пружність пари зростає. Це змінює рівновагу рідини в U-подібній трубці. Для корекції цього в прилад через клапан подається азот або повітря до тих пір, доки рідина індикатора тиску не повернеться на нульову відмітку. Тиск, що вимагається для цього, може зчитуватися з високоточного манометра при кімнатній температурі. Цей тиск відповідає пружності пари речовини за такої окремої температури вимірювання.

Метод 2b є подібним, проте пружність пари зчитується безпосередньо.

Температурна залежність пружності пари визначається за належних невеликих інтервалів (всього близько 5-10 точок вимірювання) до передбаченого максимуму. Низькотемпературні показники мають повторюватися для контролю.

Якщо показники, отримані від повторюваних зчитувань, не співпадають з кривою, отриманою для зростаючої температури, це може бути наслідком одного з наступних випадків:

1. зразок все ще містить повітря (наприклад, високов'язкі матеріали) або речовини, що закипають при низьких температурах, які вивільняються протягом нагрівання і можуть бути видалені висмоктуванням з подальшим переохолодженням;

2. температура охолодження недостатньо низька. В цьому випадку рідкий азот використовується в якості охолоджувальної речовини.

Якщо причиною є 1-ий або 2-ий випадок, вимірювання мають бути повторені.

3. речовина зазнає хімічної реакції у досліджуваному температурному діапазоні (наприклад, розпаду, полімеризації).

1.6.3. Ізотенископ

Повну характеристику цього методу можна знайти в посиланні 7. принцип вимірювального приладу показаний на мал. 3. Подібно до статичного методу, описаного в підпункті 1.6.2, ізотенископ підходить для дослідження твердих речовин або рідин.

У випадку з рідинами речовина сама слугує робочою рідиною у допоміжному манометрі. Кількість рідини, достатня для наповнення балона та короткого плеча секції манометра, вводиться в ізотенископ. Ізотенископ приєднується до вакуумної системи і з нього відкачується повітря, потім наповнюється азотом. Відкачування повітря та очистка системи повторюється двічі для видалення залишків кисню. Наповнений ізотенископ розміщується горизонтально таким чином, щоб зразок розтікався тонким шаром у балоні для зразка та секції манометра (U-подібній частині). Тиск системи знижується до 133 Па і зразок повільно нагрівається до тих пір доки закипить (видалення розкладених постійних газів). Далі ізотенископ розміщується таким чином, щоб зразок повернувся до балону та короткого плеча манометра, щоб обидва були повністю заповнені рідиною. Тиск утримується на такому рівні, який передбачається для вакуумування; витягнутий кінець балона для зразка нагрівається на малому вогні до того часу, доки вивільнена пара зразка розширюється достатньо, щоб змістити частину зразка з верхньої частини балона та плеча манометра в секцію манометра в ізотенископі, створивши таким чином простір, наповнений парою та вільний від азоту.

Потім ізотенископ поміщається в ванну з постійною температурою, а тиск азоту регулюється таким чином, щоб він дорівнював тиску зразка. Рівноважний тиск вказується манометричною секцією ізотенископа. При рівновазі пружність пари азоту дорівнює пружності пари речовини.

У випадку з твердими речовинами, в залежності від діапазону тиску та температур, використовуються манометричні рідини, перераховані в підпункті 1.6.2.1. Вакуумована робоча рідина манометра додається в опуклу частину довгого плеча ізотенископа. Далі тверда речовина, що має бути досліджена, поміщається в балон і вакуумується при підвищеній температурі. Після цього ізотенископ нахиляється таким чином, щоб робоча рідина манометра могла витікати в U-подібну трубку. Вимірювання пружності пари як функції температури проводиться відповідно до пункту 1.6.2.

1.6.4. Ефузіометричний метод: Вирівнювання тиску пари

1.6.4.1. Прилад

Різноманітні варіанти приладу описані в літературі (1). Прилад, описаний тут, ілюструє загальний принцип виконання (мал. 4). На малюнку 4 зображено основні компоненти приладу, включаючи контейнер з високовакуумної нержавіючої сталі або скла, обладнання для створення та вимірювання вакууму, а також вбудовані компоненти для вимірювання пружності пари на терезах. До приладу включено наступні вбудовані компоненти:

- Термокамера для випаровування з отвором, що обертається. Термокамера для випаровування розроблена у формі циліндричної ємності, виготовленої, наприклад, з міді або хімічно стійкого сплаву з високою теплопровідністю. Може також застосовуватися скляна ємність з мідною стінкою.

- Термокамера має діаметр близько 3-5 см та при цьому 2-5 см висотою. В ній передбачено від одного до трьох отворів різного розміру для потоку пари. Термокамера нагрівається з допомогою спіралі розжарення, що розташовується навколо камери ззовні. Для запобігання розсіюванню тепла на опорну плиту нагрівач приєднується до опорної плити металом з низькою теплопровідністю (нейзильбер або хромонікелева сталь), наприклад, труба з нейзильберу приєднується до отвору, що обертається, якщо використовується термокамера з кількома отворами. Таке обладнання має перевагу в тому, що дозволяє використання мідної перемички. Це дозволяє охолодження ззовні шляхом застосування ванни для охолодження,

- якщо мідна кришка термокамери має три отвори різних діаметрів під кутом 90 град. один до одного, в межах загального діапазону вимірювання можуть бути задіяні різні діапазони пружності пари (отвори діаметром між близько 0,30 та 4,50 мм). Широкі отвори використовуються для низької пружності пари і навпаки. Шляхом обертання термокамери може встановлюватися бажаний отвір або проміжна позиція для потоку пари (отвір термокамери - запобіжний екран - шалька терезів), при цьому потік молекул вивільняється або проходить через отвір термокамери у шальку терезів. З метою вимірювання температури речовини у відповідному місці розміщується термопара або термометр опору,

- над захисним екраном знаходиться шалька високочутливих терезів (див. нижче). Шалька терезів має діаметр близько 30 мм. Гарним матеріалом для неї є позолочений алюміній,

- шалька терезів оточена циліндричним патроном або мідною охолоджувальною камерою. Залежно від типу терезів вона має отвори для балансира та отвір захисного екрана для потоку молекул, при цьому вона має забезпечувати повну конденсацію пари на шальці терезів. Розсіювання тепла ззовні забезпечується, наприклад, мідною перемичкою, з'єднаною з охолоджувальною камерою. Перемичка проходить через опорну плиту та теплоізольована від неї, наприклад, трубкою з хромонікелевої сталі. Перемичка занурюється в ємність Дюара з рідким азотом під опорною плитою або рідкий азот циркулює через перемичку. При цьому охолоджувальна камера утримується при температурі близько - 120 град.С. Шалька терезів охолоджується окремо шляхом опромінення на рівні, достатньому для діапазону показників пружності, що досліджується (охолодження близько 1 години до початку вимірювання),

- терези розташовуються над охолоджувальною камерою. Такі терези можуть бути високочутливими 2-плечними електронними мікротерезами (8) або високочутливим магнітоелектричним вимірювальним приладом (див. Рекомендацію ОЕСР з тестування 104, видання від 12.05.1981 р.),

- опорна плита також передбачає електричні з'єднувачі для термопар (або термометрів опору) та нагрівального приладу,

- вакуум створюється в посуді з допомогою низьковакуумного або високовакуумного насоса (рівень вакууму, що вимагається, -3

становить  близько  1  -2  ·  10    Па та отримується після 2 год.
Роботи насоса). Тиск регулюється відповідним іонним манометром.

1.6.4.2. Порядок проведення вимірювання

Посуд наповнюється тестовою речовиною і закривається кришка. Захисний екран і охолоджувальна камера переміщуються в термокамеру. Прилад закривається і вмикаються вакуумні насоси. Остаточний тиск перед початком вимірювань має становити близько -4

10   Па. Охолодження   охолоджувальної  камери   починається   при
  -2
10   Па.

Після того, як було отримано необхідний рівень вакууму, починайте серію калібрування за найнижчої з передбачених температури. Встановлюється відповідний отвір у кришці, потік пари проходить через захисний екран безпосередньо над отвором і потрапляє в охолоджену шальку терезів. Шалька терезів має біти достатньо великою, щоб забезпечити потрапляння до неї цілого потоку, проведеного через захисний екран. Імпульс потоку пари діє на шальку терезів і молекули конденсуються на її охолодженій поверхні.

Імпульс та одночасна конденсація продукують сигнал на самописець. Оцінка сигналів надає два типи інформації:

1. в описаному приладі пружність пари визначається безпосередньо з імпульсу на шальці терезів (для цього немає необхідності знати молекулярну масу (2)). При оцінці показників мають братися до уваги такі геометричні фактори, як, наприклад, кришка термокамери та кут молекулярного потоку;

2. одночасно з цим може бути виміряна маса конденсату та звідси розрахована інтенсивність випаровування. Пружність пари може також бути розрахована з інтенсивності випаровування та молекулярної маси з допомогою рівняння Герца (2).

---------------
                             |             3
                             | 2 пі RT · 10
                     p = G _ |--------------
                            \|      M

де:

-1 -2 G = інтенсивність випаровування (кг·с ·м )

-1 M = молярна маса (г·моль )

T = температура (К)

-1 -1 R = універсальна молярна газова константа (Дж·моль ·К )

p = пружність пари (Па)

Після того, як було досягнуто необхідного рівня вакууму, серія вимірювань починається за найнижчої передбаченої температури вимірювання.

При подальших вимірюваннях температура підвищується невеликими інтервалами до досягнення максимального передбаченого температурного показника. Далі зразок знову охолоджується і може фіксуватися друга крива пружності пари. Якщо під час другого заходу результати першого вимірювання не підтверджуються, це може бути свідченням того, що при встановленому температурному діапазоні речовина розкладається.

1.6.5. Ефузіометричний метод - через зменшення ваги

1.6.5.1. Прилад

Ефузійний прилад складається з наступних основних деталей:

- камера, що може бути термостатична та вакуумована і в якій розміщуються ефузійні елементи,

- високовакуумний насос (наприклад, дифузійний або турбомолекулярний насос) з вакуумметром,

- вловлювач, у якому застосовується розріджений азот або сухий лід.

Алюмінієва вакуумна камера з електрообігрівачем та з чотирма ефузійними елементами з нержавіючої сталі показана на мал. 5 для зразка. Покриття з нержавіючої сталі товщиною близько 0,3 мм має ефузійний отвір діаметром 0,2-1,0 мм і приєднується до ефузійного елемента кришкою з різьбою.

1.6.5.2. Порядок проведення вимірювання

Еталонна та тестова речовини поміщаються в кожен з ефузійних елементів, металева мембрана з виходом фіксується кришкою з різьбою, кожен з елементів зважується з точністю до 0,1 мг. Елемент поміщається в термостатний прилад, який далі вакуумується до показника нижче одної десятої очікуваного тиску. За визначені інтервали часу у діапазоні від 5 до 30 годин в прилад пропускається повітря, при цьому переважуванням визначається зниження маси ефузійного елемента.

З метою убезпечення результатів від впливу летучих домішок елемент зважується у встановлені проміжки часу для перевірки того, чи є сталою інтенсивність випаровування протягом щонайменше двох таких проміжків часу.

Пружність пари р в ефузійному елементі визначається за формулою:

----------
                            m     | 2 пі RT
                      p = ----- _ | --------
                           KA    \|     M
                             t

де:

p = пружність пари (Па)

m = маса речовини, що залишає елемент за час t (кг)

t = час (с)

A = площа отвору (кв.м)

K = коефіцієнт корекції

-1 -1 R = універсальна молярна газова константа (Дж·моль ·К )

T = температура (К)

-1 M = молекулярна маса (г·моль )

Коефіцієнт корекції К залежить від відношення довжини до радіуса циліндричного виходу:

------------------------------------------------------------------
|відношення    |0,1      |0,2      |0,6      |1,0      |2,0      |
|--------------+---------+---------+---------+---------+---------|
|К             |0,952    |0,909    |0,771    |0,672    |0,514    |
------------------------------------------------------------------

Вищенаведене рівняння можна записати наступним чином:

------
                               m    |  T
                        p = E --- _ | ---
                               t   \|  M

1   _ --------
     де E = ----  \| 2 пі R і є константою ефузійного елемента.
             KA

Ця константа ефузійного елемента Е може бути вирахувана з еталонними речовинами (2,9) за наступним рівнянням:

------
                            p(r)t    | M(r)
                       E = ------- _ | ---
                              m     \|  T

де:

p(r) = пружність пари еталонної речовини (Па)

-1 M(r) = молекулярна маса еталонної речовини (кг·моль )

1.6.6. Метод газонасичення

1.6.6.1. Прилад

Типовий прилад для проведення цього тестування включає ряд компонентів, наведених на мал. 6а, і описується нижче (1).

Інертний газ:

Газ-носій не повинен вступати в хімічну реакцію з тестовою речовиною. Для цієї мети зазвичай достатньо азоту, але іноді може вимагатися використання інших газів (10). Використовуваний газ має бути сухим (див. мал. 6а, позначення 4 - датчик відносної вологості).

Контроль потоку:

Для забезпечення постійного та обраного потоку через колону насичення необхідна відповідна система контролю газу.

Вловлювачі для збирання пари:

Вони залежать від особливих характеристик зразка та обраного методу аналізу. Пара має вловлюватися порціями та в такій формі, яка б дозволяла подальший аналіз. Для деяких тестових речовин можуть застосовуватися рідини-вловлювачі, наприклад, гексан або етиленгліколь. Для інших можна використовувати абсорбенти у твердій формі.

У якості альтернативи вловлюванню пари та подальшому аналізу, для визначення кількості матеріалу, транспортованого відомою кількістю газу-носія, можуть застосовуватися лінійні методи аналізу, наприклад, хроматографія. Крім того, може бути виміряне зниження маси зразка.

Теплообмінник:

Для вимірювань при різних температурах може бути необхідно включити в систему теплообмінник.

Колона насичення:

Тестова речовина переноситься з розчину на відповідний інертний носій. Покритий таким чином носій поміщається в колону насичення, розміри якої та інтенсивність потоку мають бути такими, щоб забезпечувалося цілковите насичення газу-носія. Колона насичення має бути термостатована. Для вимірювань при температурі вищій, ніж кімнатна, має нагріватися площина між колоною насичення та вловлювачами для запобігання конденсації тестової речовини.

З метою зниження перенесення матеріалу, що відбувається через дифузію, після колони насичення у систему може бути поміщена капілярна трубка (мал. 6b).

1.6.6.2. Порядок проведення вимірювання

Підготовка колони насичення:

Розчин тестової речовини у легколетучому розчиннику додається до відповідної кількості носія. Слід додати достатню кількість тестової речовини для підтримки належного рівня насичення протягом всього тестування. Розчинник повністю випаровується в повітрі або в роторному випаровувачі і ретельно перемішаний матеріал додається в колону насичення. Після термостатування зразка через апарат пропускається сухий азот.

Вимірювання:

Вловлювачі або лінійний детектор приєднуються до вихідної лінії колони і фіксується час. Інтенсивність потоку перевіряється на початку та через рівні проміжки часу протягом експерименту з допомогою вимірювача потоку бульбашок (або послідовно з вимірювачем втрати маси).

Має вимірюватися тиск на виході до насичуючого апарату. Це може бути зроблено або:

(a) включенням вимірювача тиску між насичуючим апаратом та вловлювачами (цього може бути недостатньо, оскільки таким чином збільшується мертва зона та абсорбуюча поверхня); або

(b) вимірюванням перепадів тиску в особливій системі вловлювання, що використовуються як функція інтенсивності потоку в окремо взятому експерименті (цей спосіб може не спрацювати у випадку з рідинами-вловлювачами).

Час, що вимагається на збір такої кількості речовини, що необхідна для різних методів аналізу, визначається попереднім тестуванням або шляхом оцінювання. У якості альтернативи збору речовини для подальшого аналізу може застосовуватися лінійний кількісний метод аналізу (наприклад, хроматографія). Перед проведенням розрахунку пружності пари за обумовленої температури мають бути проведенні попередні тестування для визначення максимальної інтенсивності потоку, за якої відбудеться цілковите насичення газу-носія парою речовини. Це відбувається, якщо газ-носій пропускається через насичуючий апарат достатньо повільно таким чином, щоб ще менша інтенсивність не давала більш високого показника пружності пари при розрахунках.

Вибір методу аналізу обумовлюється характеристиками речовини, що має бути протестована (наприклад, газова хроматографія або гравіметрія).

Визначається кількість речовини, що переноситься відомим об'ємом газу-носія.

1.6.6.3. Розрахунок пружності пари

Пружність пари розраховується з густини пари, W/V, за такою формулою:

W     RT
               p = --- x ----
                    V     M

де:

p = пружність пари (Па)

W = маса випаруваної тестової речовини (г)

V = об'єм насиченого газу (куб.м)

-1 -1 R = універсальна молярна газова константа (Дж·моль ·К )

T = температура (К)

-1 M = молярна маса тестової речовини (г·моль )

Виміряні об'єми мають бути скориговані для різниць показників тиску і температури між вимірювачем витрат матеріалу та термостатичним насичуючим апаратом. Якщо вимірювач витрати матеріалу розміщений за вловлювачем пари, може бути необхідне коригування з метою врахування всіх складових випаруваного вловлювача (1).

1.6.7. Оборотний ротор (8, 11, 13)

1.6.7.1. Прилад

Методика обладнання оборотного ротора може бути виконана з використанням в'язкісного манометра ротора, як це показано на мал. 8. Схема експериментальної установки зображена на мал. 7.

Вимірювальний прилад зазвичай складається з вимірювальної головки ротора, розміщеної в термостатичній камері (регульованій з точністю до 0,1 град.С). Контейнер зі зразком розміщується в термостатичній камері (з температурою, відрегульованою до 0,01 град.С), а всі інші деталі обладнання піддаються дії високої температури для уникнення конденсації. До системи через високовакуумні клапани приєднується високовакуумний насос.

Вимірювальна головка оборотного ротора складається з металевої кулі (діаметром 4-5 мм) у трубці. Куля підвішена та тримається у магнітному полі, при цьому зазвичай використовується комбінація постійних магнітів та регулюючих кілець.

Куля обертається завдяки магнітним полям, що формуються кільцями. Приймаючі кільця, визначаючи завжди присутній слабкий магнітний момент кулі, дозволяють вимірювати інтенсивність її обертання.

1.6.7.2. Порядок проведення вимірювання

Після того, як куля досягає заданої швидкості обертання v(о) (зазвичай близько 400 обертів за секунду), подальше приведення в дію припиняється і відбувається сповільнення завдяки тертю газу.

Спад швидкості  обертання  вимірюється   як   функція   часу.
Оскільки тертя, спричинене магнітним підвісом, несуттєве порівняно
з тертям газу, тиск газу р визначається за наступною формулою:
                           _
                        пі c r ро       v(t)
                    p = --------- · ln ------

сигма 10t v(o)

де:

c = середня швидкість молекул газу

r = радіус кулі

ро = масова густина кулі

сигма = коефіцієнт переносу тангенціального імпульсу (епсилон = 1 для ідеальної сферичної поверхні кулі)

t = час

v(t) = швидкість обертання після часу t

v(o) = початкова швидкість обертання

Це рівняння можна записати наступним чином:

_        t  - t
                     пі c r ро    n    n-1
                 p = --------- · ---------
                     10 сигма    t  · t
                                  n    n-1

де t , t - це показники часу, що вимагаються для заданої n n-1

кількості N  оборотів.  Ці  часові  інтервали  t   та  t     йдуть
                                                n       n-1
послідовно один за одним, при цьому t  > t   .
                                     n    n-1

Середня швидкість молекули газу визначається за наступною формулою:

1/2
                           _     8RT
                           c = (-----)
                                 пі M

де:

T = температура

R = універсальна молярна газова константа

M = молярна маса

2. ДАНІ

Пружність пари у будь-якому з вищеописаних методів має визначатися щонайменше для двох температур. Бажано, щоб було три або більше в діапазоні від 0 до 50 град.С, з метою перевірки лінійності кривої пружності пари.

3. ЗВІТНІСТЬ

Звіт про результати дослідження, по можливості, має включати наступну інформацію:

- використана методика,

- точна специфікація речовини (особливості та домішки) та попередні заходи очищення, якщо такі були,

- щонайменше два показники пружності пари та температури, бажано в діапазоні від 0 до 50 град.С,

- всі вихідні дані,

- log p від кривої 1/Т,

- розрахунок пружності пари при 20 або 25 град.С.

Якщо спостерігається трансформація (зміна стану, розпад), слід вказати наступну інформацію:

- характер зміни,

- температура, за якої відбувається зміна при атмосферному тиску,

- пружність пари при 10 і 20 град.С нижче температури трансформації та при 10 і 20 град.С вище цієї температури (крім випадку, якщо відбувається перехід з твердого стану у газоподібний).

4. ПОСИЛАННЯ

(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 104, Decision of the Council С(81) 30 final.

(2) Ambrose, D. in B. Le Neindre, B.Vodar, (Eds.): Experimental Thermodynamics, Butterworths, London, 1975, vol. II.

(3) R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Chapter IX, Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I.

(4) Knudsen, M.Ann.Phys. Lpz., 1909, vol. 29, 1979; 1911, vol. 34, p. 593.

(5) NF T 20-048 AFNOR (September 85) Chemical products for industrial use - Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10-1 to 105 Pa - Static method.

(6) NF T 20-047 AFNOR (September 85) Chemical products for industrial use - Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10-3 to 1 Pa - Vapour pressure balance method.

(7) ASTM D 2879-86, Standard test method for vapour pressure-temperature relationship and initial decomposition temperature of liquids by isoteniscope.

(8) G.Messer, P.Rohl, G.Grosse and W.Jitschin. J.Vac.Sci. Technol.(A), 1987, 'Vol. 5 (4), p. 2440.

(9) Ambrose, D.; Lawrenson, I.J.; Sprake, C.H.S.J.Chem. Thermodynamics 1975, vol. 7, p. 1173.

(10) B.F.Rordorf. Thermochimica Acta, 1985, vol. 85, p. 435.

(11) G.Comsa, J.K.Fremerey and B.Lindenau. J.Vac.Sci. Technol. , 1980, vol. 17 (2), p. 642.

(12) G.Reich. J.Vac.Sci. Technol., 1982, vol. 20 (4), p. 1148.

(13) J.K.Fremerey. J.Vac.Sci. Technol.(A), 1985, vol. 3 (3), p. 1715.

Додаток 1

Метод оцінки

ВСТУП

Розраховані показники пружності пари можуть використовуватися:

- для вирішення того, який із експериментальних методів підходить,

- для надання оціночної або граничної величини у випадках, коли експериментальний метод не може бути застосований з технічних причин (включаючи випадок, коли пружність пари дуже низька)

- щоб допомогти визначити випадки, коли випущення вимірювання експериментальним шляхом є виправданим внаслідок того, що -5

пружність пари,  швидше за все,  становить < 10   Па при кімнатній
температурі.

МЕТОД ОЦІНКИ

Пружність пари рідин та твердих речовин може оцінюватися шляхом застосування модифікованої кореляції Уотсона (а). Єдиним показником, отриманим експериментально, є точка кипіння за нормальних умов. Метод застосовується у діапазоні показників 5 -5

пружності від 10  Па до 10   Па.

Детальна інформація про метод наведена в "Посібнику з методів оцінки хімічних властивостей" (b).

ПОРЯДОК ПРОВЕДЕННЯ РОЗРАХУНКІВ

Відповідно до (b) пружність пари розраховується наступним чином:

T  m
                                      (3 - 2 ---)
                    Дельта H                  T
                            vb                 b               T  m-1     T
 ln P   приблизно = ------------ (1 - ------------ - 2m(3 - 2 ---)    ln ---)
     vp             Дельта Z RT            T                   T          T
                            b  b          ----                  b          b
                                           T
                                            b

де:

Т = температура, що становить інтерес

Т = точка кипіння за нормальних умов

P = пружність пари при температурі Т

Дельта H = теплота пароутворення vb

Дельта Z = коефіцієнт стиснення (на рівні 0,97) b

m = емпіричний коефіцієнт в залежності від фізичного стану при температурі, що становить інтерес

звідси:

Дельта H vb

----------- = K (8,75 + R ln T )
                     T          F              b
                      b

де K є емпіричним коефіцієнтом, що враховує полярність F

речовини.  Для деяких типів сполук коефіцієнти K   перераховані  в
                                                F
посиланні (b).

Досить часто є доступними дані, у яких наводиться точка кипіння при приведеному тиску. У такому випадку, відповідно до (b), пружність пари розраховується наступним чином:

Дельта Hv T 1 T 1 T m-1 T

ln P   приблизно = ln P  + ------------- (1 - (3 - 2 ---) m --- - 2m (3 - 2 ---)    ln ---)
     vp                 1   Дельта Z  RT               T      T               T          T
                                    b   1               1                      1          1

де Т  є точкою кипіння при приведеному тиску Р .
         1                                         1

ЗВІТНІСТЬ

У випадку застосування методу оцінки звіт має включати повну документацію стосовно проведення розрахунків.

ЛІТЕРАТУРА

(a) K.M.Watson, Ind.Eng.Chem., 1943, vol. 35, p. 398.

(b) W.J.Lyman, W.F.Reehl, D.H.Rosenblatt. Handbook of Chemical Property Estimation Methods, Mc Graw-Hill, 1982.

Додаток 2

Малюнок 1

Прилад для визначення кривої пружності пари за динамічним методом ( 994_b14 )

Малюнок 2а

Прилад для визначення кривої пружності пари за статичним методом (з використанням манометра з U-подібною трубкою) ( 994_b14 )

Малюнок 2b

Прилад для визначення кривої пружності пари за статичним методом (з використанням індикатора тиску) ( 994_b14 )

Малюнок 3

Ізотенископ (див. посилання 7) ( 994_b14 )

Малюнок 4

Прилад для визначення кривої пружності пари за методом вирівнювання тиску пари ( 994_b14 )

Малюнок 5

Приклад апарату для випаровування при низькому тиску за ефузіометричним методом з об'ємом ефузійного елементу у 8 куб.см ( 994_b14 )

Малюнок 6а

Приклад системи регулювання потоку для визначення пружності пари за методом газонасичення ( 994_b14 )

Малюнок 6b

Приклад системи для визначення пружності пари за методом газонасичення, у якій капілярна трубка розміщена після камери насичення ( 994_b14 )

Малюнок 7

Приклад експериментальної установки для методу оборотного ротора ( 994_b14 )

Малюнок 8

Приклад вимірювальної головки оборотного ротора ( 994_b14 )

А.5. ПОВЕРХНЕВЕ НАТЯГНЕННЯ

1. МЕТОДИКА

Описані методи ґрунтуються на Рекомендаціях ОЕСР з тестування (1). Основні принципи наведені в посиланні (2).

1.1. ВСТУП

Описані методи мають застосовуватися для вимірювання поверхневого натягнення водних розчинів.

Перед проведенням тестування доцільно мати попередню інформацію про розчинність у воді, структуру, характеристики гідролізу та критичну концентрацію для міцелоутворення речовини.

Наступні методи застосовуються до більшості хімічних речовин, без будь-яких обмежень стосовно ступеня їх чистоти.

Вимірювання поверхневого натягнення з використанням кільцевого тензіометра обмежується водними розчинами з динамічною в'язкістю, що становить менше, ніж близько 200 мПа·с.

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ ТА ОДИНИЦІ

Ентальпія відкритої поверхні на одиницю площі поверхні називається поверхневим натягненням.

Поверхневе натягнення приймається в:

Н/м (одиниця системи CI) або

мН/м (підодиниця системи CI)

1 Н/м = 103 дин/см

1 мН/м = 1 дин/см в застарілій системі одиниць СГС

1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ

Деякі калібрувальні речовини, що включають широкий діапазон видів поверхневого натягнення, перераховані в посиланнях 1 та 3.

1.4. ПРИНЦИП ЗАСТОСУВАННЯ МЕТОДІВ

Методи ґрунтуються на вимірюванні максимального зусилля, яке має бути прикладене у вертикальній площині до підвісу або кільця, що знаходиться у контакті з поверхнею досліджуваної рідини, поміщеної в мірний посуд, з метою відділення його від поверхні рідини, або до пластини, край якої контактує з поверхнею, з метою витягування плівки, що утворилася.

Речовини, що розчиняються в воді щонайменше при концентрації 1 мг/л, тестуються у водному розчині з разовою концентрацією.

1.5. КРИТЕРІЇ ЯКОСТІ

Ці методи можуть давати більш точні результати, ніж це необхідно для оцінки впливу на навколишнє середовище.

1.6. ОПИС МЕТОДИК

Розчин речовини готується у дистильованій воді. Концентрація цього розчину має становити 90% від максимально можливої розчинності речовини у воді; якщо концентрація перевищує 1 г/л, для тестування використовується концентрація у розмірі 1 г/л. Речовини, що мають розчинність нижчу, ніж 1 мг/л, немає необхідності піддавати тестуванню.

1.6.1. Метод пластинок

Див. ISO 304 та НФ Т 73-060 (Поверхнево-активні компоненти - визначення поверхневого натягнення шляхом витягування плівки рідини).

1.6.2. Метод підвісу

1.6.3. Метод кільця

1.6.4. Метод кільця, погоджений ОЕСР

1.6.4.1. Прилад

Для цього вимірювання підходять тенсіометри, доступні в продажу. Вони складаються з наступних елементів:

- переносний стіл для зразка,

- система вимірювання сили,

- вимірний елемент (кільце),

- посуд для проведення вимірів.

1.6.4.1.1. Переносний стіл для зразка

Переносний стіл для зразка використовується як штатив для посуду з можливістю температурного контролю, в якому проводиться дослідження рідини. Що має бути піддана тестуванню. Він монтується на стенді разом з системою вимірювання сили.

1.6.4.1.2. Система вимірювання сили

Система вимірювання сили (див. малюнок) розміщується над столом для зразка. Похибка у вимірюванні сили не повинна -6

перевищувати +-  10    Н,  що  відповідає можливій похибці в межах
+- 0,1  мг  в  вимірюванні  маси.  У  більшості   випадків   шкали
вимірювання тенсіометрів,  що знаходяться в продажу, калібровані в
мН/м таким чином,  щоб поверхневе натягнення могло бути  прочитано
безпосередньо в мН/м з точністю до 0,1 мН/м.

1.6.4.1.3. Вимірний елемент (кільце)

Кільце зазвичай виготовляється з платиново-іридієвого дроту близько 0,4 мм товщиною та з середньою окружністю 60 мм. Кільце з дроту підвішується горизонтально з металевого гвинта та каркаса з дроту, що слугує для з'єднання з системою вимірювання сили (див. малюнок).

Малюнок

Вимірний елемент ( 994_b14 )

1.6.4.1.4. Посуд для проведення вимірів

Посуд для проведення вимірів, в якому утримується розчин для тестування, що має бути виміряний, - це скляний посуд з можливістю контролю температури. Він виготовлений таким чином, щоб під час проведення вимірів температура розчину рідини, що тестується, а також газова фаза над його поверхнею залишалися сталими та щоб зразок не міг випаруватися. Допускається циліндричний скляний посуд з внутрішнім діаметром не менше 45 мм.

1.6.4.2. Підготовка приладу

1.6.4.2.1. Очищення

Скляний посуд має бути чисто вимитий. За необхідності його можна вимити гарячою хромо-сульфатною кислотою, а потім густою фосфорною кислотою (83-98% ваги Н РО ), ретельно прополоскати в 3 4

проточній   воді   та  наостанок  промити  в  дистиляті  подвійної
перегонки,  доки не буде  отримано  нейтральну  реакцію,  а  потім
просушити або сполоснути рідиною зі зразка, що має вимірюватися.

Кільце спочатку має бути ретельно промите у воді для видалення будь-яких речовин, що можуть бути розчинними у воді, ненадовго опущене в хром-сульфатну кислоту, промите в дистиляті подвійної перегонки, доки не буде отримано нейтральну реакцію, а наостанок нагріте короткочасним утриманням над полум'ям від метанолу.

Примітка:

Забруднення речовинами, які не розчиняються та не руйнуються під впливом хром-сульфатної кислоти, наприклад, кремнійорганічні сполуки, видаляються за допомогою відповідних органічних розчинників.

1.6.4.2.2. Калібрування приладу

Атестування приладу складається з перевірки нульової точки та налаштування її таким чином, щоб показники інструменту дозволяли отримати достовірне визначення в мН/м.

Монтаж:

Прилад урівноважується, наприклад, спиртовим рівнем в основі тензіометра, шляхом регулювання установочних гвинтів в основі.

Налаштування нульової точки

Після при ладнання кільця до приладу та перед зануренням у рідину необхідно налаштувати показник тензіометра на нуль та перевірити кільце на розташування його паралельно до поверхні рідини. Для цієї цілі поверхня рідини може бути використана в якості дзеркала.

Калібрування:

Калібрування для даного тесту може бути виконане однією з двох наступних процедур:

(а) З використанням маси: шляхом використання гир відомої маси між 0,1 та 1,0 г, що розміщуються на кільці. Коефіцієнт калібрування Ф , на який мають множитися всі показники а

інструмента, визначається за наступним рівнянням (1).

сигма
                                     r
                           Ф  = ------
                            а   сигма
                                     a

де:

mg
                       сигма  = ---- (мН/м)
                            r    2b

m = маса гирі (г)

-2 g = гравітаційне прискорення (981 см·с на рівні моря)

b = середня окружність кільця (см)

сигма = показник тензіометра після поміщення гирі в кільце a

(мН/м).

(b) З використанням води: шляхом використання чистої води, поверхневе натягнення якої, наприклад, при 23 град.С дорівнює 72,3 мН/м. Ця процедура виконується швидше, ніж калібрування за масою, але завжди є ризик, що показник поверхневого натягнення води буде викривлений внаслідок слідів забруднення поверхнево-активними речовинами.

Коефіцієнт калібрування Ф , на який мають множитися всі b

показники інструмента, визначається за наступним рівнянням (2):

сигма
                                     0
                           Ф  = ------
                            b   сигма
                                     g

де:

сигма = офіційно встановлений показник поверхневого 0

натягнення води (мН/м)

сигма = виміряний показник поверхневого натягнення води g

(мН/м), при цьому обидва визначаються за однакової температури.

1.6.4.3. Підготовка зразків

Водні розчини готуються з речовин, що мають проходити тестування, з застосуванням належних концентрацій у воді, та при цьому не містити будь-яких нерозчинних речовин.

Розчин має підтримуватися при сталій температурі (+- 0,5 град.С). Оскільки поверхневе натягнення розчину в посуді для вимірювання з часом змінюється, у різний час має бути проведено кілька вимірів та побудовано криву, що б відображала поверхневе натягнення як функцію часу. Якщо більше не відбувається змін, це означає, що досягнуто стану рівноваги.

Пилове та газове забруднення іншими речовинами заважає вимірам. Тому робота проводиться під захисним покриттям.

1.6.5. Умови тестування

Вимірювання проводиться при температурі близько 20 град.С та має утримуватися в межах відхилення +- 0,5 град.С.

1.6.6. Проведення тестування

Розчини для вимірювання переливаються в ретельно вимитий посуд для вимірювання, при цьому необхідно слідкувати, щоб не було піни, а потім посуд з розчином поміщається стіл тестового приладу. Дека стола з посудом для вимірювання піднімається до тих пір, доки кільце не зануриться в розчин, що тестується. Далі дека стола поступово рівномірно опускається (зі швидкістю близько 0,5 см/хв.) для відриву кільця від поверхні, доки не буде досягнуто максимальної сили. Шар рідини, що тягнеться за кільцем, не повинен відділятися від кільця. Після завершення вимірів, кільце знову занурюється в розчин і виміри проводяться повторно до тих пір, доки не буде досягнуто сталого показника поверхневого натягнення. Для кожного такого визначення має вказуватися час від моменту переливання розчину в посуд для дослідів. Показники беруться для максимальної сили, що вимагається для відривання кільця від поверхні рідини.

2. ДАНІ

Для того, щоб вирахувати поверхневе натягнення, значення отриманого на приладі показника у мН/м, перш за все, має бути помножене на фактор калібрування Ф або Ф (в залежності від а b

процедури калібрування,  що застосовується). Це дасть показник, що
має лише приблизне значення та потребує внесення поправок.

Гаркінс та Джордан (4) емпірично визначили коефіцієнти поправки для значень поверхневого натягнення, виміряних методом кільця, що залежать від розміру кільця, густини рідини та її поверхневого натягнення.

Оскільки визначення коефіцієнтів поправки для кожного окремого виміру з таблиць Гаркінса-Джордана є досить трудомістким, з метою розрахунку поверхневого натягнення для водних розчинів може застосовуватися спрощена процедура зчитування показників поверхневого натягнення безпосередньо з таблиці. (Для даних, що знаходяться в діапазоні між показниками таблиці, застосовується інтерполяція).

Таблиця:

Поправка виміряного поверхневого натягнення

Лише для водних розчинів, с = 1 г/куб.см

------------------------------------------------------------------
|r              |= 9,55 мм (середній радіус кільця)              |
|---------------+------------------------------------------------|
|r              |= 0,185 мм (радіус дроту кільця)                |
------------------------------------------------------------------

------------------------------------------------------------------
|  Значення, отримане |        Значення з поправкою (мН/м)       |
|   при експерименті  |------------------------------------------|
|        (мН/м)       |Калібрування за вагою|  Калібрування за   |
|                     | (див. 1.6.4.2.2(а)) |    водою (див.     |
|                     |                     |   1.6.4.2.2(b))    |
|---------------------+---------------------+--------------------|
|          20         |        16,9         |        18,1        |
|          22         |        18,7         |        20,1        |
|          24         |        20,6         |        22,1        |
|          26         |        22,4         |        24,1        |
|          28         |        24,3         |        26,1        |
|          30         |        26,2         |        28,1        |
|          32         |        28,1         |        30,1        |
|          34         |        29,9         |        32,1        |
|          36         |        31,8         |        34,1        |
|          38         |        33,7         |        36,1        |
|          40         |        35,6         |        38,2        |
|          42         |        37,6         |        40,3        |
|          44         |        39,5         |        42,3        |
|          46         |        41,4         |        44,4        |
|          48         |        43,4         |        46,5        |
|          50         |        45,3         |        48,6        |
|          52         |        47,3         |        50,7        |
|          54         |        49,3         |        52,8        |
|          56         |        51,2         |        54,9        |
|          58         |        53,2         |        57,0        |
|          60         |        55,2         |        59,1        |
|          62         |        57,2         |        61,3        |
|          64         |        59,2         |        63,4        |
|          66         |        61,2         |        65,5        |
|          68         |        63,2         |        67,7        |
|          70         |        65,2         |        69,9        |
|          72         |        67,2         |        72,0        |
|          74         |        69,2         |          -         |
|          76         |        71,2         |          -         |
|          78         |        73,2         |          -         |
------------------------------------------------------------------

Ця таблиця була складена на базі поправок Гаркінса-Джордана. Вона подібна до таблиці Стандартів від Німецького інституту стандартів (DIN 53914) для води та водних розчинів (густина с = 1 г/куб.см, при цьому застосовується для доступних у продажу кілець з розмірами R = 9,55 мм (середній радіус кільця) та r = 0,185 мм (радіус дроту кільця). В таблиці наведено поправки для значень поверхневого натягнення, виміряних після калібрування з допомогою гир або за водою.

Як альтернативний варіант, можливий розрахунок поверхневого натягнення без попереднього калібрування за наступною формулою:

f + F
                         сигма = -------
                                  4 пі R

де:

F = сила, виміряна динамометром на точці розриву плівки

R = радіус кільця

f = коефіцієнт поправки (1)

3. ЗВІТНІСТЬ

3.1. ЗВІТ ПРО РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Звіт про результати дослідження, по можливості, має включати наступну інформацію:

- використана методика,

- тип застосованої води або розчину,

- точна специфікація речовини (особливості та домішки),

- результати вимірювання: поверхневе натягнення (показник), при цьому вказуються як індивідуальні показники, так і їхнє середньоарифметичне значення, а також скориговане середнє значення (з урахуванням похибки інструмента та таблиці поправок),

- концентрація розчину,

- температура тестування,

- вік використовуваного розчину; зокрема, час між приготуванням та проведенням вимірювання,

- опис часової залежності поверхневого натягнення після переливання розчину в посуд для вимірів,

- вся інформація та примітки, що стосуються пояснення результатів, мають бути відображені в звіті, особливо щодо домішок та фізичного стану речовини.

3.2. ПОЯСНЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

Прийнявши, що дистильована вода має поверхневе натягнення 72,75 мН/м при 20 град.С, речовини, поверхневе натягнення яких становить менше 60 мН/м, в умовах цього методу мають розглядатися як поверхнево-активні матеріали.

4. ПОСИЛАННЯ

(14) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 115, Decision of the Council С(81) 30 final.

(15) R.Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter XIV.

(16) Pure Appl. Chem., 1976, vol. 48, p. 511.

(17) Harkins, W.D., Jordan, H.F., J. Amer. Chem. Soc., 1930, vol. 52, p. 1751.

А.6. РОЗЧИННІСТЬ У ВОДІ

1. МЕТОДИКА

Описані методи ґрунтуються на Рекомендаціях ОЕСР з тестування (1).

1.1. ВСТУП

Перед проведенням тестування доцільно мати попередню інформацію про структурну формулу, пружність пари, константу дисоціації та характеристики гідролізу (як функцію рН) речовини.

Не існує єдиного методу, що був би ефективним для всіх видів розчинності у воді.

Два методи тестування, описані нижче, покривають всі види розчинності, але не застосовуються до летучих речовин:

- один застосовується до головним чином хімічно чистих -2

речовин з низьким ступенем розчинності (<  10    грама  на  літр),
стійких у воді, і має назву "метод елюювання",

- інший застосовується до головним чином хімічно чистих -2

речовин  з  вищим  ступенем  розчинності  (>  10   грама на літр),
стійких у воді, і має назву "метод колби".

На розчинність у воді речовини, призначеної для тестування, може серйозно впливати присутність домішок.

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ ТА ОДИНИЦІ

Розчинність речовини у воді визначається масовою концентрацією насичення речовини у воді при заданій температурі. Розчинність у воді наводиться в одиницях маси на об'єм розчину. Одиницею в системі CI є кг/куб.м (також можуть використовуватися грами на літр).

1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ

1.4. ПРИНЦИП ЗАСТОСУВАННЯ МЕТОДУ ТЕСТУВАННЯ

Приблизна кількість зразка та час, необхідний для досягнення масової концентрації насичення, має визначатися простим попереднім тестуванням.

1.4.1. Метод елюювання

Цей метод ґрунтується на елююванні речовини, що тестується, з водою з мікроколони, наповненої інертним допоміжним матеріалом, наприклад, скляними гранулами або піском, покритим надмірною кількістю речовини, що тестується. Розчинність у воді встановлюється, коли масова концентрація елюенту є сталою. Це підтверджується плато концентрації як функцією часу.

1.4.2. Метод колби

У цьому методі речовина (тверді тіла мають бути подрібнені) розчиняється у воді при температурі дещо вищій, ніж температура тестування. Після досягнення насичення суміш охолоджується та витримується в температурі тестування, при цьому її необхідно перемішати до досягнення однорідної маси. Як альтернативний варіант, вимірювання може проводитись безпосередньо при температурі тестування, якщо відповідною пробою буде забезпечено досягнення однорідності насичення. Внаслідок цього масова концентрація речовини у водному розчині, що не повинен містити жодних нерозчинних часток, визначається належним аналітичним методом.

1.5. КРИТЕРІЇ ЯКОСТІ

1.5.1. Повторюваність

Для методу елюювання може  отримуватися  <  30%;  для  методу
колби має бути витримано < 15%.

1.5.2. Чутливість

Це залежить від методу аналізу, але масові концентрації, -6

нижчі за 10   г/л, можуть бути визначені.

1.6. ОПИС МЕТОДИКИ

1.6.1. Умови тестування

Бажано проводити тестування при температурі 20 +- 0,5 град.С. Якщо є підозра, що температура залежить від розчинності (> 3% на град.С), мають також застосовуватися два інші температурні показники щонайменше на 10 град.С вище та нижче первинно встановленої температури. У цьому випадку температурний контроль має бути в межах +- 0,1 град.С. Обрана температура має постійно підтримуватися в усіх відповідних деталях обладнання.

1.6.2. Попереднє тестування

До близько 0,1 г зразка (тверді речовини мають бути подрібнені) у мірному циліндрі на 10 мл з притертою пробкою додається дистильована вода в об'ємах, що поступово збільшуються, при кімнатній температурі відповідно до етапів, наведених у таблиці нижче:

------------------------------------------------------------------
|   0,1 г   |  0,1  |  0,5  |   1   |   2   |  10   |  100 |> 100|
| розчинний |       |       |       |       |       |      |     |
|    y'x'   |       |       |       |       |       |      |     |
|  мл води  |       |       |       |       |       |      |     |
|-----------+-------+-------+-------+-------+-------+------+-----|
|Приблизна  |> 1 000|1 000- |200-100|100-50 | 50-10 | 10-1 | < 1 |
|розчинність|       |200    |       |       |       |      |     |
|(грами на  |       |       |       |       |       |      |     |
|літр)      |       |       |       |       |       |      |     |
------------------------------------------------------------------

Після кожного додавання вказаної кількості води суміш енергійно збовтується протягом 10 хвилин і візуально перевіряється на присутність будь-яких нерозчинених часток зразка. Якщо після додавання 10 мл води зразок або його частки залишаються нерозчиненими, експеримент має бути повторено у мірному циліндрі на 100 мл з більшими об'ємами води. При нижчому рівні розчинності час, що вимагається на розчинення речовини, може бути суттєво довшим (має дозволятися принаймні 24 години). Приблизний рівень розчинності наведений у таблиці під показниками об'єму доданої води, у якій відбувається повне розчинення зразка. Якщо речовина залишається очевидно нерозчиненою, може бути дозволено більше 24 годин (максимально 96 годин) або застосовується подальше розбавлення з метою отримання свідчення того, чи має застосовуватися для розчинення метод елюювання або метод колби.

1.6.3. Метод елюювання

1.6.3.1. Допоміжний матеріал, розчинник та елюент

Допоміжний матеріал для методу елюювання має бути інертним. Прикладом матеріалів, які можуть бути використані, є скляні гранули та пісок. Для застосування тестової речовини на допоміжному матеріалі має застосовуватися відповідний летучий розчинник з якістю аналітичного реагенту. У якості елюенту застосовується вода, що двічі переганялася у скляному чи кварцовому апараті.

Примітка:

Не повинна використовуватися вода безпосередньо з органічного іонообмінного фільтра.

1.6.3.2. Завантаження допоміжного матеріалу

Близько 600 мг допоміжного матеріалу зважується та переміщується в колбу з круглим дном на 50 мл.

Відповідна зважена кількість тестової речовини розчиняється в обраному розчиннику. Належна кількість цього розчину додається до допоміжного матеріалу. Розчинник має бути повністю випаруваний, наприклад, у роторному випарнику; інакше насичення допоміжного матеріалу водою не буде досягнуто внаслідок ефекту розмежування на поверхні допоміжного матеріалу.

Завантаження допоміжного матеріалу може спричинити проблеми (помилкові результати), якщо тестова речовина осідає у вигляді олії чи в іншій фазі кристалізації. Ця проблема має бути експериментально досліджена, про що складається звіт.

Дозволяється, щоб завантажений допоміжний матеріал замочувався протягом двох годин приблизно в 5 мл води, а потім ця суспензія додається в мікроколону. Як варіант, сухий завантажений допоміжний матеріал може засипатися в мікроколону, що перед цим наповнюється водою, після чого залишається в такому стані близько двох годин.

Порядок тестування:

Відділення речовини від допоміжного матеріалу може проводитися одним із двох різних способів:

- рециркуляційний насос (див. малюнок 1),

- рівноважний посуд (див. малюнок 4).

1.6.3.3. Метод елюювання з рециркуляційним насосом

Прилад

Схема розміщення типової системи представлена на мал. 1. Відповідна мікроколона показана на мал. 2, хоча прийнятним є будь-який розмір за умови, що він відповідає критеріям відтворюваності та чутливості. В колоні має бути місце для щонайменше п'яти об'ємів шарів води, при цьому вона має бути здатна утримувати мінімум п'ять зразків. Як варіант, розмір може бути зменшено, якщо замість первинних п'яти об'ємів шарів, використовується розчинник, очищений від домішок.

Колона має бути приєднана до рециркуляційного насоса, здатного контролювати потоки об'ємом близько 25 мл/год. Насос приєднаний політетрафторетиленовими (ПТФЕ) та/або скляними з'єднувальними патрубками. Колона та насос, з'єднуючись, повинні мати резерв для відбору відходів та забезпечення у вільному місці атмосферного тиску. Матеріал колони супроводжується невеликою (5 мм) пробкою зі скловати, що одночасно слугує для фільтрування часток. Рециркуляційний насос може бути, наприклад, шланговим або мембранним (необхідно слідкувати за тим, щоб не трапилося забруднення та/або абсорбції матеріалу труби).

Порядок проведення вимірів

Через колону запускається потік. Рекомендується використовувати потік об'ємом 25 мл/год. (такий об'єм відповідає проходженню 10 об'ємів шарів за годину для описаної колони). Перші п'ять об'ємів шарів (мінімум) відкидаються з метою видалення розчинних у воді домішок. Після цього рециркуляційний насос працює до тих пір, доки не буде досягнуто рівноваги, визначеної за п'ятьма зразками, концентрація яких не відрізняється більш ніж на +- 30% у випадковій послідовності. Ці зразки мають бути відділені один від одного часовими проміжками, що відповідають проходженню щонайменше 10 об'ємів шарів елюенту.

1.6.3.4. Метод елюювання з рівноважним посудом

Прилад (див. малюнки 4 та 3)

Рівноважний посуд: з'єднання з рівноважним посудом здійснюється через використання скляного шліфу, приєднаного політетрафторетиленовими з'єднувальним патрубком. Рекомендується використовувати потік об'ємом близько 25 мл/год. Відділені частки мають бути зібрані та проаналізовані за обраним методом.

Порядок проведення вимірів

Ці частки, зібрані з елюату середнього рівня, де концентрація постійна (+- 30%) щонайменше у п'яти послідовних відборах, використовуються для визначення розчинності у воді.

В обох випадках (з використанням рециркуляційного насосу або рівноважного посуду) має бути проведено другий пробіг експерименту з вдвічі меншим об'ємом потоку, ніж у першому. Якщо результати обох пробігів співпадають, тестування задовільне; якщо спостерігається очевидно вища розчинність при нижчому об'ємі потоку, у цьому випадку зменшення об'єму потоку вдвічі має продовжуватися до того часу, коли два пробіги підряд покажуть однакову розчинність.

В обох випадках (з використанням рециркуляційного насосу або рівноважного посуду) частки мають бути перевірені на наявність колоїдних речовин шляхом дослідження їх на ефект Тиндалла (розсіювання світла). Присутність таких часток робить результати недійсними і тестування має проводитися повторно з більш високим рівнем фільтрування речовин колони.

Має фіксуватися водневий показник кожного зразка. Другий замір має проводитися при такій самій температурі.

1.6.4. Метод колби

1.6.4.1. Прилад

Для тестування за методом колби необхідні наступні матеріали:

- стандартний лабораторний набір скляного посуду та інструментів,

- пристрій для перемішування розчинів при контрольованих сталих температурах,

- центрифуга (бажано з термостатом), якщо в ній є потреба для емульсій, та

- обладнання для визначення аналітичним шляхом.

1.6.4.2. Порядок проведення вимірів

Кількість матеріалу, необхідна для насичення бажаного об'єму води розраховується з попереднього тестування. Об'єм води, що вимагається, буде залежати від аналітичного методу та діапазону розчинності. Близько п'яти разів кількість матеріалу, як визначено вище, зважується в кожному з трьох видів скляного посуду зі скляними пробками (наприклад, пробірки центрифуг, колби). Обраний об'єм води додається до кожного з видів посуду і посуд щільно закривається пробками. Закритий посуд струшується при 30 град.С. (Має застосовуватися прилад для струшування або змішування, здатний працювати при постійній температурі, наприклад, магнітне змішування в регульованому водяному термостаті). Через день одна з посудин видаляється та залишається для відновлення рівноваги на 24 години при температурі тестування, при цьому час від часу струшуючись. Потім вміст посудини центрифугується при температурі тестування і шляхом відповідного аналітичного методу визначається концентрація тестової речовини у чистій водній фазі. З іншими двома колбами проводяться такі самі заходи після первинного врівноваження при 30 град.С протягом двох та трьох днів відповідно. Якщо показники концентрації принаймні з двох останніх посудин співпадають з відтворюваністю, що вимагається, в такому випадку тестування задовільне. Тестування має проводитися заново з наданням більш тривалого часу на врівноваження, якщо показники з посудин 1, 2 та 3 мають тенденцію до зростання.

Порядок проведення вимірів може також виконуватися без попередньої інкубації при 30 град.С. З метою оцінки показника досягнення рівноважного насичення зразки проходять тестування до того часу, доки час змішування перестане впливати на концентрацію тестової речовини.

Має фіксуватися водневий показник кожного зразка.

1.6.5. Аналіз

Для таких вимірів бажано застосовувати метод аналізу особливостей речовини, оскільки навіть малі частки розчинних домішок можуть спричинити серйозні відхилення у показниках розчинності. Прикладами таких методів є: газова або рідинна хроматографія, методи титрування, фотометричні методи, вольтамперометричні методи.

2. ДАНІ

2.1. МЕТОД ЕЛЮЮВАННЯ: ВИДАЛЕННЯ РЕЧОВИН З ХРОМАТОГРАФІЧНОЇ КОЛОНИ

Відповідно до допустимого відхилення по стандарту, для кожного циклу вираховується середній показник, щонайменше, з п'яти послідовних вибірок. Результати подаються в одиницях маси на об'єм розчину.

Показники отримані в результаті розрахунків з двох тестів, де використовувались різні потоки рідин, відповідно порівнюються так, щоб їх повторюваність була меншою 30%.

2.2. МЕТОД РОЗДІЛЕННЯ РІДИН ЗА ДОПОМОГОЮ КОЛБИ

Отримані необхідні результати по кожній з трьох колб слід вважати незмінними (повторюваність менше 15%) та усередненими. Одиниця вимірювання - маса на об'єм розчину. При потребі необхідно перевести одиниці маси в одиниці об'єму, використовуючи таку густину, коли розчинність дуже висока (> 100 грам/літр).

3. ПОВІДОМЛЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

3.1. МЕТОД ЕЛЮЮВАННЯ: ВИДАЛЕННЯ РЕЧОВИН З ХРОМАТОГРАФІЧНОЇ КОЛОНИ

Повідомлення результатів, якщо це можливо, має містити наступну інформацію:

- результати попереднього тесту,

- точна специфікація речовини (характерні особливості та домішки),

- індивідуальні концентрації, швидкість потоку/витрати рідини та рівень рН кожної вибірки,

- величини та допустимі відхилення по стандарту, щонайменше, п'яти вибірок стадії насиченості/поглинання з кожного циклу,

- середнє число двох наступних допустимих циклів,

- температура води під час процесу насиченості/поглинання,

- назва застосовуваного методу,

- структура застосовуваного допоміжного матеріалу,

- використання допоміжного матеріалу,

- застосовуваний розчинник,

- дані про хімічну нестабільність речовини протягом тестування та метод застосування,

- будь-яка інформація стосовно інтерпретації результатів, особливо щодо домішок та фізичного стану речовини.

3.2. МЕТОД РОЗДІЛЕННЯ РІДИН ЗА ДОПОМОГОЮ КОЛБИ

Повідомлення результатів, якщо це можливо, має містити наступну інформацію:

- результати попереднього тесту,

- точна специфікація речовини (характерні особливості та домішки),

- індивідуальні аналітичні підрахунки та середнє число (коли для кожної колби визначалось більше одної величини),

- рН кожної вибірки,

- середнє число величини по різних сумісних колбах,

- температура під час тестування,

- застосовуваний аналітичний метод,

- дані про хімічну нестабільність речовини протягом тестування та метод застосування,

4. ПОСИЛАННЯ

(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 105, Decision of the Council C(81) 30 final.

(2) NF T 20-045 (AFNOR) (September 85) Chemical products for industrial use - Determination of water solubility of solids and liquids with low solubility - Column elution method.

(3) NF T 20-046 (AFNOR) (September 85) Chemical products for industrial use - Determination of water solubility of solids and liquids with high solubility - Flask method.

Додаток

Малюнок 1

Метод елюювання: видалення речовин з хроматографічної колони з використанням рециркуляційного насосу ( 994_b14 )

Малюнок 2

Типова мікроколона ( 994_b14 )

Малюнок 3

Типова мікроколона ( 994_b14 )

Малюнок 4

Метод елюювання з використанням вирівнювальних посудин ( 994_b14 )

А.8. КОЕФІЦІЄНТ РОЗПОДІЛУ

1. МЕТОД

Описаний метод із використанням "струшування колби" проводиться із врахуванням Тестових Рекомендацій (1).

1.1. ВСТУП

Для проведення цього тесту необхідно мати попередню інформацію про структурну формулу, константу дисоціації, показник розчинності у воді, гідроліз, н-октанолову розчинність та поверхневий натяг субстанції.

Замірювання необхідно проводити лише на прикладі іонізованих речовин в їхній неіонізованій формі (вільна кислота або чиста основа), виготовлених зі спеціальної буферної суміші, яка має не менше однієї одиниці рН нижче (для вільної кислоти) або вище (для чистої основи) пек.

Цей метод тестування включає дві окремих процедури: метод струшування колби та хроматографію рідин високого тиску (ХРВТ). Перший метод застосовується при логарифмічному показнику P ow (визначення дивіться нижче) в межах від 2 до 4, і другий метод при показниках 0-6. До проведення одного з методів тестування, необхідно попередньо вирахувати коефіцієнт розподілу.

Метод струшування колби застосовується лише до речовин високої очистки, що розчиняються у воді та н-октанолі. Не можна застосовувати цей метод до поверхнево-активних матеріалів (для яких необхідні певні розрахунки щодо індивідуальних показників розчинності у воді та н-октанолі).

Метод ХРВТ не застосовується до кислот із високою концентрацією та основ, змішаних металів, поверхнево-активних матеріалів чи речовин, які реагують на елюенти. Для таких матеріалів необхідні певні розрахунки щодо індивідуальних показників розчинності у воді та н-октанолі.

Під час застосування методу тестування ХРВТ наявність домішок у суміші менш помітна, ніж у методі струшування колби. Проте, в деяких випадках через такі домішки може бути важко отримати правильні результати, оскільки максимальне розподілення є нечітким. Для сумішей з нечітким діапазоном встановлюють верхнє та нижнє обмеження показника Р.

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ ТА ОДИНИЦІ

Коефіцієнт розподілу визначається, як співвідношення рівноважних концентрацій (с ) розчиненої речовини в двофазній i

системі,  що  складається  з  двох  розчинників,  що   не   здатні
змішуватися між собою в достатній мірі. У випадку з н-октанолом та
водою коефіцієнт розподілу визначається так:

C
                                 n-октанол
                         P   = ----------
                          ow     C
                                  води

Таким чином, коефіцієнт розподілу (Р) є співвідношенням двох концентрацій та подається, як правило, у формі співвідношення логарифму до основи 10 (логарифм Р).

1.3. ЕТАЛОННА СУБСТАНЦІЯ

Метод струшування колби

Під час дослідження нової речовини непотрібно у всіх випадках використовувати еталонні субстанції. Вони час від часу служать для перевірки робочих характеристик методу та порівняння з результатами інших методів.

Метод ХРВТ

Для того, щоб порівняти отримані розрахункові дані ХРВТ суміші з її коефіцієнтом Р, необхідно встановити калібрувальну криву логарифму Р стосовно/відносно хроматографічних даних, із використанням не менше шести контрольних точок. Це необхідно для того, щоб користувач міг обрати відповідні еталонні субстанції. Якщо можливо, то необхідно, щоб хоча б одна із базових сумішей мала показник Р вище за показник тестованої речовини, а інший ow

показник    Р     нижче   показника   тестованої   речовини.   Для
             ow
логарифмічних показників Р,  які є менше 4, калібрування базується
на  перевірених  фактичних  показниках,  якщо  такі  не суперечать
розрахунковим даним. Для отримання точніших результатів, необхідно
підбирати такі базові суміші,  що за своєю структурою відповідають
тестованій речовині.

Детальний/докладний перелік величин логарифму Р для ow

багатьох  груп  хімічних речовин представлено в (2)(3).  Якщо дані
щодо коефіцієнтів розподілу  для  структурно  відповідних  сумішей
відсутні,  тоді  застосовують  більш  узагальнене  калібрування на
прикладі інших сумішей.

Список рекомендованих  еталонних  речовин  та  їх величин Р
                                                                ow
представлено у Додатку 2.

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ

1.4.1. Метод струшування колби

Для визначення коефіцієнту розподілу необхідно, щоб була досягнута рівновага між всіма взаємодіючими компонентами системи. Вивчення спеціалізованої літератури з даного питання показує, що можна використовувати кілька різних методів для вирішення цієї проблеми. Наприклад, застосовується метод ретельного змішування двох фаз з наступним їх розділенням, щоб визначити концентрацію рівноваги для тестованої речовини.

1.4.2. Метод ХРВТ

Метод ХРВТ здійснюється на прикладі аналітичних колонок, запакованих доступною в продажі твердою фазою, що має довгий вуглеводний ланцюг (наприклад, С , С ), хімічно зв'язаний в 8 18

двоокис  кремнію.  Хімічні  речовини,  введені  в  таку   колонку,
рухаються  по  ній із різною швидкістю,  оскільки градус розподілу
рухомої фази відрізняється від вуглеводної нерухомої фази.  Суміші
хімічних  речовин  елююються  в порядку їх гідрофобності так,  щоб
водорозчинні хімічні речовини елюювались першими,  а маслорозчинні
останніми,  у  відповідності до коефіцієнту  їх  водо-вуглеводного
розподілу.  Це дає можливість встановити відповідне співвідношення
між   часом  утримання  хроматографічної  речовини  такої  колонки
(зворотна  фаза)  та   коефіцієнтом   розподілу   н-октанолу/води.
Коефіцієнт розподілу  виводиться  з  коефіцієнту  навантаження, k,
який вираховується так:

t  - t
                                 r    o
                           k = --------
                                  t
                                   o

де, t = час утримання хроматографічної речовини сорбентом, а r

t  = середній час,  потрібний молекулі, щоб пройти  крізь  колонку
 o

(час простою).

Кількісно-аналітичні методи не є обов'язковими, а лише потрібно визначити часи елюювання.

1.5. КРИТЕРІЙ ЯКОСТІ

1.5.1. Повторюваність

Метод струшування колби

На підтвердження точності коефіцієнту розподілу потрібно провести подвійне визначення за трьох різних умов тестування, відповідно до яких може змінюватись кількість визначеної речовини та показник об'єму розчинення. Визначені величини вираженого коефіцієнту розподілу при десятинному логарифмі мають знаходитись в межах +- 0.3 логарифмічних одиниць.

Метод ХРВТ

Для більшої впевненості в розрахунках потрібно провести подвійні визначення. Величини логарифму Р, виведені з індивідуальних розрахунків, повинні бути в межах +- 0.1 логарифмічних одиниць.

1.5.2. Чуттєвість

Метод струшування колби

Діапазон вимірювань методу визначається за допомогою межі виявлення аналітичної процедури. Це дає можливість провести оцінювання величин логарифму Р в межах від 2 до 4 (інколи, якщо ow

цього  дозволяють  умови,  можна  розширити  межі Р   до 5),  коли
                                                   ow
концентрація розчиненої речовини у  будь-якій  фазі  не  перевищує
0.01 моль/літр.

Метод ХРВТ

Метод ХРВТ дає можливість визначити коефіцієнти розподілу логарифму Р в межах від 0 до 6. ow

Як правило, коефіцієнт розподілу суміші можна визначити до +- 1 логарифмічної одиниці показника струшування. Типові співвідношення можна знайти у літературі (4)(5)(6)(7)(8). Більшої точності можна досягти тоді, коли криві співвідношень базуються на структурному співвідношенні еталонних сумішей (9).

1.5.3. Специфіка

Метод струшування колби

Закон Нернста (Метод розподілу розчинної речовини) стосується лише розчинів, що розбавляються при сталій температурі, мають сталий тиск та рН. В обов'язковому порядку цей метод застосовують до чистої речовини, розсіяної між двома чистими розчинниками. Якщо в одній чи двох фазах одночасно є кілька різних розчинників, це може впливати на результати.

Дисоціація чи асоціація розчинених молекул призводить до відхилень від Закону Нернста. На факт таких відхилень вказує те, що коефіцієнт розподілу залежить від концентрації розчину.

Без корекції даний метод тестування не слід застосовувати до іонізованих сумішей через складну рівновагу. Щодо таких сумішей слід розглянути можливість використання буферних розчинів замість води; рН буферного розчину повинен становити 1 від рКа речовини, беручи до уваги відповідність цього рН до навколишнього середовища.

1.6. ОПИС МЕТОДУ

1.6.1. Попередня оцінка коефіцієнту розподілу

Бажано, щоб коефіцієнт розподілу визначався методом калькуляції (див. Додаток 1) або, якщо можливо, з показника розчинності тестованої речовини в чистих розчинниках (10).

1.6.2. Метод струшування колби

1.6.2.1. Підготовка

Н-Октанол: визначення коефіцієнту розподілу проводиться за допомогою хімічної речовини високої очистки.

Вода: необхідно використовувати дистильовану або двічі дистильовану воду в скляній, або кварцовій посудині. За необхідності, для іонізованих сумішей використовують буферні розчини замість води.

Примітка:

Не дозволяється використовувати воду з іонообмінного фільтру.

1.6.2.1.1. Стадія перед поглинанням/змішуванням розчинників

До моменту визначення коефіцієнту розподілу обидві фази системи розчинення слід піддати поглинанню/змішуванню методом струшування при температурі експерименту. Для цього в механічному шейкері протягом 24 годин струшують дві великих вихідних колби, що містять аналітичний н-октанол високої очистки або воду, кожна з них повинна мати достатню кількість іншого розчинника. Потім колби зупиняють і дають постояти протягом тривалого часу, щоб фази розділились до стану змішування/поглинання.

1.6.2.1.2. Підготовка до тесту

Тестова посудина заповнюється майже повністю цілим об'ємом двофазної системи. Це дає можливість запобігти втраті матеріалу через випаровування. Показник об'єму та кількості застосовуваної речовини фіксується таким чином:

- попередня оцінка коефіцієнту розподілу (як вказано вище),

- мінімальна кількість тестованої речовини, необхідної для аналітичного методу,

- обмеження максимальної концентрації в будь-якій фазі до 0.01 моль/літр.

Проводиться три тести. У першому тесті використовують розрахований коефіцієнт об'єму н-октанолу у воді; у другому цей коефіцієнт ділиться надвоє; та у третьому помножується на два (наприклад, 1:1, 1:2, 2:1).

1.6.2.1.3. Речовина для тестування

Основний розчин готують в н-октанолі, змішаному з водою. Концентрація такого основного розчину повинна бути точно визначена перед тим, як визначатимуть коефіцієнт розподілу. Розчин зберігають в умовах стійкості та стабільності.

1.6.2.1.3.1. Умови тестування

Температура під час проведення тесту повинна бути сталою (+- 1 град.С) - в межах 20-25 град.С.

1.6.2.3. Процедура вимірювання

1.6.2.3.1. Встановлення балансу розподілу

Для кожної з умов тестування необхідно приготувати дублікати тестових посудин, що містять необхідні, точно визначені об'єми двох розчинників разом із необхідною кількістю основної речовини.

Фази н-октанолу вимірюють відповідно до об'єму. Посудини для тесту поміщають у відповідний шейкер або струшують вручну. При використанні центрифугальної пробірки рекомендується обертати трубку швидко - 180 град. навколо своєї поперечної осі таким чином, щоб будь-яке затримане повітря піднімалось через дві фази. Досвід показує, що 50 таких обертів є достатнім для встановлення балансу розподілу. Для більшої впевненості рекомендується 100 обертів протягом 5 хвилин.

1.6.2.3.2. Розділення фаз

Якщо необхідно, для розділення фаз суміш центрифугують. Це роблять в лабораторній центрифузі при кімнатній температурі або, якщо використовують центрифугу з не кімнатною температурою, використовують центрифугальні пробірки, які для врівноваження тримають при температурі тестування протягом години до проведення аналізу.

1.6.2.4. Аналіз

Для визначення коефіцієнту розподілу необхідно визначити ступінь концентрації тестової речовини в обох фазах. Для цього беруть кратне кожної з фаз із кожної пробірки для кожної з умов тестування, а потім їх аналізують за допомогою одного з методів. Необхідно вирахувати та порівняти загальну кількість присутньої в обох фазах речовини з тією кількістю, яка задавалась на початковій стадії.

Вибірку водної фази проводять так, щоб мінімізувати ризик виявлення слідів н-октанолу: зробити вибірку води можна за допомогою скляного шприца зі змінною голкою. Перед цим шприц повинен бути частково заповнений повітрям, яке акуратно випускають, коли вводять голку у шар н-октанолу. Далі, певний об'єм водної фази набирають у шприц. Потім шприц швидко усувають з розчину, а голку знімають. Вміст шприца можна в подальшому використовувати в якості водної вибірки. Бажано, щоб концентрація двох розділених фаз визначалась методом специфікації речовини. Прикладами відповідних аналітичних методів можуть бути наступні:

- фонометричні методи,

- газова хроматографія,

- хроматографія високоякісної хімічної рідини.

1.6.3. Метод ХРВТ

1.6.3.1. Підготовка

Прилад

Необхідно мати рідинний хроматограф з прилаштованим до нього безімпульсним насосом та детектором. Рекомендується використовувати клапан для вприскування та трубки/кільця. Наявність полярних груп в стаціонарній фазі може досить послабити робочі характеристики колонки ХРВТ. Тому необхідно, щоб стаціонарні фази мали мінімальний відсоток полярних груп (11). Можна використовувати готові запаковані колонки або доступні для продажу пакування мікрочастинок зворотного чергування фаз. Захисна колонка може бути розміщена між системою вприскування та аналітичною колонкою.

Фаза руху

Високоякісні метанол та вода ХРВТ використовуються для приготування елюенту (розчиннику для вимивання), який перед використанням дегазують. Застосовується також ізократичне елюювання. Використовується пропорційне співвідношення метанол/вода, де вміст води становить 25%. Як правило, суміш води/метанолу в пропорції 3:1, або навпаки, є достатньою для елюювання сумішей з логарифмічним показником Р6 протягом години при швидкості потоку 1 мл/хвилину. Для сумішей з високим логарифмічним показником Р необхідно скоротити час елюювання (так само як і для базових сумішей) шляхом зменшення полярності фази руху чи довжини колонки.

Речовини з дуже низьким рівнем розчинності в н-октанолі мають тенденцію показувати надто низькі логарифмічні показники Р при ow

застосуванні  методу  ХРВТ;  іноді  максимальні  значення  сумішей
супроводжують  фронт  розчинника.  Це  відбувається  через те,  що
процес   розподілу    є    надто    повільним,    щоб    досягнути
рівноваги/балансу  протягом часу,  який витрачається на розділення
ХРВТ.  Тому, для того, щоб отримати достовірні значення, необхідно
зменшити швидкість потоку та/чи знизити коефіцієнт метанолу/води.

Під час фази руху базові суміші та суміші для тестування повинні розчинятись у концентраціях, достатніх для їх виявлення. Лише в окремих випадках дозволяється використовувати домішки із сумішшю води - метанолу, оскільки домішки мають здатність змінювати властивості колонки. Для хроматограм із домішками обов'язково використовувати окрему колонку того самого типу. У випадку, якщо не підходить суміш води - метанолу, можна використовувати інші органічні суміші, що розчиняються у воді (наприклад, етанол-вода чи ацетонітрил-вода).

Для іонізованих сумішей рН елюенту є критичним. Він має бути в межах робочого діапазону колонки, як правило, від 2 до 8. Рекомендується буферизація. Необхідно бути обережним, щоб не допустити осідання солі та пошкодження колонки, що трапляються у випадку з деякими органічними фазовими/буферними сумішами. Не рекомендується допускати розмірів ХРВТ, основаних на стаціонарній фазі з використанням двоокису вуглецю, що перевищують 8 рН, оскільки використання лужної, рухомої фази може спричинити швидке погіршення робочих характеристик колонки.

Розчини

Необхідні базові суміші найвищої очистки без домішок. Суміші, які використовуватимуть для тестування чи калібрування, розчиняють, якщо можливо, в рухомій фазі.

Умови тестування

Температура під час вимірювання не повинна змінюватись більше +- 2 K.

1.6.3.2. Вимірювання

Обчислення t - середнього часу, потрібного молекулі, щоб 0

пройти крізь колонку (час простою)

Середній час t визначається за допомогою гомологічного ряду 0

(наприклад, налкилометилокетонів) або нестриманих органічних сумішей (наприклад, тиосечовини чи формаміду). Для обчислення t 0 за допомогою гомологічного ряду необхідно ввести, щонайменше, сім елементів гомологічного ряду та визначити час утримання хроматографічної речовини сорбентом. Невідкорегований час утримання хроматографічної речовини сорбентом t (n + 1) r c

наноситься на графік, як функція t (n ), і визначаються відрізок а
                                  r   c
та дуга b рівняння регресії:

t         = a + b t
                      r(nc+ 1)          r(nc)

де n = кількість атомів вуглецю. Час простою тоді c

визначається так: t  = a/(1 - b)
                   0

Графік калібрування

Наступним кроком буде створення кореляційного графіку показника логарифму k у відношенні до логарифму р відповідних базових сумішей. На практиці відбувається наступне: набір 5-10 базових сумішей із логарифмічним показником р в межах очікуваних розрахунків вводиться одночасно, і визначається час утримання за допомогою записуючого інтегратора, з'єднаного з системою визначення. Відповідні логарифми коефіцієнтів завантаження, логарифму k, обчислюються та наносяться на графік, як функція логарифму р, що визначається методом струшування. Калібрування проводиться регулярними інтервалами, щонайменше, один раз на день і таким чином, щоб допускались можливі зміни в робочих характеристиках колонки.

Визначення коефіцієнту завантаження тестованої речовини

Тестована речовина вводиться в якомога меншій кількості рухомої фази. Визначається час утримання (в дублікаті), з можливістю обчислення коефіцієнту завантаження k. З кореляційного графіку базових сумішей, інтерполюється коефіцієнт розподілу тестованої речовини. Для дуже високих та дуже низьких коефіцієнтів розподілу необхідна екстраполяція. В подібних випадках для лінії регресії необхідно встановити рівні певності.

2. ДАНІ

Метод струшування колби

Достовірність визначених показників Р можна перевірити, шляхом порівняння дубльованих визначень із загальним значенням.

3. ПОВІДОМЛЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

Повідомлення результатів, якщо це можливо, повинно містити наступну інформацію:

- точна специфікація речовини (характерні особливості та домішки),

- коли не застосовують методи (наприклад, поверхнево-активний матеріал) потрібен обчислений показник або визначення розчинності у воді та н-октанолі,

Для методу струшування колби:

- результати попередньої оцінки, якщо такі є,

- температура при визначенні,

- дата аналітичних методів, застосовуваних при визначенні концентрацій,

- час та швидкість конфігурації, якщо такі застосовуються,

- виміряні концентрації в обох фазах для кожного визначення (це означає, що повідомлятимуться результати 12 концентрацій),

- вага тестованої речовини, об'єм кожної фази, використаної в кожній посудині для тестувань та загальна вирахувана кількість тестованої речовини, що залишається в кожній фазі після врівноваження/балансування,

- обчислені показники коефіцієнту розподілу (Р) та середній показник повідомляються по кожній серії умов тестування так само, як і середній показник всіх визначень. Якщо щось вказує на залежність від концентрації коефіцієнту розподілу, тоді це також повідомляється у звітуванні,

- середнє квадратичне відхилення величин Р.

- середнє значення Р всіх визначень також повинно виражатись як логарифм (база 10),

- обчислений теоретичний показник Р , якщо визначалась його ow 4

величина чи якщо виміряна величина є > 10 ,

- рН використаної води та водної фази під час експерименту,

- якщо використовують буферні розчини, надати інформацію про доцільність їх використання замість води; склад та рН буферних розчинів, рН водної фази до і після експерименту.

Для методу ХРВТ:

- результати попередньої оцінки, якщо такі є,

- базові речовини та речовини для тестування (без домішок),

- температурний режим визначень,

- рН при якому проводились визначення,

- деталі аналітичної та захисної колонки, фази руху та засоби виявлення,

- дані про утримання та фактичні показники логарифму Р базових сумішей, застосованих в калібруванні,

- деталі підібраної лінії регресії (відношення логарифму k до логарифму P),

- дані середнього утримання та інтерпольованої величини логарифмічного показника Р для тестованої суміші,

- опис обладнання та робочих умов,

- профілі елюювання,

- кількість тестованих та базових речовин, представлених в колонці,

- час простою та його визначення.

4. ПОСИЛАННЯ

(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 107, Decision of the Council C(81) 30 final.

(2) C.Hansch and A.J.Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979.

(3) Log P and Parameter Database, A tool for the quantitative prediction of bioactivity (C.Hansch, chairman, A.J.Leo, dir.) - Available from Pomona College Medical Chemistry Project 1982, Pomona College, Claremont, California 91711.

(4) L.Renberg, G.Sundstrom and K.Sundh-Nygard, Chemosphere, 1980, vol. 80, p. 683.

(5) H.Ellgehausen, C.D'Hondt and R.Fuerer, Pestic. Sci., 1981, vol. 12, p. 219.

(6) B.McDuffie, Chemosphere, 1981, vol. 10, p. 73.

(7) W.E.Hammers et al., J.Chromatogr., 1982, vol. 247, p. 1.

(8) J.E.Haky and A.M.Young, J.Liq. Chromat., 1984, vol. 7, p. 675.

(9) S.Fujisawa and E.Masuhara, J.Biomed. Mat. Res., 1981, vol. 15, p. 787.

(10) O.Jubermann, Verteilen und Extrahieren, in Methoden der Organischen Chemie (Houben Weyl), Allgemeine Laboratoriumpraxis (edited by E.Muller), Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1958, Band I/1, p. 223-339.

(11) R.F.Rekker and H.M.de Kort, Euro. J. Med. Chem., 1979, vol. 14, p. 479.

(12) A.Leo, C.Hansch and D.Elkins, Partition coefficients and their uses. Chem. Rev., 1971, vol. 71, p. 525.

(13) R.F.Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Elsevier, Amsterdam, 1977.

(14) NF T 20-043 AFNOR (1985). Chemical products for industrial use - Determination of partition coefficient - Flask shaking method.

(15) C.V.Eadsforth and P.Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, p. 1459.

(16) A.Leo, C.Hansch and D.Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, p. 525.

(17) C.Hansch, A.Leo, S.H.Unger, K.H.Kim, D.Nikaitani and E.J.Lien, J.Med.Chem., 1973, vol. 16, p. 1207.

(18) W.B.Neely, D.R.Branson and G.E.Blau, Environ. Sci. Technol., 1974, vol. 8, p. 1113.

(19) D.S.Brown and E.W.Flagg, J.Environ. Qual., 1981, vol. 10, p. 382.

(20) J.K.Seydel and K.J.Schaper, Chemische Struktur und biologische Aktivitat von Wirkstoffen, Verlag Chemie, Weinheim, New York, 1979.

(21) R.Franke, Theoretical Drug Design Methods, Elsevier, Amsterdam, 1984.

(22) Y.C.Martin, Quantitative Drug Design, Marcel Dekker, New York, Base1, 1978.

(23) N.S.Nirrlees, S.J.Noulton, C.T.Murphy, P.J.Taylor; J.Med.Chem., 1976, vol. 19, p. 615.

Додаток 1

Методи підрахунків та оцінки

ВСТУП

Загальні положення щодо методів підрахунку, даних та прикладів містяться в Довіднику Методів Оцінки Хімічних Властивостей (а).

Обчислені показники Р можна використати: ow

- для вирішення, який з експериментальних методів є відповідним (межі струшування колби: логарифм Р : від -2 до 4), ow

межі ХРВТ: логарифм Р  : від 0 до 6),
                     ow

- для вибору відповідних умов тестування (наприклад, базові речовини для методів ХРВТ, об'єм н-октанолу/води для методу струшування колби),

- в якості лабораторної внутрішньої перевірки з метою виявлення можливих експериментальних помилок,

- для забезпечення оцінки Р у випадках, коли ow

експериментальні методи не застосовуються через технічні причини.

МЕТОД ОЦІНКИ

Попередня оцінка коефіцієнту розподілу

Величина коефіцієнту розподілу визначається шляхом розчинення тестованої речовини в чистих розчинниках:

Для цього застосовують формулу:

змішування C
                                         n-октанол
               Р           = ----------------------
                визначення      змішування C
                                            води

МЕТОДИ РОЗРАХУНКУ

Основний принцип методів розрахунку

Всі методи розрахунку побудовані на формальній фрагментації молекули на відповідні підструктури, для яких відомі збільшення логарифму Р . Логарифм Р цілої молекули далі обчислюється, як ow ow

сума  її  фрагментальних  величин плюс сума поправкових членів для
внутрішньомолекулярної взаємодії.

Список фрагментарних констант та поправкових членів подано у пунктах (b)(c)(d)(e); деякі з них постійно оновлюються (b).

Критерій якості

Загалом, надійність методу розрахунків зменшується по мірі того, як збільшується складність самої тестованої суміші. У випадку, коли йдеться про молекули з низькою молекулярною вагою та одну-дві функціональні групи, допускається похибка в 0,1-0,3 одиниці логарифму Р між результатами різних фрагментарних ow

методів та виміряним показником. Якщо беруться складніші молекули,
тоді межа похибки може збільшуватись. Це залежатиме від надійності
та  доступності  фрагментальних  констант,  а  також від здатності
виявити інтрамолекулярні взаємодії (наприклад, вуглеводні зв'язки)
та  правильне  використання  поправкових  членів  (менше проблем з
програмним забезпеченням CLOGP-3) (b).  У випадку  з  іонізованими
сумішами важливо правильно підібрати заряд та ступінь іонізації.

Метод проведення розрахунків

пі-метод Ханша

Перша гідрофобна константа заміщення - пі, представлена Фуджірою та іншими (f) визначається так:

пі x = log P (PhX) - log P (PhH) ow ow

де P (PhX) - коефіцієнт розподілу ароматичної похідної і ow

P   (PhH) - коефіцієнт розподілу заміщу вальної суміші, наприклад:
 ow

(пі = log P (C H Cl) - log P (C H ) = 2,84 - 2,13 = 0,71). Cl ow 6 5 ow 6 6

Згідно визначення, пі-метод застосовується, головним чином, до ароматичних заміщень. Величини пі для великої кількості заміщувачів, подані у таблицях (b)(c)(d). Вони використовуються для обчислення логарифму P ароматичних молекул чи підструктур. ow

Метод Рекера

Згідно цього методу (g), показник логарифма P обчислюється ow

так:

log P   =  S a f  + S (періоди взаємодії)
                 ow    i  i i   j

S - знак суми

де f представляє різні константи молекулярних фрагментів та i

a  - частоту їх  випадків  в  досліджуваній  молекулі.  Поправкові
 i
члени  можуть  виражатися як інтегральна множинність однієї єдиної
константи  C   (так  званої  магічної   константи).   Фрагментарні
            m
константи   f    and   C    були   визначені   з  переліку  1  054
             i          m
експериментальних  значень  P    (825  складових),  використовуючи
                             ow
складовий  регресивний  аналіз  (c)(h).  Визначення умов взаємодії
здійснюється відповідно до низки  правил,  описаних  в  літературі
(e)(h)(i).

Метод Хенша-Лео

log P = S a f + S b F ow i i i j j j

S - знак суми

Де f представляє різні константи молекулярних фрагментів, i

F  - поправкові члени,  та a ,  b  - відповідні частоти  випадків.
 j                          i    j
Виведений з експериментальних величин P  ,  перелік елементарних і
                                       ow
групових фрагментарних величин та перелік  поправкових  членів  F
                                                                 j
(так званих   факторів)   визначались  методом  проб  та  помилок.
Поправкові члени впорядковуються в декілька різних класів  (а)(с).
Для того,  щоб врахувати всі правила та поправкові члени, потрібно
витратити багато часу,  оскільки це досить важко. Також розроблено
відповідне програмне забезпечення (b).

Комбінований метод

Обчислення логарифмічного показника P складних молекул ow

можна значно покращити,  якщо  молекула  розкладається  на  більші
підструктури,  для  яких  існують  чіткі показники P  ,  з таблиць
                                                    ow

(b)(c) або з власних розмірів. Такі фрагменти (наприклад, гетеро цикли, антраквінони, азобензоли) можна потім комбінувати з пі величинами Ханша або Рекера, або з констант фрагментарними константами Лео.

Примітки

(i) методи ведення розрахунків можна застосовувати до повністю або частково іонізованих сумішей тоді, коли можливо врахувати всі необхідні поплавкові коефіцієнти;

(ii) якщо допускаються інтрамолекулярні водневі зв'язки, тоді необхідно додати поправкові члени (приблизно, від + 0,6 до + 1,0 логарифма P ) (а). виявити наявність таких зв'язків можна зі ow

стерео моделей або спектроскопічних даних молекули;

(iii) якщо можливо використати таутомерні форми, тоді за основу розрахунку беруть найбільш вірогідні таутомерні форми.

(iv) уважно перевірити списки фрагментарних констант.

Повідомлення результатів

- опис субстанції (суміш, домішки і т.д.),

- вказати на можливі інтрамолекулярні водневі зв'язки, дисоціації, заряд та інші незвичні впливи (наприклад, таутомерія),

- опис методу розрахунків,

- ідентифікація або надання бази даних,

- особливості вибору фрагментів,

- повна документація розрахунків,

ЛІТЕРАТУРА

(a) W.J.Lyman, W.F.Reehl and D.H.Rosenblatt (ed.), Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill, New York, 1983.

(b) Pomona College, Medicinal Chemistry Project, Claremont, California 91711, USA, Log P Database and Med. Chem. Software (Program CLOGP-3).

(c) C.Hansch, A.J.Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979.

(d) A.Leo, C.Hansch, D.Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, p. 525.

(e) R.F.Rekker, H.M.de Kort, Eur.J.Med. Chem. -Chill. Ther. 1979, vol. 14, p. 479.

(f) T.Fujita, J.Iwasa and C.Hansch, J.Amer.Chem.Soc., 1964, vol. 86, p. 5175.

(g) R.F.Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry Library, Elsevier, New York, 1977, vol. 1.

(h) C.V.Eadsforth, P.Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, p. 1459.

(i) R.A.Scherrer, ACS, American Chemical Society, Washington D.C., 1984, Symposium Series 255, p. 225.

Додаток 2

Рекомендовані базові суміші для Методу ХРВТ

__________________________________________________________________
  N      Базова суміш               логарифм P         рКа
                                              ow
__________________________________________________________________
  1      2-бутанон                  0.3
  2      4-ацетилперідин            0.5
  3      анілін                     0.9
  4      ацетанілід                 1.0
  5      бензоловий спирт           1.1
  6      p-метоксифенол             1.3                рКа = 10.26
  7      феноло-оцтова кислота      1.4                рКа = 3.12
  8      фенол                      1.5                рКа =9.92
  9      2,4-динітрофенол           1.5                рКа =3.96
 10      бензонітрил                1.6
 11      фениоацетонітрил           1.6
 12      4-метилобензиловий спирт   1.6
 13      ацетофенон                 1.7
 14      2-нітрофенол               1.8                рКа = 7.17
 15      3-нітробензойна кислота    1.8                рКа = 3.47
 16      4-хлоранілін               1.8                рКа = 4.15
 17      нітробензол                1.9
 18      коричний спирт             1.9
 19      бензойна кислота           1.9                рКа = 4.19
 20      p-крезол                   1.9                рКа = 10.17
 21      корична кислота            2.1   рКа = 3.89 cis 4.44trans
 22      анізол                     2.1
 23      метилбензоат               2.1
 24      бензол                     2.1
 25      3-метилобензойна кислота   2.4                рКа = 4.27
 26      4-хлорофенол               2.4                рКа = 9.1
 27      трихлоретилен              2.4
 28      атразін                    2.6
 29      етилбензоат                2.6
 30      2,6-дихлорбензонітрил      2.6
 31      3-хлоробензойна кислота    2.7                рКа = 3.82
 32      толуол                     2.7
 33      1-нафтол                   2.7                рКа = 9.34
 34      2,3-дихлоранілін           2.8
 35      хлорбензол                 2.8
 36      алил-фенилетил             2.9
 37      бромобензол                3.0
 38      етилбензол                 3.2
 39      бензофенон                 3.2
 40      4-фенилфенол               3.2                рКа = 9.54
 41      тимол                      3.3
 42      1,4- дихлорбензол          3.4
 43      дифеніламін                3.4                рКа = 0.79
 44      нафталін                   3.6
 45      фенилбензоат               3.6
 46      ізопропилбензол            3.7
 47      2,4,6-трихлорфенол         3.7                рКа = 6
 48      біфеніл                    4.0
 49      бензилбензоат              4.0
 50      2,4-динітро -
         6 сек. бутилфенол          4.1
 51      1,2,4-трихлорбензол        4.2
 52      додекаїнова кислота        4.2
 53      дифенелен                  4.5
 54      н-бутилбензен              4.5
 55      фенатрен                   4.5
 56      флуорантен                 4.7
 57      дибензил                   4.8
 58      2,6-дифенилпередін         4.9
 59      трифениламін               5.7
 60      інсектицид                 6.2

Інші базові суміші з нижчим логарифмом Р
                                                    ow

1      нікотинова кислота      - 0.07

А.9. ВИЗНАЧЕННЯ ТЕМПЕРАТУРИ СПАЛАХУ

1. МЕТОД

1.1. ВСТУП

Доцільно отримати попередню інформацію щодо займистості речовини перед проведенням самого тесту. Процедура тестування стосується рідин, чиї пари можуть спалахувати від джерел займання. Наведені в даному тексті методи тестування достовірні лише для визначення меж температури спалаху, які в кожному методі мають індивідуальний характер.

Під час вибору методу тестування необхідно враховувати ймовірність виникнення хімічних реакцій між рідиною та тримачем зразка.

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ ТА ОДИНИЦІ

Температура спалаху - це температура, відкоригована до тиску в 101,325 кПа, при якій рідина випускає пари за умов, визначених методом тестування, і в тій кількості, в якій легкозаймиста суміш пари/повітря утворюється в посудині.

Одиниці виміру: град.С

t = T - 273,15

(t у град.C та T у K)

1.3. БАЗОВІ РЕЧОВИНИ

В процесі дослідження нової речовини непотрібно у всіх випадках застосовувати базові речовини. Вони повинні використовуватись для того, щоб можна було час від часу перевіряти робочі характеристики методу та порівнювати з результатами інших методів.

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ

Речовина розміщується в посудину для тестування та нагрівається чи охолоджується до температури, описаної в індивідуальному методі тестування. Пробні спалахування проводять для того, щоб вияснити чи спалахнув зразок при заданій тестовій температурі.

1.5. КРИТЕРІЙ ЯКОСТІ

1.5.1. Повторюваність

Повторюваність змінюється відповідно до межі точки спалахування в умовах застосованого методу тестування; максимум 2 град.С.

1.5.2. Чутливість

Чутливість залежатиме від виду тесту.

1.5.3. Специфіка

Специфіка деяких методів тестування обмежується певними межами точок спалахування, а також залежить від інших даних, що стосуються речовини (наприклад, висока в'язкість).

1.6. ОПИС МЕТОДУ

1.6.1. Підготовка

Зразок тестованої речовини поміщають у прилад для проведення тесту, відповідно до пунктів 1.6.3.1 та/чи 1.6.3.2.

З метою дотримання норм безпеки, рекомендується, щоб метод тестування, в якому використовується розмір зразка 2 куб.см, використовували для енергетичних або токсичних речовин.

1.6.2. Умови проведення тесту

Прилад, що застосовується для проведення тесту, повинен бути безпечним та розміщуватись подалі від тяги повітря.

1.6.3. Виконання тесту

1.6.3.1. Метод рівноважності/визначення балансу

Див. МОС 1516, МОС 3680, 1523, МОС 3679.

1.6.3.2. Метод нерівноважності

Прилад Абеля:

Див. BS 2000 частина 170, NF M07-011, NF T66-009.

Прилад Абеля-Пенські:

Див. ЄН 57, НІС (Німецький Інститут Стандартів) 51755 частина 1 (для температур від 5 до 65 град.C), НІС 51755 частина 2 (для температур нижче 5 град.C), NF M07-036.

Прилад Таг:

Див. ААВМ D 56.

Прилад Пенські-Мартенса:

Див. МОС 2719, ЄН 11, НІС 51758, ААВМ D 93, BS 2000-34, NF M07-019.

Примітки:

Якщо за допомогою методу нерівноважності (1.6.3.2) буде виявлено, що температура спалаху становить 0 +- 2 град.С, 21 +- 2 град.С або 55 +- 2 град.C, тоді це необхідно підтвердити методом рівноважності, використовуючи той самий прилад.

Повідомляти необхідно лише про ті методи, які дають змогу визначити температуру спалаху.

Для того, щоб визначити температуру спалаху в'язких рідин (фарби, смоли і т.д.), які містять розчинники, необхідно застосовувати лише відповідні методи та прилади.

Див. МОС 3679, МОС 3680, МОС 1523, НІС 53213 частина 1.

2. ДАНІ

3. ПОВІДОМЛЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

Повідомлення результатів має включати таку інформацію:

- точна специфікація речовини (характерні особливості та домішки),

- назва методу, що застосовувався, а також можливі відхилення,

- результати та будь-які додаткові примітки, що стосуються інтерпретації результатів.

4. ПОСИЛАННЯ

Немає.

А.10. ЗАЙМИСТІСТЬ (ТВЕРДІ РЕЧОВИНИ)

1. МЕТОД

1.1. ВСТУП

Перед проведенням тесту бажано мати попередню інформацію щодо можливих вибухових властивостей речовини.

Тест застосовується лише до порошкоподібних, гранульованих або пастоподібних речовин.

Для того, щоб не включати всі спалахуючі речовини, окрім тих, що швидко горять чи тих, чия горючість надто небезпечна, сильноспалахуючими слід вважати лише ті речовини, швидкість горіння яких перевищує певний обмежуючий показник.

Особливо небезпечно, якщо тепловий білий жар поширюватиметься крізь білий порошок, оскільки погасити вогонь може бути досить важко. Металеві порошки вважаються швидкозаймистими, якщо вони допускають поширення теплового жару через суміш протягом певного часу.

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ ТА ОДИНИЦІ ВИМІРЮВАННЯ

Час горіння виражається в секундах.

1.3. БАЗОВІ СУМІШІ

Не визначено.

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ

Речовина формується в герметично закритий рулон або вогняний ланцюг довжиною 250 мм. Далі проводиться попередній скрінінг - тест, щоб запалювання при запалюванні газовим полум'ям визначити чи горіння поширюватиметься завдяки цьому полум'ю або через тління. Якщо вогонь поширюється вогняним ланцюгом більше 200 мм протягом визначеного часу, тоді проводять повне тестування з метою визначення швидкості горіння.

1.5. КРИТЕРІЙ ЯКОСТІ

Не вказано.

1.6. ОПИС МЕТОДУ

1.6.1. Попередній скрінінг - тест

Речовина формується в герметично закритий рулон або вогняний ланцюг довжиною 250 мм, 20 мм шириною та висотою 10 мм, ставиться на опорну плиту, яка повинна бути вогнетривкою, непористою та мати низьку теплопровідність. Високотемпературний факел від газової горілки (мін. діаметр 5 мм) підводиться до одного кінця вогняного ланцюга поки він не загориться або максимум на 2 хвилини (5 хвилин - для металевих порошків або порошків з металу та інших домішок). Необхідно звернути увагу на те, чи поширюватиметься горіння на всі 200 мм ланцюга протягом 4 хвилин, чи 40 хвилин (коли йдеться про металеві порошки). Якщо речовина не загорається та не поширює горіння від полум'я чи тління на відрізку вогняного ланцюга в 200 мм протягом 4 хвилин, чи 40 хвилин (коли йдеться про металеві порошки) тестового періоду, тоді така речовина не вважатиметься легкозаймистою, і подальше тестування непотрібно. Якщо ж речовина поширює горіння на відрізку вогняного ланцюга в 200 мм за менш, ніж 4 хвилини, чи 40 хвилин (коли йдеться про металеві порошки), необхідно застосувати нижчеописану процедуру (див. пункт 1.6.2. та наступні).

1.6.2. Тест на визначення швидкості горіння

1.6.2.1. Підготовка

Порошкоподібні чи гранульовані речовини засипають негусто в форму 250 мм довжини, що має трикутні поперечні розрізи по 10 мм висотою та 20 мм шириною. По обидві сторони форми в повздовжньому напрямку кріпляться дві металеві платформи, які слугують боковими обмежувачами на відстані 2 мм від верхнього краю трикутного поперечного перерізу. Далі, форму тричі кидають з висоти 2 см на тверду поверхню. За необхідності форму наповнюють знову. Потім бокові обмежувачі забирають, а решту речовини усувають. Платформа, яка є вогнетривкою, непористою та має низьку теплопровідність, ставиться зверху форми, потім прилад перевертають, а форму забирають.

Пастоподібні речовини розмащують по платформі, яка є вогнетривкою, непористою та має низьку теплопровідність, у форму канату завдовжки 250 мм з поперечним перерізом в 1 кв.см.

1.6.2.2. Умови тестування

Якщо застосовуються чутливі до вологи речовини, тоді тест необхідно провести якнайшвидше, і відразу після виймання речовини з контейнера.

1.6.2.3. Виконання тесту

У витяжній шафі розмістіть купку з речовиною навпроти тяги.

Швидкість вітру має бути такою, щоб запобігти попаданню вихлопів та випаровувань в лабораторію, а також швидкість не повинна змінюватись в ході тестування. Довкола приладу встановлюється витяжний екран.

Для запалювання стовпчика з речовиною застосовують високотемпературний факел від газової горілки (мін. діаметр 5 мм). Коли стовпчик прогоріла досягнув 80 мм, вимірюється швидкість горіння наступних 100 мм.

Тест повторюють шість разів, використовуючи при цьому щоразу чисту, охолоджену платформу, якщо раніше не було отримано позитивного результату.

2. ДАНІ

Для проведення адекватної та достатньої оцінки необхідно отримати час горіння з попереднього скрінінг - тесту (1.6.1.) та час горіння, показаний в 6 тестах (1.6.2.3.).

3. ПОВІДОМЛЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

3.1. ПОВІДОМЛЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ ТЕСТУВАННЯ

За можливості, результати мають включати:

- точну специфікацію речовини (характерні особливості та домішки),

- опис тестованої речовини, фізичний стан, включаючи вміст вологи,

- результати попереднього скрінінг - тесту і результати тесту з визначення швидкості горіння, якщо такий тест проводився,

- всі додаткові примітки щодо інтерпретації результатів.

3.2. ІНТЕРПРЕТАЦІЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

Порошкоподібні, гранульовані або пастоподібні речовини вважаються сильнозаймистими тоді, коли час горіння в будь-яких проведених тестах, відповідно до описаної у пункті 1.6.2 методики проведення тестів, становить менше 45 секунд. Порошкоподібні речовини чи речовини, що мають в своєму складі метал та інші домішки, вважаються сильнозаймистими тоді, коли вони займаються і полум'я або зона реакції поширюється на весь зразок речовини за 10 і менше хвилин.

4. ПОСИЛАННЯ

NF T 20-042 (September 85) Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of solids.

Додаток

Малюнок

Форма та засоби для приготування стовпчика ( 994_b14 )

А.11. ЗАЙМИСТІСТЬ (ГАЗИ)

1. МЕТОД

1.1. ВСТУП

Даний метод дозволяє визначити, чи гази, змішані з повітрям кімнатної температури (приблизно 20 град.С) і атмосферним тиском, є займистими, і, якщо так, то в межах яких концентрацій. Суміші збільшуваних концентрацій тестованого газу і повітря піддають електричному розряду (іскрі), і спостерігають за тим, чи відбувається запалювання.

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ ТА ОДИНИЦІ ВИМІРЮВАННЯ

Межа займистості - це межа концентрації між нижчими та вищими рівнями спалаху/вибуху. Нижчий та вищий рівні спалаху - це ті рівні концентрації займистого газу, змішаного з повітрям, при яких не відбувається поширення полум'я.

1.3. БАЗОВІ РЕЧОВИНИ

Не визначені.

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ

Концентрація газу в повітрі збільшується поступово, і суміш на кожній стадії піддають дії електричного розряду.

1.5. КРИТЕРІЙ ЯКОСТІ

Не вказані.

1.6. ОПИС МЕТОДУ

1.6.1. Прилад

Посудина для проведення тестування - це прямий скляний циліндр з мінімальним внутрішнім діаметром 50 мм та мінімальною висотою 300 мм. Електроди запалювання знаходяться на відстані 3-5 мм та розташовуються в 60 мм над поверхнею циліндра. Циліндр має отвір для випускання тиску (декомпресійний отвір). Прилад має бути захищений від ушкоджень на випадок вибуху.

В якості джерела запалювання використовується постійна іскра тривалістю 0.5 секунд, яку генерує високовольтний трансформатор з вихідною напругою 10-15 кіловольт (максимальна вхідна напруга 300 Вт). В посиланні (2) показано приклад такого відповідного приладу.

1.6.2. Умови тестування

Тест необхідно проводити при кімнатній температурі (приблизно 20 град.С).

1.6.3. Проведення тесту

Використовуючи дозувальні насоси, в скляний циліндр вводиться відома концентрація газу в повітрі. Далі, іскра проходить крізь суміш, і спостерігаємо, чи полум'я відділяється від джерела запалювання і поширюється самостійно. Концентрація газу поступово змінюється (в районі 1% від об'єму) до тих пір, поки не відбудеться запалювання, як описано вище.

У випадку, якщо хімічна структура газу вказує на те, що цей газ є незаймистим, і склад стехіометричної суміші з повітрям можна вирахувати, тоді необхідно тестувати лише такі суміші, які мають на 10% більше стехіометричного складу і на 10% менше. Тестування сумішей такого складу проводиться з урахуванням того, що концентрація газу поступово змінюється (в районі 1% від об'єму).

2. ДАНІ

Єдиною інформацією щодо визначення таких властивостей є інформація про частоту поширення полум'я.

3. ПОВІДОМЛЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

За можливості результати тесту мають включати наступну інформацію:

- точну специфікацію речовини (характерні особливості та домішки),

- опис та розміри застосовуваного приладу,

- температуру, при якій проводився тест,

- перевірені концентрації та отримані результати,

- результати тесту: незаймистий газ або сильно займистий газ,

- у випадку, якщо газ незаймистий - інформація про межу концентрації, згідно якої газ тестували, відповідно до того, концентрація газу поступово змінюється (в районі 1% від об'єму),

- всі додаткові примітки щодо інтерпретації результатів.

4. ПОСИЛАННЯ

(1) NF T 20-041 (September 85) Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of gases.

(2) W.Berthold, D.Conrad, T.Grewer, H. Grosse-Wortmann 'Entwicklung einer Standard-Apparatur zur Messung von Explosionsgrenzen'. Chem.-Ing.- Tech. 1984, vo1. 56, 2, 126-127., T.Redeker und H.Schacke, p. 126-127.

A.12. ЗАЙМИСТІСТЬ (КОНТАКТ З ВОДОЮ)

1. МЕТОД

1.1. ВСТУП

Даний вид тестування допоможе визначити, чи реакція речовини з водою або вологим повітрям приводить до утворення небезпечної кількості газу/газів, що можуть бути досить сильнозаймистими.

Такий метод тестування можна застосувати, як для рідин, так і для твердих речовин. До речовин, які спалахують спонтанно від контакту з повітрям, такий тест не застосовується.

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ ТА ОДИНИЦІ ВИМІРЮВАННЯ

Сильнозаймисті речовини: речовини, котрі при контакті з водою або вологим повітрям, виділяють сильно займисті гази в небезпечній кількості при мінімальній швидкості 1 літр/кг у годину.

1.3. ПРИНЦИП МЕТОДУ

Речовина тестується в певній послідовності, поступово, як описано нижче; якщо на якомусь етапі відбувається спалахування, тоді подальше тестування непотрібно. Якщо ж стає відомо, що речовина не бурно реагує на воду, тоді переходять до наступного етапу 4 (1.3.4.).

1.3.1. Етап 1

Речовину поміщають в лоток з дистильованою водою при t 20 град.С і спостерігають, чи виділений газ спалахне.

1.3.2. Етап 2

Речовину поміщають у фільтрувальний папір, що плаває на поверхні посудини з дистильованою водою при t 20 град.С і спостерігають, чи виділений газ спалахне. Фільтрувальний папір використовують для того, щоб речовина перебувала в нерухомому стані, і тим самим збільшувалась ймовірність запалювання.

1.3.3. Етап 3

Тестовану речовину кладуть у вигляді стовпчика заввишки 2 см та діаметром 3 см. Додають кілька крапель води, і спостерігають, чи виділений газ спалахне.

1.3.4. Етап 4

Речовину змішують з дистильованою водою при t 20 град.С, і протягом семи годин (інтервал - 1 година) вимірюють виділення газу. Якщо швидкість виділення газу непостійна або збільшується після семи годин, тоді час вимірювання збільшують до п'яти днів максимум. Тестування припиняють, якщо швидкість в будь-який момент зростає, із розрахунку 1 літр/кг в годину.

1.4. БАЗОВІ СУМІШІ

Не визначені.

1.5. КРИТЕРІЙ ЯКОСТІ

Не вказано.

1.6. ОПИС МЕТОДІВ

1.6.1. Етап 1

1.6.1.1. Умови тестування

Тестування проводиться при кімнатній температурі (приблизно 20 град.С).

1.6.1.2. Проведення тесту

Невелику кількість (приблизно 2 мм в діаметрі) тестованої речовини кладуть в лоток з дистильованою водою. Необхідно спостерігати, чи виділятиметься який-небудь газ (i), і чи відбудеться запалювання цього газу (ii). Якщо газ спалахне, тоді подальше тестування речовини непотрібне, оскільки така речовина вважається небезпечною.

1.6.2. Етап 2

1.6.2.1. Прилад

Застосовують фільтрувальний папір, який має плавати рівно на поверхні води в будь-якій посудині, наприклад, у чашці для випаровування діаметром 100 мм.

1.6.2.2. Умови тестування

Тестування проводиться при кімнатній температурі (приблизно 20 град.С).

1.6.2.3. Проведення тесту

Невелику кількість (приблизно 2 мм в діаметрі) тестованої речовини кладуть в центрі фільтрувального паперу. Необхідно спостерігати, чи виділятиметься який-небудь газ (i), і чи відбудеться запалювання цього газу (ii). Якщо газ спалахне, тоді подальше тестування речовини непотрібне, оскільки така речовина вважається небезпечною.

1.6.3. Етап 3

1.6.3.1. Умови тестування

Тестування проводиться при кімнатній температурі (приблизно 20 град.С).

1.6.3.2. Проведення тесту

Тестовану речовину формують у вигляді стовпчика заввишки, приблизно, 2 см і 3 см діаметром, роблячи зверху виїмку. Потім у виїмку додають кілька крапель води та спостерігають, чи виділятиметься який-небудь газ (i), і чи відбудеться запалювання цього газу (ii). Якщо газ спалахне, тоді подальше тестування речовини непотрібне, оскільки така речовина вважається небезпечною.

1.6.4. Етап 4

1.6.4.1. Прилад

Прилад налаштовують так, як показано на малюнку.

1.6.4.1. Умови тестування

Контейнер, в якому міститься тестована речовина, необхідно перевірити на наявність будь-якого порошку < 500 мю m (розмір частинок). Якщо порошок складає більше 1% від загальної кількості складського варіанту, чи взятий зразок є ламким/крихким, тоді перед проведенням тесту необхідно всю речовину перемолоти в порошок для того, щоб зменшити розмір частинок під час зберігання та користування; в іншому випадку речовину тестують такою, як є. Тест проводять при кімнатній температурі (приблизно 20 град.С) та атмосферному тиску.

1.6.4.3. Проведення тесту

У роздільну лійку приладу вливають 10-20 мл води та 10 г речовини в колбу конусоподібної форми. Об'єм виділеного газу можна виміряти будь-якими доступними методами. Потім відкривають кран роздільної лійки, вода вливається у колбу, і засікають час на секундомірі. Виділення газу вимірюють протягом семи годин. Якщо протягом цього часу швидкість виділення газу непостійна або, якщо по закінченні цього часу, швидкість збільшується, тоді час вимірювання збільшують до максимум п'яти днів. Тестування припиняють, якщо швидкість в будь-який момент зростає, з розрахунку 1 літр/кг в годину. Тест повторюють тричі.

Газ необхідно дослідити, якщо його хімічні характеристики невідомі. Якщо в газі виявлено сильнозаймисті компоненти та невідомо, наскільки сильнозаймистою є вся суміш, необхідно приготувати подібну суміш такого самого складу та перевірити її у відповідності до методу А.11.

2. ДАНІ

Речовина вважається небезпечною, якщо:

- на будь-якому етапі проведення тесту відбувається спонтанне спалахування,

або

- швидкість виділення вогненебезпечного газу більша 1 літр/кг в годину.

3. ПОВІДОМЛЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

За можливості, результати тесту мають включати наступну інформацію:

- точну специфікацію речовини (характерні особливості та домішки),

- інформацію про будь-яку попередню підготовку тестованої речовини,

- результати тестів (етапи 1, 2, 3 та 4),

- хімічні особливості виділеного газу,

- швидкість виділення газу, якщо проводився етап 4 (1.6.4.),

- всі додаткові примітки щодо інтерпретації результатів.

4. ПОСИЛАННЯ

(1) Recommendations on the transport of dangerous goods, test and criteria, 1990, United Nations, New York.

(2) NF T 20-040 (September 85) Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of gases formed by the hydrolysis of solid and liquid products.

Додаток

Малюнок

Прилад ( 994_b14 )

А.13. ВЛАСТИВІСТЬ САМОЗАПАЛЕННЯ ТВЕРДИХ ТІЛ ТА РІДИН

1. МЕТОД

1.1. ВСТУП

Даний метод тестування застосовується до твердих тіл або рідин, які в невеликій кількості спалахують спонтанно - відразу після контакту з повітрям при кімнатній температурі, наближеній до 20 град.С.

Даний метод тестування не розповсюджується на речовини, яким для спалахування потрібно годинами та днями перебувати на повітрі при кімнатній температурі або при температурі, що постійно збільшується.

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ ТА ОДИНИЦІ ВИМІРУ

Вважається, що речовини мають властивості самозапалювання, якщо вони спалахують або обвуглюються за умов, описаних в пункті 1.6.

Може виникнути потреба у перевірці самозапалювання рідин методом А.15. Температура самозапалювання (рідин та газів).

1.3. БАЗОВІ РЕЧОВИНИ

Не визначені.

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ

Тверде тіло або рідина додається до інертного елементу та вводиться в контакт з повітрям при температурі навколишнього середовища протягом п'яти хвилин. Якщо рідини не спалахують, їх кладуть для всмоктування на фільтрувальний папір та піддають дії повітря при температурі навколишнього середовища (приблизно 20 град.С) на п'ять хвилин. У випадку, якщо тверде тіло або рідина спалахує або від неї загорається/обвуглюється фільтрувальний папір, тоді така речовина вважається самозапалюваною.

1.5. КРИТЕРІЙ ЯКОСТІ

Повторюваність: у зв'язку із важливістю забезпечення безпеки для визначення властивостей самозапалювання речовини, достатньо отримання одного позитивного результату.

1.6. ОПИС МЕТОДУ ТЕСТУВАННЯ

1.6.1. Прилад

Фарфорова чашка, діаметром, приблизно, 10 см, заповнюється діатомовою землею до 5 мм при кімнатній температурі (приблизно 20 град.С).

Примітка:

Діатомова земля або інша подібна інертна речовина, що, як правило, завжди є в наявності, служить в якості ґрунту, на який може випадково пролитись тестована речовина.

В наявності має бути фільтрувальний папір для тестування рідин, які не загораються підчас контакту з повітрям або інертною хімічною речовиною.

1.6.2. Проведення тесту

(а) Порошкоподібні речовини

1-2 куб.см тестованої речовини зсипають з майже метрової висоти на негорючу поверхню, і спостерігають за тим, чи речовина спалахне внаслідок цього, чи через п'ять хвилин після падіння.

Якщо спалахування не відбувається, тест проводять до шести разів.

(b) рідини

Приблизно 5 куб.см тестованої рідини заливають в підготовлену для цього фарфорову чашку та спостерігають, чи протягом 5 хвилин відбудеться спалахування.

Якщо протягом шести разів не відбудеться спалахування, необхідно провести наступні тести:

0.5 мл тестованого зразка через шприц випускають на підготовлений фільтрувальний папір та спостерігають, чи в результаті цього за протягом п'яти хвилин папір спалахне або обвуглиться. Якщо не відбувається спалахування або обвуглення, тест проводять до трьох разів.

2. ДАНІ

2.1. ОБРОБЛЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

Тестування припиняють після того, як в ході будь-якого з тестів було досягнуто позитивних результатів.

2.2. ЕВАЛЮЮВАННЯ

У випадку, якщо речовина спалахує протягом п'яти хвилин після того, як на неї подіяли повітря та інертна речовина, або від рідини спалахує/обвуглюється фільтрувальний папір, тоді така речовина вважається самозапалюваною.

3. ПОВІДОМЛЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

За можливості,результати тестумають включати наступну інформацію:

- точну специфікацію речовини (характерні особливості та домішки),

- результати тестів,

- всі додаткові примітки щодо інтерпретації результатів.

4. ПОСИЛАННЯ

(1) NF T 20-039 (September 85) Chemical products for industrial use. Determination of the spontaneous flammability of solids and liquids.

(2) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Test and criteria, 1990, United Nations, New York.

А.14. ВИБУХОНЕБЕЗПЕЧНІСТЬ

1. МЕТОД

1.1. ВСТУП

Даний метод є схемою проведення тестування щодо визначення того, чи тверде тіло або пастоподібна речовина буде вибухонебезпечною, якщо перебуватиме в контакті з полум'ям (перевірка теплочутливості), або, якщо така речовина піддається удару чи тертю (перевірка на механічне подразнення). Метод також перевіряє вибухонебезпечність рідини під дією полум'я або удару.

Метод складається з трьох частин:

(а) перевірка теплочутливості (1);

(b) перевірка на механічне подразнення від удару (1);

Метод представляє дані щодо оцінки можливості виникнення вибуху через певні загальні подразники. Даний метод не ставить за мету визначити, чи речовина є вибуховою при будь-яких умовах.

Метод підходить для того, щоб визначити вибухонебезпечність речовини (перевірка теплочутливості та механічного подразнення) за певних умов, визначених директивою. В основі методу лежить використання кількох типів приладів, які використовуються по всьому світу (1), і які, зазвичай, показують значимі результати. Загальновизнаним фактом є те, що самі методи не відіграють віришального значення. Окрім спеціалізованих приладів використовують й альтернативні, за умови, що вони визнані на міжнародному рівні, а результати, відповідно, співвідносяться з результатами, отриманими з використанням спеціалізованих приладів.

Тестування проводити непотрібно, якщо наявна інформація щодо термодинаміки (наприклад, теплота розкладання) та/чи відсутність певних груп реактивності (2) в структурній формулі безсумнівно доводять, що речовина нездатна швидко розкладатись і при цьому виділяти газ або тепло (тобто, матеріал не є вибухонебезпечним). Для рідин не потрібно проводити тесту на механічне подразнення (тертя).

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ ТА ОДИНИЦІ ВИМІРУ

Вибухонебезпечна речовина:

Речовини у спеціальному приладі можуть вибухнути під дією полум'я або в результаті чутливості до удару чи тертя (або, якщо мають більшу механічну чутливість, ніж 1.3 - динітробензол в альтернативному приладі).

1.3. БАЗОВІ РЕЧОВИНИ

1,3-динітробензол, просіяний через фільтр до 0.5 мм технічний продукт кристалічної структури, - для методів перевірки дії тертя та удару.

Пергідро-1,3,5-тринітро-1,3,5-триазін (ВВД: вибухівка відділу досліджень, гексоген, циклоніт - РСХ: Референтна служба по хімії 121-82-4), рекристалізовані з водного циклогексанону, проціджені при 250 мю m, утримані на 150 мю m і висушені при температурі 103 +- 2 град.С (протягом чотирьох годин) - для другого ряду тестів на тертя та дію електричного розряду.

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ

Необхідно проведення попередніх тестів з метою визначення безпечних умов проведення трьох тестів на чутливість.

1.4.1. Тести на безпечність експлуатації (3)

В цілях безпеки, перед проведенням основних тестів, беруть зразки речовини у дуже малій кількості (приблизно 10 мг) і піддають їх тепловій обробці, не обмежуючись і полум'ям, дією удару в приладі будь-якої зручної форми, а також терттям: між молотом та наковальнею або в іншій машині, де можна провести тертя. Основне завдання тут полягає в тому, щоб визначити, наскільки чутливою і вибухонебезпечною є речовина. Це необхідно для того, щоб в ході проведення тестів на чутливість, особливо, коли йдеться про визначення теплочутливості, можна було б врахувати певні застереження, та оператор зміг уникнути ушкоджень.

1.4.2. Теплочутливість

Метод полягає в тому, що речовину нагрівають в металевій трубці, отвори якої закриті вимірювальними діафрагмами з різним діаметром дірки, для визначення здатності речовини вибухати при інтенсивному нагріванні та певному утриманні частинок.

1.4.3. Механічне подразнення (удар)

У цьому методі тестування речовину піддають удару через падіння певної визначеної маси з визначеної висоти.

1.4.4. Механічне подразнення (тертя)

Тверде тіло або пастоподібну речовину піддають тертю між звичайними поверхнями при певному навантаженні та русі.

1.5. КРИТЕРІЙ ЯКОСТІ

Не вказано.

1.6. ОПИС МЕТОДУ

1.6.1. Теплочутливість (під дією полум'я)

1.6.1.1. Прилад

Прилад для проведення тестування складається з одноразової металевої трубки та закриву багаторазового використання (див. малюнок 1), які вмонтовуються в захисний нагрівальний пристрій. Кожна трубка виготовлена з тонколистової сталі (див. Додаток) і має діаметр 24 мм, довжину 75 мм та товщину стінок 0.5 мм. Отвір для відкривання трубки має закручувальну різь для діафрагми. Це стійка до стискання діафрагма з діркою посередині, яка щільно пристає до трубки за допомогою двостороннього гвинтового з'єднання (гайка/муфта та кільце з внутрішньою різьбою). Гайка та кільце з внутрішньою різьбою виготовлені з хромо-марганцевої сталі (див. Додаток), стійкої до нагрівання - 800 град.С. Діафрагми товщиною 6 мм виготовляються з теплостійкої сталі (див. Доповнення) та мають різні діаметри відкривання.

1.6.1.2. Умови проведення тесту

Зазвичай, речовину тестують, як є, хоча в деяких випадках, наприклад, коли її розмір зменшено завдяки порізці чи пресуванню, таку речовину тестують після подрібнення.

Що стосується твердих тіл, то їх маса для проведення кожного окремого тестування визначається методом пробного прогону в два етапи. Сама трубка заповнюється 9 куб.см речовини та речовиною, набитою при силі 80 Н, що застосовується до всієї перехресної форми трубки. В цілях безпеки або, якщо фізична форма зразка речовини змінюється методом компресії, необхідно застосовувати інші методи заповнення трубки; наприклад, якщо речовина надто чутлива до тертя, тоді метод набивання не підходить. Якщо ж матеріал такий, що піддається стисканню/компресії, тоді його можна добавляти у більшій кількості і набивати трубку до 55 мм від верху. При набиванні трубки до 55 мм визначається загальна маса основної речовини, і додаються два наступні інкременти, які набиваються силою 80 Н кожен. Потім набивають матеріал або, якщо необхідно, виймають, таким чином, щоб трубка була забитою тільки до 15 мм від верху. Другий пробний прогін проводять при кількості набитої речовини 1/3 від загальної маси речовини першого погону. Ще два цих інкременти додають при силі набивання 80 Н, а рівень речовини в трубці повинен становити до 15 мм від верху - методом додавання або віднімання матеріалу, в залежності від необхідності. Для кожного експерименту беруть кількість речовини, визначену в ході другого пробного прогону; набивання відбувається трьома рівними частинами, кожну з яких спресовують до 9 куб.см, використовуючи будь-яку необхідну силу. (Полегшити процес можна застосувавши розпіркові кільця).

Рідини та гелі вводять в трубку на висоту до 60 мм. Особливої обережності потребують гелі, щоб уникнути утворення вакууму. Кільце з внутрішньою різзю просувають в трубку знизу, вставляють діафрагму з відповідним отвором і затягують гайку, попередньо змазавши її дисульфідом молібдену. Дуже важливо перевірити, чи не застрягає речовина між крайкою трубки та діафрагмою або у різі.

Нагрівання відбувається пропаном з технічного циліндру, що має регулюючий клапан (60-70 мбар), і далі тепло за допомогою мірки через колектор рівномірно розподіляють до чотирьох горілок. Горілки розміщені довкола барокамери, як показано на мал. 1. Загальна витрата палива чотирьох горілок становить 3,2 літра пропану в хвилину. Можна використовувати альтернативні горілки та паливні гази, але швидкість нагріву повинна бути такою, як показано на мал. 3. У всіх приладах необхідно перевіряти швидкість нагріву, використовуючи трубки, заповнені дибутилфталатом, як вказано на мал. 3.

1.6.1.3. Проведення тестів

Кожен тест проводять до тих пір, поки трубка не розколиться на шматки або ж нагрівають трубку до п'яти хвилин. Тест, в результаті якого трубка розколюється на три і більше шматків, які іноді між собою з'єднані смужками металу, як показано на мал. 2, вважається підтвердженням вибуху. Якщо ж по завершенню тесту трубка розколюється на менше шматків або не розколюється взагалі, тоді це не вважається вибухом.

Спочатку проводять серію з трьох тестів, використавши 6-ти міліметрову діафрагму, і, якщо не виявлено вибухів, проводять другу серію з трьох тестів, використовуючи діафрагму з діаметром 2,00 мм. Якщо в ході однієї з серій тестів відбувається вибух, тоді подальші випробовування непотрібні.

1.6.1.4. Оцінка

1.6.1.5. Результат тестування вважається позитивним, якщо в ході однієї з серій тестів відбувається вибух.

1.6.2. Перевірка на механічне подразнення (удар)

1.6.2.1. Прилад (мал. 4)

Основними частинами типового приладу з падаючим молотом є блок сталевої конструкції на платформі, ковадло, колонка, направляючі, падаючий вантаж, спусковий пристрій та тримач зразка для тестування. Сталеве ковадло (100 мм діаметром х 70 мм висотою) прикручується до верху стального блоку (230 мм довжиною х 250 мм шириною х 200 мм висотою) на платформі (450 мм довжиною х 450 мм шириною х 60 мм висотою). Зроблена з цільного куска сталевого шматка колонка має захисний патрон, який прикручується до задньої стінки сталевого блоку. Чотирма шурупами прилад прикручується до бетонної основи (60 x 60 x 60 см) таким чином, щоб направляючі рейки були у вертикальному положенні, і вантаж міг вільно падати. В наявності повинні бути 5-ти та 10-ти кілограмові вантажі, зроблені з твердої сталі. Ударний наконечник кожного вантажу має бути з гартованої сталі, мати мінімальний діаметр 25 мм, і твердість по шкалі С Роквелла має становити 60-63.

Зразок речовини для тестування поміщається в ударний пристрій, що складається з двох одновісних циліндрів, виготовлених з твердої сталі, розміщених один над одним в циліндричному сталевому направляючому кільці. Одновісні циліндри з твердої сталі повинні мати такі розміри: 10 (- 0,003, - 0,005) мм в діаметрі та 10 мм висоти, поверхні мають бути відполіровані та із заокругленими краями (радіус викривлення 0,005 мм), твердість по шкалі С Роквелла становитиме 58-65. Зовнішній діаметр порожнього циліндра становитиме 16 мм, відполірований отвір 10 (+ 0,005, + 0,010) мм і висота 13 мм. Ударний пристрій встановлюється на допоміжному ковадлі (26 мм діаметром та 26 мм висотою), виготовленого зі сталі та відцентрованого за допомогою направляючого кільця з отворами для випаровування диму/газів.

1.6.2.2. Умови тестування

Об'єм тестованого зразка має бути 40 куб.мм або таким, щоб це відповідало розмірам альтернативного приладу. Речовини тестують в сухому вигляді та готують наступним чином:

(а) порошкоподібні речовини просіюють (розмір просіювання ситом 0,5 мм); всі частинки, пропущені крізь сито, використовуються для тестування;

(b) спресовані, відлиті чи іншим чином ущільнені речовини розламують на малі шматки та просіюють; просіяну частинку діаметром 0.5-1 мм використовують для тестування в якості вихідної речовини.

Пастоподібні речовини, за можливості, тестують в сухому вигляді або в будь-якому випадку, після того, як буде усунено якомога більше розчинника. Рідини тестують при одноміліметровому зазорі між верхнім та нижнім сталевими циліндрами.

1.6.2.3. Проведення тестувань

Проводиться серія з шести тестів, в ході яких з висоти 0.40 м (40J) кидають вантаж масою 10 кг. Якщо при 40J відбувається вибух, тоді проводиться наступна серія з шести тестів, в ході яких з висоти 0.15 м (7,5J) кидають вантаж масою 5 кг. У випадку використання інших приладів для тестування зразок порівнюють з обраною основною речовиною, відповідно до визначеного методу (наприклад, вертикальними зворотно-поступальними рухами, тощо).

1.6.2.4. Оцінка результатів

Результат тесту вважається позитивним, якщо вибух (розрив в полум'я і/або доповідь результатів еквівалентна вибуху) трапляється хоча б один раз в будь-якому з тестів, використовуючи відповідний ударний пристрій, чи, якщо зразок чутливий більше 1,3-динітробензолу, чи ВВД в альтернативному тесті на удар.

1.6.3. Перевірка на механічне подразнення від тертя

1.6.3.1. Прилад (мал. 5)

Прилад для перевірки тертя складається з відлитої сталевої платформи, на яку кріпиться пристрій тертя. Він складається з циліндричного фарфорового стрижня та рухомої фарфорової посудини, яка рухається в двох напрямках на каретці. Каретка під'єднується до електромотору за допомогою шатунного механізму, ексцентрикового кулачка та відповідного механізму, щоб посудина рухалась, лише раз, вперед і назад під стрижнем на відстань 10 мм. Навантаження на фарфоровий стержень має бути, наприклад, 120 або 130 Ньютонів.

Фарфорові посудини плоскої форми виготовляють з білого технічного фарфору (нерівність поверхні 9-32 мю m) та вони мають такі розміри: 25 мм (довжини) x 25 мм (ширини) x 5 мм (висоти). Циліндричний фарфоровий стрижень також виготовляють з білого технічного фарфору завдовжки 15 мм, діаметром 10 мм. Стрижень має шорстку необроблену поверхню, радіус його заокруглення становить 10 мм.

1.6.3.2. Умови проведення тесту

Об'єм тестованого зразка повинен бути 10 куб.мм або таким, щоб це відповідало розмірам альтернативного приладу.

Речовини тестують в сухому вигляді та готують наступним чином:

(b) спресовані, відлиті чи іншим чином ущільнені речовини розламують на малі шматки та просіюють; просіяну частинку діаметром < 0.5 мм використовують для тестування.

Пастоподібні речовини, за можливості, тестують в сухому вигляді. Якщо речовину неможливо приготувати в сухому стані, тоді в пастоподібному стані (після того, як буде усунено якомога більше розчинника) її тестують при таких розмірах: 0,5 мм товщини, 2 мм ширини, 10 мм довжини.

1.6.3.3. Проведення тестувань

Фарфоровий стрижень опускають на зразок речовини, відповідно до обраного тесту та навантаження. В процесі виконання тесту необхідно, щоб пористі позначки фарфорової посудини лежали навхрест відносно напрямку руху. Необхідно прослідкувати, щоб в момент, коли стрижень опускається на посудину, в ній було достатньо речовини, і щоб посудина під стрижнем правильно рухалась. У випадку тестування пастоподібних речовин використовують вимірювальний прилад 0,5 мм товщиною з отвором 2 х 10 мм для подачі речовини в посудину. Фарфорова посудина повинна рухатись на 10 мм вперед-назад під стрижнем з частотою 0,44 секунди. Кожна частина поверхні посудини та стрижня повинні використовуватись лише один раз; два кінці кожного стрижня мають служити для двох тестувань, а дві поверхні посудини - для трьох спроб кожна.

Проводиться серія з шести тестів при навантаженні 360 Н. Якщо внаслідок цього буде отримано позитивний результат, наступна серія з шести тестів проводитиметься при навантаженні 120 Н. У випадку використання інших приладів для тестування зразок порівнюють з обраною основною речовиною, відповідно до визначеного методу (наприклад, вертикальними зворотно-поступальними рухами, тощо).

1.6.3.4. Оцінка результатів

Результат тесту вважається позитивним, якщо вибух (потріскування та/чи розрив в полум'я еквівалентні вибуху) трапляється хоча б один раз в будь-якому з тестів, використовуючи відповідний пристрій для тертя, чи, якщо результат тестування відповідає еквівалентним критеріям альтернативного тесту на тертя.

2. ДАНІ

В принципі, згідно визначень директиви, речовина вважається вибухонебезпечною тоді, коли в результаті проведення тестів на удар, термообробку і тертя, отримано позитивний результат.

3. ПОВІДОМЛЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

3.1. ЗВІТ ПРО ТЕСТ

За можливості, результати тесту мають містити наступну інформацію:

- специфікацію речовини, її склад, відсутність домішок, вміст вологи, тощо,

- фізичну форму зразка, інформацію про те, чи він був подрібнений, розламаний та/чи просіяний,

- спостереження під час перевірки речовини на теплочутливість (наприклад, маса зразка, кількість уламків/фрагментів),

- спостереження під час перевірки речовини на механічне подразнення (наприклад, утворення значної кількості диму або повний розклад без звуку, полум'я, іскор, потріскування, тощо),

- результати по кожному типу тесту,

- якщо використовувався альтернативний прилад - наукове обґрунтування його доцільності, а також підтвердження співвідношення між результатами, отриманими з спеціалізованого приладу із результатами, отриманими з альтернативного приладу,

- будь-які важливі коментарі, тип посилання на результати тестувань подібних виробів, що може бути важливим для правильної інтерпретації результатів,

- усі додаткові зауваження щодо інтерпретації результатів.

3.2. ІНТЕРПРЕТАЦІЯ ТА ОЦІНКА РЕЗУЛЬТАТІВ

Звіт про тестування має містити інформацію про будь-які результати, що вважаються неправильними, ненормальними чи нехарактерними для такого експерименту. Якщо будь-які з результатів необхідно зменшити, тоді необхідно представити відповідне пояснення та результати альтернативного або додаткового тестування. Якщо неправильний результат тесту неможливо пояснити, тоді його беруть за номінальне значення та, відповідно, використовують для класифікації речовини.

4. ПОСИЛАННЯ

(1) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods: Tests and criteria, 1990, United Nations, New York.

(2) Bretherick, L., Handbook of Reactive Chemical Hazards, 4th edition, Butterworths, London, ISBN 0-750-60103-5, 1990.

(3) Koenen, H., Ide, K.H. and Swart, K.H., Explosivstoffe, 1961, vol. 3, 6-13 and 30-42.

(4) NF T 20-038 (September 85) Chemical products for industrial use - Determination of explosion risk.

Додаток

Приклад специфікації матеріалу для тесту на теплочутливість (див. НІС 1623)

(1) Трубка: Специфікація матеріалу N 1.0336.505 г.

(2) Діафрагма: Специфікація матеріалу N 1.4873

(3) Кільце з внутрішньою різзю та гайка: Специфікація матеріалу N 1.3817

Малюнок 1 ( 994_b14 )

Малюнок 2 ( 994_b14 )

Малюнок 3 ( 994_b14 )

Малюнок 4 ( 994_b14 )

Малюнок 5 ( 994_b14 )

А.15. ТЕМПЕРАТУРА САМОЗАПАЛЕННЯ (РІДИНИ ТА ГАЗИ)

1. МЕТОД

1.1. ВСТУП

Вибухонебезпечні речовини, а також ті речовини, які самозапалюються від контакту з повітрям при температурі навколишнього середовища, не підлягають даному тестуванню. Така методика тестування застосовується до газів, рідин та випарів, які за наявності повітря спалахують від гарячої поверхні.

Температуру самозапалювання можна значно знизити за допомогою каталітичних домішок, матеріалом поверхні чи більшим об'ємом посудини тестування.

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ ТА ОДИНИЦІ ВИМІРЮВАННЯ

Рівень самозапалювання виражається елементами вимірювання температури самозапалювання. Температура самозапалювання - це найнижча температура, при якій речовина спалахує від контакту з повітрям за умов, визначених у методі тестування.

1.3. БАЗОВІ РЕЧОВИНИ

Базові речовини зазначені в стандартах, поданих в пункті 1.6.3, які головним чином служать для перевірки проведення методу час від часу та можливості порівняння результатів з іншими методами.

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ

Метод визначає мінімальну температуру внутрішньої поверхні корпусу, яка призводить до спалахування впорскнутих в нього газу, випарів або рідини.

1.5. КРИТЕРІЙ ЯКОСТІ

Повторюваність змінюватиметься в залежності від рівнів температури та застосовуваного методу тестування.

Чутливість та специфічні особливості залежать від застосовуваного методу тестування.

1.6. ОПИС МЕТОДУ

1.6.1. Прилад

Прилад описано в методі, посилання на який подано в пункті 1.6.3.

1.6.2. Умови тестування

Зразок речовини тестують із використанням методу, посилання на який подано в пункті 1.6.3.

1.6.3. Проведення тесту

Див. МЕК 79-4, HIC 51794, AABM-E 659-78, BS 4056, NF T 20-037.

2. ДАНІ

Внесення даних щодо температури тестування, атмосферного тиску, кількості взятого зразка та проміжку часу до моменту спалахування.

3. ПОВІДОМЛЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

За можливості, результати тесту мають містити наступну інформацію:

- Опис субстанції, її склад, відсутність домішок,

- Кількість використаного зразка, атмосферного тиску,

- Прилад, який застосовувався,

- Результати вимірювань (температура в ході тестів, результати запалювання, середній час, потрібний молекулі, щоб пройти крізь колонку (час простою)),

- Усі додаткові зауваження щодо інтерпретації результатів.

4. ПОСИЛАННЯ

Немає.

А.16. ВІДНОСНА ТЕМПЕРАТУРА САМОЗАПАЛЕННЯ ДЛЯ ТВЕРДИХ ТІЛ

1. МЕТОД

1.1. ВСТУП

Вибухонебезпечні речовини, а також ті речовини, які самозапалюються від контакту з повітрям при температурі навколишнього середовища, не підлягають даному тестуванню.

Метою даного тестування є надання попередньої інформації щодо самозапалювання твердих тіл при визначених температурних режимах.

Якщо тепло, яке виникає в процесі реакції речовини та кисню або в результаті екзотермічного розпаду, не зникає досить швидко в середовищі, тоді самонагрівання призводить до самозапалювання. Відповідно, самозапалювання відбувається тоді, коли швидкість нагрівання перевищує швидкість переохолодження.

Такий метод тестування може застосовуватись в якості попереднього скрінінг - тесту для твердих тіл. Враховуючи складні особливості процесу запалювання та горіння твердих тіл, температура самозапалювання, що визначається за допомогою даного методу тестування, використовується лише в порівняльних цілях.

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ ТА ОДИНИЦІ ВИМІРЮВАННЯ

Температура самозапалювання - це найнижча температура навколишнього середовища по Цельсію, при якій певна кількість речовини спалахує від контакту з повітрям за умов, визначених методом тестування.

1.3. БАЗОВА РЕЧОВИНА

Немає.

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ

При кімнатній температурі певну кількість речовини кладуть в піч; крива залежності від температури/часу, що вказує на стан всередині зразка, записується в той момент, коли температура всередині печі сягає 400 град.С або, якщо вона є нижчою,- це має бути температура плавлення зі швидкістю 0,5 град.С/хвилину. В даному тесті температура печі, при якій тестований зразок нагрівається до 400 град.С методом самозапалювання, називається температурою самозапалювання.

1.5. КРИТЕРІЙ ЯКОСТІ

Немає.

1.6. ОПИС МЕТОДУ

1.6.1. Прилад

1.6.1.1. Піч

Використовується лабораторна піч із запрограмованою температурою (об'ємом 2 літри), обладнана системою циркуляції природного повітря та системою виведення вихлопів. З метою уникнення потенційно можливого вибуху, гази розпаду не повинні контактувати з елементами електронагріву.

1.6.1.2. Куб з жорсткої арматурної сітки

Арматурну сітку з нержавіючої сталі з отворами в 0,045 мм необхідно порізати так, як показано на мал. 1. Сітку складають та скріплюють дротом у вигляді куба з верхнім отвором.

1.6.1.3. Термостовпчики

Звичайні, придатні для використання термостовпчики.

1.6.1.4. Записуючий пристрій

Будь-який двоканальний записуючий пристрій, відкалібрований в межах 0-600 град.С або звичайної напруги.

1.6.2. Умови проведення тесту

Речовини тестують, як є.

1.6.3. Проведення тесту

Куб заповнюють речовиною для тестування і акуратно струшують, додаючи в нього речовину до верху, заповнивши таким чином всю посудину. Далі, куб підвішують в центрі печі при кімнатній температурі. Один з термостовпчиків ставлять в центрі куба, а інший між стінками куба та печі, щоб можна було записати температуру печі.

Температуру печі та зразка постійно записують, поки температура всередині печі не досягне 400 град.С або, якщо вона є нижчою, - це має бути температура плавлення зі швидкістю 0,5 град.С/хвилину.

Коли речовина спалахує, термостовпчик повинен показати різке збільшення температури порівняно з температурою печі.

2. ДАНІ

Для оцінювання підходить температура печі, при якій зразок речовини самонагрівається до 400 град.С (див. малюнок 2).

3. ПОВІДОМЛЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

За можливості, результати тесту мають містити наступну інформацію:

- Опис субстанції/речовини, що є предметом тестування,

- Результати вимірювань, включаючи криву залежності від температури/часу,

- Усі додаткові зауваження щодо інтерпретації результатів.

4. ПОСИЛАННЯ

NF T 20-036 (September 85) Chemical products for industrial use. Determination of the relative temperature of the spontaneous flammability of solids.

Малюнок 1 ( 994_b14 )

Малюнок 2 ( 994_b14 )

А.17. ВЛАСТИВОСТІ ОКИСЛЕННЯ (ТВЕРДІ ТІЛА)

1. МЕТОД

1.1. ВСТУП

Необхідно мати попередню інформацію щодо потенційних вибухонебезпечних властивостей речовини до проведення тестування.

Даний тест не застосовується до рідин, газів, вибухонебезпечних та вогненебезпечних речовин або органічних окислювачів.

У випадку, якщо дослідження структурної формули показують, що речовина не піддається екзотермічній реакції з горючою речовиною, даний тест не проводять.

Необхідність в проведенні попереднього тестування виникає тоді, коли потрібно визначити доцільність проведення самого тесту.

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ ТА ОДИНИЦІ ВИМІРЮВАННЯ

Час горіння: час реакції (виражається в секундах), що надається реакційній зоні для проходження по стовпчику речовини, відповідно до методу, описаного в пункті 1.6.

Швидкість горіння: виражається в міліметрах/секунду.

Максимальна швидкість горіння: найвищий показник швидкості горіння, отриманий з сумішей, які містять 10-90% окислювачу.

1.3. БАЗОВА РЕЧОВИНА

Для проведення, як основного, так і попереднього тестування, в якості базової речовини використовують барій нітрат найвищої якості.

Базова суміш - це суміш барій нітрату з порошкоподібною целюлозою, приготовленого відповідно до пункту 1.6, що має максимальну швидкість горіння (як правило, це суміш з вмістом барію нітрату 60%).

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ

В цілях безпеки проводять попередній скрінінг - тест. Якщо такий попередній скрінінг - тест показує, що речовина має окислювальні властивості, тоді подальше тестування непотрібно. В іншому випадку є необхідність проведення повного тестування.

Під час проведення повного тестування в різних пропорціях змішують саму речовину та зазначену вибухонебезпечну речовину. Далі, кожну суміш формують у вигляді стовпчика, який з одного кінця підпалюють. Визначена максимальна швидкість горіння порівнюється з максимальною швидкістю горіння базової суміші.

1.5. КРИТЕРІЙ ЯКОСТІ

У випадку необхідності застосовують будь-який метод подрібнення та змішування, але за умови, щоб різниця в максимальній швидкості горіння з шести окремих тестів відрізнялась від середнього арифметичного значення не більше, ніж на 10%.

1.6. ОПИС МЕТОДУ

1.6.1. Підготовка

1.6.1.1. Речовина для тестування

Необхідно зменшити зразок речовини до розміру частинок < 0,125 мм, застосувавши такий метод: просіяти речовину, перемолоти решту шматків, повторити процедуру до повного просіювання.

Можна застосовувати будь-який з методів подрібнення та просіювання, якщо вони відповідають критеріям якості.

Перед приготуванням суміші речовину висушують при температурі 105 град.С до отримання постійної ваги. У випадку, якщо температура розпаду речовини є нижчою 105 град.С, речовину потрібно просушити при відповідній нижчій температурі.

1.6.1.2. Вогненебезпечна речовина

В якості вогненебезпечної речовини використовують порошкоподібну целюлозу. Це має бути целюлоза для тонкошарової або колонкової хроматографії. Целюлозний зразок, в якому довжина волокон є більшою 85% між 0,020 та 0,075 мм, вважається таким, що підходить для тесту. Целюлозний порошок пропускають крізь сито з розміром вічок в 0,125 мм. Таку ж партію целюлози слід використовувати в ході проведення тесту.

Перед приготуванням суміші порошкоподібну целюлозу висушують при температурі 105 град.С до отримання постійної ваги.

Якщо під час проведення попереднього тесту використовують борошно грубого млива, необхідно зібрати м'яке борошно, що проходить крізь вічка сита товщиною 1,6 мм, потім добре перемішати, просушити при температурі 105 град.С протягом чотирьох годин так, щоб товщина шару борошна була не більшою 25 мм. Просушене та охолоджене борошно зберігають в герметично закритому контейнері, заповненому до максимуму, впродовж 24 годин.

1.6.1.3. Джерело запалювання

В якості джерела запалювання використовують гаряче полум'я з газової горілки, мінімальною товщиною 5 мм. При використанні іншого джерела запалювання (наприклад, під час проведення тесту в умовах інертної атмосфери) необхідно повідомляти про хід експерименту та доцільність його проведення.

1.6.2. Проведення тестування

Примітка:

Особливу увагу та обережність слід виявляти у випадку застосування сумішей окислювачів з целюлозою чи борошном грубого млива, які вважаються потенційно вибухонебезпечними.

1.6.2.1. Попередній скрінінг - тест

Речовина змішується належним чином із сухою целюлозою чи борошном грубого млива в пропорції: 2 (тестована речовина) до 1 (целюлоза або борошно грубого млива) на вагу. Далі суміш за допомогою спеціальної форми, не сильно втрамбовуючи, викладають у вигляді маленької конусоподібної гірки, розміри якої становить 3,5 см (діаметр основи) х 2,5 см (висота). В якості форми можна використовувати лабораторну скляну лійку, яка закривається пробкою.

Сформовану конусоподібну гірку викладають на холодній, непористій платформі з низькою теплопровідністю та нездатністю до спалахування. Тестування проводять у витяжній шафі, відповідно до пункту 1.6.2.2.

До гірки з речовиною підводять джерело запалювання. Ведуться спостереження та записуються показники щодо сили та тривалості результату реакції.

Якщо достатня сила реакції, тоді речовина вважається окислювальною.

У випадку, якщо є сумніви щодо результатів реакції, тоді необхідно провести тестування "поїздом".

1.6.2.2. Тестування "потягом"

Необхідно приготувати суміші окислювача з целюлозою, де вміст окислювача на вагу становить 10-90% в 10% інкрементах. В граничних випадках використовують суміші проміжного окислювача з целюлозою, щоб отримати якомога точнішу максимальну швидкість горіння.

Речовину формують у вигляді стовпчика за допомогою спеціальної металевої прес-форми завдовжки 250 мм, з поперечним перерізом трикутної форми, внутрішньою висотою 10 мм та шириною 20 мм. По обидва боки прес-форми повздовж кріпляться два металевих листи, що слугують своєрідними боковими обмежувачами і виступають на 2 мм за верхній край поперечного перерізу трикутної форми (див. малюнок). Таку конструкцію довільно заповнюють сумішшю з невеликим надлишком. Після того, як прес-форму один раз кинули на тверду суху поверхню з висоти 2 см, надлишок суміші акуратно зчищають аркушем паперу, тримаючи його під нахилом. (Така процедура кидання та зчищання проводиться для вирівнювання суміші у формі). Потім забирають бокові обмежувачі, а решту суміші розгладжують за допомогою валика. Далі, поверху прес-форми кладуть непористу платформу з низькою теплопровідністю та нездатністю до спалахування. Після цього таку конструкцію перевертають, а пресформу забирають.

Розташуйте стовпчик з сумішшю в поперечному до протягу напрямку у витяжній шафі.

Швидкість повітря в ході тесту має бути незмінною, а також такою, щоб унеможливити вихід димів та газів у лабораторію. Довкола всього пристрою піднімають захисний щит від протягу.

Враховуючи те, що деякі речовини та целюлоза є гігроскопічними (тобто, вбирають вологу), тестування необхідно проводити якомога швидко.

Один край стовпчика із сумішшю запалюють від полум'я.

Після того, як зона реакції поширилась на початкову 30-тиміліметрову відстань, необхідно заміряти час реакції на 200 мм.

Тестування проводять із базовою сумішшю, і, щонайменше, один раз з сумішшю із целюлозою.

У випадку, якщо максимальна швидкість горіння виявиться набагато більшою, ніж швидкість горіння базової суміші, тестування можна зупинити; в іншому випадку тест потрібно повторювати по 5 хвилин для кожної з трьох сумішей, задаючи при цьому найбільшу швидкість горіння.

Якщо ж є підозра того, що отриманий результат є помилковим, тоді експеримент повторюють, використовуючи інертну речовину з подібним розміром часток, наприклад, кізельгур, замість целюлози. В якості альтернативи, речовина з целюлозою, маючи найбільшу швидкість горіння, підлягає повторному тестуванню в інертній атмосфері (< 2% v/v вміст кисню).

2. ДАНІ

В цілях безпеки необхідно брати до уваги максимальну швидкість горіння (не середній показник), як швидкість, що є характерною для окислювальних властивостей тестованої речовини.

Для оцінки швидкості підходить найвищий показник швидкості горіння, отриманий в результаті серії з шести тестів.

Побудуйте графік, на якому буде показано найвищий показник швидкості горіння по кожній суміші в залежності від концентрації окислювача. На основі графіка отримайте максимальну швидкість горіння.

Шість вирахуваних показників швидкості горіння однієї серії, отриманих із суміші з максимальною швидкістю горіння, не повинні відрізнятись від арифметичного середнього показника більше, ніж на 10%; в іншому ж випадку необхідно вдосконалити методи подрібнення та змішування речовини.

Порівняйте отриману максимальну швидкість горіння з максимальною швидкістю горіння базової суміші (див. пункт 1.3).

Якщо тестування проводять в інертній атмосфері, максимальна швидкість реакції порівнюється з швидкістю реакції базової суміші в інертній атмосфері.

3. ПОВІДОМЛЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

3.1. ПОВІДОМЛЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ ТЕСТУВАННЯ

За необхідністю, результати тестування мають містити наступну інформацію:

- точну специфікацію речовини, склад, відсутність домішок, вміст вологи, тощо,

- обробку зразка тестованої речовини (наприклад, подрібнення, висушування),

- джерело запалювання, яке використовується в ході тестування,

- результати вимірювань,

- режим/стан реакції (наприклад, спалахування поверхні речовини, прогорання крізь цілу суміш, будь-яка інформація щодо продуктів горіння, тощо),

- всі додаткові зауваження щодо інтерпретації результатів, включаючи опис сили та енергії (полум'я, спалахування, випаровування диму/газів, повільне тління, тощо), а також інформація про приблизну тривалість процесу на прикладі попереднього скрінінг - тесту, як для тестованої, так і для базової речовини,

- результати тестів інертної речовини, за наявності,

- результати тестів в інертній атмосфері, за наявності.

3.2. ІНТЕРПРЕТАЦІЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

Речовину вважають такою, що має окислювальні властивості, якщо:

(а) в ході проведення попереднього скрінінг - тесту виникає сильна реакція;

(b) в ході проведення повномасштабного тесту буде виявлено, що швидкість горіння протестованих сумішей є більшою від (або дорівнює) максимальної швидкості горіння базової суміші целюлози та барію нітрату.

Для того, щоб уникнути помилкових результатів тесту, під час інтерпретації результатів необхідно враховувати процес тестування інертного матеріалу та/або тестування в умовах інертної атмосфери.

4. ПОСИЛАННЯ

NF T 20-035 (September 85) Chemical products for industrial use. Determination of the oxidising properties of solids.

Додаток

Малюнок ( 994_b14 )

А.18. СЕРЕДНЯ МОЛЕКУЛЯРНА МАСА ТА МОЛЕКУЛЯРНО-МАСОВИЙ РОЗПОДІЛ ПОЛІМЕРІВ

1. МЕТОД

Метод гельпроникаючої хроматографії є повторенням ОЕСР ТІ ((1996). Основні принципи та подальша технічна інформація подається в посиланні(1).

1.1. ВСТУП

Враховуючи те, що властивості полімерів досить різноманітні, тому неможливо описати один окремий метод, який би визначав умови для розподілу та оцінки, що розповсюджуються на всі можливі особливості та специфіку розподілення полімерів. Особливо це стосується систем складних полімерів, які не піддаються методу гельпроникаючої хроматографії (ГПХ). Таким чином, коли не вдається провести метод ГПХ, молекулярну масу можливо визначити за допомогою інших методів (див. Додаток). У таких випадках необхідно надати повну інформацію щодо деталей та доцільності застосовуваного методу.

Описаний метод оснований на Стандарті HIC 55672 (1). Детальну інформацію щодо того, як проводити експерименти та оцінювати дані, можна знайти в цьому Стандарті HIC. Якщо необхідно змінити умови експериментів, необхідно подати інформацію щодо доцільності таких змін. Також, можна застосовувати інші стандарти, якщо на них є відповідні посилання. В описаному методі для калібрування використовуються зразки полістиролу певної полідисперсності. В методі можливі зміни, якщо це необхідно для певних полімерів, наприклад, у випадку з водорозчинними та довголанцюговими полімерами.

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ ТА ОДИНИЦІ ВИМІРУ

Середньочислова молекулярна маса М та середньомасова n

молекулярна маса М  визначаються наступними рівняннями:
                  w

n                            n
            S  H                         S  H  x M
           i=1  i                       i=1  i    i
     M  = ----------              M  = ---------------
      n    n                       w      n
           S  H /M                        S  H
          i=1  i  i                      i=1  i

де Н - рівень сигналу детектора від основної лінії для i

об'єму утримування V ,
                    i

M - молекулярна маса частки полімеру при об'ємі утримування

V  та n - точка вводу даних.
 i

S - знак суми.

Ширина розподілення молекулярної маси, що є показником дисперсності системи, задається у співвідношенні М /М . w n

1.3. БАЗОВІ СУМІШІ

Оскільки метод ГПХ є досить відносним, тому необхідно проводити калібрування. Для цього, як правило, використовують зразки полістиролу певної середньої молекулярної маси М та М та n w

розподільної  маси.  Зразки  викладають вузькими смужками в лінію.
Калібрувальна   крива   застосовується   лише    для    визначення
молекулярної маси невідомого зразка,  якщо умови розподілу пробних
та основних зразків визначались індивідуально.

Визначений взаємозв'язок між молекулярною масою та об'ємом елюювання допускається лише за певних умов в окремо взятому експерименті. Перш за все, такі умови включають температуру, розчинник (або розчинювальну суміш), хроматографічні умови та колонку розподілу або систему колонок.

Таким чином, показники молекулярної маси визначеного зразка - це лише відносні показники, які характеризуються, як "відносні показники молекулярної маси полістиролу". Це означає, що, в залежності від тих структурно-хімічних відмінностей, які існують між пробними та основними зразками, показники молекулярної маси можуть більш-менш відхилятись від абсолютних показників. Якщо використовуються інші основні зразки, наприклад, поліетиленгліколь, поліетилен оксид, поліметилметакрилат, поліакрилова кислота, тоді необхідно обумовити доцільність їх застосування.

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ТЕСТУВАННЯ

За допомогою методу ГПХ можна визначити, як розподілення молекулярної маси зразка, так і показники середньої молекулярної маси (М та М ). Метод ГПХ - це особливий вид рідинної n w

хроматографії,  в  якому  зразок  розподіляють  у відповідності до
гідродинамічного об'єму окремих компонентів(2).

Розподіл відбувається тоді, коли зразок проходить крізь колону, заповнену пористим матеріалом, як правило, органічним гелем. Молекули малих розмірів проходять крізь пори, на відміну від великих, які затримуються. Таким чином, ланцюг з великих молекул є коротшим, і вони елююються першими. Молекули середніх розмірів проходять крізь деякі пори та елююються пізніше. Найменші молекули, чий гідродинамічний радіус менший за розмір гелевих пор, можуть пройти крізь усі пори. Такі молекули елююються останніми.

В ідеальному варіанті повинно бути так, щоб на розподіл повністю впливав розмір різновидів молекул, але на практиці досить важко уникнути хоча б деяких ефектів поглинання. Погіршити ситуацію можуть нерівно запакована колонка та недіючий об'єм (2).

Виявити поглинання можна за допомогою, наприклад, індексу рефракції або ультрафіолетового випромінювання. Результати відображаються на звичайній кривій розподілу. Проте, для того, щоб на цій кривій відобразити фактичні показники молекулярної маси, необхідно відкалібрувати колонку на прикладі полімерів визначеної молекулярної маси і, в ідеальному варіанті, майже подібної структури, наприклад, різних зразків полістиролу. Йдеться про типові результати на кривій Гауса, які мають відхилення через невелику криву розподілення в бік низької молекулярної ваги; вертикальна вісь показує кількість на вагу різних молекулярних різновидів, які є предметом елюювання, а горизонтальна - логарифмічну молекулярну вагу.

1.5. КРИТЕРІЙ ЯКОСТІ

Повторюваність (Відносне стандартне відхилення: ВСВ) об'єму елюювання має бути більшою за 0,3%. Необхідно перевірити повторюваність аналізу через внутрішній зразок, якщо оцінка хроматограми залежить від часу та не відповідає вищезгаданому критерію (1). Полідисперсність залежить від молекулярної ваги зразків. Типовими показниками для стандартних зразків полістиролу є такі:

M  <  2 000                   M /M  < 1,20
          p                             w  n

6
         2 000 <= M  <= 10             M /M  < 1,05
                   p                    w  n

6
         M  > 10                       M /M  < 1,20
          p                             w  n

(М -молекулярна вага основного зразка на максимальному піку) р

1.6. ОПИС МЕТОДУ ТЕСТУВАННЯ

1.6.1. Приготування стандартних розчинів полістиролу

Зразки полістиролу розчиняються методом обережного помішування в обраному елюенті. Під час приготування розчинів необхідно враховувати рекомендації виробника.

Показники концентрації обраних зразків залежать від різних факторів, наприклад, об'єму нагнітання, в'язкості розчину та чутливості аналітичного детектору. Максимальний об'єм нагнітання повинен відповідати довжині колонки, щоб уникнути перенавантаження. Типовими об'ємами нагнітання для аналітичних розподілів, при застосуванні методу ГПХ з колонкою 30 см х 7,8 мм, будуть показники 40-100 мю l. Допускаються вищі показники, але не більше 250 мю l. Перед самим калібруванням колонки необхідно визначити оптимальний показник співвідношення об'єму нагнітання та концентрації.

1.6.2. Приготування зразка розчину

До приготування зразка розчину висуваються, в принципі, такі самі вимоги. Зразок піддають розчиненню у відповідному розчиннику, наприклад, тетрагідрофурані (ТГФ) методом обережного струшування. За жодних умов не допускається, щоб розчинення проводилось у ультразвуковій ванні. Якщо необхідно, то зразок розчину прочищають мембранним фільтром з порами розміром 0,2-2 мю m.

Якщо присутні нерозчинені частинки, тоді під час остаточного повідомлення результатів цей факт записують, оскільки поява таких нерозчинених часток є результатом великої молекулярної маси. За допомогою відповідного методу необхідно визначити, який відсоток нерозчинених часток є присутній. Розчини необхідно використовувати протягом 24 годин.

1.6.3. Прилад

- розчинний резервуар;

- дегазатор (якщо необхідно);

- насос;

- погашувач імпульсів/вібрацій (якщо необхідно);

- система впорскування/нагнітання;

- хроматографічна колонка;

- детектор,

- водомір (для вимірювання швидкості рідини в посудині) (якщо необхідно),

- пристрій для записування даних,

- зливний резервуар.

Необхідно переконатись в тому, що система ГПХ є інертною по відношенню до утилізованих розчинників (наприклад, застосувавши металеві капілярні трубки для розчинника ТГФ).

1.6.4. Система впорскування та подачі розчинника

В колонку за допомогою автоматичного пробника або вручну завантажують певний об'єм зразка розчину в призначену для цього зону. У випадку, якщо користуються шприцом, непотрібно одразу швидко послаблювати та відпускати плунжер шприца, оскільки це може призвести до змін в ході подачі молекулярної маси. Система впорскування та подачі розчинника повинна, якщо можливо, бути такою, щоб там була відсутня вібрація (застосувавши погашувач вібрацій). Швидкість руху речовини повинна становити 1 мл/хвилину.

1.6.5. Колонка

В залежності від зразка, полімер характеризується методом застосування простої колонки або кількох, послідовно з'єднаних, колонок. В наявності та вільному доступі повинні бути пористі матеріали для колонки з визначеними властивостями (наприклад, розміром пор, забороною щодо використання). Вибір розподільного гелю та довжини колонки залежить, як від властивостей зразка (гідродинамічні об'єми, розподілення молекулярної маси), так і від особливих умов розподілу: розчинника, температури та швидкості руху речовини (1)(2)(3).

1.6.6. Теоретичні тарілки

Колонка або комбінація колонок, що використовуються для розподілу, повинні характеризуватись кількістю теоретичних тарілок. У випадку з розчинником елюювання ТГФ сюди входить завантаження колонки відомої довжини розчином етил бензолу чи іншим відповідним аполярним розчином. Кількість теоретичних тарілок визначається наступним рівнянням:

V                  V
                      e  2               e  2
         N = 5,54 (-----)  або N = 16 (---)
                    W                   W
                     1/2

де

N = кількість теоретичних тарілок

V = об'єм елюювання при максимумі піку

W = ширина піку на рівні нульової лінії

W = ширина піку на половині висоти

1/2

1.6.7. Ступінь очистки

В додаток до суми теоретичних тарілок, кількість яких визначає ширину смуги пропускання, певну роль відіграє ступінь очистки, що визначається кривизною калібрувальної кривої. Ступінь очистки колонки вираховується наступною формулою:

V      - V
              e, M     e, (10M )
                  x           x                      куб.см
         ----------------------------------- >= 6,0 (------)
         cross sectional area of the collumn          кв.см

область перехресного січення колонки,

де

V = об'єм елюювання полістиролу з молекулярною масою M

е, Mx                                                     x

V            =  об'єм  елюювання  полістиролу  з молекулярною
      е, (10.Mx)
масою в десять разів більшою

Визначення системи виражається наступним чином:

V   - V
                          e1    e2         1
              R    = 2 x --------- x --------------

1,2 W + W log (M /M ) 1 2 10 2 1

де

V , V = об'єми елюювання двох зразків полістиролу при

e1 e2

максимумі піку

W , W = ширина піку на рівні нульової лінії

1 2

M , M = молекулярна вага при максимумі піку (має

1 2

відрізнятись фактором 10)

R - показник колонки має бути більший, ніж 1.7(4).

1.6.8. Розчинники

Всі розчинники повинні мати високий рівень очистки (високий рівень очистки ТГФ повинен становити 99,5%). Резервуар з розчинником повинен бути достатньо великим, щоб провести калібрування колонки та декілька аналізів зразків. Розчинник має бути дегазованим перед транспортуванням в колонку через насос.

1.6.9. Контроль за температурою

Температура критичних внутрішніх компонентів (петльовий дозатор, колонки, детектор та трубна система) має бути сталою та відповідати типу обраного розчинника.

1.6.10. Детектор

Завдання детектора полягає в тому, щоб записувати кількісну концентрацію елюйованого в колонку зразка. Для того, щоб уникнути зайвого розмивання піків, об'єм кюветки секції детектора повинен бути якомога меншим. Він не має перевищувати 10 мю l, окрім детекторів розсіювання світла та в'язкості. Для визначення, як правило, використовується диференціальна рефрактометрія. Проте, можуть застосовуватись інші типи детекторів, типу, УЧ детектор в'язкості, ІЧ детектори в'язкості і т.д., якщо цього вимагають певні особливості розчинника.

2. ДАНІ ТА ПОВІДОМЛЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

2.1. ДАНІ

Стандарт(1) HIC має стосуватись критеріїв детального елюювання, а також і вимог щодо збору та обробки даних.

По кожному зразку проводять два окремих експерименти, які необхідно аналізувати в індивідуальному порядку.

M , M , M /M та M повинні надаватись по кожному

n w w n р

вимірюванню.  Необхідно чітко вказувати,  що отримані розрахункові
показники є відносними показниками щодо молекулярної ваги  взятого
зразка.

Після визначення об'ємів або часів утримання (за можливості відкоригованих за допомогою внутрішнього зразка), логарифмічні показники М (М максимуму піку калібрувального зразка) наносять р р

на  графік  стосовно  одного  з  цих  чисел.  Необхідно,  щоб було
щонайменше дві точки калібрування на групу з  десяти  молекулярних
мас,  і  п'ять  точок  вимірювання  для  загальної кривої,  що має
охопити теоретично заплановану  молекулярну  масу  зразка.  Крайня
точка  малої  молекулярної маси калібрувальної кривої визначається
n-гексилбензолом  або  іншим   відповідним   аполярним   розчином.
Середньочислові  та  середньовагові молекулярні маси,  як правило,
визначаються методом електронного обрахунку даних,  основаного  на
формулах  частини  1.2.  якщо  оцифровка  робиться вручну,  тоді в
якості посилання можна використати AABM D 3536-91 (3).

Крива розподілення подається, як таблиця або малюнок (частота диференціалу чи сумарне відсоткове співвідношення відносно логарифму М), графічно це виглядатиме так: група з десяти молекулярних мас повинна мати 4 см товщини і максимум піку становитиме близько 8 см висотою. Якщо йдеться про криві інтегрального розподілення, тоді різниця ординат між 0 та 100% має становити приблизно 10 см.

2.2. ПОВІДОМЛЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ ТЕСТУВАННЯ

Повідомлення результатів має включати наступну інформацію:

2.2.1. Тестована речовина:

- доступна інформація щодо точної специфікації речовини, добавок, домішків,

- опис обробки зразка; спостереження, проблеми в ході експерименту.

2.2.2. Прибори, апаратура:

- резервуар з елюентом, інертним газом, дегазація елюенту, його склад, наявність домішок,

- насос, погашувач імпульсів, система нагнітання,

- колонки розподілення (виробник, вся інформація стосовно характеристики колонок, наприклад, розмір пор, вид розподільного матеріалу, тощо, кількість, довжина та порядок застосованих колонок),

- кількість теоретичних тарілок колонки (або їх комбінація),

- інформація про всі екстраполяції, припущення та співставлення, зроблені в ході проведення експерименту, оцінки та обробки даних,

2.2.3. Всі замірювання, що використовувались при побудові калібрувальної кривої, повинні бути задокументовані в таблиці, яка включає наступну інформацію щодо кожного пункту калібрування:

- назва зразка,

- виробник зразка,

- характерні ознаки зразків M , M , M , M /M , інформація про р n w w n

які  надається  виробником  або  береться  із  замірів,  отриманих
пізніше, разом з детальною інформацією щодо методу визначення,

- об'єм нагнітання/впорскування та концентрація,

- показник M , який застосовується при калібруванні, р

- об'єм елюювання або відкоректований час утримання, визначений на максимальній відмітці,

- показник M , який вираховується на максимальній відмітці, р

- відносна помилка в % показника M та калібрувальної кривої. р

2.2.4. Оцінювання

- оцінювання за шкалою часу: методи для перевірки репродуктивності (метод коректування, внутрішній стандарт тощо),

- інформація стосовно того, чи оцінювання було проведено на основі об'єму елюювання, чи часу утримання,

- інформація про обмеження оцінювання, якщо максимальна межа не є достатньо проаналізованою,

- опис методів згладжування/вирівнювання, якщо такі застосовувались,

- підготовка та методи попередньої обробки зразка,

- наявність нерозчинених часток, якщо такі є,

- об'єм нагнітання/впорскування (мю l) та його концентрація (мг/мл),

- спостереження для виявлення факторів, які спричиняють відхилення від ідеального профілю ГПХ,

- детальний опис усіх змін у ході процедур тестування,

- деталі щодо типів помилок,

- будь-яка додаткова інформація щодо інтерпретації результатів.

3. ПОСИЛАННЯ

(1) DIN 55672(1995) Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1.

(2) Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D.D. eds., (1979) Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J.Wiley and Sons.

(3) ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC) American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

(4) ASTM D 5296-92, (1992) Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

Додаток

Приклади інших методів визначення середньої молекулярної маси (М ) полімерів n

Гелепроникаюча хроматографія (ГПХ) є найкращим методом для визначення М , особливо тоді, коли в наявності є набір стандартів n

(речовин, які добавляються в пробу для порівняльного вимірювання), структура яких відповідає структурі полімеру. Проте, якщо виникають практичні труднощі з використанням ГПХ або очікується, що речовина не відповідатиме регуляторному критерію М (для чого n

потрібно  підтвердження),  вдаються  до  наступних  альтернативних
методів:

1. Використання колігативних властивостей

1.1. Ебуліоскопія/кріоскопія

включає оцінювання щодо визначення моменту закипання (ебуліоскопія) або зниження температури/моменту замерзання (кріоскопія) розчинника при додаванні в нього полімеру. Суть методу полягає в тому, що дія розчиненого полімеру для визначення моменту закипання/замерзання рідини залежить від молекулярної маси полімеру (1)(2).

Придатність, М < 20000. n

1.2. Зниження парового тиску

включає вимірювання зниження парового тиску певної базової рідини до і після додавання визначеної кількості полімеру (1)(2).

Придатність, М  < 20000 (теоретично; на практиці допускається
                   n
будь-який обмежений показник).

1.3. Мембранна осмометрія

в основі лежить принцип осмосу, тобто, природна здатність молекул розчинника проходити крізь напівпроникну мембрану концентрованого розчину, щоб утворився баланс. Під час тестування концентрація розчину буде нульовою, оскільки концентрований розчин містить полімер. У результаті протягування розчинника крізь мембрану отримаємо перепад тиску, який залежить від концентрації та молекулярної маси полімеру (1)(3)(4).

Придатність, М між 20 000 - 200 000. n

1.4. Осмометрія парової фази

полягає в порівнянні швидкості випаровування чистого розчиненого аерозолю та його перетворенні на, щонайменше, три аерозолі, які містять полімер різних концентрацій (1)(2)(4).

Придатність, М < 20 000. n

2. Аналіз кінцевої групи

Для впровадження цього методу необхідно знати, як загальну структуру полімеру, так і принцип розриву ланцюга кінцевих груп (що мають бути відокремлені від основного скелету методом, наприклад, ядерного магнітного резонансу (ЯМР) або титруванням/дериватизацією). Визначення наявної в полімері молекулярної концентрації кінцевих груп впливає на визначення молекулярної маси (7)(8)(9).

Придатність, М до 50 000 (зі зниженням надійності). n

3. Посилання

(1) Billmeyer, F.W.Jr., (1984) Textbook of Polymer Science, 3rd Edn., John Wiley, New York.

(2) Glover, C.A., (1975) Absolute Colligative Property Methods. Chapter 4. In: Polymer Molecular Weights, Part I P.E. Slade, Jr.ed., Marcel Dekker, New York.

(3) ASTM D 3750-79, (1979) Standard Practice for Determination of Number-Average Molecular Weight of Polymers by Membrane Osmometry. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

(4) Coll, H. (1989) Membrane Osmometry. In: Determination of Molecular Weight, A.R. Cooper ed., J. Wiley and Sons, pp. 25-52.

(5) ASTM 3592-77, (1977) Standard Recommended Practice for Determination of Molecular Weight by Vapour Pressure, American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

(6) Morris, C.E.M., (1989) Vapour Pressure Osmometry. In: Determinationn of Molecular Weight, A.R. Cooper ed., John Wiley and Sons.

(7) Schroder, E., Muller, G., and Arndt, K-F., (1989) Polymer Characterisation, Carl Hanser Verlag, Munich.

(8) Garmon, R.G., (1975) End-Group Determinations, Chapter 3 In: Polymer Molecular Weights, Part I, P.E. Slade, Jr. ed., Marcel Dekker, New York.

(9) Amiya, S., et al. (1990) Pure and Applied Chemistry, 62, 2139-2146.

А.19. СКЛАД НИЗЬКОМОЛЕКУЛЯРНИХ ПОЛІМЕРІВ

1. МЕТОД

Метод гелепроникаючої хроматографії дублює ТІ (Тестові інструкції) ОЕСР (Організації економічного співробітництва та розвитку) 119 (1996). Основні принципи та подальша технічна інформація подаються в посиланнях.

1.1. ВСТУП

Враховуючи те, що властивості полімерів досить різноманітні, неможливо описати один єдиний метод, який би визначав умови для розподілу та оцінки, що розповсюджуються на всі можливі особливості й специфіку розподілення полімерів. Особливо це стосується систем складних полімерів, які не піддаються методу гельпроникаючої хроматографії (ГПХ). Таким чином, коли не вдається використати метод ГПХ, молекулярну масу можна визначити за допомогою інших методів (див. Додаток). У таких випадках необхідно надати повну інформацію щодо деталей і доцільності методу, що застосовується.

Описаний метод базується на Стандарті HIC 55672(1). Детальну інформацію щодо того, як проводити експерименти та оцінювати дані, можна знайти в цьому ж Стандарті HIC. Якщо необхідно змінити умови експериментів, подається інформацію щодо доцільності таких змін. Також, можна застосовувати інші стандарти, якщо на них є відповідні посилання. У описаному методі для калібрування використовуються зразки полістиролу певної полідисперсності. У методі можливі зміни, якщо це необхідно для певних полімерів, наприклад, у випадку з водорозчинними та довголанцюговими полімерами.

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ ТА ОДИНИЦІ ВИМІРУ

Низька молекулярна маса М довільно визначається як n

молекулярна маса нижче 1000 дальтон.

Середня молекулярна  маса  М   та середня молекулярна маса М
                                 n                               w
визначаються наступними рівняннями:

n                            n
            S  H                         S  H  x M
           i=1  i                       i=1  i    i
     M  = ----------              M  = ---------------
      n    n                       w      n
           S  H /M                        S  H
          i=1  i  i                      i=1  i

де

S - знак суми,

Н - рівень сигналу детектора від нульового рівня для об'єму

утримування V ,
             i

M - молекулярна маса частки полімеру при об'ємі утримування

V  та n - кількість введення даних.
 i

1.3. БАЗОВІ СУМІШІ

Оскільки метод ГПХ є досить відносним, необхідно проводити калібрування. Для цього, як правило, використовують зразки полістиролу лінійної конструкції й певної середньої молекулярної маси М та М та розподільної маси. Калібрувальна крива n w

застосовується лише для визначення  молекулярної  маси  невідомого
зразка,   якщо   умови   розподілу  пробних  та  основних  зразків
визначались індивідуально.

Визначений взаємозв'язок між молекулярною масою та об'ємом елюювання допускається лише за певних умов у окремому експерименті. Перш за все, такі умови включають температуру, розчинник (або розчинну суміш), хроматографічні умови й колонку розподілу або систему колонок.

Таким чином, показники молекулярної маси визначеного зразка - це лише відносні показники, які характеризуються як "відносні показники молекулярної маси полістиролу". Це означає, що, залежно від тих структурно-хімічних відмінностей, які існують між пробними та основними зразками й стандартом, показники молекулярної маси можуть дещо відхилятись від абсолютних показників. Якщо використовуються інші стандарти, наприклад, поліетиленгліколь, поліетилен оксид, поліметилметакрилат, поліакрилова кислота, необхідно обумовити доцільність їх використання.

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ТЕСТУВАННЯ

хроматографії,  у  якому   зразок   розподіляють   відповідно   до
гідродинамічного об'єму окремих компонентів (2).

Розподіл відбувається тоді, коли зразок проходить крізь колону, заповнену пористим матеріалом, як правило, органічним гелем. Молекули малих розмірів проходять крізь пори, на відміну від великих, які затримуються. Таким чином, ланцюг з великих молекул є коротшим, і вони елююються першими. Молекули середніх розмірів проходять крізь деякі пори та елююються пізніше. Найменші молекули, гідродинамічний радіус яких менший за розмір гелевих пор, можуть пройти крізь усі пори. Такі молекули елююються останніми.

В ідеальному варіанті повинно бути так, щоб розподіл молекулярних часток повністю залежав від їхнього розміру, але на практиці досить важко уникнути хоча б кількох ефектів поглинання. Погіршити ситуацію можуть нерівно запакована колонка та мертвий простір (2).

Виявити поглинання можна за допомогою, наприклад, індексу рефракції або ультрафіолетового випромінювання. Результати відображаються на звичайній кривій розподілу. Проте, для того, щоб на цій кривій відобразити фактичні показники молекулярної маси, необхідно відкалібрувати колонку на прикладі полімерів визначеної молекулярної маси і, в ідеальному варіанті, майже подібної структури, наприклад, різних зразків полістиролу. Типово, що йдеться про результати на кривій Гауса, які мають відхилення через невелику криву розподілення в бік низької молекулярної ваги; вертикальна вісь показує кількість різних молекулярних елюючих часток на певну одиницю ваги, а горизонтальна - логарифмічну молекулярну вагу.

1.5. КРИТЕРІЙ ЯКОСТІ

Повторюваність (Відносне стандартне відхилення: ВСВ) об'єму елюювання повинна бути більшою за 0,3%. Необхідно перевірити повторюваність аналізу через внутрішній стандарт, якщо оцінка хроматограми залежить від часу та не відповідає вищезгаданому критерію (1). Полідисперсність залежить від молекулярної ваги зразків. Типовими показниками для стандартних зразків полістиролу є такі:

M  <  2 000                   M /M  < 1,20
          p                             w  n

6
         2 000 <= M  <= 10             M /M  < 1,05
                   p                    w  n

6
         M  > 10                       M /M  < 1,20
          p                             w  n

(М -молекулярна вага основного зразка на максимальній p

відмітці)

1.6. ОПИС МЕТОДУ ТЕСТУВАННЯ

1.6.1. Приготування стандартних розчинів полістиролу

Показники концентрації вибраних зразків залежать від різних факторів, наприклад, від об'єму нагнітання/впорскування, в'язкості розчину та чутливості аналітичного детектору. Максимальний об'єм нагнітання повинен відповідати довжині колонки, щоб уникнути перенавантаження. Типовими об'ємами нагнітання для аналітичних розподілів, при застосуванні методу ГПХ з колонкою 30 см х 7,8 мм, будуть показники 40-100 мю l. Допускаються вищі показники, але не більше за 250 мю l. Перед самим калібруванням колонки потрібно визначити оптимальний показник співвідношення об'єму нагнітання та концентрації.

1.6.2. Приготування зразка розчину

До приготування зразка розчинів висуваються, загалом, ті ж самі вимоги. Зразок піддають розчиненню у відповідному розчиннику, наприклад, тетрагідрофурані (ТГФ) методом обережного струшування. За жодних умов не допускається, щоб розчинення проводилось в ультразвуковій ванні. За необхідності зразок розчину прочищають мембранним фільтром з порами розміром 0,2-2 мю m.

Інформація про наявність нерозчинних часто має міститися в остаточному звіті, оскільки їхня поява є результатом великої молекулярної маси. За допомогою відповідного методу необхідно визначити відсоток нерозчинених часток. Розчини необхідно використовувати протягом 24 годин.

1.6.3. Коректування суміші: виявлення домішок та добавок

Як правило, необхідно проводити коректування складу груп речовин M < 1 000 в суміші на предмет виявлення в ній особливих неполімерних компонентів (наприклад, домішки та/чи добавки), але лише за умов, коли вони складають < 1%. Це проводиться методом прямого аналізу полімерного розчину або елюата ГПХ.

У тих випадках, коли елюат після проходження колонки є надто розбавленим, подальший аналіз проводять із застосуванням вже концентрованого елюату. Може виникнути необхідність випарувати елюат до сухого стану й розчинити його знову. Концентрація елюата досягається щоб шляхом уникнення змін в самому елюаті. Обробка елюата після стадії ГПХ залежить від аналітичного методу, що застосовується для кількісного аналізу.

1.6.4. Прилад

Прилад ГПХ складається з наступних компонентів:

- розчинний резервуар;

- дегазатор (якщо необхідно);

- насос;

- погашувач імпульсів/вібрацій (якщо необхідно);

- система впорскування/нагнітання;

- хроматографічна колонка;

- детектор,

- водомір (якщо необхідно),

- пристрій для записування даних,

- зливний резервуар.

Необхідно переконатись в тому, що система ГПХ є інертною стосовно утилізованих розчинників (наприклад, застосувавши металеві капілярні трубки для розчинника ТГФ).

1.6.5. Система впорскування та подачі розчинника

1.6.6. Колонка

Залежно від зразка, полімер описують застосовуючи одну або кілька простих колонок, з'єднаних послідовно. Наявними та у вільному доступі повинні бути пористі матеріали для колонки з визначеними властивостями (наприклад, розміром пор, спеціальними обмеженнями). Вибір розподільного гелю та довжини колонки залежить від властивостей зразка (гідродинамічні об'єми, розподілення молекулярної маси) і від особливих умов розподілу: розчинника, температури та швидкості руху речовини (1)(2)(3).

1.6.7. Теоретичні пластини

Колонка або комбінація колонок, що використовуються для розподілу, повинні бути охарактеризованими теоретичними пластинами. У випадку з розчинником елюювання ТГФ сюди входить заповнення колонки певної довжини розчином етил бензолу чи іншим відповідним аполярним розчином. Кількість теоретичних пластин визначається наступним рівнянням:

V                  V
                      e  2               e  2
         N = 5,54 (-----)  або N = 16 (---)
                    W                   W
                     1/2

де

N = кількість теоретичних пластин

V = об'єм елюювання при максимальній відмітці

W = ширина меж на нульовій відмітці

W = ширина меж на половині висоти

1/2

1.6.8. Ступінь очистки

У додаток до суми теоретичних пластин, кількість яких визначає ширину смуги пропускання, певну роль відіграє ступінь очистки, що визначається кривизною калібрувальної кривої. Ступінь очистки колонки вираховується за наступною формулою:

V      - V
              e, M     e, (10M )
                  x           x                       куб.см
         ------------------------------------ >= 6,0 (------)
         область перехресного січення колонки          кв.см

де

V = об'єм елюювання полістиролу з молекулярною масою M

е, Mx                                                     х

V            =  об'єм  елюювання  полістиролу  з молекулярною
      е, (10.Mx)
масою, більшою в десять разів

Визначення системи визначається наступним чином:

V   - V
                          e1    e2         1
              R    = 2 x --------- x --------------

1,2 W + W log (M /M ) 1 2 10 2 1

де

V , V = об'єми елюювання двох зразків полістиролу на

e1 e2

максимальній відмітці

W , W = ширина меж на нульовій відмітці

1 2

M , M = молекулярна вага при максимумі піку (повинна

1 2

відрізнятись фактором 10)

R - показник колонки повинен бути більший, ніж 1.7(4).

1.6.9. Розчинники

Усі розчинники повинні мати високий рівень очистки (високий рівень очистки ТГФ повинен становити 99,5%). Резервуар з розчинником повинен бути достатньо великим, щоб провести калібрування колонки та декілька аналізів зразків. Розчинник повинен бути дегазованим в колонку через насос перед транспортуванням.

1.6.10. Контроль температури

Температура критичних внутрішніх компонентів (петлевий дозатор, колонки, детектор та система труб) повинна бути сталою й відповідати типу обраного розчинника.

1.6.11. Детектор

Завдання детектора полягає в тому, щоб записувати кількісну концентрацію елюйованого в колонку зразка. Для того, щоб уникнути зайвого розмивання меж, об'єм кюветки секції детектора повинен бути якомога меншим.

Він не повинен перевищувати 10 мкл, окрім детекторів розсіювання світла та в'язкості. Для визначення, як правило, використовується диференціальна рефрактометрія. Проте, можуть застосовуватись інші типи детекторів, типу, УЧ детектор в'язкості, ІЧ детектори в'язкості й т.д., якщо цього вимагають особливості розчинника.

2. ДАНІ ТА ЗВІТНІСТЬ

2.1. ДАНІ

Стандарт (1) HIC стосується критеріїв детального елюювання, а також вимог щодо збору та обробки даних.

З кожним зразком проводять два окремих експерименти, які необхідно аналізувати в індивідуальному порядку. В усіх випадках необхідно також надавати дані з холостих проб, які обробляються так само, як і зразок.

Необхідно чітко вказувати, що отримані розрахункові показники є відносними показниками щодо молекулярної ваги взятого зразка.

Після визначення об'ємів або часу утримання (за можливості відкоректованих за допомогою внутрішнього зразка), логарифмічні показники М (М максимальної межі калібрувального зразка) вносять р р

в графік відносно відповідно до їх кількості.  Необхідно, щоб було
щонайменше дві відмітки про калібрування на групу з десяти молекул
і п'ять вимірювань для загальної кривої, що має охопити теоретично
заплановану  молекулярну  масу  зразка.  Крайня  відмітка  низької
молекулярної     маси     калібрувальної    кривої    визначається
n-гексилбензолом  або  іншим   відповідним   аполярним   розчином.
Середньокількісні та середньовагові молекулярні маси,  як правило,
визначаються методом електронного обрахунку даних, що базується на
формулах  пункту  1.2.  Якщо обрахунки робляться вручну,  в якості
посилання можна використовувати AABM D 3536-91 (3).

Якщо який-небудь з нерозчинних полімерів затримується в колонці, очевидно,що його молекулярна маса буде більшою, ніж маса розчинної частки. Тож, якщо не звернути на це уваги, такий факт може призвести до переоцінки визначення малої молекулярної маси. Інформація щодо коректування малої молекулярної маси нерозчинених полімерів представлена в Додатку.

Крива розподілення подається у вигляді таблиці або малюнку (частота диференціалу чи сумарне процентне співвідношення відносно логарифму М). Графічно це виглядатиме так: група з десяти молекулярних мас повинна бути 4 см завтовшки, і максимальна відмітка становитиме близько 8 см у висоту. Якщо йдеться про криві інтегрального розподілення, різниця ординат між 0 та 100% повинна становити приблизно 10 см.

2.2. ЗВІТНІСТЬ

Звітність повинна містити наступну інформацію:

2.2.1. Тестована речовина:

- доступна інформація щодо точної специфікації речовини, добавок, домішок,

- опис обробки зразка; спостереження, проблем, що виникли в ході експерименту.

2.2.2. Прибори, апаратура:

- резервуар з елюентом, інертним газом, дегазація елюенту, його склад, наявність домішок,

- насос, погашувач імпульсів, система нагнітання,

- колонки розподілення (виробник, вся інформація стосовно характеристики колонок, наприклад, розмір пор, вид розподільного матеріалу тощо, кількість, тривалість і порядок застосованих колонок),

- кількість теоретичних тарілок колонки (або їх комбінація), ступінь очистки (розрізнення системи),

- інформація щодо симетрії меж,

- температура колонки, вид температурного контролю,

- детектор (принцип вимірювання, тип, об'єм кюветки),

- водомір, якщо такий використовується (виробник, принцип вимірювання),

- система запису та обробки даних (апаратура й комп'ютерне програмне забезпечення).

2.2.3. Калібрування системи

- детальний опис методу, що застосовується для побудови калібрувальної кривої,

- інформація про критерій якісної оцінки методу (наприклад, кореляційний коефіцієнт, остаточна сума квадратів тощо),

- всі замірювання, що використовувались при побудові калібрувальної кривої, повинні бути задокументовані в таблиці, яка включає наступну інформацію про кожний пункт калібрування:

- назва зразка,

- виробник зразка,

- характерні ознаки зразків M , M , M , M /M , інформація про p n w w n

які  надається  виробником  або  береться  з  пізніше   проведених
замірювань, разом з детальною інформацією щодо методу визначення,

- об'єм нагнітання/впорскування та концентрація,

- показник M , який застосовується при калібруванні, p

- об'єм елюювання або відкоректований час утримання, визначений на максимальній відмітці,

- показник M , який вираховується на максимальній відмітці, p

- відносна помилка показника M та калібрувальної кривої у %. p

2.2.4. Інформація про низьку молекулярну масу полімеру:

- опис методів аналізу та спосіб проведення експериментів,

- інформація про відсоток низької молекулярної маси часток речовини (w/w) порівняно з цілим зразком,

- інформація у відсотках про наявність домішок, добавок та неполімерних часток порівняно з вагою цілого зразка,

2.2.5. Оцінювання

- оцінювання за часовою шкалою: методи для перевірки репродуктивності (метод коректування, внутрішній стандарт тощо),

- інформація стосовно того, чи оцінювання було проведено на основі об'єму елюювання, чи тривалості утримання,

- інформація про обмеження оцінювання, якщо межа не є повністю проаналізованою,

- опис методів згладжування/вирівнювання, якщо такі застосовувались,

- підготовка та методи попередньої обробки зразка,

- наявність нерозчинних часток, якщо такі є,

- об'єм нагнітання/впорскування (мкл) та його концентрація (мг/мл),

- спостереження для виявленню факторів, що призводять до відхилень від ідеального профілю ГПХ,

- детальний опис усіх змін під час процедур тестування,

- деталі щодо інтервалів помилок,

- будь-яка додаткова інформація щодо інтерпретації результатів.

3. ПОСИЛАННЯ

(1) DIN 55672 (1995) Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1.

(2) Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D.D. eds. (1979) Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons.

(3) ASTM D 3536-91, (1991) Standard Test method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

(4) ASTM D 5296-92, (1992) Standard Test method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

Додаток

Рекомендації щодо корекції низької молекулярної маси для виявлення нерозчинного полімеру

Якщо в зразку є нерозчинений полімер, це призводить до втрати маси під час проведення аналізу ГПХ. Нерозчинений полімер в будь-якому випадку утримуватиметься колонкою або фільтром як під час проходження розчинної частини зразка крізь колонку. У випадку, якщо вдається вирахувати коефіцієнт збільшення показника заломлення (dn/dc) полімеру, можна оцінити втрату маси зразка в колонці. Таким чином, корекція проводиться завдяки зовнішньому калібруванню із застосуванням стандартних матеріалів певної концентрації та dn/dc для того, щоб відкалібрувати показники рефрактометра. У подальших прикладах використовується стандарт полі(метилметакрилату) (ПММК).

При зовнішньому калібруванні акрилових полімерів, стандарту ПММК певної концентрації в тетрагідрофурані, використовується ГПХ аналіз, а отримані дані використовують для встановлення константи рефрактометра, як показано в даному рівнянні:

K = R/(C x V x dn/dc)

де:

K = константа рефрактометра (у мікровольт секундах/мл),

R = показник зразка-стандарту ПММК (в мікровольт/секунду),

C = концентрація зразка-стандарту ПММК (в мг/мл),

V = об'єм нагнітання/впорскування (в мл) та

dn/dc = інкремент показника заломлення ПММК у тетрагідрофурані (в мл/мг).

Для зразка-стандарту ПММК типовими є такі показники:

R = 2 937 891

C = 1,07 мг/мл

V = 0,1 мл

-5 dn/dc = 9 x 10 мл/мг

11 вихідний показник К, 3,05 х 10 потім використовують для вираховування теоретичного показника детектора, якщо 100% введеного полімеру пройшло елюювання детектором.

А.20. ОСОБЛИВОСТІ ПОВЕДІНКИ ПОЛІМЕРУ В ВОДІ ПРИ РОЗЧИНЕННІ/ВИОКРЕМЛЕННІ

1. МЕТОД

Метод гельпроникаючої хроматографії є повторенням ТІ (Тестових інструкцій) ОЕСР (Організація економічного співробітництва та розвитку) 120 (1997). Основні принципи та подальша технічна інформація подається в посиланні(1).

1.1. ВСТУП

Для деяких полімерів, наприклад, емульсійних, необхідно провести попередню обробку перед застосуванням нижчеописаного методу. Такий метод не застосовується до рідких полімерів, які реагують з водою за умов тестування.

У випадку, якщо метод не практичний або його неможливо використати, поведінку полімеру в воді при розчиненні та виокремленні можна дослідити іншими способами. Тоді необхідно надати повну детальну інформацію щодо необхідності та доцільності застосування обраного методу.

1.2. НЕОБХІДНІ РЕЧОВИНИ

Відсутні.

1.3. ПРИНЦИП МЕТОДУ

Поведінка полімеру при розчиненні та виокремленні у водному середовищі визначається за допомогою методу колби (див. Водорозчинність, Метод розділення рідини за допомогою колби) та нижчеописаних модифікацій.

1.4. КРИТЕРІЇ ЯКОСТІ

Відсутні.

1.5. ОПИС МЕТОДУ ТЕСТУВАННЯ

1.5.1. Обладнання

Для використання методу необхідно наступне обладнання:

- пристрій для подрібнення, наприклад, млинок для подрібнення частинок певного розміру,

- прилад для струшування з можливістю контролю температури,

- система з мембранним фільтром,

- відповідна аналітична апаратура,

- звичайне сито.

1.5.2. Приготування зразка

Представлений для тестування зразок необхідно спочатку подрібнити до розміру частинок 0,125 та 0,25 мм, використовуючи для цього відповідне сито. Для стабільності/стійкості зразка або для процесу подрібнення може бути необхідним вихоловання речовини. Гумові та каучукоподібні матеріали можна подрібнювати при температурі рідкого азоту (1).

Якщо ж неможливо отримати частинки потрібного розміру, необхідно докласти зусиль, щоб подрібнити зразок на якомога менші шматки й повідомити про отримані результати. У доповіді потрібно вказати умови збереження подрібненого зразка перед тестуванням.

1.5.3. Процедура

Три зразки тестованої речовини вагою 10 г зважуються в кожній з трьох посудин зі скляними пробками, і в кожну з них додається по 1000 мл води. Якщо використання 10 г полімеру виявиться неможливим, необхідно застосувати іншу максимально доступну кількість речовини, додавши при цьому необхідну кількість води.

Посудини закривають скляними пробками, а потім збовтують при температурі 20 град.С. Для цього необхідно застосовувати відповідний апарат для струшування/збовтування, що працює при сталій температурі. Після 24 годин вміст кожної посудини переміщують у центрифугу або фільтрують, а концентрацію полімеру в чистій водній фазі визначають відповідним аналітичним методом. Якщо ж таких методів немає, тоді загальну розчинність/виділення можна визначити із сухої маси того, що залишилось на фільтрі або з осаду в центрифузі.

З одного боку, необхідно, як правило, зробити кількісний аналіз домішок та добавок, а з іншого - визначити низьку молекулярну масу часток. Також важливо, проводити пусту пробу без тестованої речовини, для виявлення залишків, які утворюються в результаті експерименту.

Поведінка полімерів у водному середовищі під час розчинення/екстракції при 37 град.С, рН 2 і рН 9 може визначатись так само, як і в описаному експерименті при 20 град.С. Показників рН можна досягнути методом додавання відповідних розчинів основ або кислот, таких як соляна кислота, оцтова кислота, гідроксид натрію чи калію відповідного ступеня, або NH . 3

Залежно від того, який метод аналізу застосовувався, необхідно провести 1-2 тести. Одного вищеописаного тесту буде достатньо за доступності достатньо специфічних методів прямого аналізу водної фази на вміст полімеру. Проте, якщо таких методів немає й визначення розчинності/виокремлення полімеру зводиться до непрямого аналізу, визначаючи таким чином лише загальний вміст органічного вуглецю (ЗВОВ) у водному екстракті, тоді необхідно провести додатковий тест. Цей додатковий тест також проводиться тричі/в три етапи, використовуючи в десять разів менші полімерні зразки й таку саму кількість води, як в першому тесті.

1.5.4. Аналіз

1.5.4.1. Проведення тесту зі зразком одного розміру

Методи підходять для прямого аналізу компонентів полімеру у водній фазі. У якості альтернативи можна розглядати непрямий аналіз розчинених/добутих компонентів полімеру, визначаючи при цьому вміст розчинених часток та корегуючи речовину на наявність у ній неполімерних складників.

Аналіз водної фази для визначення загальної кількості полімерних часток можливий у випадку використання одного з достатньо чутливих методів, а саме:

- ЗВОВ, з використанням персульфату або розщепленого дихромату для отримання СО , а також подальшою оцінкою за 2

допомогою методу ІЧ або за допомогою хімічного аналізу,

- атомна абсорбційна спектрометрія (ААС) чи еквівалентні методи Виділення плазми з індуктивним зв'язком (ПІЗ) - для полімерів з вмістом силікону чи металу,

- УФ абсорбція або спектрофлуорометрія - для арильних полімерів,

- LC-MS для зразків з низькою молекулярною масою,

або методом вакуумного випаровування до сухого стану водного екстракту та спектроскопічним (ІЧ, УЧ, тощо) аналізом залишків/осаду, а також методом ААС/ПІЗ.

Якщо аналіз водної фази, як такої, неможливий, водний екстракт необхідно виділити за допомогою органічного розчинника, що не змішується з водою, наприклад, хлорованого вуглеводню. Потім розчинник випаровується, а осад аналізують відповідно до описаного методу аналізу складу полімерів. Якщо буде виявлено певні компоненти, що класифікуються, як домішки або добавки, необхідно їх усунути, щоб визначити рівень розчинності/виокремлення самого полімеру.

Якщо виокремлюють досить велику кількість такого матеріалу, може виявитись необхідним піддати виявлені залишки/осад аналізу РХВТ (Рідинна хроматографія високого тиску) або ГХ (газова хроматографія), щоб відрізнити домішки з мономеру та виведених з мономеру часток. Це необхідно для того, щоб визначити точний склад останнього.

У деяких випадках достатньо провести випаровування органічного розчинника, довести його до сухого стану та зважити сухий осад/залишок.

1.5.4.2. Проведення тесту двох зразків різних розмірів

Усі водні екстракти аналізують для виявлення ЗВОВ.

Проводять зважування нерозчиненої/невиокремленої частини зразка. Якщо після обробки в центрифузі або фільтрації вмісту кожної посудини буде виявлено, що залишки/осад полімеру залишаються на стінках, тоді посудину необхідно сполоснути фільтратом до повного очищення від видимого осаду. Після цього фільтрат знову віддають в центрифугу або фільтрують. Залишки, що залишаються на фільтрі або трубці центрифуги, висушують при 40 град.С, у вакуумі та зважують. Висушування необхідно продовжувати до отримання сталої ваги.

2. ДАНІ

2.1. ПРОВЕДЕННЯ ТЕСТУ ЗІ ЗРАЗКОМ ОДНОГО РОЗМІРУ

Необхідно подати результати дослідження зразків кожної з трьох колб окремо, а також середні показники, які виражаються в одиницях маси на об'єм розчину (як правило, мг/л) або маси на масу зразка полімеру (як правило, мг/г). Крім того, необхідно зафіксувати показник втрати ваги зразка (вираховується так: вага розчину ділиться на вагу початкового зразка). Відносні стандартні відхилення (ВСВ) також необхідно вираховувати. Індивідуальні показники також вираховуються для цілої речовини (полімер + необхідні добавки тощо), а також окремо для полімеру (наприклад, після виокремлення пропорційної частки з таких добавок).

2.2. ПРОВЕДЕННЯ ТЕСТУ З ДВОМА ЗРАЗКАМИ РІЗНИХ РОЗМІРІВ

Необхідно подати показники водного екстракту для виявлення ЗВОВ кожної з трьох колб окремо, а також середні показники кожного експерименту, які виражаються в одиницях маси на об'єм розчину (як правило, мг/л) або маси на масу початкового зразка полімеру (як правило, мгС/г).

Якщо показники великої й малої порції води не відрізняються, це може говорити про те, що всі екстраговані компоненти дійсно виокремилися. Тоді прямого аналізу проводити непотрібно.

Окрему вагу залишку/осадку не потрібно подавати й виражати у відсотковому співвідношенні з початковою вагою. У кожному експерименті потрібно вираховувати середні показники. Різниця між 100 та виявленим відсотковим співвідношенням вказує на співвідношення розчиненого та виокремленого матеріалу у вихідному зразку.

3. ЗВІТНІСТЬ

3.1. ЗВІТНІСТЬ ПРО ТЕСТУВАННЯ

Звітність про тестування повинна містити наступну інформацію:

3.1.1. Тестована речовина:

- доступна інформація про саму речовину (характерні особливості, домішки, добавки, вміст часток низької молекулярної маси).

3.1.2. Умови експерименту:

- опис застосованих методів та умов проведення експерименту,

- опис аналітичного методу та методу виявлення.

3.1.3. Результати:

- результати розчинення/виокремлення в мг/л; індивідуальні та середні показники тестів виокремлення, проведених з використанням різних розчинів для виявлення вмісту полімеру та домішок, добавок тощо,

- результати розчинності/виокремлення полімеру в мг/г,

- показники ЗВОВ у водних екстрактах, вага розчину та обчислені співвідношення, якщо такі вимірювання проводились,

- рН кожного зразка,

- інформація про показники холостих випробувань,

- посилання на хімічну нестійкість тестованої речовини, як під час самого тестування, так і процесу аналізу, за необхідності,

- будь-яка інформація щодо інтерпретації результатів.

4. ПОСИЛАННЯ

(1) DIN 53733 (1976) Zerkleinerung von Kunststofferzeugnissen fur Prufzwecke.

А.21. ОКИСЛЮВАЛЬНІ ВЛАСТИВОСТІ РІДИН

1. МЕТОД

1.1. ВСТУП

Метод полягає у вимірюванні здатності рідини збільшувати швидкість чи інтенсивність горіння легкозаймистої речовини, або утворювати суміш із легкозаймистою речовиною, що спонтанно спалахує під час змішування. За основу в даному методі використовується затверджений UN тест для окислювальних рідин(1), якому даний метод є еквівалентним . Проте, оскільки цей метод А.21 головним чином розроблений для того, щоб відповідати вимогам Положення ЄС N 1907/2006, вимагається порівняння лише з однією базовою речовиною. Тестування й порівняння з іншими додатковими базовими речовинами може бути необхідним тоді, коли очікується, що результати тестування використовуватимуться для інших потреб(1).

----------------

(1) Як, наприклад, у документі про правила транспортування UN.

Непотрібно проводити тестування, якщо дослідження структурної формули показують, без жодних підстав для сумнівів, що речовина дає екзотермічну реакцію з легкозаймистим матеріалом.

Важливо мати попередню інформацію щодо можливої вибухонебезпечності речовини перед проведенням самого тесту.

Тестування не застосовується до твердих речовин, газів, вибухонебезпечних або сильно вибухонебезпечних речовин та до органічного перекису водню.

Немає потреби проводити тестування, якщо є результати тестованої речовини з UN тестування для окислювальних рідин (1).

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ ТА ОДИНИЦІ ВИМІРЮВАННЯ

Середній час зростання тиску - це середній з вимірюваних показників часу показник тестованої суміші, за який тиск зростає від 690 кПа до 2 070 кПа вище атмосферного тиску.

1.3. БАЗОВА РЕЧОВИНА

65% (w/w) водно-азотна кислота (чистого реактиву) використовується в якості базової речовини (2).

----------------

(2) Кислоту потрібно титрувати перед тестуванням, щоб підтвердити її концентрацію.

Якщо остаточні результати тестування можуть бути використані з іншими цілями(1), варто провести тестування додаткових базових речовин(3).

----------------

(3) Наприклад, 50% (w/w) хлорної кислоти та 40% (w/w) натрієвої солі використовуються в посиланні 1.

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ТЕСТУВАННЯ

Тестовану рідину змішують у пропорції один до одного, згідно маси, з волокнистою целюлозою та переміщують у герметичний посуд. Непотрібно продовжувати експеримент, якщо під час змішування або наповнення посуду суміш спалахує.

Якщо ж суміш не спалахує, проводять повний тест. Суміш в герметичній посудині нагрівають та визначають середній показник часу зростання тиску від 690 кПа до 2 070 кПа вище атмосферного тиску. Отриманий показник порівнюють із середнім показником часу зростання тиску суміші базової речовини (речовин), змішаної в пропорції 1:1 з целюлозою.

1.5. КРИТЕРІЙ ЯКОСТІ

Отримані у ході проведення серії тестувань з п'яти спроб на прикладі однієї базової суміші результати не повинні відрізнятись від арифметичного середнього показника більше, ніж на 30%. Результати, що відрізняються більше, ніж на 30% від середнього показника, не повинні братись до уваги, і, відповідно, необхідно вдосконалити процес змішування та заповнення посуду складовими, а сам тест провести знову.

1.6. ОПИС МЕТОДУ

1.6.1. Підготовка

1.6.1.1. Займиста речовина

В якості займистої речовини використовують висушену волокнисту целюлозу з довжиною волокон 50-250 мю m та середнім діаметром 25 мю m(1). Целюлозу висушують до сталої ваги, викладаючи пластами завтовшки 25 мм при 105 град.С на чотири години й тримають у вологопоглинаючій печі до охолодження й придатності до використання. Вміст води у висушеній целюлозі не повинен перевищувати 0,5% сухої маси(2). При необхідності час висушування можна продовжити, щоб отримати бажаний результат(3). Той самий вид целюлози має використовуватися під час проведення усіх тестів.

----------------

(1) Наприклад, Целюлозний порошок хроматографічної колони ватману CF 11, каталог N 4021 050.

(2) Підтвердження титруванням методом Карла Фішера.

(3) Як альтернатива, такого ж вмісту води можна досягнути, наприклад, нагріванням при температурі 105 град.C в умовах вакууму протягом 24 годин.

1.6.1.2. Прилади

1.6.1.2.1. Герметичний посуд

Для проведення тестування необхідно застосовувати герметичний посуд, який складається з металевого герметичного резервуару циліндричної форми завдовжки 89 мм та зовнішнім діаметром 60 мм (див. малюнок 1). Для того, щоб полегшити тримання посуду під час кріплення пожежного та вентиляційного кранів, необхідно обробити на станку дві плоских грані (зменшуючи поперечний розріз посуду до 50 мм). Посуд, який має отвір діаметром 20 мм повинен мати з будь-якого боку внутрішній паз глибиною 19 мм та різьбу для того, щоб туди міг зайти однодюймовий гвинт Британської конічної різьби для труб (БТКР) або його метричний еквівалент. До викривленої грані герметичного посуду, на відстані 35 мм з одного кінця та 90 градусів від оброблених граней, прикручується боковий важіль подачі тиску. Щоб прикрутити важіль потрібно зробити заглиблення на 12 мм та нарізати з одного боку різьбу для гвинта 1/2 дюйми БТКР (або еквівалент в метричних одиницях). Якщо необхідно, тоді прикріплюють інертний ущільнювач або замазку, щоб уникнути виходу газу. Боковий важіль з отвором 6 мм має продовжується на 55 мм нижче корпусу герметичного посуду. На одному кінці важеля робиться паз та нарізується різьба для датчика тиску мембранного типу. Можна використовувати будь-який пристрій для вимірювання тиску, але за умови, що він не піддається впливу гарячих газів/парів або продуктів розпаду та витримує швидкість збільшення тиску від 690 до 2070 кПа, а його довжина становить не більше 5 метрів.

Кінець герметичного посуду з довшої від важеля сторони закривається протипожежною пробкою, до якого кріпляться два електроди, один з яких ізолюється, а інший заземлюється до корпусу пробки. До іншого кінця посуду кріплять запобіжну мембрану (витримує тиск, приблизно, 2200 кПа), яка фіксується заглушкою з 20-тиміліметровим отвором. Якщо необхідно, тоді до протипожежної пробки прикріплюють інертний ущільнювач або замазку, щоб уникнути виходу газу. Для закріплення пристрою в правильному положенні під час тесту використовують підставку (див. малюнок 2). Така підставка повинна мати основу з м'якої сталі та розміри: 235 мм x 184 мм x 6 мм та 185 мм довжини квадратного пустотілого профілю (КПП) 70 мм x 70 мм x 4 мм.

Профіль ріжуть із кожної з двох протилежних сторін одного кінця довжини КПП так, щоб профіль на двох плоских опорах був на 86 мм вищий за розміри профілю інтактної коробки. Кінці цих плоских опор вирізають під кутом 60 град. до горизонталі та приварюють до основи платформи. Прорізи розміром 22 мм завширшки та 46 мм глибиною обробляють з одного верхнього кінця профілю так, щоб коли герметичний посуд опускають у підставку, протипожежною пробкою спочатку, боковий важіль заходив у проріз. Сталевий лист завширшки 30 мм та завтовшки 6 мм приварюють до нижньої внутрішньої частини профілю коробки в якості прокладки. Два 7-миміліметрові гвинти з рифленою головкою прикручують з іншого боку, щоб герметичний посуд був міцно закріплена на місці. Знизу приварюють дві сталеві смужки завширшки 12 мм та завтовшки 6 мм. Їх приварюють до боків, що виступають за основу профілю коробки, для підтримки посудини.

1.6.1.2.2. Система нагнітання/впорскування

Система нагнітання/впорскування складається з 25-тисантиметрового нікель-хромового дроту діаметром 0,6 мм та з опором 3,85 ом/м. Це скручений витками дріт з діаметром витків 5 мм, що має форму котушки та кріпиться до електродів протипожежної пробки. Котушка повинна відповідати конфігураціям, як на мал. 3. Відстань між днищем герметичного посуду та низом котушки запалювання повинна бути 20 мм. Якщо електроди не регулюються, потрібно ізолювати керамічним покриттям провід нагнітання та днище посуду. Дріт, який нагрівається постійною напругою електроенергії, повинен видавати не менше 10 А.

1.6.2. Проведення тестування(4)

Повністю зібраний прилад з датчиком тиску та системою нагріву, але без запобіжної мембрани, має знаходитись в положенні із закритою протипожежною пробкою. 2,5 г рідини для тестування змішують з 2,5 г сухої целюлози в склянці, помішуючи скляним патичком(5). Задля безпеки перемішування необхідно проводити з використанням захисного щитка між оператором і сумішшю. Якщо під час змішування або заповнення суміш спалахує, подальше тестування не проводиться.

----------------

(4) Необхідно особливо обережно ставитись до сумішей окислювачів з целюлозою, як до потенційно вибухонебезпечних.

(5) На практиці цього можна досягти, приготувавши суміш 1:1 з тестованої рідини та целюлози, більшої кількості, ніж потрібно для тестування та передачі 5 +- 0,1 г в герметичний посуд. Для кожної проби використовують лише свіжу суміш.

Суміш додають невеликими кількостями до герметичного посуду так, щоб суміш заповнювала місце довкола котушки запалювання і мала з нею хороший контакт. Дуже важливо, щоб котушка не змінювала конфігурації, оскільки це може призвести до невірних результатів(1). Запобіжну мембрану ставлять на відповідне місце, а утримуючу пробку тісно затягують. Заповнений герметичний посуд ставлять на підставку для запалювання. Запобіжна мембрана знаходиться у верхньому положенні. Підставку поміщують в армовану витяжну шафу або камеру горіння. Напруга подається на внутрішні затискачі протипожежної пробки й дається розряд силою 10 А. Час між початком змішування та включенням подачі напруги не повинен перевищувати 10 хвилин.

----------------

(1) Зокрема, слід уникати контакту із розташованими поруч витками котушки.

Датчик тиску дає сигнал, який відповідна система записує, що дозволяє оцінити та сформувати запис сталого часу профілю тиску (наприклад, самозаписуючий пристрій невстановлених процесів разом з діаграмним записуючим пристроєм). Суміш нагрівають 60 секунд або поки запобіжна мембрана не розірветься. Якщо мембрана не рветься, тоді необхідно, щоб суміш вистигла, і можна було б обережно зняти пристрій, але дотримуючись вимог безпеки, щоб не виникло зростання тиску. З тестованою речовиною та базовими речовинами проводять п'ять пробних тестувань. Необхідно в процесі роботи зафіксувати час зростання тиску від 690 кПа до 2070 кПа вище атмосферного. Вираховується середній показник часу зростання тиску.

В окремих випадках, речовини можуть сприяти зміні тиску (занадто високого чи занадто низького), що спричиняється хімічними реакціями, які не характеризують окислювальні властивості речовини. Іноді може виникнути потреба в повторенні тесту з використанням інертної речовини, наприклад, діатоміту (кізельгуру) замість целюлози, щоб з'ясувати сутність реакції.

2. ДАНІ

Час зростання тиску, як для тестованої, так і для базової речовини (речовин). Час зростання тиску для тестів, в яких використовувалась інертна речовина (якщо такий тест проводився).

2.1. ОПРАЦЮВАННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

Вираховується час зростання тиску, як для тестованої, так і для базової речовини (речовин).

Середній показник часу зростання тиску для тестів, в яких використовувалась інертна речовина (якщо такий тест проводився).

Деякі прикладів результатів наведено в Таблиці 1.

Таблиця 1

Приклади результатів(а)

------------------------------------------------------------------
|           Речовина(b)          |       Середній показник       |
|                                |    часу зростання тиску на    |
|                                |  прикладі суміші з целюлозою  |
|                                |      в пропорції 1:1 (мс)     |
|--------------------------------+-------------------------------|
|Дихромат амонію, насичений      |            20 800             |
|водний розчин                   |                               |
|Нітрат кальцію, насичений       |             6 700             |
|водний розчин                   |                               |
|--------------------------------+-------------------------------|
|Нітрат заліза, насичений        |             4 133             |
|водний розчин                   |                               |
|--------------------------------+-------------------------------|
|Перхлорат літію, насичений      |             1 686             |
|водний розчин                   |                               |
|--------------------------------+-------------------------------|
|Перхлорат магнію, насичений     |              777              |
|водний розчин                   |                               |
|--------------------------------+-------------------------------|
|Нітрат нікелю, насичений        |             6 250             |
|водний розчин                   |                               |
|--------------------------------+-------------------------------|
|Азотна кислота, 65%             |            4 767(c)           |
|--------------------------------+-------------------------------|
|Хлорна кислота, 50%             |             121(c)            |
|--------------------------------+-------------------------------|
|Хлорна кислота, 55%             |              59               |
|--------------------------------+-------------------------------|
|Нітрат калію, 30% водний розчин |            26 690             |
|--------------------------------+-------------------------------|
|Нітрат срібла, насичений        |              (d)              |
|водний розчин                   |                               |
|--------------------------------+-------------------------------|
|Хлорат натрію, 40% водний розчин|            2 555(c)           |
|--------------------------------+-------------------------------|
|Нітрат натрію, 45% водного      |              4133             |
|розчину                         |                               |
|Інертна речовина                |                               |
|Вода: целюлоза                  |              (d)              |
------------------------------------------------------------------

----------------

(a) Див. посилання (1) для класифікації згідно схеми транспортування ООН.

(b) Вологі розчини потрібно готувати при 20 град.

(d) Максимальний тиск 2070 кПа не отримано.

3. ЗВІТНІСТЬ

3.1. ЗВІТНІСТЬ ПРО ТЕСТУВАННЯ

Звітність про тестування має містити наступну інформацію:

- характерні особливості тестованої речовини, її склад, наявність домішок тощо,

- концентрація тестованої речовини,

- методика висушування целюлози,

- вміст води в целюлозі,

- результати вимірювань,

- результати тестів з використанням інертної речовини, якщо такі проводились,

- розрахунок середнього показника часу зростання тиску,

- будь-які відхилення від норм використання методу та їх причини,

- будь-яка інформація чи зауваження щодо інтерпретації результатів.

3.2. ІНТЕРПРЕТАЦІЯ РУЗУЛЬТАТІВ(1)

----------------

(1) Див. посилання 1 про інтерпретацію результатів щодо положень ООН про правила перевезення кількох видів базових речовин.

Результати тестувань повинні оцінюватись на основі наступного:

(а) здатності суміші тестованої речовини та целюлози спонтанно спалахувати;

(b) порівняння середнього показника часу зростання тиску від 690 кПа до 2070 кПа з показниками базової речовини (речовин).

Рідина вважається окислювачем, якщо:

(а) суміш речовини та целюлози на вагу, в пропорції 1:1, спонтанно спалахує; або

(b) суміш речовини та целюлози на вагу, в пропорції 1:1, має середній показник часу зростання тиску менший, ніж показник суміші целюлози та водної азотної кислоти в пропорції 1:1.

Для уникнення неправильних результатів, при потребі, під час інтерпретації результатів необхідно враховувати результати, отримані в ході тестування речовини з інертним матеріалом.

4. ПОСИЛАННЯ

(1) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Manual of Tests and Criteria. 3rd revised edition. UN Publication No: ST/SG/AC.10/11/Rev. 3, 1999, page 342. Test O.2: Test for oxidising liquids.

Малюнок 1 ( 994_b14 )

Малюнок 2 ( 994_b14 )

Малюнок 3 ( 994_b14 )

ЧАСТИНА В: МЕТОДИ ВИЗНАЧЕННЯ ТОКСИЧНОСТІ ТА ІНШИХ НАСЛІДКІВ ДЛЯ ЗДОРОВ'Я

ЗМІСТ

ВСТУП

В.1 bis. ГОСТРА ПЕРОРАЛЬНА ТОКСИЧНІСТЬ - ПРОЦЕДУРА ФІКСУВАННЯ ДОЗИ

В.1 tris. ГОСТРА ПЕРОРАЛЬНА ТОКСИЧНІСТЬ - МЕТОД КЛАСИФІКАЦІЇ ГОСТРОЇ ТОКСИЧНОСТІ

В.2. ГОСТРА ТОКСИЧНІСТЬ (ВДИХАННЯ)

В.3. ГОСТРА ТОКСИЧНІСТЬ (УРАЖЕННЯ ШКІРИ)

В.4. ГОСТРА ТОКСИЧНІСТЬ: ПОДРАЗНЕННЯ ШКІРИ/РОЗ'ЇДАННЯ

В.5. ГОСТРА ТОКСИЧНІСТЬ: ПОДРАЗНЕННЯ ОКА/РОЗ'ЇДАННЯ

В.6. СЕНСИБІЛІЗАЦІЯ ШКІРИ

В.7. ТОКСИЧНІСТЬ ПОВТОРНОЇ ДОЗИ (ЯКА ВВОДИТЬСЯ ПЕРОРАЛЬНО ВПРОДОВЖ 28 ДНІВ)

В.8. ТОКСИЧНІСТЬ ПОВТОРНОЇ ДОЗИ (ВВЕДЕНОЇ ЧЕРЕЗ ІНГАЛЯЦІЮ ВПРОДОВЖ 28 ДНІВ)

В.9. ТОКСИЧНІСТЬ ПОВТОРНОЇ ДОЗИ (ВВЕДЕНОЇ ЧЕРЕЗ ШКІРУ ВПРОДОВЖ 28 ДНІВ)

В.10. МУТАГЕННІСТЬ - ТЕСТ IN VITRO НА ХРОМОСОМНУ АБЕРАЦІЮ ССАВЦІВ

В.11. МУТАГЕННІСТЬ - ТЕСТ IN VIVO НА ХРОМОСОМНУ АБЕРАЦІЮ КІСТКОВОГО МОЗКУ ССАВЦІВ

В.12. МУТАГЕННІСТЬ - МІКРОЯДЕРНИЙ ТЕСТ IN VIVO НА ЕРИТРОЦИТАХ ССАВЦІВ

В.13/14. МУТАГЕННІСТЬ - ТЕСТ НА ЗВОРОТНЮ МУТАЦІЮ З ВИКОРИСТАННЯМ БАКТЕРІЙ

В.15. ДОСЛІДЖЕННЯ МУТАГЕННОСТІ ТА СКРИНІНГ НА ГЕНЕТИЧНІ МУТАЦІЇ КАНЦЕРОГЕННОЇ ДІЇ - ПИВНІ ДРІЖДЖІ

В.16. МІТОТИЧНА РЕКОМБІНАЦІЯ - ПИВНІ ДРІЖДЖІ

В.17. МУТАГЕННІСТЬ - ТЕСТ IN VITRO НА ГЕННУ МУТАЦІЮ КЛІТИН ССАВЦІВ

В.18. ПОШКОДЖЕННЯ ТА РЕПАРАЦІЯ ДНК - НЕРЕПАРТИВНИЙ СИНТЕЗ ДНК - КЛІТИНИ ССАВЦІВ IN VITRO

В.19. АНАЛІЗ ОБМІНУ СЕСТРИНСЬКИМИ ХРОМАТИДАМИ IN VITRO

В.20. РЕЦЕСИВНИЙ ТЕСТ НА ЛЕТАЛЬНІСТЬ, ПОВ'ЯЗАНУ ЗІ СТАТЕВИМИ ВІДМІННОСТЯМИ, У ДРОЗОФІЛИ ЧОРНОЧЕРЕВОЇ

В.21. ТЕСТИ IN VITRO НА ТРАНСФОРМАЦІЮ КЛІТИН ССАВЦІВ

В.22. ТЕСТ НА ДОМІНУВАННЯ ЛЕТАЛЬНИХ НАСЛІДКІВ У ГРИЗУНІВ

В.23. ТЕСТ НА ХРОМОСОМНУ СПЕРМАТОГОНІАЛЬНУ АБЕРАЦІЮ ССАВЦІВ

В.24. КРАПЕЛЬНИЙ ТЕСТ НА ПІДДОСЛІДНИХ МИШАХ

В.25. СПАДКОВА ТРАНСЛОКАЦІЯ У МИШЕЙ

В.26. ТЕСТ НА СУБХРОНІЧНУ ПЕРОРАЛЬНУ ТОКСИЧНІСТЬ ПРИ ПОВТОРЮВАНІЙ ДОЗІ: 90-ДЕННЕ ДОСЛІДЖЕННЯ ПЕРОРАЛЬНОЇ ТОКСИЧНОСТІ НА ПРИКЛАДІ ГРИЗУНІВ

В.27. ТЕСТ НА СУБХРОНІЧНУ ПЕРОРАЛЬНУ ТОКСИЧНІСТЬ ПРИ ПОВТОРЮВАНІЙ ДОЗІ: 90-ДЕННЕ ДОСЛІДЖЕННЯ ПЕРОРАЛЬНОЇ ТОКСИЧНОСТІ НЕ НА ПРИКЛАДІ ГРИЗУНІВ

В.28. ТЕСТ НА СУБХРОНІЧНУ ДЕРМАЛЬНУ ТОКСИЧНІСТЬ: 90-ДЕННЕ ДОСЛІДЖЕННЯ З ПОВТОРЮВАНОЮ ДЕРМАЛЬНОЮ ДОЗОЮ НА ПРИКЛАДІ ГРИЗУНІВ

В.29. ТЕСТ НА СУБХРОНІЧНУ ТОКСИЧНІСТЬ ПРИ ВДИХАННІ: 90-ДЕННЕ ДОСЛІДЖЕННЯ З ПОВТОРЮВАНОЮ ДОЗОЮ ДЛЯ ВДИХАННЯ НА ПРИКЛАДІ ГРИЗУНІВ

В.30. ТЕСТ НА ХРОНІЧНУ ТОКСИЧНІСТЬ

В.31. ДОСЛІДЖЕННЯ ДІЇ ТОКСИЧНИХ РЕЧОВИН НА ПРЕНАТАЛЬНИЙ РОЗВИТОК

В.32. ТЕСТ-ПРОБА НА КАНЦЕРОГЕННІСТЬ

В.33. КОМБІНОВАНИЙ ТЕСТ НА ХРОНІЧНУ ТОКСИЧНІСТЬ/КАНЦЕРОГЕННІСТЬ

В.34. ДОСЛІДЖЕННЯ РЕПРОДУКТИВНОЇ ТОКСИЧНОСТІ ОДНОЇ ГЕНЕРАЦІЇ

В.35. ДОСЛІДЖЕННЯ РЕПРОДУКТИВНОЇ ТОКСИЧНОСТІ ДВОХ ГЕНЕРАЦІЙ

В.36. ТОКСИКОКІНЕТИКА

В.37. ЗАТРИМАНА НЕЙРОТОКСИЧНІСТЬ ФОСФОРОРГАНІЧНИХ РЕЧОВИН ПІСЛЯ ЗНАЧНОЇ ЕКСПОЗИЦІЇ

В.38. 28-ДЕННЕ ДОСЛІДЖЕННЯ ЗАТРИМАНОЇ НЕЙРОТОКСИЧНІСТІ З ПОВТОРЮВАНОЮ ДОЗОЮ ФОСФОРОРГАНІЧНИХ РЕЧОВИН

В.39. ДОСЛІДЖЕННЯ ПОЗАПЛАНОВОГО/РЕПАРАТИВНОГО СИНТЕЗУ ДНК НА КЛІТИНАХ ПЕЧІНКИ ССАВЦІВ IN VIVO

B.40. РОЗ'ЇДАННЯ ШКІРИ IN VITRO: ТЕСТ НА ОПІР ДІЇ ЕЛЕКТРИЧНОГО СТРУМУ ЧЕРЕЗ ШКІРУ (ТОДЕСЧШ)

В.40.BIS РОЗ'ЇДАННЯ ШКІРИ IN VITRO: ДОСЛІДЖЕННЯ ЗРАЗКА ЛЮДСЬКОЇ ШКІРИ

В.41. ТЕСТ НА ФОТОТОКСИЧНІСТЬ 3Т3 NRU IN VITRO

В.42. ЧУТЛИВІСТЬ ШКІРИ: АНАЛІЗ РЕАКЦІЇ ІЗОЛЬОВАНИХ ВУЗЛІВ

В.43. ДОСЛІДЖЕННЯ НЕЙРОТОКСИЧНОСТІ НА ГРИЗУНАХ

В.44. АБСОРБЦІЯ ЧЕРЕЗ ШКІРУ: МЕТОД IN VIVO

В.45. АБСОРБЦІЯ ЧЕРЕЗ ШКІРУ: МЕТОД IN VITRO

ВСТУП

А. ХАРАКТЕРИСТИКА ТЕСТОВАНОЇ РЕЧОВИНИ

Перед початком вивчення токсичності необхідно отримати інформацію щодо складу тестованої речовини, включаючи найбільші домішки, дані про відповідні фізичні й хімічні властивості речовини, її стабільність.

Інформація про фізичні й хімічні властивості речовини є важливою при виборі методу управління та проведення кожного окремого тесту, а також, коли йдеться про умови зберігання та обробки самої речовини.

Також перед початком експерименту необхідно врахувати процес розробки методу кількісного та якісного визначення/вимірювання тестованої речовини в дозаторі та біологічному матеріалі.

Звітність про тестування повинна містити всю інформацію щодо ідентифікації, фізичних і хімічних властивостей речовини, а також наявності домішок і поведінки в ході експерименту.

B. ДОГЛЯД ЗА ТВАРИНАМИ

Під час проведення перевірки на токсичність необхідно суворо контролювати умови, в яких знаходяться піддослідні тварини.

(i) Умови утримання

Кліматичні умови в приміщеннях та корпусах з піддослідними тваринами повинні відповідати умовам, що є необхідними для піддослідних видів. Так, для щурів, мишей і морських свинок, задовільними вважатимуться температурні умови в межах 22 град.С +- 3 град.С, з відносною вологістю повітря 30-70%; для кролів задовільними вважатимуться температурні умови в межах 20 град.С +- 3 град.С, з відносною вологістю повітря 30-70%.

Оскільки деяке експериментальне обладнання досить чутливе до впливу температури, необхідно включати певну інформацію щодо відповідних умов тестування в матеріали про проведення тестування. Під час проведення тесту потрібно контролювати, записувати та включати в остаточний звіт показники температури.

Освітлення повинно бути штучним, з наступним інтервалом: 12 годин - світло, 12 годин - темно. Деталі щодо освітлення записують і доповіді вносять до підсумкового звіту про результати експерименту.

Тварин у клітках розміщують окремо або малими групами, що складаються з особин однієї статі (не більше п'яти особин в одній клітці), якщо інше не передбачено умовами експерименту.

Звіти про результати експериментів над тваринами повинні включати інформацію про тип кліток і кількість тварин, що утримуються в кожній з цих кліток, як під час дії хімічного препарату, так і в ході подальших спостережень.

(ii) Умови годування

Корм для тварин повинен відповідати всім вимогам харчування того виду тварин, над якими проводяться експерименти. Якщо в ході тесту тваринам дають певні хімічні речовини, зміни поживної цінності їх корму можна пояснити взаємодією речовини та харчового компоненту. Необхідно зважати на можливість отримання такого результату під час інтерпретації результатів. Застосовують звичайний лабораторний корм та необмежену кількість питної води. Вибір харчового раціону тварин повинен бути таким, щоб це відповідало особливостям зазначеної тестованої речовини. Якщо в кормі тварин є домішки та сторонні елементи, які можуть впливати на токсичність, тоді необхідно, щоб їх концентрація не впливала негативно на проведення тесту та інтерпретацію результатів.

C. АЛЬТЕРНАТИВНІ МЕТОДИ ТЕСТУВАННЯ

Європейський Союз наполегливо працює над розвитком та впровадженням альтернативних методик тестування, які можуть надати ту саму інформацію, що й сучасні методи, але використовуючи при цьому менше тварин, і таким чином, завдаючи їм менше шкоди або намагаючись уникнути використання тварин взагалі.

Якщо буде можливо впроваджувати такі нові методики, тоді, відповідно, необхідно враховувати такі моменти, як експлуатаційна безпека, подальша класифікація, маркування властивих тесту небезпек та оцінка хімічної безпеки.

D. ОЦІНКА ТА ІНТЕРИРИТАЦІЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

Після первинної оцінки та інтерпретації результатів тестів необхідно врахувати те, що результати тестів, як тварин, так і пробірок передаються потім спеціалісту. Отже, можливо, що в процесі підтвердження остаточного результату, негативну роль може зіграти людський фактор.

E. ЛІТЕРАТУРА

Більшість даних методів розроблено в рамках програми ОЕСР щодо рекомендацій для проведення тестів, і, відповідно, необхідно дотримуватись принципів Апробованих лабораторних методів для того, щоб якомога ширше використовувати "взаємно прийнятні дані".

Додаткову інформацію можна переглянути в посиланнях, які є в рекомендаційних матеріалах ОЕСР та іншій опублікованій літературі.

В.1 bis. ГОСТРА ПЕРОРАЛЬНА ТОКСИЧНІСТЬ - ПРОЦЕДУРА ФІКСУВАННЯ ДОЗИ

1. МЕТОД

Даний метод тестування є еквівалентним ТІ (ТЕСТОВИХ ІНСТРУКЦІЙ) ОЕСР 420 (2001)

1.1. ВСТУП

У традиційних методах оцінки пероральної токсичності тварини наприкінці експерименту помирають. У 1984 році Британським токсикологічним товариством було запропоновано новий метод оцінки пероральної токсичності, в основі якого лежить фіксування доз (1). Завдяки цьому методу вдалось уникнути смерті тварин наприкінці експерименту. В основі методу тепер було спостереження за явними ознаками токсичності на прикладі одного з видів фіксованих доз. У результаті міжнародних лабораторних оціночних тестів у пробірці та експериментів, що проводились у Сполученому Королівстві Великобританії та Північної Ірландії, у 1992 році нововведену методику було затверджено, як новий метод тестування. Потім було зроблено оцінку статистичних якостей Методики фіксованих доз, використовуючи в ході дослідження математичні моделі (4)(5)(6). Також, результати тестів на прикладі живих організмів та математичних моделей показали, що така нововведена методика є продуктивною, оскільки в ній задіяно менше тварин, які вже не так страждають під час таких експериментів, на відміну від попередніх тестів, а також є можливість класифікувати речовини подібно до інших методів оцінки гострої токсичності.

У Рекомендаційних матеріалах про гостру пероральну токсичність (7) міститься інформація щодо вибору найвідповіднішого методу тестування з заданої теми. У даному документі також дається додаткова інформація щодо проведення та інтерпретації результатів методу тестування В.1 bis.

В основі методу лежить принцип застосування помірно токсичних доз в ході експерименту. Слід уникати використання таких доз, в результаті дії яких можливий летальний кінець. Непотрібно застосовувати дози, які подразнюють та роз'їдають організм і викликають сильний біль та нездужання. Необхідно якомога гуманніше позбавити життя помираючих тварин, а також тих, які вже довгий час страждають від нездужання та сильного болю. Щодо інтерпретації результатів тестів, в яких тварини були вимушено позбавленні життя, то вони враховуються так само, як і результати тих експериментів, в яких тварини померли самі. Рекомендаційні матеріали (8) містять критерії прийняття рішень щодо позбавлення життя помираючих та страждаючих тварин, а також інформацію стосовно ознак передбачуваної або очікуваної смерті.

У даному методі подається інформація щодо шкідливих та небезпечних властивостей речовин, а також те, як ці речовини необхідно групувати та класифікувати, відповідно до Глобальної Гармонізованої Системи (ГГС) класифікації хімічних речовин, які викликають гостру токсичність (9).

Перед початком тестування речовини в умовах лабораторії необхідно брати до уваги всю інформацію, що стосується взятого хімікату. Сюди входить інформація щодо характерних особливостей речовини, її хімічного складу; токсичні дані структурно пов'язаних речовин; передбачуване застосування хімікату. Така інформація є необхідною для того, щоб можна було підібрати відповідну початкову дозу і переконатись в тому, що здоров'ю людини нічого не загрожує.

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ

Гостра пероральна токсичність: стосується перорального вживання однієї або кількох доз речовини протягом 24 годин, в результаті чого з'являються шкідливі побічні ефекти.

Запізніла смерть: це означає, що піддослідна тварина не помирає або знаходиться в передсмертному стані протягом 24 годин, але вмирає пізніше - протягом 14-тиденного періоду ведення спостережень.

Доза: кількість застосовуваної хімічної речовини. Доза виражається в одиницях ваги взятого хімікату на вагу піддослідної тварини (наприклад, мг/кг).

Очевидна токсичність:загальний термін, який вказує на явні ознаки токсичності, що виникли в результаті застосування тестованої речовини (див. приклад в (3)), і після наступної найбільшої фіксованої дози це може призвести до того, що тварини будуть страждати від сильного болю та явного сильного нездужання; також можливо, що тварини будуть знаходитись у передсмертному стані (критерії подано в Рекомендаціях щодо Гуманності (8)) або слід очікувати ймовірної смерті більшої частини піддослідних тварин.

ГГС: Глобально Гармонізована Система (ГГС) класифікації хімічних речовин та сумішей, які викликають гостру токсичність. Спільна діяльність ОЕСР в галузі охорони навколишнього середовища та життя людини, Експертного комітету ООН з транспортування небезпечних речовин (вивчення фізико-хімічних властивостей) і Міжнародної організації праці (МОТ) (використання небезпечних матеріалів) координується Міжорганізаційною програмою раціонального застосування хімічних речовин (МПРЗХР).

Ймовірна смерть: стан, коли піддослідна тварина вмирає або очікується, що вона помре до наступного очікуваного моменту спостереження. Ознаками такого стану для щурів є, наприклад, поява конвульсій, перевертання набік, лежаче положення та тремтіння. Додаткова інформація міститься у Рекомендаціях щодо Гуманності(8).

Напівлетальна доза: НД (коли гине 50% особин): статистично 50

взята   повна  доза  хімічної  речовини,  в  результаті  дії  якої
очікується летальний кінець у 50%  тварин,  які  приймали  хімікат
перорально.  Показник  НД   виражається в одиницях ваги тестованої
                         50
речовини на вагу піддослідної тварини (мг/кг).

Допустима доза: допустима доза під час тестування (2000 або 5000 мг/кг).

Передсмертний стан: стан, коли тварина вмирає або не може вижити навіть при наданні медичної допомоги. Додаткова інформація міститься у Рекомендаціях щодо Гуманності (8).

Очікувана смерть: наявність клінічних ознак, які вказують на наближення летального результату у визначений час задовго до запланованого часу завершення експерименту. Наприклад: тварина нездатна дотягнутись до їжі або води. Додаткова інформація міститься у Рекомендаціях щодо Гуманності (8).

1.3. ПРИНЦИП МЕТОДУ ТЕСТУВАННЯ

Групам тварин однієї статі дають дози хімічної речовини поступово: фіксовані дози по 5, 50, 300 та 2000 мг/кг (в окремих випадках дозволяється давати 5000 мг/кг - див. пункт 1.6.2.). Рівень дозування вираховується візуально і так, щоб введена доза речовини призвела лише до певних ознак токсичності, не спричинивши при цьому серйозної гострої токсичності або смерті тварин. У Рекомендаціях ОЕСР (8) подано перелік клінічних ознак та умов, що вказують на виникнення болю, страждання та очікувану смерть. Наступним групам тварин дозування збільшують до більшого/меншого фіксованого рівня, в залежності від того, чи є ознаки токсичності або смерті. Така процедура продовжується до тих пір, поки не буде визначено саме ту дозу, яка спричиняє очевидну токсичність чи, принаймні, одну смерть. Також, експеримент продовжується, якщо після застосування найбільшої дози не виявлено жодних ефектів або тварини вмирають після з'їдання найменшої дози хімічної речовини.

1.4. ОПИС МЕТОДУ

1.4.1. Підбір видів тварин

Найкращим з виду гризунів є щур, хоча можна також застосовувати інших представників цього виду. Як правило, використовують самок (7), оскільки результати сучасних тестів НД 50 та спеціалізована література говорять про те, що, зазвичай, хоча різниця між чутливістю статей невелика, проте, якщо такі відмінності все ж спостерігаються, самки виявляються до певної міри чутливішими (10). Однак, якщо в результаті вивчення токсичних або токсикокінетичних властивостей структурно пов'язаних хімічних речовин виявиться, що самці можуть бути чутливішими, тоді перевага надається цій статі. Під час використання в тестах самців необхідно обумовлювати доцільність їх застосування.

1.4.2. Умови утримування та годування тварин

Температура в експериментальних приміщеннях, де утримують тварин повинна бути в межах 22 град.С (+- 3 град.С). Незважаючи на те, що відносна вологість повітря повинна бути, принаймні, 30% та, якщо можливо, не перевищувати 70%, за винятком, коли приміщення прибирають, необхідно намагатись, щоб цей показник був 50-60%. Освітлення має бути штучним, з інтервалом 12 годин (світло-темно). Що стосується сучасного годування тварин в лабораторних умовах, то необхідно, щоб в їх раціоні кількість питної води не обмежувалась. Тварин групують в клітках, згідно дозування, але важливо, щоб кількість особин в одній клітці не заважала нормальному спостереженню за кожною з них.

1.4.3. Підготовка тварин

Тварин обирають навмання, маркують для індивідуальної ідентифікації та тримають в клітках не менше п'яти днів перед початком дозування для того, щоб вони окліматизувались у лабораторних умовах.

1.4.4. Підготовка доз

Загалом, об'єм дози повинен бути постійним стосовно інших видів доз, які застосовуватимуться в експерименті, але відрізнятись концентрацією приготування. Коли тестують кінцевий продукт рідини, то може виявитись, що застосування нерозбавленої речовини, наприклад, при сталій концентрації, є важливішим в процесі оцінки ризиків, які спричиняє така речовина, і така вимога існує з боку деяких керівних органів. У будь-якому випадку максимальний об'єм дози не можна збільшувати.

Максимальний об'єм дози, яку можна застосовувати один раз, залежить від розмірів піддослідної тварини. Так, для щурів цей об'єм, як правило, на повинен перевищувати 1 мл/100 г ваги тіла: проте, якщо застосовуються водний розчин, тоді можна за основу взяти показник ваги тіла в 2 мл/100 г. Що стосується самої рецептури приготування дози, то, якщо можливо, рекомендується водний розчин/суспензія/емульсія, які додаються в залежності від того, як розчиняється суспензія/емульсія в олії (наприклад, кукурудзяній) та інших технологічних рідинах. Коли використовуються інші технологічні рідини (не вода), тоді необхідно ознайомитись з їх характерними особливостями. Дози потрібно готувати безпосередньо перед їх застосуванням, якщо невідома інформація щодо стабільності приготування на певний період часу, протягом якого ці дози будуть використані та вважатимуться придатними для застосування.

1.5. ПРОЦЕДУРА

1.5.1. Застосування/введення доз

Введення дози відбувається методом штучного годування через зонд або введенням трубки в орган. В окремих випадках, коли повну дозу ввести не вдається, її розбивають на менші частини, на період, який не перевищує 24 години.

Перед дозуванням тварин утримують від їжі наступним чином: наприклад, щурам дають на ніч лише воду, мишам дають воду, а їсти не дозволяють 3-4 години. Після такого утримання від їжі тварин зважують, а потім вводять необхідну дозу хімічної речовини. Потім, наступні 3-4 години щурів знову утримують від їжі, а мишей 1-2 години. Якщо дозування розбивається на частини, протягом певного періоду, тварин за необхідності годують і дають воду, в залежності від тривалості такого періоду дозування.

1.5.2. Візуальна перевірка

Завдання візуальної перевірки полягає у виборі відповідної початкової дози для головного експерименту. Тестована хімічна речовина вводиться окремим тваринам так, як показано в блок-схемі Додатку 1. Візуальна перевірка закінчується тоді, коли прийнято рішення щодо розмірів початкової дози для головного експерименту (або, якщо при найменшій фіксованій дозі трапляється летальний кінець).

Початкова доза для візуальної перевірки береться на основі рівнів фіксованої дози в 5, 50, 300 та 2000 мг/кг. Це доза, від якої повинна наступати очевидна токсичність, про що мають свідчити дані лабораторних тестів (в пробірках та на прикладі живих організмів), де застосовувались такі самі хімікати, а також структурно подібні до них. За відсутності такої інформації, початкова доза хімічної речовини повинна становити 300 мг/кг.

Період між дозуванням кожної тварини повинен бути не менше 24 годин. Тварин необхідно оглядати протягом, принаймні, 14 днів.

Лише в окремих випадках, і, якщо в цьому є потреба та доцільність, дозволяється збільшувати рівень фіксованої дози до 5000 мг/кг (див. Додаток 1). З метою охорони тварин забороняється тестування методом ГГС, Категорії 5, в межах доз 2000-5000 мг/кг. Єдиним винятком може бути обґрунтована доцільність такого методу, якщо є велика впевненість в тому, що результати тесту мають прямий зв'язок з проблемами охорони навколишнього середовища та здоров'я людини.

У випадку, якщо в результаті візуального тестування при найменшому рівні фіксованої дози (5 мг/кг) тварина помирає, необхідно припинити експеримент та призначити до застосування речовину методу ГГС, Категорії 1 (як в Додатку 1). Проте, якщо необхідне подальше підтвердження класифікації, можна провести наступну додаткову процедуру. Вводиться доза другій тварині, з розрахунку 5 мг/кг. Якщо тварина помирає, тоді метод ГГС, Категорії 1 підтверджується, а експеримент одразу припиняється. У випадку, коли друга тварина виживає, беруть ще не менше трьох тварин для дозування, з розрахунку 5 мг/кг. Враховуючи, що ризик летального випадку дуже високий, цих тварин дозують послідовно, з метою гуманного ставлення до них та охорони життя. Інтервал між дозуванням кожної з тварин повинен бути достатнім для того, щоб переконатись, що перша тварина виживе після отриманої дози. Якщо за другим разом тварина помирає, порядок дозування одразу припиняють, а інших тварин також не дозують. Оскільки інцидент з другим летальним випадком (незалежно від кількості протестованих тварин на момент припинення тесту) підпадає під категорію А (дві або більше смертей), вступає в дію правило класифікації, як в Додатку 2 (розрахунок фіксованої дози 5 мг/кг) (Категорія 1, якщо одна або більше смертей або Категорія 2, якщо лише один летальний кінець). Крім того, в Додатку 1 містяться рекомендації щодо класифікації за системою ЄС до тих пір, поки не буде запроваджено нового ГГС.

1.5.3. Основний експеримент

1.5.3.1. Кількість тварин та рівні дозування

Дія, яка наступає після тестування із застосуванням початкової дози, вказана у блок-схемі Додатку 2. Одна з трьох дій є обов'язковою; необхідно або припинити тестування та призначити відповідний тест для класифікації ризиків, використавши при цьому більшу фіксовану дозу, або проводити експеримент при меншій фіксованій дозі. Проте, з метою захисту тварин, необхідно, щоб та доза хімікату, яка спричинила смерть тварини в ході візуального тесту, не застосовувалась повторно в головному тесті (див. Додаток 2). Досвід показує, що при застосуванні початкової дози найймовірнішим буває результат, коли хімічну речовину вдається класифікувати, і продовження експерименту далі непотрібно.

Для дослідження дії кожного рівня дози беруть, як правило, до п'яти тварин однієї статі. До складу цієї групи з п'яти тварин входить одна тварина з візуального тесту, яку дозували згідно певного рівня дози, а також решта чотири тварини (крім ситуації, хоча таке малоймовірно, коли рівень дози з основного експерименту не було включено у візуальний тест).

Інтервал між дозуваннями кожного рівня визначається появою, тривалістю та складністю ознак токсичності. Надання медичної допомоги тваринам слід відкласти, поки не буде впевненості в тому, що вижили тварини, дозовані раніше. Рекомендується, щоб період між дозуваннями на кожному рівні складав, якщо необхідно, 3-4 дні, щоб провести спостереження сповільнення токсичності. Цей інтервал можна збільшити при необхідності, наприклад, у випадку отримання невпевнених результатів.

Коли застосовується збільшене фіксоване дозування в 5000 мг/кг, необхідно перейти до процедури, описаної в Додатку 3 (див. також секцію 1.6.2).

Граничний тест

Граничний тест головним чином застосовують в ситуаціях, коли в експериментатора є інформація про те, що тестований матеріал очевидно виявиться нетоксичним, тобто, матиме показник токсичності в межах допустимих норм .Інформацію стосовно токсичності матеріалу можна отримати з даних про тестування подібних хімічних речовин, сумішей або продуктів, враховуючи також характеристику та процентне співвідношення компонентів, що можуть виявитись токсичними. У подібних ситуаціях, коли майже немає інформації про токсичність або, якщо така токсичність очікується в застосованому матеріалі, необхідно проводити повне тестування (основний тест).

В якості рекомендації слід зазначити, що граничним тестом за нормальних умов буде візуальний тест при дозуванні 2000 мг/кг (або 5000 мг/кг в окремих випадках).

1.6. СПОСТЕРЕЖЕННЯ

Тварин спостерігають індивідуально після дозування, хоча б раз протягом перших 24 годин, звертаючи особливу увагу на перші чотири години. Потім спостерігають щодня, загалом 14 днів, крім ситуацій, коли експеримент припиняють, а тварин позбавляють життя з міркувань гуманності, або, якщо тварин знайдено вже мертвими. Проте, тривалість експерименту непотрібно суворо задавати в певні часові рамки. Тривалість повинна обумовлюватись токсичними реакціями, початком та тривалістю відновлювального періоду та може при потребі розтягуватись. Дуже важливим є зафіксувати, коли з'являються та зникають ознаки токсичності, особливо, якщо є тенденція запізнілої появи таких ознак(11). Результати спостережень систематично записують, затверджуючи їх стосовно кожної тварини.

Додаткові спостереження необхідно проводити, якщо тварини продовжують проявляти ознаки токсичності. У процесі спостережень потрібно виявити зміни на шкірі, шерсті, очах, слизовій оболонці, а також в дихальній системі, системі кровообігу, вегетативній та центральній нервовій системі. Також спостерігаються зміни в соматомоторній діяльності та поведінці. Необхідно уважно слідкувати за тим, чи з'являються тремтіння та конвульсії, виділення слини, діарея, впадання в летаргічний сон та кому. Керуватись необхідно критеріями, поданими в Рекомендаціях щодо Гуманності (8). Тварин, які перебувають в передсмертному стані або страждають від сильного болю та недомагань, необхідно позбавляти життя гуманним способом. Якщо тварин позбавлено життя з гуманних міркувань або знайдено вже мертвими, необхідно обов'язково якомога точніше вказати час смерті.

1.6.1. Вага тіла

Вагу тіла тварин необхідно визначити незадовго до початку дозування, а також через тиждень після цього. Будь-які зміни у вазі потрібно вираховувати та записувати. Тварин, які вижили, в кінці експерименту зважують, а потім гуманно позбавляють життя.

1.6.2. Патологія

Всім тваринам (навіть тим, які померли під час тесту або були усунуті від подальшого експерименту з гуманних міркувань) роблять загальний розтин. Результати загальних патологічних змін записують стосовно кожної тварини окремо. До уваги беруться і результати мікроскопічного дослідження органів, в яких виявлено ознаки загальної патології. Йдеться про тварин, які вижили через 24 або більше годин після першого дозування. Такі результати можуть виявитись досить важливими.

2. ДАНІ

Подаються дані стосовно кожної тварини окремо. Крім того, всю інформацію підсумовують у вигляді таблиці, вказуючи кількість тварин кожної тестованої групи, кількість тварин, в яких виявлено ознаки токсичності, кількість тварин, померлих в ході експерименту або позбавлених життя з гуманних міркувань. Фіксується також час смерті окремих тварин, опис та час появи ознак токсичності й зворотного процесу, а також результати розтину.

3. ЗВІТНІСТЬ

3.1. ЗВІТНІСТЬ ПРО РЕЗУЛЬТАТИ ТЕСТУ

Звітність про результати тесту має містити наступну інформацію:

Тестована речовина:

- характерні особливості, наявність домішок і, якщо необхідно, фізико-хімічні властивості (включаючи ізомеризацію),

- дані ідентифікації та номер CAS.

Технологічна рідина (якщо є доцільність):

- якщо використовується інша технологічна рідина, ніж вода, тоді обґрунтувати доцільність такого застосування.

Тварини для експерименту:

- вид/рід тварин,

- мікробіологічний статус тварин, якщо відомо,

- кількість, вік та стать тварин (включаючи, якщо потрібно, обґрунтування вибору самців замість самок),

- інформація про те, звідки тварини, умови утримування, корм тощо.

Умови проведення тесту:

- інформація щодо рецептури/складу речовини, включаючи деталі фізичної форми застосовуваного матеріалу,

- деталі застосування тестованої речовини, включаючи дані про об'єми та час дозувань,

- інформація про якість їжі та води (також, тип раціону/корму, походження, походженні води),

- обґрунтування вибору початкової дози.

Результати:

- результати щодо отриманої інформації та рівень дози для кожної тварини (наприклад, тварини з ознаками токсичності; також дані про смертність, особливості, труднощі та тривалість ефектів),

- введення в таблицю даних про вагу та зміни у вазі,

- індивідуальна вага тварин в день дозування, з тижневими інтервалами, та в момент смерті або під час настання конвульсій та страждань,

- дата і час смерті, якщо остання наступила до початку страждань тварини,

- початок та період тривалості токсичних ознак, і чи не має це зворотної дії на кожну з тварин,

- результати загального та гістопатологічного розтину кожної тварини, якщо такі результати є.

Обговорення та інтерпретація результатів.

Висновки.

4. ПОСИЛАННЯ

(1) British Toxicology Society Working Party on Toxicity (1984) Special report: a new approach to theclassification of substances and preparations on the basis of their acute toxicity. Human Toxicol., 3, p. 85-92.

(2) Van den Heuvel, M.J., Dayan, A.D. and Shillaker, R. O (1987) Evaluation of the BTS approach to the testing of substances and preparations for their acute toxicity. Human Toxicol., 6, p. 279-291.

(3) Van den Heuvel, M.J., Clark, D.G., Fielder, R.J., Koundakjian, P.P., Oliver, G.J.A., Pelling, D., Tomlinson, N.J. and Walker, A.P (1990) The international validation of a fixed-dose procedure as an alternative to the classical LD50 test. Fd. Chem. Toxicol. 28, p. 469-482.

(4) Whitehead, A. and Curnow, R.N (1992) Statistical evaluation of the fixed-dose procedure. Fd. Chem. Toxicol., 30, p. 313-324.

(5) Stallard, N. and Whitehead, A (1995) Reducing numbers in the fixed-dose procedure. Human Exptl. Toxicol. 14, p. 315-323.

(6) Stallard, N., Whitehead, A and Ridgeway, P. (2002) Statistical evaluation of the revised fixed dose procedure. Hum. Exp. Toxicol., 21, p. 183-196.

(7) OECD (2001) Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 24. Paris

(8) OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assesment No 19.

(9) OECD (1998) Harmonised Integrated Hazard Classification for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 (http: //webnet1.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380, EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.html).

(10) Lipnick, R.L., Cotruvo, J.A., Hill, R.N., Bruce, R.D., Stitzel, K.A., Walker, A.P., Chu, I., Goddard, M., Segal, L., Springer, J.A. and Myers, R.C (1995) Comparison of the Up-and-Down, Conventional LD50, and Fixed-Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol. 33, p. 223-231.

(11) Chan P.K and A. W Hayes (1994) Chapter 16 Acute Toxicity and Eye Irritation. In: Principles and Methods of Toxicology. 3rd Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press Ltd. New York, USA.

Додаток 1 ( 994_b14 ) Додаток 2 ( 994_b14 ) Додаток 3

КРИТЕРІЇ КЛАСИФІКАЦІЇ ТЕСТОВАНИХ РЕЧОВИН З ОЧІКУВАНИМИ ПОКАЗНИКАМИ НД БІЛЬШЕ 2000 МГ/КГ 50 БЕЗ НЕОБХІДНОСТІ ТЕСТУВАННЯ

Критерії небезпеки Категорії 5 необхідні для того, щоб можна було ідентифікувати тестовані речовини, рівень токсичності яких досить низький, але які за певних обставин можуть становити небезпеку вразливим групам людей. Очікувані показники НД при 50

пероральному або      шкірному      подразненні      становитимуть
2000-5000 мг/кг  або  відповідатимуть  еквівалентним  дозам  інших
напрямків тестувань. Тестовані речовини можна було б класифікувати
згідно  категорії  небезпеки  так:  2000 мг/кг < НД   < 5000 мг/кг
                                                   50

(Категорія 5 в ГГС). Класифікація можлива в наступних випадках:

(а) якщо на таку категорію вказують схеми тестування Додатку 2 на основі летальних випадків,

(b) якщо є достатньо доказів того, що НД знаходиться в 50

межах   показників   Категорії  5;  або,  якщо  дослідження  інших
токсичних ефектів в тварин вказують  на  те,  що  можлива  реальна
велика загроза життю людини;

(c) методом екстраполяції, оцінки або вимірювання даних, якщо не підтверджується зарахування речовини до класу більш загрозливих хімікатів, а також

- коли є достовірна інформація про те, що було виявлено гострі токсичні ознаки в людей або

- мав місце летальний кінець під час тестування до показників Категорії 4 шляхом перорального введення, чи

- у разі експертного підтвердження того, що з'явились ознаки токсичності під час тестування до показників Категорії 4, за винятком тестів на вияв діареї, пілоерекції або інших невизначених ознак, або

- якщо в разі експертного підтвердження виявиться, що можливі гострі ознаки токсичності, отримані в інших експериментах над тваринами.

ТЕСТУВАННЯ ПРИ ДОЗАХ, ЩО ПЕРЕВИЩУЮТЬ 2000 МГ/КГ

В окремих випадках, а також тоді, коли цього вимагають специфічні умови, дозволяється розглядати можливість дозування на додатковому рівні більшої фіксованої дози в 5000 мг/кг. З міркувань охорони тварин та гуманного ставлення до них забороняється тестування при 5000 мг/кг, за винятком, якщо є велика ймовірність того, що результати такого тестування матимуть прямий зв'язок з проблемами охорони тварин та життя людини (9).

Візуальний експеримент

Правила прийняття рішень, які регулюють процедуру, описану в Додатку 1, доповнюються таким чином, щоб можна було використати дозу 5000 мг/кг. Якщо ж використання дози 500 мг/кг призводить до результату А (смерть), необхідно зменшити дозу для другої тварини до 200 мг/; результати Б та В (очевидна токсичність або її відсутність) дають змогу вибрати дозу в 5000 мг/кг, як головну початкову дозу. Так само, якщо використовується доза, відмінна від 5000 мг/кг, тестування продовжують до використання дози 5000 мг/кг, якщо отримано результати Б та В під час використання дози 2000 мг/кг; наступний результат А під час застосування дози 5000 мг/кг диктуватиме початкову доза головного експерименту 2000 мг/кг, а результати Б та В - початкову дозу основного тестування на рівні 5000 мг/кг.

Основний експеримент

Візуальний експеримент

Правила прийняття рішень, які регулюють процедуру, описану в Додатку 2, доповнюються таким чином, щоб можна було використати дозу 5000 мг/кг. Так, якщо застосовується початкова доза основного експерименту 5000 мг/кг, тоді результати А (>= 2 летальних випадки) вимагатимуть тестування другої групи з використанням дози, що становить 2000 мг/кг; результат Б (очевидна токсичність та/або <= 1 летальний кінець) або В (відсутність токсичності) призведе до того, що речовину не класифікують за ГГС. Так само, якщо використовується доза, відмінна від 5000 мг/кг, тестування проводять до використання 5000 мг/кг, якщо В становитиме 2000 мг/кг; наступний результат А при використання дози 5000 мг/кг призведе до призначення речовині Категорії 5, а результати Б та В - до декласифікації речовини.

Додаток 4 ( 994_b14 )

В.1.tris. ГОСТРА ПЕРОРАЛЬНА ТОКСИЧНІСТЬ - МЕТОД КЛАСИФІКАЦІЇ ГОСТРОЇ ТОКСИЧНОСТІ

1. МЕТОД

Даний метод є еквівалентним ТІ (ТЕСТОВИХ ІНСТРУКЦІЙ) ОЕСР (2001)

1.1. ВСТУП

Метод класу гострої токсичності (1), наведений у даному тесті, є поетапною процедурою, коли використовується 3 тварини. Приблизно, 2-4 етапи можуть знадобитись, щоб визначити ознаки гострої токсичності в тестованій речовині, в залежності від смертності та ознак наближеної смерті тварин. Цей метод є відтворюваним, в ньому використовують лише кількох тварин, можна класифікувати хімічні речовини так само, як і в інших методах дослідження гострої токсичності. Метод класу гострої токсичності заснований на біометричних показниках (2)(3)(4)(5) фіксованих доз, окремо розподілених так, щоб речовину можна було класифікувати та оцінити ступінь небезпеки. Прийнятий в 1996 році метод було ретельно перевірено на живих організмах стосовно показника НД , 50 як вказано у національний (6) та міжнародній літературі (7).

Рекомендації щодо вибору найвідповіднішого методу тестування для даного завдання можна віднайти в Рекомендаційних Матеріалах з визначення Гострої Пероральної Токсичності (8). Дані Рекомендації також містять додаткову інформацію про проведення та інтерпретацію результатів методу В.1 частина третя.

Непотрібно застосовувати дози, які подразнюють та роз'їдають організм і викликають сильний біль та нездужання. Необхідно якомога гуманніше позбавити життя помираючих тварин, а також тих, які вже довгий час страждають від нездужання та сильного болю. Результати, отримані в процесі тестування таких тварин, беруться до уваги так само, як і результати тестування тих, які померли самі. У Рекомендаційних матеріалах міститься інформація про критерії для прийняття рішень щодо того, як позбавити життя помираючих тварин, а також тих, які вже довгий час страждають від нездужання та сильного болю (9).

У методі використовуються заздалегідь визначені дози, а результати дають змогу класифікувати речовину у відповідності до Глобальної Гармонізованої Системи класифікації хімічних речовин гострої токсичності (10).

Загалом, в даному методі не ставиться мета визначити точний показник НД , але можна визначити певні межі дії, при яких 50

очікується  летальний  кінець,  оскільки  смерть  певних  тварин є
основним закінченням тестів.  Метод дає змогу  визначити  показник
НД   лише тоді,  коли смертність перевищує 0% та менша за 100% і є
  50
спричиненою двома дозами.  Застосування заздалегідь визначених доз
будь-якої  речовини  та класифікації лише певної кількості тварин,
яких спостерігали в різних станах, покращує можливість лабораторії
отримати певну послідовність та відтворювання.

Лабораторія для тестувань повинна звертати увагу на всю можливу інформацію стосовно тестованої речовини. Сюди входить окремий хімічний склад речовини; її фізико-хімічні властивості; результати тестувань на токсичність, як в пробірці, так і на живих організмах; токсикологічні дані про структурно подібні речовини; призначення речовини. Така інформація є необхідною для того, щоб переконатись в тому, що даний тест відповідає вимогам охорони здоров'я людини та дає змогу визначити найвідповіднішу початкову дозу.

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ

Запізніла смерть: це означає, що піддослідна тварина не помирає або знаходиться в передсмертному стані протягом 48 годин, а вмирає пізніше - протягом 14-тиденного періоду ведення спостережень.

ГГС: Глобально Гармонізована Система (ГГС) класифікації хімічних речовин та сумішей, які викликають гостру токсичність. Спільна діяльність ОЕСР в галузі охорони навколишнього середовища та життя людини, Експертного Комітету ООН з Транспортування Небезпечних Речовин (вивчення фізико-хімічних властивостей) і Міжнародної Організації Праці (МОТ) (використання небезпечних матеріалів) координується Міжорганізаційною Програмою Раціонального Застосування Хімічних Речовин (МПРЗХР).

Напівлетальна доза: НД (коли гине 50% особин): статистично 50

взята  повна  доза  хімічної  речовини,  в  результаті  дії   якої
очікується  летальний  кінець у 50%  тварин,  які приймали хімікат
перорально.  Показник НД   виражається в одиницях ваги  тестованої
                        50
речовини на вагу піддослідної тварини (мг/кг).

Допустима доза: допустима доза під час тестування (2000 або 5000 мг/кг).

Вмираючий стан: стан, коли тварина вмирає або не може вижити навіть при наданні медичної допомоги. Додаткова інформація міститься у Рекомендаціях щодо Гуманності (9).

1.3. ПРИНЦИП ТЕСТУВАННЯ

В основі лежить поетапний метод застосування якомога меншої кількості тварин на кожному етапі. Основним в методі є також отримання достатньої кількості інформації щодо гострої токсичності речовини для подальшої її класифікації. Групі тварин, залучених до експерименту, перорально вводять хімічну речовину визначеної дози. Речовину тестують поетапно: по три тварини однієї статі (як правило, самки) на кожному з етапів. Наступний етап визначається наявністю/відсутністю смертельного випадку через зазначену речовину, наприклад:

- подальше тестування непотрібно,

- дозування ще трьох тварин однаковою дозою,

- подальше дозування ще трьох тварин більшою або меншою дозою.

Деталі методу тестування описано в Додатку 1. За допомогою цього методу можна провести оцінку класифікації тестованої речовини стосовно однієї з серій токсичності, що визначається фіксованими малозначними показниками НД . 50

1.4. ОПИС МЕТОДУ

1.4.1. Підбір видів тварин

Найкращим з виду гризунів є щур, хоча можна також застосовувати інших представників цього виду. Як правило, використовують самок (9), оскільки результати сучасних тестів НД 50 та спеціалізована література говорять про те, що, зазвичай, хоча різниця між чутливістю статей невелика, проте, якщо такі відмінності все ж спостерігаються, самки виявляються до певної міри чутливішими (11). Однак, якщо в результаті вивчення токсикологічних або токсикокінетичних властивостей структурно зв'язаних хімічних речовин виявиться, що самці можуть бути чутливішими, тоді перевага надається цій статі. Під час використання в тестах самців необхідно обумовлювати доцільність їх застосування.

Слід використовувати спеціально призначених для лабораторних дослідів молодих здорових тварин. Важливо, щоб самки ще не народжували та на момент тесту не чекали потомство. Вік кожної тварини на момент прийняття дози повинен бути 8-12 тижнів, а вага повинна падати з інтервалом +- 20% від середньої ваги будь-яких попередньо дозованих тварин.

1.4.2. Умови утримування та годування тварин

Температура в експериментальних приміщеннях, де утримують тварин повинна бути в межах 22 град.С (+- 3 град.С). Незважаючи на те, що відносна вологість повинна бути, принаймні, 30% та, якщо можливо, не перевищувати 70%, за винятком, коли приміщення прибирають, необхідно намагатись, щоб цей показник був 50-60%. Освітлення має бути штучним, з частотою 12 годин (світло-темно). Що стосується сучасного годування тварин в лабораторних умовах, то необхідно, щоб в їх раціоні кількість питної води не обмежувалась. Тварин групують у клітках, згідно дозування, але важливо, щоб кількість особин в одній клітці не заважала нормальному спостереженню за кожною з них.

1.4.3. Підготовка тварин

Тварин обирають навмання, маркують для індивідуальної ідентифікації та тримають в клітках не менше п'яти днів перед початком дозування для того, щоб вони акліматизувались в лабораторних умовах.

1.4.4. Підготовка доз

В загальному, об'єм дози повинен бути постійним відносно інших видів доз, які застосовуватимуться в експерименті, але відрізнятись концентрацією приготування. Коли тестують кінцевий продукт рідини, то може виявитись, що застосування нерозбавленої речовини, наприклад, при сталій концентрації, є важливішим в процесі оцінки ризиків, які спричиняє така речовина, і така вимога існує з боку деяких керівних органів. В будь-якому випадку максимальний об'єм дози не можна збільшувати. Максимальний об'єм дози, яку можна застосовувати один раз, залежить від розмірів піддослідної тварини. Так, для щурів цей об'єм, як правило, на повинен перевищувати 1 мл/100 г ваги тіла: проте, якщо застосовуються водний розчин, тоді можна за основу взяти показник ваги тіла в 2 мл/100 г. Що стосується самої рецептури приготування дози, то, якщо можливо, рекомендується водний розчин/суспензія/емульсія, які додаються в залежності від того, як розчиняється суспензія/емульсія в олії (наприклад, кукурудзяній) та інших технологічних рідинах. Коли використовуються інші технологічні рідини (не вода), тоді необхідно ознайомитись з їх характерними особливостями. Дози потрібно готувати безпосередньо перед їх застосуванням, якщо невідома інформація щодо стабільності приготування на певний період часу, протягом якого ці дози будуть використані та вважатимуться придатними до застосування.

1.5. ПРОЦЕДУРА

1.5.1. Застосування/введення доз

1.5.2. Кількість тварин та рівні дозування

На кожному етапі використовують трьох тварин. Початкова доза для візуальної перевірки береться на основі рівнів фіксованої дози в 5, 50, 300 та 2000 мг/кг. Це доза, від якої повинна наступати смерть кількох тварин, яким цю дозу введено. Блок-схеми Додатку 1 описують процедуру, яку необхідно повторювати для кожної початкової дози. Крім того, в Додатку 4 міститься інформація про рекомендації щодо класифікації за Системою ЄС до тих пір, поки не буде впроваджено нової ГГС.

Якщо є інформація про те, що смерть не може наступити при найбільшому рівні дози (2000 мг/кг ваги тіла). У таких випадках проводять граничний тест. Якщо немає інформації про тестовану речовину, тоді з міркувань гуманного ставлення до тварин, вводиться початкова доза 300 мг/кг ваги тіла.

Інтервал між дозуванням та початком надання медичної допомоги групам залежить від початку появи ознак токсичності, тривалості та критичності цих ознак, медичну допомогу тваринам не надають до тих пір, поки не буде впевненості в тому, що вижили попередньо дозовані тварини.

Лише в окремих випадках, і, якщо в цьому є потреба та доцільність, дозволяється збільшувати рівень фіксованої дози до 5000 мг/кг (див. Додаток 2). З метою охорони тварин забороняється тестування методом ГГС, Категорії 5, в межах доз 2000-5000 мг/кг. Єдиним винятком може бути обґрунтована доцільність такого методу, якщо є велика впевненість в тому, що результати тесту мають прямий зв'язок з проблемами охорони навколишнього середовища та здоров'я людини.

1.5.3. Граничний тест

Граничний тест головним чином застосовують в ситуаціях, коли в експериментатора є інформація про те, що тестований матеріал очевидно виявиться нетоксичним, тобто, матиме показник токсичності в межах допустимих норм. Інформацію стосовно токсичності матеріалу можна отримати з даних про тестування подібних хімічних речовин, сумішей або продуктів, враховуючи також характеристику та процентне співвідношення компонентів, що можуть виявитись токсичними. У подібних ситуаціях, коли майже немає інформації про токсичність або, якщо очікується така токсичність застосованого матеріалу, необхідно проводити повне тестування (основний тест).

Граничний тест із застосуванням дози 2000 мг/кг ваги тіла може проводитись на шести тваринах (по три тварини на етап). В окремих випадках граничний тест проводять на трьох тваринах із застосуванням дози 5000 мг/кг (див. Додаток 2). Якщо в результаті застосування речовини настає летальний кінець, може виявитись необхідним провести подальше тестування із застосуванням меншої дози.

1.6. СПОСТЕРЕЖЕННЯ

Тварин спостерігають індивідуально після дозування, хоча б раз протягом перших 30 хвилин, періодично протягом 24 годин, особливо на перші чотири години. Потім спостерігають щодня, протягом 14 днів, крім ситуацій, коли експеримент припиняють, а тварин позбавляють життя з міркувань гуманності, або, якщо тварин знайдено вже мертвими. Проте, тривалість експерименту непотрібно суворо ставити в певні часові рамки. Тривалість повинна обумовлюватись токсичними реакціями, початком та тривалістю відновлювального періоду та може при потребі розтягуватись. Дуже важливим є зафіксувати, коли з'являються та зникають ознаки токсичності, особливо, якщо є тенденція запізнілої появи таких ознак (12). Результати спостережень систематично записують, затверджуючи їх окремо стосовно кожній тварині.

Додаткові спостереження необхідно проводити, якщо тварини продовжують проявляти ознаки токсичності. У процесі спостережень потрібно виявити зміни на шкірі, шерсті, очах, слизовій оболонці, а також в дихальній системі, системі кровообігу, вегетативній та центральній нервовій системі. Також спостерігаються зміни в соматомоторній діяльності та поведінці. Необхідно уважно слідкувати за тим, чи з'являються тремтіння та конвульсії, виділення слини, діарея, впадання в летаргійний сон та кому. Керуватись необхідно критеріями, поданими в Рекомендаціях щодо Гуманності (9). Тварин, що помирають або страждають від сильного болю та нездужання, необхідно позбавляти життя гуманним способом. Якщо тварин позбавлено життя з гуманних міркувань або знайдено вже мертвими, необхідно обов'язково якомога точніше вказати час смерті.

1.6.1. Вага тіла

1.6.2. Патологія

Всім тваринам (навіть тим, які померли під час тесту або були усунуті від подальшого експерименту з гуманних міркувань) роблять загальний розтин. Результати загальних патологічних змін записують окремо стосовно кожної тварини. До уваги беруться і результати мікроскопічного дослідження органів, в яких виявлено ознаки загальної патології. Йдеться про тварин, які вижили через 24 або більше годин після першого дозування. Такі результати можуть виявитись досить важливими.

2. ДАНІ

Подаються дані окремо про кожну тварину. Крім того, всю інформацію підсумовують у вигляді таблиці, вказуючи кількість тварин кожної тестованої групи, кількість тварин, в яких виявлено ознаки токсичності, кількість померлих в ході експерименту або позбавлених життя з гуманних міркувань. Фіксується також час смерті окремих тварин, опис та час появи ознак токсичності та зворотного процесу, а також результати розтину.

3. ЗВІТНІСТЬ

3.1. Звітність про результати тесту

Повідомлення результатів тесту повинно включати наступну інформацію:

Тестована речовина:

- дані про ідентифікацію та номер CAS.

Технологічна рідина (якщо є доцільність):

- необхідність вибору рідини (якщо це не вода).

Піддослідні тварини:

- вид/рід тварин,

- мікробіологічний статус тварин, якщо відомо,

- кількість, вік та стать тварин (включаючи, якщо потрібно, обґрунтування вибору самців замість самок),

- інформація про те, звідки тварини, умови утримування, корм тощо.

Умови проведення тесту:

- інформація щодо рецептури/складу речовини, включаючи деталі фізичної форми застосовуваного матеріалу,

- деталі застосування тестованої речовини, включаючи дані про об'єми та час дозувань,

- інформація про якість їжі та води (також, тип раціону/корму, походження, походженні води),

- обґрунтування вибору початкової дози.

Результати:

- введення в таблицю даних про вагу та зміни у вазі,

- дата й час смерті, якщо остання наступила перед початком страждань тварини,

- початок і період тривалості токсичних ознак, і чи не має це зворотної дії на кожну з тварин,

- результати загального та гістопатологічного розтину окремо стосовно кожної тварини, якщо такі результати є.

Обговорення та інтерпретація результатів.

Висновки.

4. ПОСИЛАННЯ

(1) Roll R., Hofer-Bosse Th. And Kayser D (1986) New Perspectives in Acute Toxicity Testing of Chemicals. Toxicol. Lett., Suppl. 31, p. 86.

(2) Roll R., Riebschlager M., Mischke U. and Kayser D (1989) Neue Wege zur Bestimmung der akuten Toxizitat von Chemikalien. Bundesgesundheitsblatt 32, p. 336-341.

(3) Diener W., Sichha L., Mischke U., Kayser D. and Schlede E (1994) The Biometric Evaluation of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 68, p. 559-610.

(4) Diener W., Mischke U., Kayser D. and Schlede E., (1995) The Biometric Evaluation of the OECD Modified Version of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, p. 729-734.

(5) Diener W., and Schlede E., (1999) Acute Toxicity Class Methods: Alterations to LD/LC50 Tests. ALTEX 16,p. 129-134.

(6) Schlede E., Mischke U., Roll R. and Kayser D., (1992). A National Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method - An Alternative to the LD50 Test. Arch. Toxicol. 66, 455-470.

(7) Schlede E., Mischke U., Diener W. and Kayser D., (1994) The International Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, p. 659-670.

(8) OECD, (2001) Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and SafetyMonograph Series on Testing and Assessment No 24. Paris.

(9) OECD, (2000) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 19.

(10) OECD, (1998) Harmonised Integrated Hazard Classification System For Human Health And Environmental Effects Of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 (http:// webnet1.oecd.org/oecd/pages/home/ displaygeneral/0,3380, EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.html).

(11) Lipnick R.L., Cotruvo, J.A., Hill R.N., Bruce R.D., Stitzel K.A., Walker A.P., Chu I.; Goddard M., Segal L., Springer J.A. and Myers R.C. (1995) Comparison of the Up-and Down, Conventional LD50, and Fixed Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol 33, p. 223-231.

(12) Chan P.K. and A.W. Hayes. (1994). Chap. 16. Acute Toxicity and Eye Irritancy. Principles and Methods ow Toxicology. Third Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd., New York, USA.

Додаток 1

НЕОБХІДНА ПРОЦЕДУРА СТОСОВНО КОЖНОЇ ПОЧАТКОВОЇ ДОЗИ

ЗАГАЛЬНІ ПОЛОЖЕННЯ

Для кожної початкової дози є схеми тестування (як вказано в даному Додатку), які описують подальшу процедуру.

- Додаток 1а: початкова доза: 5 мг/кг на вагу тіла,

- Додаток 1б: початкова доза: 50 мг/кг на вагу тіла,

- Додаток 1в: початкова доза: 300 мг/кг на вагу тіла,

- Додаток 1г: початкова доза: 2000 мг/кг на вагу тіла

Нижчеподані стрілки вказують на те, як відбувається процедура, в залежності від кількості померлих або гуманно позбавлених життя тварин.

Додаток 1А ( 994_b14 ) Додаток 1В ( 994_b14 ) Додаток 1С ( 994_b14 ) Додаток 1D ( 994_b14 ) Додаток 2

пероральному або      шкірному      подразненні      становитимуть
2000-5000 мг/кг  або  відповідатимуть  еквівалентним  дозам  інших
напрямків тестувань. Тестовані речовини можна було б класифікувати
згідно  категорії  небезпеки  так:  2000 мг/кг < НД   < 5000 мг/кг
                                                   50

(Категорія 5 в ГГС). Класифікація можлива в наступних випадках:

(а) якщо на таку категорію вказують схеми тестування Додаток 1а-1г базуючись на летальних випадках,

(b) якщо є достатньо доказів того, що НД знаходиться в 50

межах   показників   Категорії  5;  або,  якщо  дослідження  інших
токсичних ефектів в тварин вказують  на  те,  що  можлива  реальна
велика загроза життю людини;

- коли є достовірна інформація про те, що було виявлено гострі токсичні ознаки у людей або

- мав місце летальний кінець під час тестування шляхом перорального введення, відповідно до показників Категорії 4, чи

- у разі експертного підтвердження того, що з'явились ознаки токсичності під час тестування, відповідно до показників Категорії 4, за винятком тестів на вияв діареї, пілоерекції або інших невизначених ознак, або

- якщо в разі експертного підтвердження виявиться, що можливі гострі ознаки токсичності, отримані в ході інших експериментів над тваринами.

ТЕСТУВАННЯ ДОЗАМИ, ЩО ПЕРЕВИЩУЮТЬ 2000 МГ/КГ

З метою охорони тварин та гуманного ставлення до них забороняється тестування тварин за Категорією 5 (5000 мг/кг), і дозволяється лише в тих випадках, коли є велика ймовірність того, що отримані результати можуть бути безпосередньо пов'язані з охороною здоров'я людини та захистом тварин (10). Подальше тестування із застосуванням більших доз непотрібно.

Якщо тестування є необхідним, тоді потрібно виконувати лише один його етап з дозою 5000 мг/кг. У випадку, якщо перша тварина помирає в ході експерименту, подальше тестування проходить з використанням дози 2000 мг/кг, як показано в блок-схемах Додатку 1. І, навпаки, коли тварина виживає, дозують двох наступних. Якщо вмирає тільки одна з трьох тварин, є ймовірність того, що показник НД може бути більшим за 5000 мг/кг. Коли 50

вмирають обидві тварини, дозування продовжують з 2000 мг/кг.

Додаток 3 ( 994_b14 )

В.2. ГОСТРА ТОКСИЧНІСТЬ (ВДИХАННЯ)

1. МЕТОД

1.1. ВСТУП

Бажано мати попередню інформацію про гранулометричний склад речовини, тиск пари, температуру плавлення, температуру кипіння, загорання та вибуху (якщо є).

Див. також Вступ до Частини В (А).

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ

Див. Вступ до Частини В (В).

1.3. БАЗОВІ РЕЧОВИНИ

Відсутні.

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ТЕСТУВАННЯ

Декілька груп з піддослідними тваринами піддають дії хімічної речовини в різних концентраціях - по одній на групу. Потім спостерігають вплив речовини та пов'язані з цим летальні випадки. Померлим під час тесту тваринам роблять розтин, і після закінчення експерименту тваринам, що вижили, також роблять розтин.

Тварин, що виявляють гострі ознаки нездужання та болю, за необхідності, позбавляють життя гуманним способом. Не дозволяється застосовувати такі дози хімічних речовин, в результаті роз'їдаючої або подразливої дії яких виникає сильний біль чи нездужання.

1.5. КРИТЕРІЙ ЯКОСТІ

Відсутні.

1.6. ОПИС МЕТОДУ

1.6.1. Підготовка

Необхідно, щоб не менше п'яти днів до початку експерименту тварини перебували в спеціальних умовах утримання та годування. До початку тестування тварини навмання вибирають та розподіляють на певну кількість груп. Моделювання ситуації, коли тварин піддають дії препарату, непотрібно, якщо це не передбачено приладом, який застосовуватиметься при тестуванні.

Сухі тверді речовини при потребі подрібнюють, щоб гранулометричні зразки були відповідного розміру.

Якщо необхідно отримати відповідну концентрацію речовини в атмосфері, дозволяється додавати необхідну технологічну рідину та використовувати апаратний контроль за рідиною. У випадку, якщо застосовуються добавки або інші технологічні рідини, необхідно отримати про них необхідну інформацію, щоб не викликати токсичних ефектів. Можна використовувати дані за минулі періоди.

1.6.2. Умови тестування

1.6.2.1. Тварини в ході експерименту

Перевага віддається щурам, якщо немає інших вказівок. При цьому застосовуються спеціальні лабораторні види тварин. На момент проведення тесту необхідно, щоб вага тварин кожної статі не перевищувала +- 20% середнього показника.

1.6.2.2. Кількість та стать тварин

Для кожного рівня концентрації використовують не менше 10 гризунів (по п'ять особин кожної статі). Важливо, щоб самки до того ще не народжували та на момент тесту не чекали потомство.

Примітка: в тестах для визначення гострої токсичності, який піддаються тварини вищого від гризунів виду, кількість тварин повинна бути меншою. Дозування при цьому ретельно розподіляють так, щоб не перевищити середню дозу токсичності. Під час проведення таких тестів слід уникати доз, в результаті дії яких може настати летальний кінець.

1.6.2.3. Концентрації доз

Їх повинна бути достатня кількість - не менше трьох, з таким інтервалом, щоб можна було виявити ознаки токсичності в тварин та показники смертності. Такої інформації повинно бути достатньо для того, щоб побудувати криву концентрації смертності, і, якщо є можливість, визначити НД . 1.6.2.4. Граничного тесту. 50

1.6.2.4. Граничний тест

Якщо в результаті тестування п'яти самок та п'яти самців з використанням 20 мг/л газу або 5 доріжок/л аерозолю або порошку протягом 4 годин (або, якщо таке неможливо через фізико-хімічні та вибухові властивості речовини, максимально можливої концентрації) не буде виявлено суміші, від якої наступає смерть протягом 14 днів, - подальше тестування вважається непотрібним (18 АТР, рішення ЄЕС 93/21, L 110/93).

1.6.2.5. Тривалість дії

Тривалість дії - 4 години.

1.6.2.6. Обладнання

Тестування тварин проводять із застосуванням інгаляційного обладнання, яке розроблено таким чином, щоб підтримувати динамічний потік повітря з 12 повітряних обмінів на годину для того, щоб був рівномірний розподіл кисню при рівномірному впливі атмосфери. Якщо дослід проводять в камері, необхідно, щоб її конструкція була такою, щоб мінімізувати скупчення тварин, і надати їм якомога більше можливості вдихнути хімічну речовину. Для того, щоб була певна стабільність всередині камери, необхідно, як правило, щоб загальний "об'єм" тварин не перевищував 5% від об'єму самої камери. Використовуються камери для фіксації ротової та носової області тварини або лише голови, або ж застосовують окремі камери для того, щоб тварина могла там розміститись повністю; перші два види камери можуть мінімізувати ризик проходження хімікату іншими шляхами.

1.6.2.7. Період спостереження

Період спостереження повинен тривати не менше 14 днів. Проте, обмежувати в часі період спостереження непотрібно. Він визначатиметься токсичними реакціями, швидкістю появи ознак токсичності та періодом відновлення; при потребі цей період часу очікування збільшують. Важливим є спостереження за тим, коли саме з'являються/зникають ознаки токсичності, яка їх тривалість в часі, а також, коли настає летальний кінець, особливо, якщо спостерігається тенденція затримки смерті.

1.6.3. Процедура

Перед початком експерименту тварин зважують, а потім піддають впливу концентрації речовини в призначеному для цього пристрої протягом 4 годин, після врівноваження з концентрацією камери. Час врівноваження повинен бути коротким. Температура проведення тесту встановлюється на рівні 22 +- 3 град.С. Бажано, щоб відносна вологість повітря становила 30%-70%, а в окремих випадках (наприклад, тестування аерозолів) таких вимог не дотримуються. Якщо всередині камери встановити невеликий від'ємний тиск (>= 5 мм води), тоді це допоможе запобігти витіканню речовини назовні. Під час експерименту тваринам не дають води та їжі. Необхідно використовувати відповідні системи для створення та моніторингу навколишньої атмосфери в експерименті. Система має забезпечити стійкі стабільні умови проведення тесту якомога швидше. Конструкція камери повинна бути такою, щоб розподілення в ній речовини було рівномірним.

У ході моніторингу проводять наступні вимірювання:

(а) швидкість повітряного потоку (постійно);

(b) фактична концентрація тестованої речовини, взятої в зоні дихання не менше трьох разів під час експерименту (деякі атмосфери, наприклад, аерозолі високої концентрації можуть не потребувати такого частого моніторингу). У ході експерименту рівень концентрації речовини не повинен коливатись більше, ніж на +- 15% від середнього показника. Проте, для деяких аерозолів цього рівня контролю отримати не вдається, і дозволяється коливання концентрації речовини в більших межах. Для аерозолів проводять аналіз розміру часток стільки разів, скільки необхідно (не менше одного разу в одній групі тесту);

Під час проведення експерименту необхідно систематично записувати спостереження. Роблять окремі записи стосовно кожної тварини. У перший день експерименту спостереження проводять досить часто. Необхідно, принаймні, кожного робочого дня робити ретельний клінічний огляд, а також проводити інші спостереження щодня, щоб мінімізувати втрати тварин в ході експерименту (наприклад, розтин або замороження тварин, знайдених вже мертвими, ізоляція слабких, напівмертвих тварин, а також тих, які зазнають сильного болю).

Під час спостережень потрібно виявляти зміни на шкірі, шерсті, очах, слизовій оболонці, а також в дихальній системі, системі кровообігу, вегетативній та центральній нервовій системі. Також спостерігаються зміни в соматомоторній діяльності та поведінці. Необхідно уважно слідкувати за тим, чи з'являються тремтіння та конвульсії, виділення слини, діарея, впадання в летаргічний сон та кому. Необхідно якомога точніше записати час смерті. Індивідуальну вагу тварин визначають потижнево після експерименту та на момент смерті.

Тварини, які померли в ході тесту, а також ті, які вижили після закінчення експерименту, піддаються розтину. Особливу увагу звертають на зміни у верхніх та нижніх дихальних шляхах. Всі загальні патологічні зміни також записують. В окремих випадках беруть зразки тканин для гістопатологічного дослідження.

2. ДАНІ

Всі дані підсумовують у вигляді таблиці, в якій стосовно кожної групи вказують наступне: кількість тварин на початку тесту, час смерті окремих тварин, кількість тих тварин, в яких виявлено інші ознаки токсичності, опис токсичних ефектів та результати розтину. Якщо виживання тварини перевищує норму одного дня, необхідно вирахувати та записати зміни у вазі. Результати щодо тварин, яких було гуманним способом позбавлено життя, через виявлення в них ознак недомагання сильного болю чи нездужання, записуються, як летальні випадки, причиною яких став гострий біль від приймання хімікату. Показник НД визначається відповідним для 50

цього методом.  Оцінка даних повинна включати співвідношення (якщо
такі  мають  місце)  між  дією  речовини  на  тварину  та ступенем
важкості отриманих в  результаті  цього  відхилень.  Сюди  входять
аномалії поведінки,  клінічні відхилення, загальні ураження, зміни
у вазі, смертність та інші токсичні ефекти.

3. ЗВІТНІСТЬ

3.1. ЗВІТНІСТЬ ПРО РЕЗУЛЬТАТИ ТЕСТУВАННЯ

Звітність про результати тестування, якщо можливо, включати повинна містити наступну інформацію:

- біологічний вид та походження тварин, умови утримання, середовище та харчування тощо,

- умови проведення тестування: опис приладу, де було проведено експеримент, конструкція, тип, розміри, система надходження повітря, система генерації аерозолів, метод кондиціювання повітря, утримання тварин в тестовій камері, якщо така використовується.

Дані результатів експерименту

Подаються в таблиці з середніми показниками та показником можливого відхилення (наприклад, стандартне відхилення) і містять, якщо можливо, наступне:

(а) швидкість повітряного потоку через інгаляційний пристрій;

(b) температура та вологість повітря;

(c) номінальні концентрації (загальна кількість тестованої речовини, введеної в інгаляційний пристрій, поділена на об'єм повітря);

(d) особливості технологічної рідини, якщо така застосовується;

(e) фактичні концентрації в дихальній зоні тесту;

(f) Мас-медіанний аеродинамічний діаметр (ММАД) та Геометричне стандартне відхилення (ГСВ);

(g) період врівноваження;

(h) час впливу (дії речовини на об'єкт тестування);

- зведення в таблиці отриманих даних про вплив на кожну стать (наприклад, кількість тварин, які померли або були гуманно позбавлені життя, кількість тварин з ознаками токсичності, кількість тварин в ході експерименту),

- час смерті під час експерименту, причини та критерії для позбавлення тварин життя гуманним способом,

- всі інші спостереження,

- показник НД щодо кожної статі - визначається в кінці 50

періоду спостереження (визначеним методом розрахунків),

- 95% інтервал довіри для НД (там, де можна отримати такі 50

дані),

- крива дозування/смертності, падіння (якщо дозволяє метод визначення),

- результати розтину,

- будь-які гістопатологічні результати,

- обговорення результатів (звернути особливу увагу на те, який вплив на показник НД має гуманне позбавлення тварин життя), 50

- інтерпретація результатів.

3.2. ОЦІНКА ТА ІНТЕРПРИТАЦІЯ

Див. Вступ до Частини В (D).

4. ПОСИЛАННЯ

Див. Вступ до Частини В (D).

В.3. ГОСТРА ТОКСИЧНІСТЬ (УРАЖЕННЯ ШКІРИ)

1. МЕТОД

1.1. ВСТУП

Див. Вступ до Частини В (А).

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ

Див. Вступ до Частини В (В).

1.3. БАЗОВІ РЕЧОВИНИ

Відсутні.

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ

Тестована речовина вводиться в шкіру вибраними дозами кільком групам піддослідних тварин, по одній дозі на групу. Далі спостерігають ефекти цього дозування та випадки смертності. Тварин, які в ході експерименту помирають, віддають на розтин, а тих, які вижили після закінчення тесту, також розтинають.

Тварин, які мають явно виражене наростання болю та сильно страждають, необхідно позбавити життя гуманно. Не потрібно застосовувати такі дози хімічних речовин, які спричиняють різкий сильний біль та нездужання через свою роз'їдаючу корозійну властивість.

1.5. КРИТЕРІЙ ЯКОСТІ

Відсутні.

1.6. ОПИС МЕТОДУ ТЕСТУВАННЯ

1.6.1. Підготовка

Протягом п'яти днів до початку експерименту тварин розміщують у дослідних клітках, з відповідними умовами утримання та годування. Перед тестом вибирають навмання молодих та здорових тварин та групують. Приблизно за 24 години до тесту необхідно видалити шерсть, вирізавши або поголивши ділянку від спини до голови тварини. Важливо це робити обережно, щоб в ході такої процедури не пошкодилась шкіра тварин, оскільки її ураження може вплинути потім на проникність хімічної речовини. Так, необхідно, щоб 10% тіла тварини було чистим від шерсті, для введення хімікату. У випадку використання сухих твердих хімічних речовин можна застосовувати пульверизатор, а саму речовину потрібно змочити в достатній кількості води або, при потребі, в іншому технологічному розчині для кращого приставання до шкіри. Коли використовується технологічна рідина, необхідно врахувати її вплив на властивість шкіри пропускати хімікат. Як правило, рідини в ході тестування використовують нерозбавленими.

1.6.2. Умови проведення тесту

1.6.2.1. Тварини для експерименту

Беруть дорослого щура або кролика. Якщо доцільно, тоді можна використовувати тварин інших видів. Зазвичай беруть лабораторних тварин. Що стосується ваги, то на момент експерименту, вага особин кожної статі може коливатись від межах +- 20% відносно певного середнього показника.

1.6.2.2. Стать та кількість тварин

Використовується не менше п'яти тварин однієї статі на кожному етапі дозування. Якщо використовуються самки, важливо, щоб вони ще не народжували та на момент тесту не чекали потомство. Також, якщо є інформація про те, що одна стать є чутливішою, ніж інша, тоді варто дозувати представників саме цієї статі.

Примітка: в тестах на визначення гострої токсичності, де задіяні тварини вищого від гризунів виду, кількість тварин повинна бути меншою. Дозування при цьому ретельно розподіляють так, щоб не перевищити середню дозу токсичності. Під час проведення таких тестів слід уникати доз, в результаті дії яких може настати летальний кінець.

1.6.2.3. Концентрації дозувань

Їх повинна бути достатня кількість - не менше трьох, з таким інтервалом, щоб можна було виявити ознаки токсичності в тварин та показники смертності. При фасуванні дози враховують роз'їдаючі та корозійні властивості самої речовини. Такої інформації повинно бути достатньо для того, щоб побудувати криву дозування та отриманих результатів, і, якщо є можливість, - визначити НД . 50

1.6.2.4. Граничний тест

Використовуючи вищеописані процедури можна провести експеримент із застосуванням дози рівня 2000 мг/кг на вагу тіла на прикладі групи з п'яти тварин, як самок, так і самців. Варіант повного тесту не розглядатиметься, якщо результатом такого експерименту буде смерть, що наступила внаслідок приймання зазначеного хімікату.

1.6.2.5. Період спостереження

1.6.3. Процедура

Тварин розміщують в клітках окремо. Хімічну речовину розподіляють рівномірно, охоплюючи приблизно 10% загальної поверхні тіла тварини. Якщо використовуються хімікати високої токсичності, тоді загальна поверхня тіла тварини, вкрита такою речовиною, може бути меншою, але так, щоб ця речовина розподілялась рівномірним тонким шаром.

Протягом періоду усіх 24 годин хімічні речовини при контакті з шкірою повинні бути в марлевій сітці з не подразнюючою клейкою тасьмою. Місце проведення тесту також потім відповідно накривають, щоб речовина з сітки не просочилась, і тварини не могли її проковтнути. Утримуючі пристрої необхідні для того, щоб тварина не проковтнула хімікат, але повна фіксація не рекомендується.

Наприкінці експерименту видаляють рештки речовини, і, якщо необхідно, промивають шкіру водою або чимось іншим.

Під час проведення експерименту необхідно систематично записувати проведення спостережень. Роблять окремі записи про кожну тварину. У перший день експерименту спостереження проводять досить часто. Необхідно, принаймні, кожного робочого дня робити ретельний клінічний огляд, а також проводити інші спостереження щодня, щоб мінімізувати втрати тварин в ході експерименту (наприклад, розтин або замороження тварин, знайдених вже мертвими, ізоляція слабких, напівмертвих тварин, а також тих, які зазнають сильного болю).

У процесі спостережень потрібно виявити зміни на шкірі, шерсті, очах, слизовій оболонці, а також в дихальній системі, системі кровообігу, вегетативній та центральній нервовій системі. Також спостерігаються зміни в соматомоторній діяльності та поведінці. Необхідно уважно слідкувати за тим, чи з'являються тремтіння та конвульсії, виділення слини, діарея, впадання в летаргічний сон та кому. Необхідно якомога точніше записати час смерті. Індивідуальну вагу тварин визначають щотижнево після експерименту та на момент смерті. Тварини, які померли в ході тесту, а також і ті, які вижили після закінчення експерименту, піддаються розтину. Особливу увагу звертають на зміни у верхніх та нижніх дихальних шляхах. Всі загальні патологічні зміни також записують. В окремих випадках беруть зразки тканин для гістопатологічного дослідження.

Оцінка токсичності в представників протилежної статі

Після того, як закінчено тестування однієї статі, дозують хоча б одну групу з п'яти тварин протилежної статі, щоб визначити, чи ці тварини не є більш чутливими до хімічної речовини. В окремих випадках може бути доцільним тестувати й меншу кількість тварин. Якщо є достовірна інформація про те, що тварини тієї статі, над якою проводились експерименти, є більш чутливими до взятої хімічної речовини, тоді проведення подальшого тестування можна уникнути.

2. ДАНІ

Всі дані підсумовують у вигляді таблиці, в якій про кожну групу вказують наступне: кількість тварин на початку тесту, час смерті окремих тварин, кількість тих тварин, у яких виявлено інші ознаки токсичності, опис токсичних ефектів та результати розтину. Якщо виживання тварини перевищує одноденну норму, необхідно вирахувати та записати зміни у вазі. Результати, що стосуються тварин, яких було гуманним способом позбавлено життя, через виявлення в них ознак гострого болю та нездужання, записуються, як летальні випадки, причиною яких стали гострий біль від приймання хімікату. Показник НД визначається відповідним для цього 50

методом.

Оцінка даних повинна включати співвідношення (якщо такі мають місце) між дією речовини на тварину та ступенем тяжкості отриманих у результаті цього відхилень. Сюди входять аномалії поведінки, клінічні відхилення, загальні ураження, зміни у вазі, смертність та інші токсичні ефекти.

3. ЗВІТНІСТЬ

3.1. ЗВІТНІСТЬ ПРО РЕЗУЛЬТАТИ ТЕСТУ

Звітність про результати тесту, якщо можливо, повинна містити наступну інформацію:

- біологічний вид та походження тварин, умови утримання, середовище та харчування тощо,

- умови проведення тестування (включаючи метод очищення шкіри від шерсті та обробка камери: з накриттям чи без),

- час смерті під час або протягом експерименту, причини та критерії для позбавлення тварин життя гуманним способом,

- рівні дозувань (з використанням технологічної рідини, концентрації),

- стать дозованих тварин,

- введення в таблицю отриманих даних про кожну стать, рівень дози (наприклад, кількість померлих/позбавлених життя тварин в ході тесту, кількість тварин з ознаками токсичності, загальна кількість протестованих тварин),

- час настання смерті після дозування, причини та критерії для гуманного позбавлення життя,

- всі інші спостереження,

- показник НД стосовно кожній статі - визначається на 50

14 день спостереження (визначеним методом розрахунків),

- 95% інтервал довіри для НД (там, де можна отримати такі 50

дані),

- крива дозування/смертності, падіння (якщо дозволяє метод визначення),

- результати розтину,

- будь-які гістопатологічні результати,

- результати будь-якого тесту стосовно протилежній статі,

- обговорення результатів (звернути особливу увагу на те, який вплив на показник НД матиме гуманне позбавлення тварин 50

життя),

- інтерпретація результатів.

3.2. ОЦІНКА ТА ІНТЕРПРИТАЦІЯ

Див. Вступ до Частини В (D).

4. ПОСИЛАННЯ

Див. Вступ до Частини В (Е).

В.4. ГОСТРА ТОКСИЧНІСТЬ: УРАЖЕННЯ/РОЗ'ЇДАННЯ ШКІРИ

1. МЕТОД

Даний метод є еквівалентним ТІ (Тестовим інструкціям) ОЕСР 404 (2002).

1.1. ВСТУП

Під час підготовки та розробки цього вдосконаленого методу особливу увагу приділяли питанням модернізації охорони тварин, оцінці існуючої інформації про хімічну речовину, з метою можливого уникнення потреби проведення лабораторних дослідів на тваринах. Даним методом рекомендується аналізувати фактичну вагу тварин на підставі існуючої відповідної інформації перед самим проведенням дослідження на живих істотах (тести на роз'їдання та ураження шкіри). Якщо для такої оцінки немає достатньо даних, тоді їх можна отримати з наступного тесту (1). Стратегія тестування включає виконання дійсних та загальноприйнятих тестів у пробірці, і подається, як Додаток до даного методу. Крім того, в ході початкового тесту в пробірці рекомендується поступове, а не одночасне, застосовування до тварини трьох тестових зразків.

З метою дотримання правил охорони тварин та розумного наукового підходу необхідно утриматись від проведення тестів на живих організмах до тих пір, поки не буде оцінено дію хімічної речовини (роз'їдання/ураження шкіри) методом аналізу фактичної ваги. До таких даних входять лабораторні дослідження на людях та/або тваринах, докази роз'їдання речовиною або кількома структурно подібними речовинами або сумішами таких речовин, дані, що показують високу кислотність або лужність речовини (2)(3), а також результати дійсних загальноприйнятих тестів на живих організмах (коли доза вводиться спочатку в ізольовані клітини, а потім в організм) та в пробірці (4)(5)(5а). Такий метод аналізу повинен зменшити потребу в проведені тесту на живих істотах на предмет виявлення роз'їдання/ураження шкіри хімікатами, про дію яких вже є достатньо інформації з інших тестів.

Перевага надається стратегії послідовного тестування, яка полягає в проведенні експериментів в пробірці або колишніх досліджень на живих організмах на предмет роз'їдання/ураження шкіри. Дана стратегія подається, як Додаток до цього Методу. Така стратегія була розроблена, одностайно рекомендована учасниками семінару ОЕСР (6) та прийнята, як рекомендована стратегія тестування Глобальної Гармонізованої Системи (ГГС) класифікації хімічних речовин (7). Дану стратегію рекомендується застосовувати перед виконанням дослідів на живих організмах. Що стосується істотно нових хімічних речовин, то рекомендується поступовий підхід до тестування для розробки науково обґрунтованих даних щодо ураження/роз'їдання речовиною поверхні об'єкта експерименту. Якщо йдеться про вже існуючі речовини, про які немає достатньо інформації щодо ефекту ураження/роз'їдання, тоді описана стратегія повинна заповнити такі прогалини. Можливе впровадження іншої методики або стратегії, а також прийняття рішення щодо відмови застосування поступового підходу. Проте, необхідно обґрунтувати доцільність таких рішень.

Якщо не вдається визначити корозійну активність або ефект ураження/подразнення за допомогою аналізу фактичної ваги, сумісного зі стратегією поступового тестування, необхідно розглянути можливість тестування на живих організмах протягом 4 годин.

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ

Ураження/подразнення шкіри: завдання шкірі оборотної шкоди після застосування тестованої речовини протягом 4 годин.

Роз'їдання шкіри: завдання шкірі необоротної шкоди; тобто, візуально спостерігається омертвіння епідерму шкіри, після застосування тестованої речовини протягом 4 годин. Типовими ознаками реакції роз'їдання є виразки, кровотечі, криваві струпи, і наприкінці 14-го дня експерименту відбувається зміна кольору через відбілювання шкіри, спостерігаються великі ділянки облисіння та шрами. Деякі ураження викликають спірні запитання, тому рекомендується гістопатологія.

1.3. ПРИНЦИП МЕТОДУ

Хімічну речовину, що є предметом тестування, наносять однією дозою на шкіру піддослідної тварини; неуражені ділянки шкіри якості слугують для порівняння. Показник рівня роз'їдання шкіри зчитується та записується через певні інтервали, і описується далі для того, щоб забезпечити повну оцінку отриманих результатів. Дослідження повинно тривати стільки, щоб оцінити можливість оборотності/необоротності отриманих ефектів.

Тварин, які виявляють ознаки тривалих страждань та гострого болю на будь-якому з етапів тестування, необхідно позбавити життя гуманним способом. Критерії прийняття рішень щодо гуманності позбавлення життя тварин, які знаходяться в передсмертному стані, можна знайти в посиланні (8).

1.4. ОПИС МЕТОДУ

1.4.1. Підготовка до проведення тесту на живих організмах

1.4.1.1. Вибір виду тварин

В якості найкращої лабораторної тварини підходить кролик-альбінос та молоді дорослі кролі загалом. Доцільність використання інших видів тварин повинна бути відповідно обґрунтована.

1.4.1.2. Підготовка тварин

Приблизно за 24 години до початку тесту необхідно видалити шерсть, вирізавши шерсть або поголивши ділянку від спини до голови тварини. Важливо це робити обережно, щоб в ході такої процедури не пошкодилась шкіра тварин, тому варто вибирати лише тварин зі здоровою, неушкодженою шкірою.

1.4.1.3. Умови утримання та годування

Тварин необхідно тримати окремо. Температура в експериментальних приміщеннях, де утримують кролів повинна бути в межах 22 град.С (+- 3 град.С). Незважаючи на те, що відносна вологість повітря повинна бути, принаймні, 30% та, якщо можливо, не перевищувати 70%, за винятком, коли приміщення прибирають, необхідно намагатись, щоб цей показник був 50-60%. Освітлення має бути штучним, з інтервалом 12 годин (світло-темно). Що стосується сучасного годування тварин в лабораторних умовах, то необхідно, щоб в їх раціоні кількість питної води не обмежувалась.

1.4.2 Процедура тесту

1.4.2.1. Застосування/нанесення тестованої речовини

Тестовану речовину наносять на невелику ділянку шкіри (приблизно, 6 кв.см) і накривають клаптиком марлі, яку прикріплюють до тіла тварини клейкою тасьмою, яка б не спричиняла подразнення. Якщо в деяких випадках пряме нанесення речовини неможливе (наприклад, рідини або пастоподібні речовини), тоді хімікат спочатку наносять на марлю, яку в свою чергу прикріплюють на шкіру тварини. Марля з речовиною повинна бути вільно прикріплена до шкіри за допомогою напівгерметичної пов'язки на весь період експерименту. Якщо речовина наноситься на марлю, а потім на шкіру, то закріплюватись вона повинна так, щоб був хороший контакт та рівномірний розподіл хімікату по всій поверхні шкіри. Необхідно, щоб тварина не змогла дістати марлю з речовиною, а також з'їсти або вдихнути її.

Рідини, в основному, застосовують в нерозбавленому виді. У випадку використання сухих твердих хімічних речовин (за потреби можна застосовувати пульверизатор) саму речовину потрібно змочити в достатній кількості води або, при потребі, в іншому технологічному розчині для кращого приставання до шкіри. Коли використовується технологічна рідина (не вода) необхідно, щоб можливий вплив хімікату на шкіру, її роз'їдання, був мінімальним, якщо можливо.

Наприкінці тестування, яке триває, як правило, 4 години, видаляють всі залишки речовини, використовуючи, якщо потрібно, воду чи відповідний розчинник, не змінюючи отриманих результатів на шкірі або цілісність епідермісу.

1.4.2.2. Рівень дозувань

Беруть дозу рідини із вмістом 0,5 мл, або 0,5 г сухої чи пастоподібної речовини.

1.4.2.3. Початковий тест (на живих організмах: ураження/роз'їдання шкіри на прикладі однієї тварини)

Дуже важливо, щоб тест на живих організмах проводився спочатку на одній тварині, особливо тоді, коли є підозра того, що речовина може мати ефект роз'їдання. Це відповідає вимогам стратегії поступового тестування (див. Додаток 1).

Якщо роз'їдаючо-корозійні властивості речовини було виявлено на основі аналізу фактичної ваги, тоді подальше тестування на тваринах непотрібне. Більшість речовин, які можуть мати корозійно-роз'їдаючі властивості, як правило, не потребують подальшої тестової перевірки на живих організмах. Проте, в тих випадках, коли додаткової інформації недостатньо через відсутність достатніх доказів, обмежена кількість тестів допускається. При цьому застосовується такий підхід:

На тварину в певній послідовності наносять три марлевих клаптика з хімікатом. Через три хвилини забирають перший клаптик. Якщо на шкірі не спостерігається жодної серйозної реакції, тоді наносять другий марлевий клаптик з хімікатом, який знімають через годину. Якщо на даній стадії спостережень буде виявлено, що експеримент гуманним чином можна продовжити до 4 годин загалом, тоді наноситься третій марлевий клаптик, який знімається через 4 години, а результати записують.

Якщо в ході одного з трьох етапів експерименту спостерігатиметься ефект роз'їдання шкіри, тестування негайно припиняють. У випадку, коли такого ефекту не спостерігається навіть після закріплення останнього марлевого клаптика, за твариною спостерігають 14 днів, за винятком, якщо ефект роз'їдання шкіри з'являється раніше.

Якщо взята хімічна речовина, ймовірно, не є корозійною, а лише спричиняє подразнення, тоді для нанесення її на тварину застосовують лише один марлевий клаптик протягом 4 годин.

1.4.2.4. Тест-підтвердження (тестування на живих організмах на предмет ураження/роз'їдання шкіри): дослід на додаткових тваринах

Якщо ефект роз'їдання/корозії не спостерігається під час початкового тесту, тоді необхідно отримати підтвердження про подразнення або його відсутність, провівши дослід на двох додаткових тваринах з нанесенням хімічної речовини на 4 години. У випадку, коли ефект подразнення спостерігається в першому тестуванні, послідовно проводять тест-підтвердження, або роблять дослід на ще двох тваринах одночасно. В окремих випадках, якщо не проводиться початковий тест, двом-трьом тваринам прикріпляють по одному клаптику марлі з хімікатом, який знімають за 4 години. Подальше тестування непотрібно, якщо беруть двох тварин, на яких виявляють однакові результати. В іншому ж випадку тестують і третю тварину. Необхідність використання додаткових тварин пояснюється лише нечіткими та непереконливими результатами.

1.4.2.5. Період спостереження

Тривалість періоду спостереження повинна бути достатньою настільки, щоб повною мірою оцінити оборотність отриманих ефектів. Проте, експеримент необхідно зупинити в будь-який час, якщо піддослідна тварина виявляє ознаки гострого болю або знедужання. Щоб визначити оборотність отриманих результатів, за тваринами потрібно спостерігати 14 днів після зняття марлевих клаптиків. Якщо оборотність спостерігається раніше 14 днів, експеримент слід припинити відразу.

1.4.2.6 Клінічні спостереження та класифікація реакцій шкіри

Всіх тварин необхідно перевірити на предмет появи в них ознак еритеми (почервоніння шкіри) та набряків на 60-тій хвилині, а потім через 24, 48 та 72 години після зняття марлевого клаптика з речовиною. При проведенні початкового тесту над однією твариною необхідно одразу після зняття марлі з хімікатом оглянути місце проведення експерименту. Результати отриманих реакцій на шкірі класифікують та записують, як показано нижче в Таблиці градацій. Якщо ураження шкіри не класифікується, як подразнення або роз'їдання на 72-ій годині експерименту, необхідно, при потребі, проводити спостереження 14 днів, щоб визначити оборотність ефектів. Крім спостережень за появою роз'їдання, необхідно повністю описувати та фіксувати всі локальні ефекти, такі, як обезжирення шкіри та будь-які систематичні шкідливі ефекти (наприклад, клінічні ознаки токсичності та вага тіла). У випадку появи нечітких або незрозумілих результатів проводять гістопатологічний огляд.

Класифікація реакцій на шкірі є завжди суб'єктивною. Тому, для узгодженості та координації в процесі класифікації рівнів ураження шкіри, а також з метою допомогти лабораторіям та персоналу під час отримання та інтерпретації результатів спостережень, необхідно, щоб працівники мали належну підготовку та кваліфікацію для підрахунку балів системи (див. подану нижче Таблицю). Корисним може виявитись ілюстрований довідник з класифікації результатів роз'їдання шкіри та інших уражень (9).

2. ДАНІ

2.1. ЗВІТНІСТЬ

Результати експерименту підсумовують у вигляді таблиці в підсумковому звіті про результати. Таблиця повинна відображати всі пункти, перелічені в секції 3.1.

2.2. ОЦІНЮВАННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

Показники/бали подразнення шкіри оцінюються відповідно до характеру та шкідливості уражень, а також їх оборотності або необоротності. Індивідуальні показники не є абсолютним стандартом в плані оцінки подразнюючих властивостей матеріалу, оскільки проводиться оцінка інших ефектів тестованого матеріалу. Тож, такі індивідуальні показники варто розглядати, як номінальні, стосовно яких необхідно робити порівняння з іншими, отриманими в ході експерименту, величинами.

Під час оцінки результатів подразнення шкіри необхідно враховувати оборотність отриманих уражень. Якщо такі ознаки, як облисіння (невелика ділянка), гіперкератоз, гіперплазія та лущення шкіри продовжуються до 14 дня спостереження, тоді речовину вважають такою, що спричиняє подразнення.

3. ЗВІТНІСТЬ

3.1. ЗВІТНІСТЬ ПРО РЕЗУЛЬТИ ТЕСТУ

Звітність про результати тесту, якщо можливо, повинна містити наступну інформацію:

Підстава для проведення тесту на живих організмах: аналіз фактичної ваги (на основі попередніх даних тестування, включаючи результати стратегії поетапного тестування):

- опис відповідних даних з попереднього тестування,

- дані, отримані на кожному етапі стратегії тестування,

- опис виконаних тестів на живих організмах, включаючи деталі проведення процедур, результати, отримані в ході тестування базових речовин,

- аналіз фактичної ваги для проведення досліду на живих організмах.

Речовина для тестування:

- дані ідентифікації (наприклад, номер CAS, походження хімікату, відсутність домішок, наявні домішки, номер партії),

- фізичні характеристики та фізико-хімічні властивості (наприклад, рН, змінність, розчинюваність, стійкість),

- якщо це суміш - її склад та співвідношення компонентів у відсотках.

Технологічна рідина:

- ідентифікація, концентрація (якщо потрібно), об'єм,

- доцільність застосування технологічної рідини.

Піддослідні тварини:

- види та роди тварин, обґрунтована доцільність використання інших тварин (не кроликів),

- кількість тварин кожної статі,

- індивідуальна вага тварин на початку та наприкінці тесту,

- вік тварин на момент експерименту,

- походження тварин, умови утримання тощо.

Умови проведення тестування:

- техніка підготовки ділянки, на яку наноситиметься хімікат,

- інформація про матеріали, що використовуються для підготовки ділянки, на яку наноситиметься хімікат,

- деталі щодо приготування тестованої речовини, її застосування/нанесення та зняття.

Результати:

- зведення в таблицю інформації про кожну тварину: показники подразнення/роз'їдання шкіри, які замірювались постійно,

- опис уражень шкіри в ході спостережень,

- детальний опис особливостей та рівня подразнення або роз'їдання в ході спостереження, а також будь-які гістопатологічні дані,

- опис інших шкідливих локальних (наприклад, обезжирення шкіри) та систематичних ефектів, в додаток до вже описаних ефектів ураження або роз'їдання шкіри,

- обговорення результатів.

4. ПОСИЛАННЯ

(1) Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J. J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, p. 410-429.

2) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicollogy In Vitro, 2, p. 19-26.

(3) Worth, A.P., Fentem, J.H., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Liebsch, M. (1998) Evaluation of the proposed OECD Testing Strategy for skin corrosion. ATLA 26, p. 709-720.

(4) ECETOC (1990) Monograph No 15, 'Skin Irritation', European Chemical Industry, Ecology and Toxicology Centre, Brussels.

(5) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G.and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology In Vitro 12, p. 483-524.

(5a) Testing Method B.40 Skin Corrosion.

(6) OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonisation of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22-24 January 1996 (http://www.oecd1.org/ehs/test/background.htm).

(7) OECD (1998) Harmonised Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www.oecd1.org/ehs/Class/HCL6.htm).

(8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No 19 (http://www.oecd1.org/ehs/test/monos.htm).

(9) EPA (1990). Atlas of Dermal Lesions, (20T-2004). United States Environmental Protection Agency, Office of Pesticides and Toxic Substances, Washington, DC, August 1990.

(Дані публікації можна отримати на вимогу в Секретаріаті ОЕСР).

Таблиця 1

КЛАСИФІКАЦІЯ РЕЗУЛЬТАТІВ РЕАКЦІЇ НА ШКІРІ

Інформація про появу почервоніння та струпів

Почервоніння (еритема) .................................... 0

Легке почервоніння (ледве помітне) ........................ 1

Явно виражене почервоніння ................................ 2

Почервоніння середнього та високого рівня ................. 3

Дуже сильне почервоніння (яловиче почервоніння) або

утворення струпів, ще не класифікується, як еритема ....... 4

Максимально можливе: 4

Утворення набряків

Набряки відсутні .......................................... 0

Ледь помітний набряк (легкої форми) ....................... 1

Легкий набряк (краї шкіри явно виражені та припідняті)..... 2

Набряк середньої форми (краї шкіри припідняті,

приблизно, на 1 мм) ....................................... 3

Сильний набряк (краї шкіри припідняті більше, ніж

на 1 мм та заходять за визначену ділянку) ................. 4

Максимально можливе: 4

Якщо результати досліджень нечіткі або незрозумілі, тоді проводять гістопатологічний огляд.

Додаток

Стратегія поступового тестування на предмет оцінки подразнення та роз'їдання шкіри

ЗАГАЛЬНИЙ РОЗГЛЯД

З метою розумного наукового підходу та охорони життя тварин дуже важливо уникати зайвого проведення досліджень на живих істотах, а також мінімізувати можливість будь-яких експериментів, в ході яких тваринам, ймовірно, буде завдано серйозної шкоди. Перед тим, як розглянути саму можливість проведення тестів на живих організмах, необхідно зробити оцінку інформації щодо можливого ураження шкіри: подразнення та роз'їдання. Потреба в проведенні досліджень над тваринами може виявитись зайвою, якщо вже є достатньо інформації щодо класифікації хімічної речовини на предмет ураження та роз'їдання шкіри. Таким чином, застосування аналізу фактичної ваги та стратегії поступового тестування зможуть мінімізувати потребу в проведенні тесту на живих організмах, якщо тестована речовина може викликати шкідливі реакції.

Метод аналізу фактичної ваги рекомендується застосовувати для того, щоб оцінити доступну інформацію щодо подразнення та роз'їдання шкіри хімічною речовиною з метою визначення потреби в проведенні додаткових досліджень, які відрізняються від експериментів на живих організмах. Якщо потреба в подальших дослідженнях все ж існує, тоді рекомендується застосовувати стратегію поступового тестування для розробки та вдосконалення відповідних експериментальних даних. Метод аналізу фактичної ваги застосовується до тих хімічних речовин, про які відсутня будь-яка історія досліджень, з метою розробки даних для оцінки потенційно можливих ефектів ураження та роз'їдання шкіри. Описана в даному Доповненні стратегія тестування була розроблена в ході семінару ОЕСР (1), згодом затверджена і розвинута в Глобальній Гармонізованій Системі (ГГС) Класифікації Хімічних Речовин щодо впливу на здоров'я людини та навколишнє середовище. Рішення будо затверджено 28 листопада 1998 року, під час 28-го Спільного скликання хімічного комітету та Робочої групи з дослідження хімічних речовин (2).

Незважаючи на те, що стратегія поступового тестування не є компонентом методу В.4, вона все ж носить рекомендаційний характер щодо визначення характеристик подразнення/роз'їдання шкіри. Такий рекомендаційний характер даної стратегії представляє собою, як передовий досвід, так і певні етичні критерії оцінки результатів досліду на живих організмах на предмет виявлення ефектів подразнення та роз'їдання шкіри. Метод тестування дає рекомендації щодо проведення експерименту на живих організмах, а також підсумовує показники, на які варто звернути увагу ще до початку самого тестування. Стратегія являє собою підхід до оцінки вже існуючої бази даних про роз'їдаючі властивості хімічних речовин, а також багаторівневий підхід щодо формування відповідних даних про речовини, які потребують додаткового вивчення або про які не проводилось жодних досліджень. Дана стратегія також рекомендує проведення в певних умовах вже оцінених та загальноприйнятих тестів на живих організмах або в пробірці з метою визначення подразнення/роз'їдання шкіри.

СТРАТЕГІЯ ТЕСТУВАННЯ ТА ОПИС ОЦІНЮВАННЯ

Перед проведенням тестів, як елементу стратегії поступового тестування (див. Малюнок), необхідно зробити оцінку існуючої з даного питання інформації, щоб визначити потребу в дослідах на живих організмах. Незважаючи на те, що важливу інформацію можна отримати з оцінки окремих параметрів (наприклад, крайнє значення рН), необхідно враховувати всю інформацію в цілому. Сумнівна інформація про дію речовини або її аналогів повинна перевірятись методом оцінки фактичної ваги, а рішення про застосування такого методу необхідно обґрунтувати. Особливо підкреслити необхідно вже існуючу інформацію про дію речовини на тварин та людей, а також результати досліджень на живих організмах і в пробірці. Необхідно уникати, якщо можливо, проведення експериментів над тваринами (живими організмами) на предмет виявлення роз'їдаючих властивостей хімічної речовини. До показників стратегії тестування входить наступна інформація:

Оцінка даних про дію хімічної речовини на тварин та людей (Етап 1). Першими беруться до уваги результати дії речовини на людях, наприклад, дані клінічних та професійних досліджень, доповіді, результати щодо тварин (наприклад, окремі та повторювані експерименти щодо визначення токсичності ураження шкіри). Така інформація враховується першою, оскільки безпосередньо стосується дії речовини на шкіру. Під час проведення експериментів на живих організмах непотрібно застосовувати хімічні речовини, які відомі своєю роз'їдаючою та подразнюючою дією або, навпаки, не проявляють таких ознак.

Аналіз залежності речовини від структури (ЗРВ) (Етап 2). Результати тестування структурно пов'язаних хімічних речовин необхідно при можливості враховувати. Якщо є достатньо інформації про структурно пов'язані речовини або суміші таких речовин, а саме, їх роз'їдаючу та подразнюючу дію на людей та/чи тварин, тоді можна припустити, що тестована речовина продемонструє такі самі результати. За таких умов даний хімікат тестувати непотрібно. Негативні результати досліджень структурно пов'язаних речовин або їх сумішей не дають достатніх доказів про відсутність роз'їдаючої та подразнюючої дії хімічної речовини під час використання стратегії поступового тестування. Для визначення можливості ефекту подразнення та роз'їдання шкіри необхідно застосовувати загальноприйняті та оцінені методи ЗРВ.

Фізичні та хімічні властивості, хімічна активність (Етап 3). Сильнодіючими можуть виявитись хімічні речовини з крайнім значенням рН, а саме: <= 2,0 та >= 11,5. Якщо крайнє значення рН є основним при визначенні роз'їдаючої дії речовини на шкіру, тоді також можна брати до уваги такі характеристики речовини, як кислотно-лужний резерв (або буферну ємність) (3)(4). Якщо з буферної ємності випливає, що взята речовина не може проявляти роз'їдаючої дії на шкірі, тоді варто далі проводити дослідження, щоб цей факт можна було підтвердити. Для цього застосовують загальноприйняте тестування в пробірці або на живих організмах (коли доза вводиться спочатку в ізольовані клітини, а потім в організм тварини) - див. етапи 5, 6.

Шкірна токсичність (Етап 4). Якщо хімічна речовина виявляється досить токсичною після нанесення на шкіру, дослідження ефектів роз'їдання/подразнення шкіри на живих організмах не практикують, оскільки та кількість речовини, що, як правило застосовується, може перевищити максимально допустиму дозу токсичності, і, відповідно, призвести до загибелі тварин або спричинити сильний біль. Крім того, коли проведені на кроликах-альбіносах досліди шкірної токсичності показують, що при застосуванні дози в 2000 мг/кг (відносно ваги) або більше, не було виявлено жодних ознак подразнення чи роз'їдання, подальші дослідження в цьому напрямку непотрібні. Під час оцінки гострої шкірної токсичності слід враховувати ряд факторів. Так, наприклад, інформації про ураження шкіри може виявитись недостатньо. Тестування та спостереження могли проводитись на інших видах тварин (не на кроликах), які можуть суттєво відрізнятись чутливістю до хімічної речовини. Також, форма тестованої речовини, що наноситься на тіло тварини, може бути невідповідною для оцінки ефекту роз'їдання/подразнення шкіри (наприклад, розріджування речовин для перевірки шкірної токсичності (5)). Проте, в тих випадках, коли на кроликах проводились добре розроблені та організовані експерименти для виявлення шкірної токсичності, отримані в результаті цього негативні результати можна вважати достатнім доказом того, що хімічна речовина не викликає подразнення або роз'їдання.

Результати тестів в пробірці або на живих організмах (коли доза вводиться спочатку в ізольовані клітини, а потім в організм тварини) (Етап 5, 6). На тваринах непотрібно тестувати хімічні речовини, які виявили подразнюючу та роз'їдаючу дію під час проведення спеціально розроблених для цього тестів в пробірці або на живих організмах (коли доза вводиться спочатку в ізольовані клітини, а потім в організм тварини) (6)(7). Можна припустити, що такі хімікати продемонструють подібні шкідливі ефекти під час експериментів на живих організмах (де доза вводиться одразу в організм тварини).

Тести на кроликах (Етап 7, 8). У випадку, якщо буде прийнято рішення про застосування аналізу фактичної ваги для проведення тестування на живих організмах, починати необхідно з початкового тесту на одній тварині. Якщо результати покажуть, що речовина має подразнюючу/роз'їдаючу дію, тоді подальше тестування непотрібно. І, навпаки, коли в першому тестуванні такого ефекту не спостерігається, необхідно взяти ще двох додаткових тварин і провести над ними експеримент для підтвердження ефекту роз'їдання або подразнення шкіри. Якщо ефект подразнення спостерігається вже в початковому тестуванні, тоді тест-підтвердження проводять поетапно або тестуючи двох тварин одночасно.

ПОСИЛАННЯ

(1) OECD, (1996) Test Guidelines Programme: Final Report on the OECDWorkshop on Harmonisation of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held on Solna, Sweden, 22-24 January 1996 (http://www1.oecd.org/ehs/test/background.htm).

(2) OECD, (1998) Harmonised Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects ow Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www1.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).

(3) Worth, A.P., Fentem J.H., Balls M., Botham P.A., Curren R.D., Earl L.K., Esdaile D.J., Liebsch M., (1998). An Evaluation of the Proposed OECD Testing Strategy for Skin Corrosion. ATLA 26, p. 709-720.

(4) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth, W.M.H., (1988). Classification as Corrosive or Irritant to Skin ow Preparations Containing Acidic or Alkaline Substances, Without Testing on Animals. Toxicology In Vitro, 2(1), p. 19-26.

(5) Patil, S.M., Patrick, E., Maibach, H.I. (1996) Animal, Human, and In Vitro Test Methods for Predicting Skin Irritation, in: Francis N. Marzulli and Howard I. Maibach (editors): Dermatotoxicology. Fifth Edition ISBN 1-56032-356-6, Chapter 31, p. 411-436.

(6) Testing Method B.40.

(7) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology In Vitro 12, p. 483-524.

Малюнок

СТРАТЕГІЯ ТЕСТУВАННЯ ТА ОЦІНКИ ШКІРНОГО ПОДРАЗНЕННЯ/РОЗЇДАННЯ

Діяльність             Результат                 Висновок

-----------------
 1. |Існуючі дані   |       Роз'їдання               Найвищий показник;
    |про ефект      |                                вважається роз'їданням.
    |ураження шкіри |                                Тестування непотрібно.
    |або слизової   |
    |оболонки людини|       Подразнення              Найвищий показник;
    |та/чи тварини  |                                вважається подразненням.
    -----------------                                Тестування непотрібно.
           |
           |                Ефект                    Найвищий показник;
           |                подразнення/             ефект
           |                роз'їдання               подразнення/роз'їдання
           |                відсутній                відсутній
           |                                         Тестування непотрібно.
           |
           |
           |
           |
           \/
    Інформація відсутня або непереконлива

-----------------
 2. |Проведіть      |       Передбачається           Вважається роз'їданням.
    |оцінку ЗРВ     |       сильне                   Тестування непотрібно.
    |на предмет     |       ураження шкіри
    |роз'їдання/    |
    |подразнення    |       Передбачається           Вважається подразненням.
    |шкіри          |       подразнення шкіри        Тестування непотрібно.
    -----------------
           |
           |
           |
           \/
    Прогнозування неможливе
    або не допускає роз'їдання
    чи негативного результату

-----------------
 3. |Виміряйте рН   |       рН <= 2,0 та >= 11,5     Роз'їдання допускається.
    |(враховуючи    |       (при великій             Тестування непотрібно.
    |буферну        |       буферній ємності,
    |ємність, якщо  |       якщо потрібно)
    |потрібно)      |
    -----------------
           |
           \/
    2 < рН < 11,5 або рН <= 2,0 та >= 11,5
    при малій буферній ємності/або її
    відсутності, якщо потрібно

-----------------
 4. |Проведіть      |       Сильна токсичність       Потрібне подальше
    |оцінку даних   |                                тестування.
    |про            |
    |систематичну   |       Ефект                    Роз'їдання/подразнення
    |токсичність дії|       роз'їдання/подразнення   не допускається.
    |на шкіру(1)    |       відсутній під час        Подальше тестування
    -----------------       тестування на кроликах   непотрібно.
           |                при обмеженій дозі, що
           |                становить 2000 мг/кг
           |                або більше
           \/
    Така інформація недоступна
    або вважається непереконливою

-----------------
 5. |Необхідно      |       Роз'їдання               Роз'їдання допускається
    |провести       |                                під час досліду на живих
    |оцінені та     |                                організмах. Подальше
    |загально-      |                                тестування непотрібно.
    |прийняті       |
    |тестування в   |
    |пробірці та на |
    |живих          |
    |організмах     |
    |(коли доза     |
    |вводиться      |
    |спочатку в     |
    |ізольовані     |
    |клітини, а     |
    |потім          |
    |в організм     |
    |тварини) на    |
    |предмет        |
    |роз'їдання     |
    |шкіри          |
    -----------------
           |
           \/
    Речовина не має роз'їдаючої дії

-----------------
 6. |Необхідно      |       Подразнення              Роз'їдання допускається
    |провести       |                                під час досліду на живих
    |оцінні та      |                                організмах. Подальше
    |загально-      |                                тестування непотрібно.
    |прийняті       |
    |тестування в   |
    |пробірці та    |
    |на живих       |
    |організмах     |
    |(коли доза     |
    |вводиться      |
    |спочатку в     |
    |ізольовані     |
    |клітини, а     |
    |потім в        |
    |організм       |
    |тварини) на    |
    |предмет        |
    |подразнення    |
    |шкіри          |
    -----------------
           |
           \/
    Коли відсутні загальноприйняті
    методи тестування в пробірці або
    на живих організмах (коли хімікат
    спочатку вводиться в клітину
    ізольовано) на предмет подразнення
    шкіри, або хімічна речовина
    не викликає подразнення

-----------------
 7. |Проведіть      |       Сильне ураження          Ефект роз'їдання.
    |початковий тест|       шкіри                    Подальше тестування
    |над кроликом   |                                непотрібно.
    |(лише одна     |
    |тварина)       |
    -----------------
           |
           \/
    Сильного ураження немає

-----------------
 8. |Проведіть тест-|       Роз'їдання або           Ефект роз'їдання або
    |підтвердження  |       подразнення              подразнення.
    |на ще одній    |                                Подальше тестування
    |або двох       |                                непотрібно.
    |тваринах       |
    -----------------       Відсутність              Немає ефекту роз'їдання
                            роз'їдання або           чи подразнення.
                            подразнення              Подальше тестування

непотрібно.

----------------

(1) береться до уваги перед Етапом 2, 3.

B.5. ГОСТРА ТОКСИЧНІСТЬ: ПОДРАЗНЕННЯ ОКА/РОЗ'ЇДАННЯ

1. МЕТОД

Цей метод еквівалентний методу, описаному у ТІ ОЕСР 405 (2002).

1.1. ВСТУП

При підготовці цього оновленого методу особлива увага приділялася можливості вдосконалення шляхом оцінки наявної інформації щодо досліджуваної речовини з метою уникнення зайвих досліджень на лабораторних тваринах, враховуючи, таким чином, питання захисту тварин. Цей метод містить наступну рекомендацію: перш ніж проводити описане дослідження гострого подразнення ока/роз'їдання in vivo, потрібно здійснити аналіз вагомих доказів (1) на основі існуючих відповідних даних. Якщо наявних даних недостатньо, рекомендується розробляти їх шляхом застосування послідовних тестувань (2)(3). Стратегія тестувань включає виконання затверджених і прийнятих досліджень in vitro і розглядається в Додатку до методу дослідження. Додатково рекомендується застосування дослідження подразнення/роз'їдання на шкірі in vivo для передбачення подразнення ока, перш ніж проводити дослідження на оці живих організмів.

В інтересах як фундаментальної науки, так і захисту тварин, не слід вдаватися до досліджень in vivo до проведення оцінки методом аналізу вагомих доказів всіх доступних даних, що стосуються потенційної корозійної активності/подразнення речовиною ока. Такі дані включатимуть дані, отримані з існуючих досліджень на людях та/або лабораторних тваринах, дані щодо корозійної активності/подразнення однієї або більше структурно подібних речовин або суміші таких речовин, дані, що демонструють високу кислотність або лужність речовини (4)(5), та результати затверджених і прийнятих досліджень роз'їдання/подразнення шкіри в лабораторних умовах і на неживих організмах (6)(6a). Дослідження потрібно проводити до проведення аналізу вагомих доказів, або після проведення цього аналізу.

Для певних речовин такий аналіз може означати необхідність в проведенні дослідження на живих організмах роз'їдання ока/потенціалу подразнення речовини. В усіх зазначених випадках перед проведенням випробування на оці живого організму доцільно провести спочатку дослідження впливу речовини на шкіру і оцінити результати згідно з методом випробування B.4 (7). Застосування методу аналізу вагомих доказів і стратегії послідовних випробувань зменшує потребу в проведенні випробувань на живих організмах для виявлення корозійної активності/подразнення для речовин, щодо яких вже отримано достатньо результатів у ході інших досліджень. Якщо визначення корозійного потенціалу або потенціалу подразнення щодо ока не може бути виявлене за допомогою стратегії послідовних випробувань, навіть після застосування дослідження впливу роз'їдання або подразнення на шкіру живих організмів, можливе проведення дослідження впливу роз'їдання/подразнення на око живих організмів.

Стратегія послідовних випробувань, що включає в себе застосування затверджених досліджень роз'їдання/подразнення в лабораторних умовах та на неживих організмах, якій надається перевага, внесена у Додаток до цього методу випробування. Стратегію було розроблено і одностайно рекомендовано учасниками семінару ОЕСР, а також було внесено як рекомендовану стратегію випробувань у склад Всесвітньо Гармонізованої Системи Класифікації Хімічних Речовин (ВГС) (9). Рекомендується використовувати цю стратегію випробувань перед проведенням випробувань на живих організмах. Для нових речовин рекомендований поетапний підхід до випробувань з метою отримання науково вагомих даних щодо корозійної активності/подразнення речовини. Для існуючих речовин, щодо яких немає достатньої кількості даних про роз'їдання/подразнення очей і шкіри, ця стратегія застосовується з метою заповнення прогалин у даних. Використання іншої стратегії або процедури випробувань, або рішення не використовувати поетапний підхід до випробувань має бути виправданим.

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ

Подразнення ока: зміни в оці, викликані застосуванням досліджуваної речовини до зовнішньої поверхні ока, які повністю зворотні впродовж 21 дня після застосування.

Роз'їдання очей: пошкодження тканини ока або серйозні фізичні розлади зору, викликані застосуванням досліджуваної речовини до зовнішньої поверхні ока, які повністю зворотні впродовж 21 дня після застосування.

1.3. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

Речовина, що випробовується, застосовується в одиничній дозі до одного з очей піддослідної тварини; неушкоджене око використовується в якості контрольного. Ступінь подразнення/роз'їдання ока розраховується шляхом оцінювання пошкоджень кон'юнктиви, роговиці і райдужної оболонки через визначені проміжки. Інші впливи на око і шкідливі для здоров'я системні впливи також описані для повноти оцінки впливів. Тривалість дослідження має бути достатньою для оцінки зворотності або незворотності впливів.

Тварини, що демонструють постійні ознаки сильних страждань та/або болю на будь-якому етапі досліджень, підлягають знищенню гуманним способом, а речовині надається відповідна оцінка. Критерії для прийняття рішення щодо гуманного знищення помираючих або сильно страждаючих тварин можна знайти за посиланням(10).

1.4. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

1.4.1. Підготовка до досліджень на живих організмах

1.4.1.1. Вибір біологічних видів

Кролик-альбінос якнайкраще підходить для лабораторних досліджень; для досліджень обирають здорових молодих дорослих тварин. Для використання інших ліній біологічних видів потрібне обґрунтування.

1.4.1.2. Підготовка тварин

Огляд обох очей кожної з попередньо вибраних піддослідних тварин проводиться за 24 години до початку випробування. Тварини, що мають прояви подразнення очей, ушкодження очей або вже існуючі ураження рогівки, не підлягають використанню.

1.4.1.3. Умови утримання і годування

Тварин потрібно утримувати окремо. Температура у приміщенні, де утримуються піддослідні тварини має становити 20 град.C (+- 3 град.C) для кроликів. Хоча відносна вологість має становити принаймні 30% і не перевищувати 70%, крім часу прибирання приміщення, оптимальним значенням є 50-60%. Освітлення має бути штучним, у наступній послідовності: 12 годин світла, 12 годин темряви. Стосовно годування, можливе використання узгоджених лабораторних дієт з безперервним постачанням питної води.

1.4.2. Процедура дослідження

1.4.2.1. Застосування досліджуваної речовини

Досліджувану речовину слід помістити в кон'юнктивальний мішок одного ока кожної тварини після того, як обережно відтягли нижню повіку від очного яблука. Потім повіки слід обережно притиснути одна до одної впродовж однієї секунди з метою запобігання втрати речовини. Інше око, що залишається неушкодженим, використовується в якості контрольного.

1.4.2.2. Зволоження

Очі піддослідних тварин не слід промивати протягом принаймні 24 годин після введення досліджуваної речовини, окрім випадків введення твердих речовин (див. Розділ 1.4.2.3.2) та негайного роз'їдаючого або подразнюючого ефекту. Через 24 години можна у випадку необхідності промити око.

Використання супутньої групи тварин для вивчення впливу промивання не рекомендується, якщо це не є науково обґрунтованим. Якщо є потреба в супутній групі, слід використати двох кроликів. Умови промивання, як от: час промивання, склад і температура розчину для промивання, тривалість, об'єм рідини і швидкість застосування, необхідно ретельно задокументувати.

1.4.2.3. Рівень дозування

1.4.2.3.1. Тестування рідин

Для тестування рідин використовується доза 0,1 мл. Спрей з розпилювачем не використовується для введення речовини безпосередньо в око. Рідкий спрей слід виштовхувати і збирати в контейнер перед введенням дози 0,1 мл в око.

1.4.2.3.2. Тестування твердих речовин

При тестуванні твердих речовин, паст і порошкових речовин, кількість використовуваної речовини має становити 0,1 мл або не більше 100 мг. Досліджуваний матеріал має бути подрібненим на дрібний пил. Об'єм твердого матеріалу слід вимірювати після обережного ущільнення, наприклад, шляхом постукування мірного контейнера. Якщо тверда досліджувана речовина не вивелася з ока піддослідної тварини завдяки фізіологічним механізмам в перший проміжок спостереження впродовж однієї години після втручання, око можна промити сольовим розчином або дистильованою водою.

1.4.2.3.3. Тестування аерозолів

Рекомендується зібрати спреї з розпилювачем і аерозолі перед закапуванням в око. Єдиний виняток становлять речовини в запресованих аерозольних контейнерах, які неможливо зібрати через випаровування. В таких випадках око слід тримати відкритим, а досліджувану речовину ввести в око простим викидом тривалістю біля однієї секунди на відстані 10 см прямо перед оком. Ця відстань може варіюватися в залежності від тиску розпилювача і його вмісту. Необхідно подбати про те, щоб не пошкодити око тиском розпилювача. У випадках, коли це є доцільним, може виникнути потреба виміряти потенціал "механічного" пошкодження ока силою розпилювача.

Оцінка дози аерозолю може проводитись за допомогою наступного способу моделювання випробування: речовина розпилюється на папір для зважування через отвір розміром з око кролика, розташований безпосередньо перед папером. Збільшення ваги паперу використовується для визначення приблизної кількості речовини, розпиленої в око. Для летючих речовин дозу можна оцінити, зважуючи приймаючий контейнер до та після видалення досліджуваного матеріалу.

1.4.2.4. Початкове тестування (дослідження впливу роз'їдання/подразнення на око живого організму з використанням однієї тварини)

Як зазначено в стратегії послідовних випробувань (див. Додаток 1), наполегливо рекомендується проведення дослідження на живому організмі, використовуючи спочатку одну тварину.

Якщо результати випробування показують, що речовина є роз'їдаючою або викликає сильне подразнення ока за умови використання описаної процедури, подальші дослідження подразнюваності ока необхідно припинити.

1.4.2.5. Місцева анестезія

Місцева анестезія може використовуватись в окремих випадках. Якщо аналіз вагомих доказів показує, що речовина потенційно може викликати біль, або попередні випробування виявили можливість болісних реакцій, можливе застосування місцевої анестезії перед закапуванням досліджуваної речовини. Тип, концентрацію і дозу місцевої анестезії слід ретельно добирати, щоб переконатися, що різниця в реакції на досліджувану речовину не є результатом використання анестезії. Контрольне око також має бути анестезоване.

1.4.2.6. Підтверджувальне тестування (дослідження впливу подразнення на око живого організму з використанням додаткових тварин)

Якщо роз'їдаючого впливу під час початкового тестування не спостерігалось, подразнення або негативна реакція має бути підтверджена використанням додатково до двох тварин. Якщо під час початкового випробування спостерігався сильний подразнюючий ефект, що вказує на можливий сильний (незворотній) вплив під час підтверджувального випробування, рекомендується проводити підтверджувальне випробування послідовним способом на одній тварині за один раз, а не з використанням двох додаткових тварин одночасно. Якщо у другої тварини проявляється роз'їдаючий або сильний подразнюючий ефект, випробування не продовжують. Для підтвердження слабких або помірних реакцій подразнення може виникнути потреба в використанні додаткових тварин.

1.4.2.7. Період спостереження

Тривалість періоду спостереження має бути достатньою для повної оцінки величини та зворотності виявлених впливів. Проте, експеримент слід припинити на будь-якому етапі, якщо тварина демонструє постійні ознаки сильного болю або страждань(9). Для визначення зворотності впливів необхідно спостерігати за твариною впродовж 21 дня після застосування досліджуваної речовини. Якщо зворотні ефекти спостерігається раніше, ніж через 21 день, слід припинити експеримент в цей момент.

1.4.2.7.1. Клінічні спостереження і класифікація реакцій ока

Очі необхідно оглянути через 1, 24, 48 і 72 години після застосування досліджуваної речовини. Тварин слід піддавати дослідженням не довше, ніж потрібно для отримання остаточної інформації. Тварини, що демонструють постійний сильний біль або страждання, підлягають невідкладному знищенню гуманним способом, а речовині дається відповідна оцінка. Тварини з наступними ураженнями ока після закапування підлягають знищенню гуманним способом: рогівкова перфорація або значна кількість рогівкових виразок включаючи стафілому; кров у передній камері ока; непрозорість рогівки 4 ступеню, що зберігається впродовж 48 годин; відсутність реакції зіниці на світло (реакція райдужки другого ступеню), що зберігається впродовж 72 годин; утворення виразок кон'юнктивальної мембрани; некроз кон'юнктиви або мигальної перетинки; або відторгнення некротичних мас. Такі ураження зазвичай є незворотними.

Тварини, у яких ураження ока не прогресують, можуть бути знищені не раніше, ніж через три дні після закапування. За тваринами з м'якими або помірними ураженнями потрібно спостерігати до того, як вони зникнуть, або впродовж 21 дня, тобто до закінчення дослідження. Спостереження необхідно проводити через 7, 14 та 21 день з метою визначення статусу уражень, а також їх зворотності або незворотності.

Ступінь реакцій ока (кон'юнктиви, роговиці і райдужної оболонки) потрібно фіксувати при кожному огляді (Таблиця 1). Про всі інші ураження ока (наприклад, паннус, забарвлювання) або шкідливі для здоров'я системні впливи також потрібно повідомляти.

Перевірка реакцій може бути полегшена використанням бінокулярної лупи, ручної щілинної лампи, біомікроскопу або іншого відповідного приладу. Після запису спостережень через 24 години можливе проведення подальшого огляду за допомогою флуоресцину.

Класифікація реакцій ока обов'язково є суб'єктивною. Для гармонізації процесу класифікації реакцій ока і з метою допомоги дослідним лабораторіям і тим, хто бере участь у здійсненні та інтерпретації спостережень, персонал, що проводить спостереження, має бути відповідно проінструктованим щодо використовуваної системи оцінювання.

2. ДАНІ

2.2. ОЦІНКА РЕЗУЛЬТАТІВ

Оцінку подразнення ока слід проводити в поєднанні з оцінкою природи та сили уражень, та їх зворотності чи їх відсутності. Індивідуальна оцінка не являє собою абсолютного стандарту щодо подразнюючих якостей матеріалу, тому інші впливи досліджуваного матеріалу також оцінюються. Навпаки, індивідуальну оцінку не слід розглядати як опорну величину; вона є суттєвою тільки тоді, коли підтверджується повним описом і оцінкою всіх спостережень.

3. ЗВІТНІСТЬ

3.1. ЗВІТ ПРО ПРОВЕДЕННЯ ТЕСТУ

Звіт про проведення тесту має містити наступну інформацію:

Обґрунтування для дослідження на живому організмі: аналіз вагомих доказів, отриманих з вже існуючих випробувань, включаючи результати, отримані за допомогою стратегії послідовних випробувань.

- опис відповідних даних попередніх тестувань,

- дані, отримані з кожного етапу стратегії тестування,

- опис здійснених тестувань в лабораторних умовах, включаючи деталі процедур, результати, отримані щодо досліджуваних/еталонних речовин,

- опис здійснених досліджень впливу подразнення/роз'їдання на шкіру живого організму, включаючи отримані результати,

- аналіз вагомих доказів для здійснення дослідження на живому організмі.

Досліджувана речовина:

- ідентифікаційні дані (наприклад, номер РСХ (Реферативної служби з хімії), джерело, ступінь очищення, відомі домішки, номер партії),

- фізична природа і фізико-хімічні властивості ( наприклад, pH, летючість, розчинність, стабільність, реактивність з водою),

- у випадку використання суміші, склад і процентний вміст компонентів,

- при використанні місцевої анестезії, ідентифікація, ступінь очищення, тип, доза та потенційна взаємодія з досліджуваною речовиною.

Розчинник:

- ідентифікація, концентрація (якщо потрібно), використаний об'єм,

- обґрунтування для вибору розчинника.

Піддослідні тварини:

- біологічні види/лінії тварин, що використовуються, обґрунтування для використання інших тварин, окрім кроликів-альбіносів,

- вік кожної тварини на початку дослідження,

- кількість тварин кожної статі в піддослідній і контрольній групах (якщо вимагається),

- вага кожної тварини на початку і наприкінці випробування,

- походження, умови утримання, дієта, і т.д.

Результати:

- опис методу, використаного для оцінювання ступеню подразнення в кожний період спостереження (наприклад, ручної щілинної лампи, біомікроскопу або іншого відповідного приладу),

- табличні дані реакції подразнення/роз'їдання для кожної тварини в кожний період спостереження до вилучення кожної тварини з процесу випробування,

- текстовий опис ступеню і природи подразнення або роз'їдання, що спостерігалося,

- опис всіх інших уражень ока (наприклад, васкуляризація, утворення паннуса, рубці, забарвлювання),

- опис місцевих і системних шкідливих для здоров'я впливів на інші органи, крім очей, та гістопатологічні показники, якщо вони є.

Обговорення результатів.

3.2. ІНТЕРПРЕТАЦІЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

Екстраполяція результатів досліджень подразнення ока у лабораторних тварин дійсна для людини тільки до певної міри. В багатьох випадках кролик-альбінос проявляє більшу чутливість до подразнюючих або роз'їдаючих око речовин, ніж людина.

Потрібна обережність в інтерпретації даних з метою виключення подразнення, спричиненого вторинною інфекцією.

4. ПОСИЛАННЯ

(1) Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T.J. B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, p. 410-429.

(2) de Silva, O., Cottin, M., Dami, N., Roguet, R., Catroux, P., Toufic, A., Sicard, C., Dossou, K.G., Gerner, I., Schlede, E., Spielmann, H., Gupta, K.C., Hill, R.N., (1997) Evaluation of Eye Irritation Potential: Statistical Analysis and Tier Testing Strategies. Food Chem. Toxicol 35, p. 159-164.

(3) Worth A.P. and Fentem J.H., (1999) A general approach for evaluating stepwise testing strategies ATLA 27, p. 161-177

(4) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H., (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. ToxicollogyIn Vitro, 2, p. 19-26.

(5) Neun, D.J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH.J.Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, p. 227-231.

(6) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology In Vitro 12, p. 483-524.

(6a) Testing Method B.40 Skin Corrosion.

(7) Testing method B.4. Acute toxicity: dermal irritation/corrosion.

(8) OECD, (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonisation of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22-24 January 1996 (http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm).

(9) OECD, (1998) Harmonised Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).

(10) OECD, (2000) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No 19 (http://www.oecd.org/ehs/test/monos.

Таблиця 1

КЛАСИФІКАЦІЇ УРАЖЕНЬ ОКА

Рогівка

Непрозорість: ступінь щільності (виміри слід

проводити в найщільнішій області)(*)

Немає утворення виразок або непрозорост ................... 0

Окремі або розсіяні області непрозорості (крім незначного

помутніння від звичайного відблиску); елементи райдужки чітко

видимі .................................................... 1

Легко визначається напівпрозора область; елементи райдужки

мають незначне затемнення ................................. 2

Перламутрова область; елементи райдужки невидимі;

розмір зіниці майже не визначається ....................... 3

Мутна рогівка, райдужка не визначається

через непрозорість ........................................ 4

Максимально можливо: 4

ПРИМІТКИ

(*) Необхідно відмітити область помутніння рогівки

Райдужка

Нормальна ................................................. 0

Помітно поглиблені зморшки, гіперемія, набухання, помірна

гіперемія навкруги рогівки або ін'єкції; райдужка реагує на

світло (в'яла реакція розглядається як вплив) ............. 1

Крововилив, макроскопічне руйнування або відсутність

реакції на світло ......................................... 2

Максимально можливо: 2

Кон'юнктива

Почервоніння (стосується пальпебральної кон'юнктиви та

кон'юнктиви очного яблука, за винятком рогівки та райдужки)

Нормальна ................................................. 0

Деякі кровоносні судини є гіперемічними (ін'єктованими) ... 1

Розпливчастий, малиновий колір; окремі судини неможливо

легко визначити ........................................... 2

Розпливчастий яскраво червоний ............................ 3

Максимально можливо: 3

Хемоз

Набухання (стосується повік та/або мигальних перетинок)

Нормальна ................................................. 0

Набухання дещо вище норми ................................. 1

Очевидне набухання з частковою еверсією повік ............. 2

Набухання з майже наполовину закритими повіками ........... 3

Набухання з повіками, закритими більш ніж наполовину ...... 4

Максимально можливо: 4

Додаток

Стратегія проведення послідовних досліджень подразнення та роз'їдання ока

ЗАГАЛЬНИЙ ОГЛЯД

В інтересах фундаментальної науки і захисту тварин важливо уникати зайвого використання тварин та мінімізувати випробування, що можуть викликати важкі реакції у тварин. Необхідно оцінити всю інформацію стосовно подразнення/роз'їдаючої активності речовини для ока перш ніж проводити дослідження in vivo. Вже отримано достатньо результатів для класифікації досліджуваної речовини з точки зору її потенціалу роз'їдання або подразнення ока, і немає потреби проводити випробування на лабораторних тваринах. Отже, застосування аналізу вагомих доказів та стратегії послідовних випробувань мінімізує потребу у проведенні випробувань in vivo, особливо якщо речовина може викликати важкі реакції.

Для оцінки існуючої інформації щодо подразнення та роз'їдання очей речовинами та з метою визначення необхідності проведення інших, не in vivo, досліджень на оці з метою визначення такого потенціалу рекомендується застосування аналізу вагомих доказів. Якщо виникне потреба в подальших дослідженнях, рекомендується застосування стратегії послідовних тестувань для подальшої розробки відповідних експериментальних даних. Для речовин, які не мають історії тестувань, необхідно використовувати стратегію послідовних досліджень для оцінки роз'їдання/подразнення очей. Стратегію тестувань, описану в цьому Додатку, було розроблено на семінарі ОЕСР (1). Вона була затверджена і доповнена в Гармонізованій інтегрованій системі класифікації загроз здоров'ю людини, спричинених хімічними речовинами, та їх впливом на навколишнє середовище, що було підтверджено на 28-му спільному засіданні Комітету Хіміків і Робочої Групи Хіміків у листопаді 1998 року (2).

Хоча ця стратегія досліджень не є складовою частиною методу тестування B.5, вона виражає рекомендований підхід до визначення властивостей подразнення/роз'їдання ока. Цей підхід являє собою як найкраще практичне втілення, так і етичний критерій для проведення випробувань подразнення/роз'їдання ока in vivo. Метод випробування надає інструкції щодо проведення випробування in vivo і підсумовує фактори, на які слід звернути увагу перед розглядом такого випробування. Стратегія послідовних випробувань забезпечує підхід з точки зору вагомих доказів до оцінки існуючих даних щодо властивостей подразнення/роз'їдання ока речовинами і поступовий підхід до генерації відповідних даних, для яких потрібні додаткові дослідження або щодо яких не проводилося досліджень. Стратегія включає в себе спочатку застосування затверджених і прийнятих випробувань in vitro або ex vivo, а потім метод випробування B.4, дослідження подразнення/роз'їдання шкіри за специфічних умов (3)(4).

ОПИС ПОЕТАПНОГО ПІДХОДУ ДО ДОСЛІДЖЕННЯ

Перш ніж проводити випробування як складову частину стратегії послідовних випробувань (малюнок), необхідно оцінити всю наявну інформацію з метою визначення необхідності в випробуванні на оці in vivo. Хоча важливу інформацію можна отримати з оцінки одиничних параметрів (наприклад, максимальний pH), необхідно оцінити сукупність наявної інформації. Всі релевантні дані щодо впливів досліджуваної речовини та її структурних аналогів необхідно оцінювати при прийнятті рішення про вагомість доказів, а також необхідно навести обґрунтування цього рішення. Особливий наголос необхідно зробити на існуванні даних про вплив речовини на людину і на тварину, результатом чого буде проведення дослідження in vitro або ex vivo. За можливості, слід уникати досліджень корозійних речовин in vivo. Фактори, що беруться до уваги в стратегії випробувань, включають:

Оцінку існуючих даних щодо людини і тварини (Крок 1). Існуючі дані щодо людини, наприклад, клінічні та професійні дослідження, а також судові звіти та/або дані про випробування на тваринах з досліджень ока слід розглядати в першу чергу, тому що вони надають інформацію, що стосується безпосередньо впливу на очі. Надалі необхідно оцінити дані, наявні з досліджень на людях та/або тваринах, що вивчають роз'їдання/подразнення шкіри. Речовини з відомим ступенем роз'їдаючої активності або сильним подразнюючим впливом на очі не слід ні вводити в очі тваринам, ні наносити речовини, що мають роз'їдаючий або подразнюючий вплив на шкіру, такі речовини слід вважати роз'їдаючими та/чи подразнюючими. Речовини, щодо яких вже отримано достатньо доказів відсутності роз'їдання та подразнення в ході попередніх досліджень на оці, не потрібно випробовувати за допомогою досліджень на оці in vivo.

Аналіз відносин структурної активності (ВСА) (Крок 2) Результати випробувань структурно пов'язаних хімікатів мають розглядатися за наявності. За наявності достатньої кількості даних щодо досліджень впливу структурно пов'язаних речовин або суміші таких речовин на людину та/або тварину, що показує їх потенціал роз'їдання/подразнення ока, можна припустити, що досліджувана речовина спровокує такі самі реакції. В таких випадках немає необхідності у випробуванні речовини. Негативні дані, отримані в ході досліджень структурно подібних речовин або суміші таких речовин, не є достатнім доказом відсутності роз'їдаючої/подразнюючої активності речовини згідно стратегії послідовних випробувань. Для визначення потенціалу впливу подразнення та роз'їдання як шкіри, так і очей, слід використовувати підходи, затверджені і прийняті ВСА.

Фізико-хімічні властивості та хімічна реактивність (Крок 3). Речовини, що виявляють екстремальний рівень pH, такий як <= 2,0 або >= 11,5, можуть мати сильний локальний вплив. Якщо екстремальний рівень pH є підґрунтям для ідентифікації речовини як роз'їдаючої або подразнюючої око, то її кислотний/лужний резерв (здатність до буферизації) також можна брати до уваги (5)(6). Якщо здатність до буферизації дозволяє зробити припущення, що речовина може не бути роз'їдаючою для ока, на підтвердження цього необхідно провести подальші дослідження; перевага надається використанню затверджених і прийнятих досліджень in vitro або ex vivo (див. Розділи Крок 5 та 6).

Розгляд іншої існуючої інформації (Крок 4). На цьому етапі необхідно оцінити всю наявну інформацію щодо системної токсичності через шкіру. Гостру шкірну токсичність досліджуваної речовини також необхідно брати до уваги. Якщо досліджувана речовина виявилася дуже токсичною для шкіри, її не потрібно випробовувати на оці. Хоча не обов'язково існує зв'язок між токсичністю для шкіри та подразненням/роз'їданням ока, можна припустити, що, якщо реагент є дуже токсичним для шкіри, він також виявлятиме високу токсичність при введенні в око. Ці дані також необхідно брати до уваги між Кроками 2 та 3.

Результати випробувань in vitro або ex vivo (Кроки 5 та 6). Речовини, які виявили роз'їдаючі або сильні подразнюючі властивості під час випробувань in vitro або ex vivo (7)(8), та були затверджені і прийняті для оцінки саме роз'їдаючої активності/подразнення для очей або шкіри, не слід випробувати на тваринах. Можна припустити, що досліджувана речовина матиме подібні сильні впливи in vivo. За відсутності затверджених і прийнятих до оцінки досліджень in vitro/ex vivo, слід пропустити Кроки 5 та 6, і переходити одразу до Кроку 7.

Оцінка потенціалу речовини викликати подразнення або роз'їдання (Крок 7). Якщо існує недостатньо доказів, що базуються на вищезазначених дослідженнях, для здійснення підсумкового аналізу вагомих доказів потенційного подразнюючого/роз'їдаючого впливу речовини на очі, спочатку слід оцінити потенціал подразнення/роз'їдання шкіри in vivo, використовуючи метод випробування B.4 (4) і супроводжуючий Додаток (9). Якщо виявилося, що речовина спричиняє роз'їдання або сильне подразнення шкіри, її слід вважати роз'їдаючою і подразнюючою око, якщо інша інформація не підтверджує альтернативного висновку. Таким чином, може не бути потреби в проведенні досліджень на оці in vivo. Якщо речовина не є роз'їдаючою або сильно подразнюючою для шкіри, необхідно здійснити дослідження на оці in vivo.

Випробування in vivo на кроликах (Кроки 8 та 9): Дослідження на оці in vivo слід починати з використанням однієї тварини. Якщо результати випробування показують, що речовина є роз'їдаючою або викликає сильне подразнення ока, подальші дослідження подразнюваності ока необхідно припинити. Якщо це випробування не виявило роз'їдаючого або сильного подразнюючого ефекту, проводиться підтверджувальне випробування з використанням двох додаткових тварин.

ПОСИЛАННЯ

(1) OECD, (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonisation of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22-24 January 1996 (http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm).

(2) OECD, (1998) Harmonised Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).

(3) Worth, A.P. and Fentem J.H., (1999). A General Approach for Evaluating Stepwise Testing Strategies. ATLA 27, p. 161-177.

(4) Testing method B.4. Acute Toxicity: dermal irritation/corrosion.

(5) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H., (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicolohy In Vitro, 27, p. 19-26.

(6) Neun, D.J., (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, p. 227-231.

(7) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M., (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology In Vitro 12, p. 483-524.

(8) Testing Method B.40 Skin Corrosion.

(9) Appendix to Testing method B.4: A Sequential Testing Strategy for Skin Irritation and Corrosion.

Малюнок

ДОСЛІДЖЕННЯ І СТРАТЕГІЯ ОЦІНЮВАННЯ ПОДРАЗНЕННЯ/РОЗ'ЇДАННЯ ОКА

Вид діяльності          Отриманий                  Висновок

---------------------
 1  |Існуючі дані про   |  Серйозні ушкодження       Максимальне граничне значення;
    |впливи на очі      |  очей                      вважати роз'їдаючою для очей.
    |людини та/або      |                            Дослідження непотрібні.
    |тварини            |
    |                   |  Подразнююча для ока       Максимальне граничне значення;
    |                   |                            вважати подразнюючою для очей.
    |                   |                            Дослідження непотрібні.
    |                   |
    |                   |  Не роз'їдає/не            Максимальне граничне значення;
    |                   |  подразнює око             вважати не роз'їдаючою/не
    |                   |                            подразнюючою для очей.
    |                   |                            Дослідження не вимагаються.
    |                   |
    |Існуючі дані про   |  Роз'їдає шкіру            Припускаємо роз'їдаючу
    |роз'їдаючі впливи  |                            активність щодо очей.
    |на шкіру людини    |                            Дослідження непотрібні.
    |та/або тварини     |
    |                   |
    |Існуючі дані про   |  Сильно подразнює          Припускаємо подразнюючу
    |сильні подразнюючі |  шкіру                     активність щодо очей.
    |впливи на шкіру    |                            Дослідження непотрібні.
    |людини та/або      |
    |тварини            |
    ---------------------
              |
              \/
     немає доступної інформації, або
     доступна інформація непереконлива

|
              |
              \/
    ---------------------
 2  |Продемонструвати   |  Передбачаються            Припускаємо роз'їдаючу
    |ВСА для            |  серйозні ушкодження       активність щодо очей.
    |роз'їдання/        |  очей                      Дослідження непотрібні.
    |подразнення очей   |
    |                   |
    |                   |  Передбачаються            Припускаємо подразнюючу
    |                   |  подразнення очей.         активність щодо очей.
    |                   |                            Дослідження непотрібні.
    |                   |
    |                   |
    |Продемонструвати   |  Передбачається            Припускаємо роз'їдаючу
    |ВСА для роз'їдання |  роз'їдання шкіри          активність щодо очей.
    |шкіри              |                            Дослідження непотрібні.
    ---------------------
              \/

Неможливо зробити припущення, або

припущення не є переконливими чи

є негативними

|
              \/
    ---------------------
 3  |Виміряти pH        |  pH <= 2 або >= 11,5       Припускаємо роз'їдаючу
    |(здатність до      |  (з високою здатністю      активність щодо очей.
    |буферизації, за    |  до буферизації,           Дослідження непотрібні.
    |необхідності)      |  якщо потрібно)
    ---------------------
              |
              \/

2 < pH < 11,5, або pH <= 2,0 або >= 11,5

з відсутньою/низькою здатністю до

буферизації, за необхідності

|
              |
              \/
    ---------------------
 4  |Оцінити системну   |  Дуже токсична в           Речовина була б дуже
    |токсичність через  |  концентраціях, що         токсичною для досліджень
    |вплив на шкіру     |  використовувалися б       на очах.
    ---------------------  для досліджень на оці     Дослідження непотрібні.
              |
              \/

Така інформація недоступна,

або речовина не дуже токсичною

|
              \/
    ---------------------
 5  |Виконати           |  Реакція роз'їдання        Припускаємо роз'їдаючу
    |затверджене і      |                            активність щодо очей.
    |прийняте           |                            Дослідження непотрібні.
    |дослідження        |
    |роз'їдання очей in |
    |vitro або ex vivo. |
    ---------------------
              |
              \/

Речовина не роз'їдаюча, або

затверджені методи досліджень

роз'їдання очей in vitro або

ex vivo не є доступними.

|
              |
              \/
    ---------------------
 6  |Виконати           |  Реакція подразнення       Припускаємо подразнюючу
    |затверджене і      |                            активність щодо очей.
    |прийняте           |                            Подальші дослідження
    |дослідження        |                            непотрібні
    |подразнення очей   |
    |in vitro або       |
    |ex vivo.           |
    ---------------------
              |
              \/

Речовина не подразнююча,

або затверджені методи досліджень

роз'їдання очей in vitro або ex vivo

не є доступними

|
              \/
    ---------------------
 7  |Експериментально   |  Реакція роз'їдання        Припускаємо роз'їдаючу
    |оцінити потенціал  |  або сильного              активність щодо очей.
    |подразнення/       |  подразнення               Подальші дослідження
    |роз'їдання шкіри   |                            непотрібні.
    |in vivo (див. метод|
    |дослідження В.4,   |
    |включаючи Додаток) |
    ---------------------
              |
              \/

Речовина не є роз'їдаючою

або не викликає сильних

подразнень шкіри

|
              \/
    ---------------------
 8  |Виконати початкове |  Сильні ушкодження         Вважаємо роз'їдаючою
    |дослідження на оці |  очей                      для очей. Подальші
    |кролика in vivo з  |                            дослідження непотрібні.
    |використанням      |
    |однієї тварини     |
    ---------------------
              |
              \/

Немає значних ушкоджень

або відсутня реакція

|
              |
              \/
    ---------------------
 9  |Виконати           |  Роз'їдаюча або            Вважаємо роз'їдаючою
    |підтверджувальне   |  подразнююча.              або подразнюючою для очей.
    |дослідження з      |                            Подальші дослідження
    |використанням      |                            непотрібні.
    |однієї або двох    |
    |додаткових тварин  |  Не роз'їдаюча або         Вважаємо не роз'їдаючою або
    ---------------------  не подразнююча.           не подразнюючою для очей.
                                                     Подальші дослідження

непотрібні.

B.6. СЕНСИБІЛІЗАЦІЯ ШКІРИ

1. МЕТОД

1.1. ВСТУП

Зауваження

Чутливість і можливість проведення досліджень для визначення можливих сенсибілізаторів людської шкіри вважаються важливими в системі класифікації токсичності по відношенню до здоров'я людини.

Немає єдиного методу дослідження, який би адекватно визначав всі речовини з потенціалом сенсибілізації людської шкіри і підходив би для всіх речовин.

Такі фактори, як фізичні властивості речовини, включаючи її здатність проникати крізь шкіру, слід враховувати при виборі дослідження. Було розроблено два види досліджень з використанням морських свинок: випробування на тип ад'юванту, під час якого алергічний стан підсилюється розчиненням чи заміною досліджуваної речовини на повний ад'ювант Фрейнда (ПАФ), та неад'ювантні випробування.

Випробування на тип ад'юванту можуть бути більш точними в передбаченні можливого сенсибілізаційного ефекту на шкіру людини, спричиненого речовиною, ніж методи без використання повного ад'юванту Фрейнда, та їм, таким чином, надається перевага.

Тест на максимізацію морських свинок (ТММС) є широко використовуваним випробуванням на тип ад'юванту. Хоча для визначення потенціалу речовини викликати реакцію сенсибілізації шкіри використовується декілька інших методів, ТММС вважається кращою ад'ювантною технікою.

За наявності багатьох класів хімічних речовин неад'ювантні випробування (одним з кращих вважається тест Бюхлера) вважаються менш чутливими.

В певних випадках можуть бути підстави для вибору тесту Бюхлера з для місцевого застосування, а не інтрадермальна ін'єкція, що використовується для тесту на максимізацію морських свинок. Для використання тесту Бюхлера потрібно надавати наукове обґрунтування.

Тест на максимізацію морських свинок (ТММС) та тест Бюхлера описані в цьому методі. Можливе використання інших методів за умови, якщо вони є затвердженими і науково обґрунтованими.

Якщо в ході офіційно визнаного скринінг-тесту отримано позитивний результат, досліджувана речовина може бути позначена як потенційний сенсибілізатор, і проведення подальших випробувань на морських свинках не буде необхідним. Проте, якщо результати випробування негативні, випробування на морських свинках необхідно проводити, використовуючи процедуру, описану в цьому методі досліджень.

Дивіться також Загальний вступ, Частину B.

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ

Сенсибілізація шкіри: (алергічний контактний дерматит) імунологічно опосередкована реакція шкіри на речовину. У людини реакції можуть бути виражені наступним чином: свербінням, еритемою, набряком, папулами, пухирцями, здуттями або поєднанням цих проявів. У інших біологічних видів реакції можуть відрізнятися, і може проявитися тільки еритема та набряк.

Піддавання впливу індукції: експериментальне піддавання об'єкта впливу досліджуваної речовини з наміром спровокувати надчутливий стан.

Період індукції: період тривалістю принаймні один тиждень після піддавання впливу індукції, впродовж якого може розвиватися надчутливий стан.

Піддавання впливу провокаційної проби: експериментальне піддавання попередньо розглянутого об'єкту впливу досліджуваної речовини після періоду індукції з метою визначення того, чи виникає в об'єкта реакція гіперчутливості.

1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ

Чутливість і надійність використаної експериментальної техніки слід оцінювати кожні шість місяців шляхом використання речовин, відомих своїми м'якими або помірними властивостями сенсибілізації шкіри.

Якщо тест проведено правильно, для м'яких/помірних сенсибілізаторів очікується реакція принаймні 30% при ад'ювантному дослідженні і принаймні 15% при неад'ювантному дослідженні.

Перевага надається наступним речовинам.

--------------------------------------------------------------------------------
|Номери РСХ|Номери ЄРІКХР|      Назви ЄРІКХР        |  Загальноприйняті назви  |
|----------+-------------+--------------------------+--------------------------|
| 101-86-0 |  202-983-3  |альфа-гексилсиннамальдегід|альфа-гексилсиннамальдегід|
|----------+-------------+--------------------------+--------------------------|
| 149-30-4 |  205-736-8  |    Бензотіазол-2-тіол    |          каптакс         |
|          |             |   (меркатобензотіазол)   |                          |
|----------+-------------+--------------------------+--------------------------|
|  94-09-7 |  202-303-5  |        Бензокаїн         |          норкаїн         |
--------------------------------------------------------------------------------

Є обставини, за яких, при умові відповідного обґрунтування, можуть використовуватись інші контрольні речовини, що відповідають вищенаведеним критеріям.

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕНЬ

Піддослідні тварини спочатку піддаються впливу досліджуваної речовини шляхом інтрадермальної ін'єкції та/або епідермального застосування (піддавання впливу індукції). Після періоду відпочинку від 10 до 14 днів (періоду індукції), під час якого може проявитися імунна реакція, тварині вводиться доза провокаційної проби. Міра і ступінь реакції шкіри на піддавання впливу провокаційної проби у піддослідних тварин порівнюється з реакціями, що виявилися у контрольної групи тварин, що піддавалися симулятивному лікуванню під час індукції і отримали провокаційну пробу.

1.5. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕНЬ

Якщо вважається необхідним усунення досліджуваної речовини, це необхідно зробити, використовуючи воду чи відповідний розчинник без видозмін існуючої реакції або цілісності епідермісу.

1.5.1. Тест на максимізацію морських свинок (ТММС)

1.5.1.1. Підготовка

Здорових молодих дорослих альбіносів морських свинок адаптують до лабораторних умов протягом щонайменше п'яти днів перед тестом проведенням тесту. Перед тестом тварин відбирають методом рандомізації і призначають в певну групу. Хутро видаляють шляхом підстригання, гоління або хімічної епіляції, в залежності від використаного методу дослідження. Необхідно подбати про те, щоб уникнути потертості шкіри. Тварин зважують до початку тесту та після його завершення.

1.5.1.2. Умови проведення тесту

1.5.1.2.1. Піддослідні тварини:

Зазвичай використовуються лабораторні види альбіносів морських свинок.

1.5.1.2.2. Кількість і стать

Можливе використання тварин чоловічої та/або жіночої статі. Якщо використовуються тварини жіночої статі, вони мають бути не вагітними і такими, що ніколи не народжували.

Використовується мінімум 10 тварин у піддослідній групі і щонайменше п'ять тварин в контрольній групі. Якщо для проведення тесту було використано менш ніж 20 морських свинок у піддослідній групі і менш ніж 10 - у контрольній, і висновок про те, що досліджувана речовина є сенсибілізатором, зробити неможливо, наполегливо рекомендується проведення тестування на додаткових тваринах в кількості щонайменше 20 тварин у піддослідній групі і 10 - у контрольній.

1.5.1.2.3. Рівні дозування

Концентрація досліджуваної речовини, використаної для кожного піддавання впливу індукції, має систематично добре переноситися і має бути найвищою для спричинення м'якого або помірного подразнення шкіри. Концентрація, використана для піддавання впливу провокаційної проби, має складати найвищу дозу, яка не викликає подразнення. У випадку відсутності іншої інформації відповідні концентрації слід визначати за допомогою пілотного дослідження з використанням двох або трьох тварин. З цією метою слід вирішити питання про використання тварин, які піддавалися впливу ПАФ.

1.5.1.3. Процедура

1.5.1.3.1. Індукція

0-й день - піддослідна група

Робиться три пари інтрадермальних ін'єкцій об'ємом 0,1 мл в плечову зону, очищену від хутра таким чином, що кожна пара розташована по кожній стороні середньої лінії.

Ін'єкція 1: суміш 1:1 (в об'ємному співвідношенні) ПАФ/вода або фізіологічний розчин.

Ін'єкція 2: Досліджувана речовина з відповідним розчинником у вибраній концентрації.

Ін'єкція 3: Досліджувана речовина у вибраній концентрації, складеній в пропорції 1:1 (в об'ємному співвідношенні) ПАФ/вода або фізіологічний розчин.

Для ін'єкції 3 розчинні в воді речовини розчиняються у водній фазі перед змішуванням з ПАФ. Жиророзчинні або нерозчинні речовини усуваються з ПАФ перед поєднанням з водною фазою. Остаточна концентрація досліджуваної речовини повинна дорівнювати концентрації, що була використана для ін'єкції 2.

Ін'єкції 1 та 2 робляться поряд одна з одною і якомога ближче до голови, в той час, як третя робиться біля хвостової частини зони тестування.

0-й день - контрольна група

Робиться три пари інтрадермальних ін'єкцій об'ємом 0,1 мл в ту ж саму зону, що й у тварин піддослідної групи.

Ін'єкція 1: суміш 1:1 (в об'ємному співвідношенні) ПАФ/вода або фізіологічний розчин.

Ін'єкція 2: нерозбавлений розчинник.

Ін'єкція 3: 50% розчинника по відношенню ваги до об'єму в суміші 1:1 (в об'ємному співвідношенні) ПАФ/вода або фізіологічний розчин.

Дні 5-7 - піддослідна та контрольна групи

Приблизно за 24 години до місцевого застосування індукції, якщо речовина не подразнює шкіру, зона випробувань, після підстригання коротко та/або гоління хутра обробляється 0,5 мл розчиненого у вазеліні 10%-го лаурилсульфату соди для створення місцевої реакції подразнення.

6-й - 8-й день - піддослідна група

У зоні тестування знову видаляється хутро. Фільтрувальний папір (2 х 4 см) повністю заповнюється досліджуваною речовиною з відповідним розчинником і застосовується до зони дослідження, і далі утримується в контакті за допомогою оклюзійної пов'язки протягом 48 годин. Вибір розчинника має бути обґрунтованим. Тверді речовини подрібнюються в порошок і поміщаються у відповідний розчинник. Рідини можуть застосовуватись нерозбавленими, якщо це є доцільним.

6-й - 8-й день - контрольна група

У зоні тестування знову видаляється хутро. Розчинник застосовується подібним чином до зони дослідження, і далі утримується в контакті за допомогою оклюзійної пов'язки протягом 48 годин.

1.5.1.3.2. Провокаційна проба

Дні 20-22 - піддослідна та контрольна групи

З боків тварин з піддослідної та контрольної групи видаляється хутро. Латка або камера, наповнена досліджуваною речовиною, прикладається до одного боку тварини і, якщо потрібно, латка або камера, наповнена тільки розчинником, також може прикладатися до іншого боку. Латки утримуються в контакті за допомогою оклюзійної пов'язки протягом 24 годин.

1.5.1.3.3. Спостереження і класифікація: піддослідна та контрольна групи

- приблизно через 21 годину після усунення латки, зона провокаційної проби очищується і коротко обстригається та/або голиться, та за необхідності проводиться її епіляція;

- приблизно через три години після цього (приблизно через 48 годин від початку проведення провокаційної проби) спостерігається реакція шкіри, яка фіксується згідно з класифікацією, наведеною у Додатку;

- приблизно через 24 години після цього спостереження проводиться наступне спостереження (72 години), яке знову фіксується.

Схвалюється застосування методу сліпого зчитування даних про тварин з піддослідної та контрольної групи.

Якщо необхідно прояснити результати, отримані після проведення першої провокаційної проби, можливий варіант проведення другої провокаційної проби (так званої повторної проби), за необхідності, з використанням нової контрольної групи, приблизно через тиждень після проведення першої проби. Повторна проба також може проводитися на первісній контрольній групі.

Всі реакції шкіри і будь-які незвичні відчуття, включаючи системні реакції, що є результатом індукції і процедури проведення провокаційної проби необхідно спостерігати і фіксувати згідно класифікаційної шкали Магнуссона/Клігмана (див. Додаток). Для прояснення сумнівних реакцій можуть проводитися інші процедури, наприклад, гістопатологічне дослідження, вимірювання товщини шкірної складки.

1.5.2. Тест Бюхлера

1.5.2.1. Підготовка

Здорових молодих дорослих альбіносів морських свинок адаптують до лабораторних умов протягом щонайменше п'яти днів перед проведенням тесту. Перед проведенням тесту тварин відбирають методом рандомізації і призначають в певну групу. Хутро видаляють шляхом підстригання, гоління або хімічної епіляції, в залежності від використаного методу дослідження. Необхідно подбати про те, щоб уникнути потертості шкіри. Тварин зважують до початку тесту та після його завершення.

1.5.2.2. Умови проведення тесту

1.5.2.2.1. Піддослідні тварини:

Зазвичай використовуються лабораторні види альбіносів морських свинок.

1.5.2.2.2. Кількість і стать

Використовується мінімум 20 тварин в піддослідній групі і щонайменше 10 тварин в контрольній групі.

1.5.2.2.3. Рівні дозування

Концентрація досліджуваної речовини, використаної для кожного піддавання впливу індукції, має бути найвищою з можливих для того, щоб викликати м'яке але не надмірне подразнення. Концентрація, використана для піддавання впливу провокаційної проби, має складати найвищу не подразнюючу дозу. За необхідності відповідну концентрацію можна визначати за допомогою пілотного дослідження з використанням двох або трьох тварин.

Для розчинних в воді досліджуваних матеріалів слід використовувати воду або розбавлений не подразнюючий розчин ПАР в якості розчинника. Для інших досліджуваних матеріалів надається перевага використанню 80% етанолу/води для індукції і ацетону для провокаційної проби.

1.5.2.3. Процедура

1.5.2.3.1. Індукція

0-й день - піддослідна група

Один бік очищується від хутра (коротко обстригається). Система латок для випробування має бути повністю наповнена досліджуваною речовиною із відповідним розчинником (вибір розчинника має бути виправданим; рідкі досліджувані речовини можуть використовуватися нерозбавленими, якщо це є доцільним).

Система латок для випробування прикріплюється до зони дослідження, і далі утримується в контакті за допомогою оклюзійної латки або камери та відповідної пов'язки протягом шести годин.

Система латок для випробування повинна бути оклюзійною. Підходить бавовняна підкладка, яка може бути круглою або квадратною, розміром приблизно 4-6 кв.см. Перевага надається пристосуванню для стримування з використанням відповідного фіксатора з метою забезпечення оклюзії. Якщо використовується обгортання, є можливість виникнення потреби в додатковому впливі.

0-й день - контрольна група

Один бік очищується від хутра (коротко обстригається). Тільки розчинник застосовується в подібний до використаного для піддослідної групи спосіб. Система латок для випробування прикріплюється до шкіри за допомогою оклюзійної латки або камери та відповідної пов'язки на шість годин. Якщо є можливість виявлення відсутності потреби в симулятивній контрольній групі, можна використати незаражену контрольну групу.

Дні 6-8 та 13-15 - піддослідна та контрольна групи

Те ж саме застосування, як і в 0-й день, проводиться в тій же зоні дослідження (очищеній від хутра, якщо необхідно) того ж плеча на 6-8-й день та знову на 13-15-й день.

1.5.2.3.2 Провокаційна проба

Дні 27-29 - піддослідна та контрольна групи

Не використовувані раніше боки тварин з піддослідної та контрольної групи очищуються від хутра (коротко обстригаються). Оклюзійна латка або камера, що містить відповідну кількість досліджуваної речовини у максимальній не подразнюючій концентрації, прикладається до задніх частин не використовуваних раніше боків тварин з піддослідної та контрольної групи.

При потребі оклюзійна латка або камера тільки з розчинником прикладається до передніх частин не використовуваних раніше боків тварин з піддослідної та контрольної групи. Латки або камери утримуються в контакті за допомогою відповідної пов'язки протягом шести годин.

1.5.2.3.3. Спостереження і класифікація

- приблизно через 21 годину після усунення латки зона провокаційної проби очищується від хутра,

- приблизно через три години після цього (приблизно через 30 годин від прикладення латки для проведення провокаційної проби) спостерігається реакція шкіри, яка фіксується згідно з класифікацією, наведеною у Додатку,

- приблизно через 24 години після 30-годинного спостереження (приблизно через 54 години від прикладення латки для проведення провокаційної проби) знов спостерігається і фіксується реакція шкіри.

Заохочується сліпе зчитування даних про тварин з піддослідної та контрольної групи.

Якщо необхідно з'ясувати результати, отримані після проведення першої провокаційної проби, можливий варіант проведення другої провокаційної проби (так званої повторної проби), за необхідності, з використанням нової контрольної групи, приблизно через тиждень після першої. Повторна проба також може проводитися на первісній контрольній групі.

Всі реакції шкіри і будь-які незвичні відчуття, включаючи системні реакції, що є результатом індукції і процедури проведення провокаційної проби, потрібно спостерігати і фіксувати згідно класифікаційної шкали Магнуссона/Клігмана (див. Додаток). Для з'ясування сумнівних реакцій можуть проводитися інші процедури, наприклад, гістопатологічне дослідження, вимірювання товщини шкірної складки.

2. ДАНІ (ТММС та тест Бюхлера)

Дані повинні бути підсумовані у формі таблиці, де зазначені шкірні реакції кожної тварини при кожному спостереженні.

3. ЗВІТНІСТЬ (ТММС та тест Бюхлера)

Якщо скринінг-аналіз виконано перед проведенням дослідження на морських свинках, необхідно надати опис або посилання на дослідження (наприклад, Тест на набухання вух мишей (ТНВМ)), включаючи докладну інформацію про процедури, разом з отриманими результатами щодо досліджуваних і еталонних речовин.

Звіт щодо проведеного дослідження (тммс та тест Бюхлера)

За можливості, звіт щодо проведеного дослідження має містити наступну інформацію:

Піддослідні тварини:

- використана лінія морських свинок

- кількість, вік і стать тварин

- походження, умови утримання, дієта, і т.д.

- вага кожної тварини на початку дослідження.

Умови проведення дослідження:

- техніка підготовки місця для прикладення латки,

- докладна інформація щодо використаних матеріалів для латок і техніки прикріплення латок,

- результат пілотного дослідження з висновком про концентрацію речовин для індукції та провокаційної проби, що мають використовуватись для дослідження,

- докладна інформація щодо приготування, прикладення і усунення досліджуваної речовини,

- обґрунтування вибору розчинника.

- концентрація розчинника і досліджуваної речовини для індукції та піддавання впливу провокаційної проби і загальна кількість речовини, застосованої для індукції та провокаційної проби.

Результати:

- зведена інформація про результати останньої перевірки на чутливість і надійність (див. пункт 1.3), включаючи інформацію щодо речовини, її концентрації та використаного розчинника,

- на кожну тварину, включаючи класифікацію,

- нарративний опис ступеню і природи реакцій, які спостерігалися,

- будь-які гістопатологічні показники.

Обговорення результатів.

Висновки.

4. ПОСИЛАННЯ

Цей метод аналогічний методу, описаному у ТІ ОЕСР 406.

Додаток ТАБЛИЦЯ

Класифікаційна шкала Магнуссона/Клігмана для оцінки реакцій при проведенні дослідження з використанням латок для провокаційної проби

0 = немає видимих змін

1 = дискретна або фрагментарна еритема

2 = помірна еритема та конфлюентна еритема

3 = гостра еритема та пухлина

B.7. ТОКСИЧНІСТЬ ПОВТОРНОЇ ДОЗИ (ЯКА ВВОДИТЬСЯ ПЕРОРАЛЬНО ВПРОДОВЖ 28 ДНІВ)

1. МЕТОД

1.1. ВСТУП

Дивіться Загальний вступ, Частину B.

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ

Дивіться Загальний вступ, Частину B.

1.3. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

Досліджувана речовина вводиться щоденно пероральним шляхом градуйованими дозами кільком групам піддослідних тварин, один рівень доз для однієї групи протягом 28 днів. Протягом періоду застосування за тваринами ведеться ретельне щоденне спостереження з метою виявлення ознак токсичності. Проводиться розтин тварин, які помирають або знищуються під час дослідження, а по завершенні дослідження проводиться знищення тварин, що вижили, і подальший їх розтин.

Цей метод робить більший наголос на виявленні неврологічного впливу, як кінцевої мети дослідження, і на потребі ретельних клінічних спостережень за тваринами з метою отримання якомога більшої кількості інформації. Метод має визначити хімічні препарати з нейротоксичним потенціалом, що надасть підстави для подальших поглиблених досліджень в цьому напрямку. Окрім того, цей метод може виявити симптоми імунологічних впливів та токсичності щодо репродуктивних органів.

1.4. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

1.4.1. Підготовка

Здорових молодих дорослих тварин із застосуванням випадкового відбору призначають в піддослідну групу. Клітки мають розташовуватись таким чином, щоб мінімізувати можливі впливи їх місця розташування. Тварини ідентифікуються окремо і поміщаються в клітках щонайменше на 5 днів до початку проведення дослідження з метою їх пристосування до лабораторних умов.

Досліджувана речовина вводиться через зонд, з їжею або питною водою. Метод перорального введення залежить від мети дослідження та фізичних/хімічних властивостей речовини.

За необхідності, досліджувана речовина розчиняється у відповідному розчиннику або усувається з його використанням. Рекомендується там, де можливо, використовувати спочатку водний розчин/суспензію, потім розглянути варіант використання розчину/емульсії олії (наприклад, кукурудзяної олії), далі - можливість розчинення в інших розчинниках. При використанні будь-якого розчинника, окрім води, слід враховувати токсичні характеристики розчинника. Необхідно визначити стабільність досліджуваної речовини в розчиннику.

1.4.2. Умови проведення дослідження:

1.4.2.1. Піддослідні тварини:

Перевага при виборі з біологічних видів гризунів надається щуру, хоча можливе використання інших біологічних видів гризунів. Слід залучити випробувань до дослідження лабораторні лінії здорових молодих дорослих тварин, що зазвичай використовуються. Тварини жіночої статі мають бути не вагітними і такими, що ніколи не народжували. Дози слід починати давати як можна раніше після закінчення вигодовування материнським молоком і, в будь-якому випадку, до того, як тварині виповниться 9 тижнів.

На початку дослідження коливання ваги тварин має бути мінімальним і не перевищувати +- 20% від середньої ваги для кожної статі.

Коли дослідження щодо перорального введення повторюваної дози проводиться як підготовче до тривалого дослідження, перевага надається використанню тварин з однієї лінії і одного походження для обох досліджень.

1.4.2.2. Кількість і стать

Щонайменше 10 тварин (п'ять самців і п'ять самок) потрібно використовувати для кожного рівня доз. Якщо заплановане проміжне знищення тварин, їх кількість слід збільшити на кількість тварин, яких планується знищити до завершення дослідження.

Окрім того, супутній групі з 10 тварин (по 5 тварин кожної статі) може вводитися найвища доза протягом 28 днів, а також проводяться спостереження щодо зворотності, витривалості або відстроченої ймовірності токсичного впливу впродовж 14 днів після введення речовини. Також використовується супутня група з 10 контрольних тварин (по 5 тварин кожної статі).

1.4.2.3. Рівень дозування

Зазвичай слід використовувати три піддослідних і одну контрольну групу. За винятком введення досліджуваної речовини, за тваринами в контрольній групі доглядають так само, як і за тваринами піддослідної групи. Якщо при введенні досліджуваної речовини використовується розчинник, контрольна група має отримувати розчинник в максимальному об'ємі, що використовувався.

Якщо згідно з оцінками або іншими даними не очікується ефекту від дози в 1000 мг/кг маси тіла/на день, можливе проведення дослідження на граничний вміст. Якщо немає наявних відповідних даних, можливе проведення дальнометричного дослідження з метою визначення використовуваних доз.

Рівні дозування слід добирати, враховуючи будь які існуючі наявні дані про токсичність та (токсико-) кінетичні дані щодо досліджуваної речовини або пов'язаних з нею матеріалів. Найвищу дозу слід обирати з метою стимуляції токсичних впливів, але не смерті або сильних страждань. Надалі потрібно обрати низхідну послідовність рівнів дозування з метою виявлення будь-якої реакції, пов'язаної з дозуванням, та шкідливі для здоров'я впливи, що не спостерігалися, при застосуванні найнижчого рівня дозування. Часто оптимальним є використання від 2 до 4 інтервалів для встановлення низхідних рівнів дозування, і часто надається перевага додаванню четвертої піддослідної групи перед використанням дуже великих інтервалів (наприклад, більше, ніж фактор 10) між введенням доз.

Для речовин, які вводяться з їжею або питною водою, важливо забезпечити, щоб введена кількість досліджуваної речовини не впливала на звичайний процес харчування або водний баланс. Коли досліджувана речовина вводиться з їжею, можливе використання або постійної концентрації їжі (в мільйонних долях), або постійного рівня дозування відповідно до ваги тварини, при використанні альтернативних варіантів їх потрібно вказати. Коли досліджувана речовина вводиться з їжею, дозу слід вводити в один і той самий час кожного дня, і, якщо потрібно, вивірити умови для підтримання постійного рівня дозування відповідно до ваги тварини.

Коли дослідження щодо введення повторюваної дози проводиться як підготовче до тривалого дослідження, для обох досліджень слід використовувати однакове харчування.

1.4.2.4. Випробування на граничний вміст

Якщо випробування на одному рівні дозування, який становить щонайменше 1000 мг/кг маси тіла/на день або, для введення з їжею або питною водою, еквівалентне співвідношення з їжею або питною водою (що засновується на визначеннях маси тіла) при використанні процедур, визначених для цього дослідження, не спричиняє токсичних впливів, і якщо токсичність не передбачається з огляду на дані щодо структурно подібних речовин, то можливо, не виникне необхідності в проведенні розширеного дослідження з використанням трьох рівнів дозування. Випробування на граничний вміст застосовується у всіх випадках, крім тих, де вплив на людину визначає потребу в використанні вищого рівня дозування.

1.4.2.5. Період спостереження

Період спостереження має тривати 28 днів. Тваринам у супутній групі, призначеним для подальшого спостереження, не слід нічого вводити щонайменше протягом 14 днів для визначення відстроченого впливу, витривалості чи відновлення після токсичних впливів.

1.4.3. Процедура

Досліджувана речовина вводиться тваринам щоденно протягом 28 днів, введення речовини в режимі 5 днів на тиждень має бути виправданим. Коли досліджувана речовина вводиться з їжею, її потрібно вводити тварині однією дозою, використовуючи зонд для штучного харчування або відповідну інтубаційну трубку. Максимальний об'єм рідини, що вводиться за один раз, залежить від розміру піддослідної тварини. Об'єм не має перевищувати 1 мл/100 г маси тіла, за винятком використання водних розчинів, де можливо використовувати 2 мл/100 г маси тіла. За винятком подразнюючих чи роз'їдаючих речовин, які зазвичай виявляють ускладнені впливи при більшій концентрації, коливання досліджуваного об'єму потрібно мінімізувати шляхом пристосування концентрації до забезпечення постійного об'єму на всіх рівнях дозування.

1.4.3.1. Загальні спостереження

Загальні клінічні спостереження слід здійснювати щонайменше один раз на день, краще в той самий час щоденно, беручи до уваги піковий період передбаченого впливу після введення дози. Стан здоров'я тварин потрібно фіксувати. Щонайменше два рази на день проводяться спостереження з метою виявлення захворюваності і смертності тварин. Помираючі тварини та тварини що постійно страждають, мають бути вилучені, як тільки цей факт помітять, знищені гуманним способом і піддані розтину.

Один раз перед першим введенням (з метою проведення порівнянь в межах об'єкта) і щонайменше раз на тиждень після нього, необхідно проводити розгорнуті клінічні спостереження за всіма тваринами. Ці спостереження потрібно здійснювати поза кліткою, де утримується тварина на стандартному місці, бажано в один і той самий час. Вони повинні детально фіксуватися, бажано з використанням систем оцінювання, які легко можуть зрозуміти в дослідній лабораторії. Потрібно прослідкувати за тим, щоб коливання умов випробування були мінімальними і бажано, щоб спостереження проводилось персоналом, що не знає про введення речовини. Фіксувати потрібно зміни у шкірі, хутрі, очах, слизових оболонках, впливі на секреторні та екскреторні функції, а також автономній діяльності (наприклад, сльозовиділенні, пілоерекції, розмірі зіниць, незвичні респіраторні явища). Зміни в ході, поставі і реакції на догляд, так само, як наявність клонічних або тонічних рухів, стереотипів (наприклад, надмірна чистка хутра, періодично повторюване ходіння по колу) або дивна поведінка (наприклад, самоушкодження, ходіння назад) мають також фіксуватися.

На четвертий тиждень піддавання впливу потрібно провести оцінку сенсорної реактивності на стимули різного типу (наприклад, слухові, візуальні та пропріоцептивні імпульси); оцінку сили захвату та моторної активності. Подальша докладна інформація щодо процедур, які можуть проводитися після вищенаведених, розглянуто в літературі (дивіться Загальний вступ, Частину B).

Функціональні спостереження, що проводяться на четвертий тиждень піддавання впливу, можуть не проводитися, якщо дослідження проводиться як підготовче до подальшого підгострого (90-денного) дослідження. У цьому випадку, функціональні спостереження мають включатися в це подальше дослідження. З іншого боку, наявність даних функціональних спостережень з дослідження введення повторюваної дози може надати можливість вибрати рівні дозування для подальшого підгострого дослідження.

Функціональні спостереження можна також пропустити виключно для груп, які іншим чином виявляють ознаки токсичності до такої міри, що це може значно впливати на процес функціонального випробування.

1.4.3.2. Маса тіла і споживання їжі/води

Всіх тварин зважують щонайменше один раз на тиждень. Вимірювання споживання їжі і води слід проводити щонайменше один раз на тиждень. Якщо досліджувана речовина вводиться з питною водою, вимірювання споживання води необхідно проводити також щонайменше один раз на тиждень.

1.4.3.3. Гематологія

Наступні гематологічні дослідження мають проводитися наприкінці періоду дослідження: гематокрит, концентрація гемоглобіну, підрахунок еритроцитів, загальний і диференціальний підрахунок лейкоцитів, підрахунок тромбоцитів і вимірювання часу/потенціалу згортання крові.

Зразки крові слід взяти з визначеного місця одразу перед або під час процедури знищення тварин, і зберігати за відповідних умов.

1.4.3.4. Клінічна біохімія

Клінічні біохімічні дослідження для виявлення найбільших токсичних впливів на тканини і, особливо, впливів на нирки і печінку, мають проводитися на зразках крові, отриманих від усіх тварин (крім помираючих та/або знищених випадково) відразу перед або під час процедури знищення тварин. Рекомендується не годувати тварин вночі перед забором крові для зразків(1). При проведенні дослідження плазми чи сироватки мають враховуватися показники соди, калію, глюкози, загальної кількості холестерину, сечовини, креатиніну, загальної кількості протеїнів та альбумінів, щонайменше два визначення впливів показників ензимів або гепатоцелюларних впливів (таких, як аланін-амінотрансфераза, аспартат-амінотрансфераза, лужна фосфатаза, гамма-глутамилтранспептидаза та сорбіт-дегідрогеназа). Вимірювання додаткових ензимів (печінкового або іншого походження) та надлишку жовчі може надати корисну інформацію за певних умов.

----------------

(1) Для кількісних вимірювань сироватки і плазми, особливо стосовно глюкози, бажано не годувати тварин вночі перед забором крові. Головною причиною цього є те, що підвищена варіативність, що є неуникненним результатом годування тварин, може замаскувати більш слабко виражені ефекти і ускладнити інтерпретацію. З іншого боку, проте, якщо не годувати тварин вночі, це може змінити загальний метаболізм тварини і, особливо при проведенні досліджень, пов'язаних з годуванням, може порушити щоденне введення досліджуваної речовини. Якщо було вирішено не годувати тварин вночі, клінічні біохімічні дослідження слід проводити після функціональних спостережень на 4-му тижні дослідження.

Можливе проведення необов'язкового аналізу сечі протягом останнього тижня дослідження з використанням збору сечі, розпланованого за часом; досліджується зовнішній вигляд, об'єм, осмотична концентрація або питома вага, pH, протеїни, клітини глюкози і крові/клітин крові.

Окрім того, слід розглянути можливість проведення досліджень для виявлення маркерів сироватки загального ушкодження тканини. Якщо відомі властивості досліджуваної речовини можуть, або передбачається, що вони можуть завдати шкоди метаболічним показникам, включаючи показники кальцію, фосфату, основних тригліцеридів, специфічних гормонів, метгемоглобіну та холінестерази, потрібно виконати інші аналізи. Їх слід визначати для певних класів речовин або від випадку до випадку.

У цілому потрібен гнучкий підхід, що залежить від біологічного виду та/або впливу, що спостерігався чи очікується від даної речовини.

Якщо історично встановлених вихідних даних недостатньо, слід розглянути можливість визначення гематологічних і клінічних біохімічних перемінних перед початком введення доз речовини.

1.4.3.5. Макроскопічні обстеження під час розтину

Всі тварини, що використовувались для дослідження, піддаються повному і детальному макроскопічному обстеженню під час розтину, що включає ретельний огляд зовнішньої поверхні тіла, всіх отворів, черепної, грудної і черевної порожнин та їх вмісту. Печінку, нирки, наднирники, яєчка, епідідіміс, тимус, селезінку, мозок та серце усіх тварин слід позбавити від сполучної тканини, якщо це потрібно, і виміряти їх вагу у вологому стані якомога скоріше після препарування, щоб уникнути висихання.

Інші тканини слід зафіксувати за допомогою найбільш придатного з точки зору як для типу тканини, так і для передбаченого наступного гістопатологічного обстеження, фіксуючого засобу: всі макроскопічні ушкодження, мозок (репрезентативні області, включаючи головний мозок, мозочок та вароліїв міст), спинний мозок, шлунок, товстий і тонкий кишечник (включаючи Пейєрові бляшки), печінку, нирки, наднирники, селезінку, серце, тимус, щитовидну залозу, трахею та легені (фіксуються вдуванням фіксатора і подальшим зануренням), гонади, додаткові статеві органи (наприклад, матка, простата), сечовий міхур, лімфатичні вузли (бажано один лімфатичний вузол, що супроводжує маршрут введення речовини та ще один, віддалений від маршруту введення речовини для дослідження системних впливів), периферичні нерви (сідничний або великий гомілковий) - переважно у безпосередній близькості до м'язу та відділів кісткового мозку (або, в якості альтернативи, свіжий вставлений в рамку аспірат кісткового мозку). Клінічні та інші показники можуть виявити потребу в огляді додаткових тканин. Також всі органи, які можуть розглядатися у якості цільових органів, ґрунтуючись на відомих властивостях досліджуваної речовини, слід зберігати.

1.4.3.6. Гістопатологічне обстеження

Повне гістопатологічне дослідження збережених органів і тканин має здійснюватися на всіх тваринах в контрольній групі та у групі, якій вводилася висока доза. Ці обстеження слід провести також на тваринах з груп, де застосовуються інші дози, якщо у групі, якій вводилася висока доза, спостерігалися зміни, викликані введенням речовини.

Слід провести обстеження всіх макроскопічних ушкоджень.

При використанні супутньої групи необхідно здійснити гістопатологічне дослідження тканин і органів, ідентифікованих як такі, що проявляють вплив на піддослідні групи.

2. ДАНІ

Необхідно отримати індивідуальні дані. Також всі дані по кожній піддослідній групі мають бути підсумовані у формі таблиці, де зазначені кількість тварин на початку випробування, кількість тварин, що померли під час випробування або були знищені з гуманістичних міркувань, а також час смерті або знищення кожної тварини, кількість тварин з ознаками токсичного впливу, опис виявлених ознак токсичного впливу, включаючи час початку, тривалість і силу токсичного впливу, кількість тварин з ушкодженнями, типи ушкоджень і відсоток тварин з будь-якими типами ушкоджень.

За можливості, цифрові результати слід оцінювати, використовуючи відповідний і загальноприйнятий статистичний метод. Статистичні методи обирають на етапі розробки плану дослідження.

3. ЗВІТНІСТЬ

ЗВІТ ЩОДО ПРОВЕДЕННЯ ДОСЛІДЖЕННЯ

Звіт щодо проведеного дослідження має, за можливості, містити наступну інформацію:

Піддослідні тварини:

- біологічні види/лінії тварин, що використовуються,

- кількість, вік і стать тварин

- походження, умови утримання, дієта, і т.д.

- вага кожної тварини на початку дослідження, а також через кожен тиждень та наприкінці дослідження.

Умови випробування:

- обґрунтування вибору розчинника, окрім води,

- обґрунтування вибору рівня дозування,

- детальний склад досліджуваної речовини/розробки раціону харчування, досягнута концентрація, стабільність і гомогенність препарату,

- докладна інформація щодо застосування досліджуваної речовини,

- перехід від концентрації досліджуваної речовини у їжі/питній воді (в мільйонних долях) до поточної дози (мг/кг маси тіла/день), у випадку застосування такого переходу,

- детальна інформація щодо якості їжі і води.

Результати:

- маса тіла/зміни маси тіла,

- споживання їжі і води, у випадку застосування,

- дані токсичної реакції з огляду на стать і рівень дозування, включаючи ознаки токсичного впливу,

- природа, жорсткість умов і тривалість клінічних спостережень (як щодо зворотних, так і щодо незворотних змін),

- оцінка сенсорної активності, сили захвату та моторної активності,

- гематологічні дослідження з відповідним базисним оцінюванням,

- клінічні біохімічні дослідження з відповідним базисним оцінюванням,

- маса тіла при знищенні і дані про вагу органів,

- показники, виявлені під час розтину,

- детальний опис всіх гістопатологічних показників,

- дані щодо абсорбції, за наявністю,

- статистична обробка результатів, якщо вона є доцільною.

Обговорення результатів.

Висновки.

4. ПОСИЛАННЯ

Цей метод аналогічний методу, що застосовується у ТІ ОЕСР 407.

B.8. ТОКСИЧНІСТЬ ПОВТОРНОЇ ДОЗИ (ВВЕДЕНОЇ ЧЕРЕЗ ІНГАЛЯЦІЮ ВПРОДОВЖ 28 ДНІВ)

1. МЕТОД

1.1. ВСТУП

Корисно отримати попередню інформацію про розподіл розмірів частинок, тиск пару, точку плавлення, точку кипіння, температуру займання і вибуховість (якщо це є застосовним) речовини.

Дивіться також Загальний вступ, Частину B (A).

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ

Дивіться Загальний вступ, Частину B (B).

1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ

Немає.

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

Кілька груп піддослідних тварин на певний період щоденно піддають впливу досліджуваної речовини в градуйованих концентраціях; одна концентрація використовується для однієї групи протягом 28 днів. Якщо для створення відповідної концентрації досліджуваної речовини в атмосфері, необхідне використання контрольної групи розчинника, така група має бути використана. Протягом періоду застосування за тваринами ведеться щоденне спостереження для виявлення ознак токсичності. Проводиться розтин тварин, які помирають під час дослідження, а по завершенні дослідження проводиться їх розтин.

1.5. КРИТЕРІЇ ЯКОСТІ

Немає.

1.6. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

1.6.1. Підготовка

Тварини утримуються в експериментальних умовах та у відповідних умовах харчування протягом щонайменше п'яти днів перед експериментом. Перед тестом тварин відбирають із застосуванням випадкового відбору і розподіляють в необхідну кількість груп. За необхідності, для створення відповідної концентрації речовини в атмосфері до досліджуваної речовини може додаватися відповідний розчинник. Якщо розчинник або інша домішка використовується для полегшення дозування, вони повинні мати підтвердження того, що вони не спричиняють токсичних впливів. Можливе використання історично встановлених даних, якщо це є доцільним.

1.6.2. Умови проведення дослідження

1.6.2.1. Піддослідні тварини

Якщо немає протипоказань, перевага при виборі з біологічних видів гризунів надається щуру. Слід залучити для випробувань лабораторні лінії здорових молодих тварин, що зазвичай використовуються.

На початку дослідження коливання ваги використовуваних тварин не повинно становити +- 20% від відповідного середнього показника.

1.6.2.2. Кількість і стать

Щонайменше 10 тварин (п'ять самців і п'ять самок) слід використовувати для кожної піддослідної групи. Тварини жіночої статі мають бути не вагітними і такими, що ніколи не народжували. Якщо заплановане проміжне знищення тварин, їх кількість потрібно збільшити на кількість тварин, яких планується знищити до завершення дослідження. На додаток, супутній групі з 10 тварин (по 5 тварин кожної статі) може вводитися доза найвищої концентрації протягом 28 днів, а також проводяться спостереження щодо зворотності, витривалості або відстроченої ймовірності токсичного впливу впродовж 14 днів після введення речовини. Також використовується супутня група з 10 контрольних тварин (по 5 тварин кожної статі).

1.6.2.3. Концентрація для впливу

Потрібно щонайменше три концентрації, з використанням контролю або контролю розчинника (що відповідає концентрації розчинника на найвищому рівні), якщо розчинник використовується. За винятком введення досліджуваної речовини, за тваринами в контрольній групі доглядають так само, як і за тваринами піддослідної групи. Найвища концентрація має призводити до токсичних впливів але не спричиняти смерть, принаймні масову. Найнижча концентрація не повинна виявляти жодних ознак токсичності. Якщо існують придатні до використання оцінки впливу на людину, найнижча концентрація має перевищувати концентрацію, використану в попередніх дослідженнях. В ідеалі, проміжна концентрація має спричиняти мінімальні токсичні впливи, які можливо спостерігати. Якщо використовується більш ніж одна проміжна концентрація, концентрації мають розташовуватись на відстані одна від одної для забезпечення градуювання токсичних впливів. Для отримання значущих результатів у групах, де застосовується речовина в низькій і проміжних концентраціях, а також в контрольній групі, повинен бути низький відсоток смертності.

1.6.2.4. Час впливу

Тривалість щоденного впливу має становити шість годин, проте, для задоволення специфічних вимог може виникнути потреба в зміні тривалості.

1.6.2.5. Обладнання

Дослідження на тваринах слід проводити за допомогою інгаляційного обладнання, здатного забезпечувати динамічний потік повітря протягом щонайменше як 12 обмінів повітря за годину для підтримання відповідного вмісту кисню та рівномірно розподіленої атмосфери впливу. При використанні камери її конструкція має забезпечувати мінімальне скупчення піддослідних тварин і максимальний вплив інгаляції досліджуваною речовиною. Загальне правило для забезпечення стабільності атмосфери в камері означає, що загальний "об'єм" піддослідних тварин не повинен перевищувати 5% об'єму камери для дослідження. Вплив за допомогою камери може бути рото-носовим, тільки на голову або індивідуальним на все тіло; перші два варіанти дозволяють мінімізувати поглинання через інші шляхи.

1.6.2.6. Період спостереження

За піддослідними тваринами ведеться щоденне спостереження з метою виявлення ознак токсичності під час всього періоду введення речовини та часу відновлення. Час смерті та час, коли з'явились і зникли ознаки токсичності, має фіксуватися.

1.6.3. Процедура

Тварин щоденно піддають впливу досліджуваної речовини, від 5 до 7 днів на тиждень протягом 28 днів. Тваринам у будь-якій супутній групі, призначеним для подальшого спостереження, не слід нічого вводити впродовж подальших 14 днів для визначення витривалості чи відновлення після токсичних впливів. Температура, за якої проводиться випробування, має підтримуватись на рівні 22 +- 3 град.C.

В ідеалі, відносна вологість має становити від 30 до 70%, але в певних випадках (наприклад, випробування деяких аерозолів) це може бути нездійсненним. Підтримання злегка від'ємного тиску всередині камери (<= 5 мм води) запобігатиме витоку досліджуваної речовини в навколишнє середовище. Тваринам не дають їжі і води під час впливу.

Потрібно використовувати динамічну інгаляційну систему з відповідною аналітичною системою контролю концентрації. Для встановлення відповідної концентрації для впливу рекомендується проведення контрольного випробування. Потік повітря слід відрегулювати для забезпечення гомогенності умов у камері для впливу. Система має забезпечувати досягнення стабільних умов впливу якомога швидше.

Вимірювання або моніторинг слід проводити щодо:

(a) швидкості потоку повітря (постійно),

(b) поточної концентрації досліджуваної речовини, що вимірюється в зоні дихання. Впродовж щоденного періоду впливу концентрація не повинна коливатися у межах більш ніж +- 15% від середнього показника. Проте, у випадку застосування деяких аерозолів контрольного рівня неможливо досягти, тому може бути прийнятий ширший діапазон. Впродовж усього періоду дослідження повсякденна концентрація має підтримуватись на можливому стабільному рівні. Для аерозолів слід проводити щонайменше один аналіз розмірів частинок на тиждень для піддослідної групи.

Під час подальшого впливу проводяться спостереження та їх результати фіксуються систематично; для кожної тварини дані мають записуватись окремо. Спостереження всіх тварин мають здійснюватися щоденно, а ознаки токсичного впливу - фіксуватися, включаючи час початку, ступінь та тривалість. Спостереження мають включати зміни в шкірі, хутрі, очах, слизових оболонках, функціонуванні дихальної, кровоносної вегетативної та центральної нервової систем, соматомоторній активності та стереотипі поведінки. Вимірювання ваги тварин слід проводити щотижня. Також рекомендується щотижня вимірювати споживання їжі. Необхідно здійснювати регулярне спостереження за тваринами з метою запобігання втрати тварин через такі причини, як канібалізм, автоліз тканин або неправильне розміщення. По закінченню періоду дослідження робиться розтин всіх тварин з несупутніх груп, що вижили. Помираючі тварини та тварини, що постійно страждають, мають бути вилучені, як тільки про цей факт помітять, знищені гуманним способом і піддані розтину.

Наступні дослідження проводяться наприкінці випробування для всіх тварин, включаючи тих, що входять до складу контрольної групи:

гематологія, включаючи принаймні гематокрит, концентрація гемоглобіну, підрахунок еритроцитів, загальний і диференціальний підрахунок лейкоцитів, підрахунок і вимірювання потенціалу згортання;

клінічні дослідження біохімії крові, включаючи принаймні один параметр функцій печінки та нирок: аланін-амінотрансфераза сироватки (раніше відома як глютамінова піровиноградна трансаміназа), аспартат-амінотрансфераза сироватки (раніше відома як глютамінова щавелевооцтова трансаміназа), азот сечовини крові, альбумін, креатинін крові, загальний білірубін і загальні вимірювання протеїнів сироватки;

Інші аналізи, які можуть бути необхідними для адекватної токсикологічної оцінки, включають аналіз показників кальцію, фосфору, хлориду, соди, калію, аналіз глюкози натщесерце на вміст жирів, гормонів, кислотно-лужний баланс, активність метгемоглобіну та холінестерази.

За необхідності, з метою розширеного вивчення виявлених токсичних впливів можуть проводитися додаткові клінічні біохімічні дослідження.

1.6.3.1. Макроскопічні обстеження під час розтину

Всі тварини, що використовувались для дослідження, піддаються повному макроскопічному обстеженню. Принаймні печінку, нирки, наднирники, легені і яєчка слід зважити у вологому стані якомога скоріше після препарування, щоб уникнути висихання. Органи і тканини (дихальний тракт, печінку, нирки, селезінку, яєчка, наднирники, серце і будь-які органи, в яких виявлено макроскопічні ушкодження або зміни розміру) потрібно зберігати у відповідному засобі для можливого гістопатологічного дослідження у майбутньому. Легені слід витягти неушкодженими, зважити і закріпити за допомогою відповідного фіксатора, щоб забезпечити збереження легеневої структури.

1.6.3.2. Гістопатологічне обстеження

В контрольній групі (групах) і групі, якій вводилася доза високої концентрації, слід провести гістопатологічне дослідження збережених органів і тканин. Органи і тканини, в яких було виявлено ушкодження, приписуються досліджуваній речовині при найвищому рівні дозування, та такі органи слід обстежити в усіх групах низького дозування. Для тварин будь-якої з супутніх груп потрібно провести гістопатологічне дослідження, приділяючи особливу увагу органам та тканинам, визначених як ті, що мають ознаки впливу, в інших піддослідних групах.

2. ДАНІ

Дані мають бути підсумовані у формі таблиці, де зазначені кількість тварин на початку проведення дослідження і кількість тварин з будь-якими ушкодженнями для кожної піддослідної групи.

Всі виявлені результати слід оцінювати, використовуючи відповідний статистичний метод. Можливе використання будь-якого визнаного статистичного методу.

3. ЗВІТНІСТЬ

3.1. ЗВІТ ПРО ПРОВЕДЕННЯ ДОСЛІДЖЕННЯ

За можливості, звіт про повинен проведення дослідження має містити таку інформацію:

- біологічні види, лінії, походження, умови навколишнього середовища, дієта, і т.д.

- умови досліду.

Опис апарату для введення, включаючи конструкцію, тип, розміри, джерело повітря, систему подачі аерозолів, метод кондиціонування повітря та метод утримання тварин у камері для випробування дослідження за умови її використання. Обладнання для вимірювання температури, вологості і, за необхідності, стабільності концентрації аерозолю або розподілу розмірів частинок також має бути описане.

Дані з піддавання впливу:

Вони мають бути представлені у формі таблиці з середніми показниками і ступенем мінливості (наприклад, стандартне відхилення) і за можливості мають включати:

(a) швидкість потоку повітря через інгаляційне обладнання;

(b) температуру і вологість повітря;

(c) номінальні концентрації (загальну кількість досліджуваної речовини, що подається в інгаляційне обладнання, поділену на об'єм повітря);

(d) природу розчинника, якщо він використовується;

(e) поточну концентрацію в досліджуваній зоні дихання;

(f) загальний серединний аеродинамічний діаметр (ЗСАД) і відхилення від геометричного стандарту (ВГС);

- дані токсичної реакції в залежності від статі і концентрації,

- час смерті під час дослідження або випадки, коли тварини дожили до моменту знищення,

- опис токсичних або інших впливів, рівень відсутності впливу,

- час спостереження будь-якої аномальної ознаки і подальший перебіг її розвитку,

- дані про масу тіла і харчування,

- проведені гематологічні дослідження та їх результати,

- проведені біохімічні дослідження та їх результати,

- показники, виявлені під час розтину,

- докладний опис всіх гістопатологічних показників,

- статистична обробка результатів, якщо вона є доцільною,

- обговорення результатів,

- інтерпретація результатів.

3.2. ОЦІНКА ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ

Дивіться Загальний вступ, Частину B (D).

4. ПОСИЛАННЯ

Дивіться Загальний вступ, Частину B (E).

B.9. ТОКСИЧНІСТЬ ПОВТОРНОЇ ДОЗИ (ВВЕДЕНОЇ ЧЕРЕЗ ШКІРУ ВПРОДОВЖ 28 ДНІВ)

1. МЕТОД

1.1. ВСТУП

Дивіться Загальний вступ, Частину B (A).

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ

Дивіться Загальний вступ, Частину B (B).

1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ

Немає.

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

Досліджувана речовина прикладається щоденно до шкіри градуйованими дозами кільком групам піддослідних тварин, одна доза для однієї групи протягом 28 днів. Протягом періоду прикладання за тваринами ведеться щоденне спостереження для виявлення ознак токсичності. Проводиться розтин тварин, які помирають під час дослідження, а по завершенні дослідження проводиться розтин тих тварин, що вижили.

1.5. КРИТЕРІЇ ЯКОСТІ

Немає.

1.6. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

1.6.1. Підготовка

Тварини утримуються в експериментальних умовах і у відповідних умовах харчування протягом щонайменше п'яти днів перед проведенням дослідження. Перед тестом тварин відбирають методом сліпого відбору і розподіляють в піддослідну і контрольну групи. Незадовго до випробування хутро обстригається зі спинної частини тулубу піддослідних тварин. Можливе застосування гоління, яке потрібно здійснити приблизно за 24 години до проведення дослідження. Повторне обстригання або гоління зазвичай слід проводити приблизно з інтервалом у тиждень. При обстриганні або голінні хутра необхідно подбати про те, щоб уникнути потертості шкіри. Не меш ніж 10% поверхні тіла слід очистити для застосування досліджуваної речовини. При вирішенні питання про зону очищення та розміри покриття потрібно враховувати вагу тварини. При тестуванні твердих речовин, які можуть подрібнюватися в порошок, якщо це є доцільним, досліджувана речовина повинна бути достатньо зволожена водою або, за необхідності, відповідним розчинником з метою забезпечення тісного контакту зі шкірою. Рідкі досліджувані речовини, зазвичай, застосовуються нерозбавленими. Використовується схема щоденного застосування від 5 до 7 днів на тиждень.

1.6.2. Умови проведення дослідження:

1.6.2.1. Піддослідні тварини

Можуть використовуватись дорослі щури, кролики або морські свинки. Можливе використання інших біологічних видів, але їх використання вимагає обґрунтування.

На початку дослідження коливання ваги використовуваних тварин не повинно перевищувати +- 20% від відповідного середнього показника.

1.6.2.2. Кількість і стать

Щонайменше 10 тварин (п'ять самців і п'ять самок) зі здоровою шкірою слід використовувати для кожного рівня дозування. Тварини жіночої статі мають бути не вагітними і такими, що ніколи не народжували. Якщо заплановане проміжне знищення тварин, їх кількість потрібно збільшити на кількість тварин, яких планується знищити до завершення дослідження. Окрім того, супутній групі з 10 тварин (по 5 тварин кожної статі) може даватися доза високого рівня протягом 28 днів, а також проводяться спостереження щодо зворотності, витривалості або відстроченої ймовірності токсичного впливу впродовж 14 днів після введення речовини. Також використовується супутня група з 10 контрольних тварин (по 5 тварин кожної статі).

1.6.2.3. Рівень дозування

Потрібно щонайменше три рівня дозування з використанням контролю або контролю розчинника, якщо розчинник використовується. Період впливу має становити щонайменше шість годин на день. Прикладання досліджуваної речовини слід здійснювати в один і той самий час кожного дня і вивірити інтервали (тижневий або двотижневий) для підтримання постійного рівня дозування в залежності від ваги тварини. За винятком введення досліджуваної речовини, за тваринами в контрольній групі доглядають так само, як і за тваринами піддослідної групи. Якщо розчинник використовується для полегшення дозування, контрольна група повинна отримувати таку саму дозу, як і піддослідні групи, і отримувати таку саму кількість, яку отримує група з найвищим рівнем дозування. Найвищий рівень дозування повинен призводити до токсичних впливів, але не спричиняти смерть, принаймні масову. Найнижчий рівень дозування не повинен виявляти ніяких ознак токсичності. Якщо існують придатні для використання оцінки впливу на людину, найнижчий рівень дозування має перевищувати використаний в попередніх дослідженнях. В ідеалі, середній рівень дозування має спричиняти мінімальні токсичні впливи, які можливо спостерігати. Якщо використовується більш ніж одна проміжна доза, рівні дозування повинні розташовуватись на відстані один від одного для забезпечення класифікації токсичних впливів. Для отримання значущих результатів у групах, де застосовується речовина в низькій і проміжних концентраціях, а також в контрольній групі, повинен бути низький відсоток смертності.

Якщо застосування досліджуваної речовини спричиняє сильне подразнення шкіри, концентрацію слід зменшити, результатом чого буде зменшення або відсутність інших токсичних впливів при високому рівні дозування. Більш того, якщо шкіру було сильно пошкоджено, може виникнути необхідність у завершенні дослідження і здійсненні нового дослідження з нижчими концентраціями.

1.6.2.4. Тестування на граничний вміст

Якщо попереднє дослідження на рівні дозування, який становить 1000 мг/кг, або на вищому рівні дозування щодо можливого впливу на людину, якщо він є відомим, не виявило токсичних впливів, необхідність в проведенні подальших досліджень може зникнути.

1.6.2.5. Період спостереження

За піддослідними тваринами ведеться щоденне спостереження з метою виявлення ознак токсичності. Час смерті та час, коли з'явились і зникли ознаки токсичності, має фіксуватися.

1.6.3. Процедура

Тварин потрібно доглядати окремо. Тварин щоденно піддають впливу досліджуваної речовини, в ідеалі 7 днів на тиждень протягом 28 днів. Тваринам у будь-якій супутній групі, призначеним для подальшого спостереження, не слід нічого вводити впродовж подальших 14 днів для визначення витривалості чи відновлення після токсичних впливів. Період впливу має становити щонайменше шість годин на день.

Досліджувана речовина наноситься рівномірно на зону тіла, яка складає приблизно 10% загальної поверхні тіла. При використанні високотоксичних речовин площа покритої поверхні може зменшуватись, але якомога більша площа має бути покрита якомога тоншим і більш рівномірним шаром речовини.

Під час впливу досліджувана речовина прикріплюється до шкіри за допомогою губчастої марлевої пов'язки та не подразнюючої стрічки. Зона тестування повинна далі вкриватися відповідним чином з метою утримання марлевої пов'язки і досліджуваної речовини та запобігання можливості ковтання твариною досліджуваної речовини. Для запобігання ковтання досліджуваної речовини можна використовувати фіксатори, проте, повне обмеження рухливості іммобілізація не рекомендується. В якості альтернативи можна використовувати "захисний прилад на комір".

По закінченні періоду впливу залишок досліджуваної речовини слід прибрати, де це можливо, використовуючи воду або інший відповідний спосіб очищення шкіри.

Спостереження всіх тварин має здійснюватися щоденно, а ознаки токсичного впливу - фіксуватися, включаючи час початку, ступінь та тривалість. Спостереження мають включати зміни в шкірі, хутрі, очах, слизових оболонках, а також у функціонуванні дихальної, кровоносної, вегетативної та центральної нервової систем, соматомоторній активності та стереотипі поведінки. Вимірювання ваги тварин потрібно проводити щотижня. Також рекомендується щотижня вимірювати споживання їжі. Необхідно здійснювати регулярне спостереження за тваринами з метою запобігання втрати тварин через такі причини, як канібалізм, автоліз тканин або неправильне розміщення. По закінченні періоду дослідження робиться розтин всіх тварин з несупутніх груп, що вижили. Помираючі тварини та тварини що постійно страждають, мають бути вилучені, як тільки цей факт помітять, знищені гуманним способом і піддані розтину.

Наступні дослідження проводяться наприкінці проведення тестування всіх тварин, включаючи тих, що входять до складу контрольної групи:

1) гематологія, включаючи принаймні гематокрит, концентрацію гемоглобіну, підрахунок еритроцитів, загальний і диференціальний підрахунок лейкоцитів, підрахунок і вимірювання потенціалу згортання;

2) клінічні дослідження біохімії крові, включаючи принаймні один параметр функцій печінки та нирок: аланін-амінотрансфераза сироватки (раніше відома як глютамінова піровиноградна трансаміназа), аспартат-амінотрансфераза сироватки (раніше відома як глютамінова щавелевооцтова трансаміназа), азот сечовини, альбумін, креатинін крові, загальний білірубін і загальні протеїни сироватки;

Інші аналізи, що можуть бути необхідними для адекватної токсикологічної оцінки, включають аналіз показників кальцію, фосфору, хлориду, соди, калію, аналіз глюкози натщесерце на вміст жирів, гормонів, кислотно-лужний баланс, активність метгемоглобіну та холінестерази.

За необхідності, можуть проводитися додаткові клінічні біохімічні дослідження для розширеного вивчення виявлених впливів.

1.6.4. Макроскопічні обстеження під час розтину

Всіх тварин, що використовувались для дослідження, піддають повному макроскопічному обстеженню під час розтину. Принаймні печінку, нирки, наднирники, яєчка слід зважити у вологому стані якомога скоріше після препарування, щоб уникнути висихання. Органи і тканини, тобто неушкоджена шкіра і шкіра після впливу досліджуваної речовини, печінка, нирки, селезінка, яєчка, наднирники, серце і цільові органи (будь-які органи, в яких виявлено макроскопічні ушкодження або зміни розміру) потрібно зберігати у відповідному засобі для можливого гістопатологічного дослідження у майбутньому.

1.6.5. Гістопатологічне обстеження

В контрольній групі і групі, якій вводилася висока доза, потрібно провести гістопатологічне дослідження збережених органів і тканин. Органи і тканини, в яких було виявлено ушкодження, приписуються досліджуваній речовині при найвищому рівні дозування, та такі органи слід обстежити в усіх групах низького дозування. Для тварин будь-якої з супутніх груп потрібно провести гістопатологічне дослідження, приділяючи особливу увагу органам та тканинам, визначених як ті, що мають ознаки впливу, в інших піддослідних групах.

2. ДАНІ

Дані повинні бути підсумовані у формі таблиці, де зазначені кількість тварин на початку дослідження і кількість тварин з будь-якими ушкодженнями для кожної піддослідної групи.

3. ЗВІТНІСТЬ

3.1. ЗВІТ ПРО ПРОВЕДЕННЯ ДОСЛІДЖЕННЯ

За можливості, звіт про проведення дослідження має містити наступну інформацію:

- дані про тварину (біологічні види, лінії, походження, умови навколишнього середовища, дієта, і т.д.)

- умови дослідження (включаючи тип пов'язки: оклюзивна або неоклюзивна),

- рівні дозування (включаючи розчинник, якщо він використовується) та концентрації,

- рівень відсутності впливу, де можливо,

- дані токсичної реакції в залежності від статі і дозування,

- час смерті під час дослідження або випадки, якщо тварини дожили до знищення,

- токсичні або інші впливи,

- час спостереження будь-якої аномальної ознаки і подальший перебіг її розвитку,

- дані про масу тіла і харчування,

- проведені гематологічні дослідження та їх результати,

- проведені біохімічні дослідження та їх результати,

- показники, виявлені під час розтину,

- докладний опис всіх гістопатологічних показників,

- статистична обробка результатів, де вона є можливою,

- обговорення результатів,

- інтерпретація результатів.

3.2. ОЦІНКА ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ

Дивіться Загальний вступ, Частину B (D).

4. ПОСИЛАННЯ

Дивіться Загальний вступ, Частину B (E).

B.10. МУТАГЕННІСТЬ - ТЕСТ IN VITRO НА ХРОМОСОМНУ АБЕРАЦІЮ ССАВЦІВ

1. МЕТОД

Цей метод відтворює метод, описаний у ТІ ОЕСР 473, Тест In Vitro на Хромосомну Аберацію Ссавців (1997).

1.1. ВСТУП

Метою тесту in vitro на хромосомну аберацію є визначення агентів, які спричиняють структурні хромосомні аберації у культивованих клітинах ссавців (1)(2)(3). Структурні аберації можуть бути двох типів: хромосомні або хроматидні. При використанні більшості хімічних мутагенів спровоковані аберації належать до хроматидного типу, але трапляються також аберації хромосомного типу. Підвищення поліплоїдії може означати, що хімічна речовина має потенціал для провокування кількісних аберацій. Проте цей метод було розроблено не для вимірювання кількісних аберацій і, зазвичай, він не використовується з цією метою. Хромосомні мутації та пов'язані з ними явища є причиною багатьох генетичних хвороб людини, і є суттєві докази того, що хромосомні мутації та пов'язані з ними явища, що спричиняють зміни в онкогенах і генах-супрессорах пухлин соматичних клітин, беруть участь у викликанні раку у людини і піддослідних тварин.

Тест in vitro на хромосомну аберацію може залучати культури усталених ліній клітин, штамів клітин або первинних клітинних культур. Клітини для використання відбираються, спираючись на здатність культури до зростання, стабільність каріотипу, кількість хромосом, різноманітність хромосом та частоту спонтанних хромосомних аберацій.

Для проведення дослідження in vitro, зазвичай вимагається використання екзогенного джерела метаболічної активації. Ця система метаболічної активації не може повністю імітувати умов функціонування організму ссавців in vivo. Необхідно подбати про те, щоб уникнути умов, які призводять до позитивних результатів, які не відображають спадкової мутагенності і можуть походити від змін pH, осмотичного тиску або високого рівня цитотоксичності (4)(5).

Це дослідження застосовується для виявлення можливих мутагенів і канцерогенів у ссавців. Багато сполук, що дають позитивний результат у цьому дослідженні, є канцерогенами ссавців; проте, немає абсолютного взаємозв'язку між цим дослідженням та канцерогенністю. Взаємозв'язок залежить від класу хімічних речовин, і збільшується кількість даних, які доводять існування канцерогенів, що не виявляються за допомогою цього дослідження, оскільки є припущення, що вони діють через інші механізми, а не пошкоджують ДНК напряму.

Дивіться також Загальний вступ, Частину B.

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ

Аберація хроматидного типу: структурне хромосомне пошкодження, що виявляється в утворенні розривів окремих хроматид або в утворенні розривів і об'єднанні хроматид.

Аберація хромосомного типу: структурне хромосомне пошкодження, що виявляється в утворенні розривів або в утворенні розривів і об'єднанні обох хроматид на ідентичній ділянці.

Ендоредуплікація: процес, у якому після S-періоду реплікації ядро ДНК починає не процес мітозу, а новий S-період. Результатом є хромосоми з 4, 8, 16... хроматидами.

Геп: ахроматичне ушкодження, менше за ширину хроматиди, та з мінімальним порушенням орієнтації хроматид).

Мітотичний індекс: співвідношення клітин у метафазі, поділене на загальну кількість клітин, що спостерігаються в популяції клітин; показник ступеню розростання цієї популяції.

Кількісна аберація: зміна кількості хромосом від характеристик нормальної кількості у використаних клітинах.

Поліплоїдія: помноження галоїдної кількості хромосом (n) на відміну від диплоїдної кількості (тобто, 3n, 4n і т.д.).

Структурна аберація: зміна в структурі хромосом, що визначається при мікроскопічному дослідженні стадії метафази поділу клітини, яка спостерігається у вигляді делецій і фрагментів, внутрішнього або взаємного обміну.

1.3. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

Клітинні культури піддають впливу досліджуваної речовини як за участю, так і без участі метаболічної активації. Через визначені інтервали після піддавання впливу досліджуваної речовини клітинних культур, їх піддають дії речовин, що спричиняють блокування метафази (наприклад, колцемід(R) або колхіцин), збирають, зафарбовують, і метафазні клітини аналізують за допомогою мікроскопу з метою виявлення присутності хромосомних аберацій.

1.4. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

1.4.1. Підготовка

1.4.1.1. Клітини

Дозволяється використання різноманітних ліній клітин, штамів клітин або первинних клітинних культур, включаючи людські клітини (наприклад, фібробласти китайського хом'яка, лімфоцити периферичної крові людини або іншого ссавця).

1.4.1.2. Середовище і умови для культур

Для підтримання культур слід використовувати відповідне середовище та умови вирощування (ємності для культур, концентрацію CO , температуру і вологость). Усталені лінії клітин і штами 2

необхідно регулярно перевіряти на стабільність модальної кількості
хромосом   і  відсутність  зараження  мікоплазмою;  при  виявленні
зараження,  їх не слід використовувати.  Потрібно знати тривалість
клітинного циклу для даних клітин і умови для них.

1.4.1.3. Підготовка культур

Усталені лінії клітин і штами: клітини розводяться з вихідної культури, висіваються в культуральне середовище за такої щільності, щоб клітини не злилися до часу збирання, і вирощуються при температурі 37 град.C.

Лімфоцити: цільна кров піддається впливу антикоагулянту (наприклад, гепарину) або відокремлені лімфоцити, отримані від здорових об'єктів, додаються в культуральне середовище, що містить міоген (наприклад, фітогемагглутинін) і вирощуються при температурі 37 град.C.

1.4.1.4. Метаболічна активація

Клітини мають піддаватись впливу досліджуваної речовини як в присутності відповідної системи метаболічної активації, так і за її відсутності. Найчастіше використовується система доповненої коферментами пост-мітохондріальної фракції (S9), приготованої з печінок гризунів, оброблених ензимами, включаючи такі агенти, як: Арохлор-1254 (6)(7)(8)(9), або суміш фенобарбіталу та в-нафтофлавону (10)(11)(12).

Пост-мітохондріальна фракція, зазвичай, використовується в концентраціях в діапазоні від 1-10% в об'ємному співвідношенні в кінцевому піддослідному середовищі. Стан системи метаболічної активації може залежати від класу хімічних речовин, що випробовується. В деяких випадках може бути доцільним використання більш ніж однієї концентрації пост-мітохондріальної фракції.

Кількість подій, включаючи створення ліній клітин, що виявляють специфічні аміноацил-тРНК-синтетази, за допомогою генної інженерії, може надати потенціал для ендогенної активації. Вибір ліній клітин для використання має бути науково виправданим (наприклад, релевантністю цитохрому P450 ізоензиму для метаболізму досліджуваної речовини).

1.4.1.5. Досліджувана речовина/Підготовка

Тверді досліджувані речовини слід розчинити або усунути за допомогою відповідного розчинника або середовища і розбавити, якщо це є доцільним, перед обробкою клітин. Рідкі досліджувані речовини можна додавати безпосередньо до досліджуваних систем та/або розбавити перед введенням. Слід застосовувати свіжі препарати досліджуваної речовини, якщо тільки дані щодо стабільності не виявляють придатності до зберігання.

1.4.2. Умови тестування:

1.4.2.1. Розчинник/середовище

Не має бути підозри на хімічну реакцію розчинника/середовища з досліджуваною речовиною, вони також повинні бути придатними для виживання клітин і сумісними з діяльністю S9. Якщо використовується не добре відомий розчинник/середовище, їх включення має підтверджуватись даними, що доводять їхню сумісність. Рекомендується там, де можливо, використовувати спочатку водний розчинник/середовище. При випробуванні речовин, нестабільних при взаємодії з водою, використовувані органічні розчинники не мають містити води. Воду можна усунути шляхом додавання молекулярного сита.

1.4.2.2. Концентрації для впливу

При визначенні найвищої концентрації слід розглянути такі критерії, як цитотоксичність, розчинність у досліджуваних системах та зміни pH або осмотичного тиску.

Цитотоксичність слід визначати з та без метаболічної активації в ході основного експерименту, використовуючи відповідний показник цілісності та росту клітин, такий, як ступінь щільності, реальна кількість клітин або мітотичний індекс. Можливо, буде корисним визначення цитотоксичності та розчинності в ході підготовчого експерименту. Потрібно використати щонайменше три концентрації, придатні до аналізування. У випадку цитотоксичності три концентрації мають покривати діапазон від максимальної до незначної токсичності або її відсутності; це зазвичай означає, що рівні концентрації мають бути відділені більше, ніж фактором між 2 та Кк 10. У момент збору найвища концентрація має суттєво зменшитись, що стосується ступеню щільності, кількості клітин або мітотичного індексу (всі більш ніж 50%). Мітотичний індекс є непрямим показником цитотоксичних/цитостатичних впливів і залежить від часу, що пройшов після введення речовини. Проте, мітотичний індекс застосовується для суспензійних культур, для яких інші вимірювання токсичності можуть бути обтяжливими та непрактичними. Інформація про кінетику клітинного циклу, така як середній час генерації (СЧГ), може використовуватись в якості додаткової інформації. Проте, СЧГ є загальним значенням, яке не завжди відображає існування уповільнених субпопуляцій, і навіть найменше збільшення середнього часу генерації може бути пов'язане з дуже значною затримкою в часі оптимального виходу аберацій.

Для відносно не цитотоксичних речовин максимальна концентрація для тестування має становити 5 мю л/мл, 5 мг/мл або 0,01 Моль, яка є найнижчою.

Для відносно нерозчинних речовин, які не є токсичними при концентраціях, нижчих, ніж концентрація нерозчинності, найвища використовувана доза має відповідати концентрації вище межі розчинності у кінцевому культуральному середовищі наприкінці періоду введення речовини. В деяких випадках, (наприклад, коли токсичність проявляється тільки при вищій концентрації, ніж найнижча концентрація нерозчинності) рекомендується проведення тестування більш ніж на одній концентрації з видимим прискоренням. Може бути корисною оцінка розчинності на початку і в кінці тестування, тому що розчинність може змінюватися протягом періоду впливу в досліджуваній системі завдяки присутності клітин, S9, сироватки, і т.д. Нерозчинність можна визначити неозброєним оком. Осад не повинен змінювати результати оцінювання.

1.4.2.3. Позитивні та негативні контрольні групи

Паралельні позитивні та негативні контрольні групи (розчинник або середовище), як з метаболічною активацією, так і без неї, мають входити до складу кожного експерименту. При використанні метаболічної активації хімічна речовина, що використовується для позитивної контрольної групи, має бути такою, що вимагає активації для мутагенної реакції.

Для позитивної контрольної групи залучається відомий кластоген з рівнем впливу, що передбачає відтворюване зростання по відношенню до вихідних даних, яке можна виявити; це зростання демонструє чутливість досліджуваної системи.

Концентрації для позитивної контрольної групи потрібно обирати таким чином, щоб впливи чітко проявлялися, проте, щоб ідентичність кодованих мікроскопічних препаратів не відразу виявлялася пристроєм для зчитування. До речовин позитивної контрольної групи належать:

------------------------------------------------------------------
| Умови метаболічної |      Речовина      |Номер РСХ|Номер ЄРІКХР|
|      активації     |                    |         |            |
|--------------------+--------------------+---------+------------|
|Відсутність         |Метилметансульфонат | 66-27-3 |  200-625-0 |
|екзогенної          |--------------------+---------+------------|
|метаболічної        |Етилметансульфонат  | 62-50-0 |  200-536-7 |
|активації           |--------------------+---------+------------|
|                    |Етилннитрозосечовина|759-73-9 |  212-072-2 |
|                    |--------------------+---------+------------|
|                    |Мітоміцин C         | 50-07-7 |  200-008-6 |
|                    |--------------------+---------+------------|
|                    |4-нітроквінолін-N-  | 56-57-5 |  200-281-1 |
|                    |оксид               |         |            |
|--------------------+--------------------+---------+------------|
|Присутність         |Бензо(альфа)пірен   | 50-32-8 |  200-028-5 |
|екзогенної          |--------------------+---------+------------|
|метаболічної        |Циклофосфамід       | 50-18-0 |  200-028-5 |
|активації           |Циклофосфаміду      |6055-19-2|            |
|                    |моногідрат          |         |            |
------------------------------------------------------------------

Можна використати інші відповідні речовини позитивної контрольної групи. Застосування хімічної речовини, що використовується для позитивної контрольної групи з огляду на клас, може розглядатись за наявності.

Негативна контрольна група, що складається окремо з розчинника або середовища у досліджуваному середовищі, до якого вводяться ті самі речовини, що й досліджуваним культурам, має бути включена до періоду збору. Окрім того, контрольні групи, що не піддавалися впливу досліджуваної речовини, теж повинні використовуватись, якщо немає історично встановлених даних з контролю, що показують відсутність шкідливих та мутагенних впливів обраного розчинника.

1.4.3. Процедура

1.4.3.1. Введення досліджуваної речовини

Клітини, що розростаються, піддають дії досліджуваної речовини як в присутності системи метаболічної активації, так і за її відсутності. Обробка лімфоцитів має починатися приблизно через 72 години після мітогенної стимуляції.

1.4.3.2. Подвійні культури, зазвичай, мають використовуватися у будь-якій концентрації, вони рекомендовані для негативних контрольних культур/контрольних культур розчинника. Якщо між подвійними культурами може спостерігатися мінімальна генетична мінливість (13)(14), відповідно до історично встановлених даних вона може бути прийнятною до використання стосовно одиночних культур у будь-якій концентрації.

Газоподібні та летючі речовини випробовуються за допомогою відповідних методів, таких як запечатані ємності для культур (15)(16).

1.4.3.3. Час збору культур

При першому експерименті клітини мають піддаватись впливу досліджуваної речовини як з метаболічною активацією, так і без неї, від 3 до 6 годин і братись на зразок через проміжок часу, еквівалентний приблизно 1,5 тривалості нормального клітинного циклу після початку обробки (12). Якщо цей протокол дає негативні результати як з активацією, так і без неї, слід провести додатковий експеримент без активації з постійною дією речовини до того, як культури візьмуть на зразок через проміжок часу, еквівалентний приблизно 1,5 тривалості нормального клітинного циклу. Певні хімічні речовини можуть з більшою готовністю виявлятися за час обробки/взяття на зразок більший, ніж 1,5 тривалості циклу. Негативні результати з метаболічною активацією необхідно підтверджувати в окремих випадках. У випадках, коли підтвердження негативних результатів не вважається необхідним, потрібно навести обґрунтування.

1.4.3.4. Підготовка хромосом

Клітинні культури піддають дії колцеміду(R) або колхіцину, зазвичай, за час від однієї до трьох годин до збору. Кожну клітинну культуру збирають і обробляють окремо для підготовки хромосом. Підготовка хромосом включає в себе гіпотонічну обробку клітин, фіксацію та зафарбовування.

1.4.3.5. Аналіз

Всі мікроскопічні препарати, включаючи препарати позитивної та негативної контрольних груп, повинні отримати незалежний код перед мікроскопічним аналізом. Оскільки процедури фіксації часто призводять до розриву метафазних клітин із втратою хромосом, оцінені клітини мають таким чином містити кількість центромерів, рівну модальному числу +- 2 для всіх типів клітин. Щонайменше 200 метафаз, що добре розрослися, мають оцінюватися щодо концентрації і контролю, рівномірно розподілених серед подвійних культур, якщо вони застосовуються. Їх кількість можна зменшити, якщо спостерігається велика кількість аберацій.

Хоча метою тесту є виявлення структурних хромосомних аберацій, важливо фіксувати випадки поліплоїдії та ендоредуплікації, якщо вони мають місце.

2. ДАНІ

2.1. ОБРОБКА РЕЗУЛЬТАТІВ

Експериментальною одиницею є клітина, тому потрібно оцінювати кількість клітин зі структурними хромосомними абераціями. Різні типи структурних хромосомних аберацій потрібно заносити в список разом з їх кількістю і частотою для експериментальних і контрольних культур. Гепи фіксуються окремо і про них повідомляють, проте, зазвичай не включають в загальну частоту аберацій.

Паралельні критерії цитотоксичності для всіх піддослідних експериментальних і негативних контрольних культур в основних експериментах з аберації також мають фіксуватися.

Потрібні індивідуальні дані. Також всі дані мають бути підсумовані у формі таблиці.

Немає вимог до перевірки чіткої позитивної реакції. Сумнівні результати повинні перевірятися за допомогою подальших досліджень, переважно з використанням модифікації експериментальних умов. Потреба у підтвердженні негативних результатів обговорювалася в пункті 1.4.3.3. Модифікація параметрів дослідження з метою розширення діапазону оцінюваних умов буде розглядатися в подальших експериментах. Параметри дослідження, що можуть бути модифіковані, включають в себе просторовий розподіл концентрації та умови метаболічної активації.

2.2. ОЦІНКА ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

Є кілька критеріїв для визначення позитивного результату, такі як збільшення, пов'язане з концентрацією, або відтворюване збільшення кількості клітин з хромосомними абераціями. Перш за все необхідно враховувати біологічну релевантність результатів. Можливе використання статистичних методів в якості допоміжних при оцінюванні результатів дослідження (3)(13). Статистична значимість не має бути єдиним фактором, що визначає позитивну реакцію.

Зростання кількості поліплоїдних клітин може означати, що досліджувана речовина має потенціал для пригнічення мітотичних процесів та провокування кількісних хромосомних аберацій. Зростання кількості клітин з ендоредуплікованими хромосомами може означати, що досліджувана речовина має потенціал для пригнічення розвитку клітинного циклу (17)(18).

Досліджувана речовина, результати якої не відповідають вищезазначеним критеріям, вважається не мутагенною в цій системі.

Хоча більшість експериментів дає чітко позитивні або негативні результати, в поодиноких випадках сукупність даних виключає можливість визначеного судження про активність досліджуваної речовини. Результати можуть залишатись сумнівними або проблематичними, не зважаючи на кількість повторень експерименту.

Позитивні результати тесту in vitro на хромосомну аберацію означають, що досліджувана речовина викликає структурні хромосомні аберації у культивованих соматичних клітинах ссавців. Негативні результати означають, що в умовах дослідження досліджувана речовина не викликає структурних хромосомних аберацій у культивованих соматичних клітинах ссавців.

3. ЗВІТНІСТЬ

ЗВІТ ПРО ПРОВЕДЕННЯ ТЕСТУ

Звіт про проведення тесту має містити наступну інформацію:

Розчинник/середовище:

- обґрунтування для вибору розчинника.

- розчинність та стабільність досліджуваної речовини в розчиннику/середовищі, якщо це відомо.

Клітини:

- тип і джерело клітин,

- характеристики каріотипу та придатність використаного типу клітин,

- можливу відсутність мікоплазми,

- інформація щодо тривалості клітинного циклу,

- стать донорів крові, цільна кров або відокремлені лімфоцити, використаний міоген,

- можливу кількість пасажів,

- метод збереження культури клітин, у випадку застосування,

- модальну кількість хромосом.

Умови проведення тесту:

- ідентичність речовини, що спричиняє блокування метафази, її концентрація та тривалість піддавання клітини впливу,

- обґрунтування для вибору концентрацій і кількості культур, включаючи, наприклад, дані про цитотоксичність та обмеження щодо розчинності, у випадку застосування,

- склад середовища, можлива концентрація CO , 2

- концентрація досліджуваної речовини,

- об'єм середовища і доданої досліджуваної речовини,

- температура вирощування,

- час вирощування,

- тривалість дії речовини,

- можлива щільність клітин при висіванні,

- тип і склад системи метаболічної активації, включаючи прийнятності,

- позитивні та негативні контрольні групи,

- методи підготовки мікроскопічних препаратів,

- критерії для оцінки аберацій,

- проаналізована кількість метафаз,

- методи вимірювання токсичності,

- критерії віднесення дослідження до позитивного, негативного, або сумнівного розряду.

Результати:

- ознаки токсичності, наприклад, ступінь щільності, дані про клітинний цикл, кількість клітин, мітотичний індекс,

- ознаки преципітації,

- дані про pH та осмотичний тиск досліджуваного середовища, якщо визначені,

- визначення аберацій, включаючи гепи,

- кількість клітин з хромосомними абераціями і типи хромосомних аберацій, наведені окремо для кожної досліджуваної і контрольної культури,

- зміни в плоїдності, якщо вони помітні,

- співвідношення дози і реакції, де можливо,

- статистичний аналіз, якщо він має місце,

- паралельні дані позитивних та негативних контрольних груп (розчинник або середовище),

- історично встановлені дані позитивних та негативних контрольних груп (розчинник або середовище), з діапазонами, середніми величинами та стандартними відхиленнями.

Обговорення результатів.

Висновки

4. ПОСИЛАННЯ

(1) Evans, H.J., (1976) Cytological Methods for Detecting Chemical Mutagens. В: Chemical mutagens, Principles and Methods for their Detection, Vol. 4, Hollaender, A. (ed) Plenum Press, New York and London, p. 1-29.

(2) Ishidate, M.Jr. and Sofuni, T., (1985). TheIn VitroChromosomal Aberration Test Using Chinese Hamster Lung (CHL) Fibroblast Cells in Culture. В: Progress in Mutation Research, Vol. 5, Ashby, J. et al., (Eds) Elsevier Science Publishers, Amsterdam-New York-Oxford, p. 427-432.

(3) Galloway, S.M., Armstrong, M.J., Reuben, C., Colman, S., Brown, B., Cannon, C., Bloom, A.D., Nakamura, F., Ahmed, M., Duk, S., Rimpo, J., Margolin, G.H., Resnick, MA, Anderson, G. and Zeiger, E., (1978). Chromosome aberration and sister chromatic exchanges in Chinese hamster ovary cells: Evaluation of 108 chemicals. Environs. Molec. Mutagen 10 (suppl. 10), p. 1-175.

(4) Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M.Jr., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B.C., (1991) Genotoxicity under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9. Mutation Res, 257, p. 147-204.

(5) Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. and Okumura, K., (1992). Clastogenicity of low pH to Various Cultured Mammalian Cells. Mutation Res., 268, p. 297-305.

(6) Ames, B.N., McCann, J. and Yamasaki, E., (1975). Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, p. 347-364.

(7) Maron, D.M. and Ames, B.N., (1983) Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, p. 173-215.

(8) Natarajan, A.T., Tates, A.D., van Buul, P.P.W., Meijers, M. and de Vogel, N., (1976) Cytogenetic Effects of Mutagen/Carcinogens after Activation in a Microsomal System in Vitro, I. Induction of Chromosome Aberrations and Sister Chromatid Exchange by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes. Mutation Res., 37, p. 83-90.

(9) Matsuoka, A., Hayashi, M. and Ishidate, M. Jr., (1979) Chromosomal Aberration Tests on 29 Chemicals Combined with S9 Mix In Vitro. Mutation Res., 66, p. 277-290.

(10) Elliot, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C., (1992). Report of UK Environmental Mutagen Society Working Party. Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in In Vitro Genotoxicity Assays. Mutagenesis, 7, p. 175-177.

(11) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T., (1976) A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems. В: de Serres, F.J., Fouts, J.R., Bend, J.R. and Philpot, R.M. (eds) In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, North-Holland, p. 85-88.

(12) Galloway, S.M., Aardema, M.J., Ishidate, M.Jr., Ivett, J.L., Kirkland, D.J., Morita, T., Mosesso, P., Sofuni, T., (1994) Report from Working Group on in In Vitro Tests for Chromosomal Aberrations. Mutation Res., 312, p. 241-261.

(13) Richardson, C., Williams, D.A., Allen, J.A., Amphlett, G., Chanter, D.O. and Phillips, B., (1989) Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays. В: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. Kirkland, D.J., (ed) Cambridge University Press, Cambridge, p. 141-154.

(14) Soper, K.A. and Galloway, S.M., (1994) Replicate Flasks are not Necessary for In Vitro Chromosome Aberration Assays in CHO Cells. Mutation Res., 312, p. 139-149.

(15) Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T., (1982) CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids. В: Tice, R.R., Costa, D.L., Schaich, K.M. (eds). Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, p. 91-103.

(16) Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L., (1983) Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay. Environmental Mutagenesis, 5, p. 795-801.

(17) Locke-Huhle, C., (1983) Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation induced G2 arrest. Mutation Res., 119, p. 403-413.

(18) Huang, Y., Change, C. and Trosko, J.E., (1983) Aphidicolin-induced endoreduplication in Chinese hamster cells. Cancer Res., 43, p. 1362-1364.

B.11. МУТАГЕННІСТЬ - ТЕСТ IN VIVO НА ХРОМОСОМНУ АБЕРАЦІЮ КІСТКОВОГО МОЗКУ ССАВЦІВ

1. МЕТОД

Цей метод відтворює метод, описаний у ТІ ОЕСР 475, Тест на Хромосомну Аберацію Кісткового Мозку Ссавців (1997).

1.1. ВСТУП

Тест на Хромосомну Аберацію Кісткового Мозоку Ссавців використовується для виявлення структурних хромосомних аберацій, викликаних досліджуваною речовиною у клітинах кісткового мозку тварин, зазвичай гризунів (1)(2)(3)(4). Структурні хромосомні аберації можуть бути двох типів: хромосомні або хроматидні. Підвищення поліплоїдії може означати, що хімічна речовина має потенціал для провокування численних аберацій. При використанні більшості хімічних мутагенів спровоковані аберації належать до хроматидного типу, але трапляються також аберації хромосомного типу. Хромосомні мутації та пов'язані з ними явища є причиною багатьох генетичних хвороб людини і є суттєві докази того, що хромосомні мутації та пов'язані з ними явища, що спричиняють зміни в онкогенах і генах-суппрессорах, беруть участь у провокуванні раку у людини і в піддослідних системах.

Зазвичай для проведення цього тесту використовуються гризуни. Кістковий мозок є цільовою тканиною в цьому випробуванні, так як це високо васкуляризована тканина, що містить популяцію клітин зі швидким циклом розвитку, які можна одразу відокремити та використати. Інші біологічні види та цільові тканини не є предметом даного методу.

Цей тест на хромосомну аберацію є особливо доцільним для оцінки мутагенної загрози, оскільки він дає змогу розглянути фактори метаболізму in vivo, фармакокінетику та процеси репарації ДНК, хоча вони можуть змінюватися в залежності від біологічного виду і тканини. Тестування in vivo також корисне для подальших досліджень мутагенного впливу, визначеного за допомогою тестування in vitro.

Якщо є докази того, що досліджувана речовина або реактивні метаболіти не досягнуть цільової тканини, проведення цього тестування не є доцільним.

Дивіться також Загальний вступ, Частину B.

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ

Геп: ахроматичне ушкодження, менше за ширину хроматиди, та з мінімальним порушенням орієнтації хроматид).

Структурна аберація: зміна в структурі хромосом, що визначається при мікроскопічному дослідженні метафазної стадії поділу клітини, яка спостерігається у вигляді делецій і фрагментів, внутрішнього або взаємного обміну.

1.3. ПРИНЦИП МЕТОДУ ТЕСТУВАННЯ

Тварин піддають впливу досліджуваної речовини, використовуючи відповідний шлях введення, і знищують у зазначений час після втручання. Перш ніж знищити, тварин піддають дії речовин, що спричиняють блокування метафази (наприклад, колцеміду(R) або колхіцину). Потім виготовляють хромосомні препарати з кісткового мозку тварин і зафарбовують їх, і метафазні клітини аналізують на предмет хромосомних аберацій.

1.4. ОПИС МЕТОДУ ТЕСТУВАННЯ

1.4.1. Підготовка

1.4.1.1. Вибір біологічних видів тварин

Зазвичай використовують щурів, мишей та китайських хом'яків, хоча можливе також використання інших придатних видів ссавців. Слід залучити для випробувань лабораторні лінії здорових молодих дорослих тварин, що зазвичай використовуються. На початку дослідження коливання ваги тварин має бути мінімальним і не перевищувати +- 20% від середньої ваги для кожної статі.

1.4.1.2. Умови утримання і годування

Застосовуються загальні умови викладені у Загальному вступі, Частині B, проте, оптимальним показником вологості є 50-60%.

1.4.1.3. Підготовка тварин

Здорових молодих дорослих тварин призначають в піддослідну групу із застосуванням методу випадкового відбору. Клітки повинні розташовуватись таким чином, щоб мінімізувати можливі впливи їх місця розташування. Тварини ідентифікуються окремо. Тварин пристосовують до лабораторних умов протягом щонайменше п'яти днів.

1.4.1.4. Підготовка доз

Тверді досліджувані речовини слід розчинити або усунути за допомогою відповідного розчинника або середовища і розбавити, якщо це є доцільним, перед обробкою клітин. Рідкі досліджувані речовини можна ввести безпосередньо або розбавити перед введенням. Слід застосовувати свіжі препарати досліджуваної речовини, якщо тільки дані щодо стабільності не виявляють прийнятності до зберігання.

1.4.2. Умови тестування:

1.4.2.1. Розчинник/середовище:

Розчинник/середовище не має спричиняти токсичних впливів при використаному рівні дозування, а також не має бути підозри на хімічну реакцію розчинника/середовища з досліджуваною речовиною. Якщо використовується не добре відомий розчинник/середовище, їх включення має підтверджуватись даними, що доводять їхню сумісність. Рекомендується там, де можливо, використовувати спочатку водний розчинник/середовище.

1.4.2.2. Контрольні групи

Паралельні позитивні та негативні контрольні групи (з використанням розчинника або середовища) мають входити до складу групи кожної статі при випробуванні проведенні кожного тестування. За винятком введення досліджуваної речовини, за тваринами в контрольній групі доглядають так само, як і за тваринами піддослідних груп.

Позитивні контрольні групи дають структурні аберації in vivo при рівнях дозування, при яких очікувалося зростання по відношенню до вихідних даних, яке можна виявити. Концентрації для позитивних контрольних груп потрібно обирати таким чином, щоб впливи чітко проявлялися, проте, щоб ідентичність кодованих мікроскопічних препаратів не одразу виявлялася пристроєм для зчитування. Можливим є варіант введення речовини позитивній контрольній групі іншим шляхом, ніж вводилася досліджувана речовина, потім зразок береться тільки один раз. За наявності, може розглядатись застосування хімічної речовини, що використовується для позитивного контролю з огляду на клас, якщо є доступним. До речовин для позитивного контролю належать:

------------------------------------------------------------------
|            Речовина           |  Номер РСХ   |  Номер ЄРІКХР   |
|-------------------------------+--------------+-----------------|
|Етилметансульфонат             |    62-50-0   |    200-536-7    |
|-------------------------------+--------------+-----------------|
|Етилннитрозосечовина           |   759-73-9   |    212-072-2    |
|-------------------------------+--------------+-----------------|
|Мітоміцин C                    |    50-07-7   |    200-008-6    |
|-------------------------------+--------------+-----------------|
|Циклофосфамід                  |    50-18-0   |    200-015-4    |
|Циклофосфаміду моногідрат      |  6055-19-2   |                 |
|-------------------------------+--------------+-----------------|
|Триетилнемеламін               |    51-18-3   |    200-083-5    |
------------------------------------------------------------------

Негативні контрольні групи, яким вводиться тільки розчинник або середовище, а в інших випадках вводяться ті ж речовини, що і досліджуваним групам, мають включатися до кожного часу відбору проб, якщо тільки не є прийнятною міжтваринна варіабельність, і концентрація клітин з хромосомними абераціями доступна завдяки історично встановленим даним з контролю. Якщо зразки у негативних контрольних груп беруться один раз, найкращим часом є перший час відбору проб. Окрім того, контрольні групи, що не піддавалися впливу досліджуваної речовини, теж повинні використовуватись, якщо немає історично встановлених або опублікованих даних з контролю, що показують відсутність шкідливих та мутагенних впливів обраного розчинника.

1.5. ПРОЦЕДУРА

1.5.1. Кількість і стать тварин

Кожна піддослідна і контрольна група має включати щонайменше п'ять придатних для аналізу тварин кожної статі. Якщо на час дослідження наявні дані інших досліджень на таких самих видах з використанням такого самого шляху введення, що демонструють відсутність суттєвої різниці у токсичності, пов'язаної зі статтю тварин, буде достатньо проведення дослідження на одній статі. Якщо вплив хімічних речовин на людину може залежати від статі, як наприклад для деяких фармацевтичних засобів, дослідження слід проводити на тваринах відповідної статі.

1.5.2. Графік введення

Досліджувані речовини переважно вводяться за один раз. Досліджувані речовини можуть також вводитися розділеною дозою, тобто робиться два введення у той самий день з перервою не більше ніж у кілька годин для полегшення введення великого об'єму речовини. Інший графік введення має бути науково обґрунтованим.

Зразки потрібно брати за два рази, окремо, після введення, протягом одного дня. Для гризунів перший інтервал забору зразків становить 1,5 тривалості нормального клітинного циклу (останній зазвичай триває 12-18 годин) після введення речовини. Оскільки час, необхідний для поглинання та метаболізму досліджуваної речовини, а також її впливу на кінетику клітинного циклу, може впливати на оптимальний час виявлення хромосомних аберацій, рекомендується зібрати зразки пізніше, через 24 години після першого збору зразків. Якщо використовується режим введення дози розрахований на більш ніж один день, слід використовувати один час забору зразка через 1,5 тривалості нормального клітинного циклу.

Перед знищенням тваринам вколюється інтраперитонально відповідна доза речовини, що спричиняє блокування метафази (наприклад, колцеміду(R) або колхіцину). Після того зразки з тварин беруться через відповідні інтервали часу. Для мишей цей інтервал складає приблизно від трьох до п'яти годин, для китайських хом'яків - від чотирьох до п'яти годин. З кісткового мозку збирають клітини і аналізують на предмет хромосомних аберацій.

1.5.3. Рівень дозування

Якщо дальнометричне дослідження проводиться тому, що немає наявних відповідних даних, воно має проводитися в тій самій лабораторії з використанням тих самих біологічних видів, ліній, статі та режиму введення, що використовувались в основному дослідженні (5). Якщо проявляється токсичність, для першого часу забору зразка використовується три рівні дозування. Ці рівні дозування повинні покривати діапазон від максимальної до незначної токсичності або її відсутності. При подальшому заборі зразків потрібно використовувати лише найвищу дозу. Найвища доза визначається як доза, за якої з'являються такі ознаки токсичності, які при вищих рівнях дозування з дотриманням того самого режиму можуть спричиняти смерть. Речовини зі специфічними видами біологічної активності при низьких нетоксичних дозах (такі, як гормони та мітогени) можуть бути винятками для критеріїв встановлення дозування і мають оцінюватись в окремих випадках. Найвища доза може також визначатися як доза, за якої з'являються деякі показники токсичності у кістковому мозку (наприклад, зменшення мітотичного індексу більш ніж на 50%).

1.5.4. Тестування на граничний вміст

Якщо випробування на одному рівні дозування, який становить щонайменше 2000 мг/кг маси тіла з використанням введення за один раз, або двох введень у той же день, не спричиняє видимих токсичних впливів, і якщо генотоксичність не передбачається з огляду на дані щодо структурно подібних речовин, то можливо, не виникне необхідності в проведенні повного дослідження з використанням трьох рівнів дозування. Для більш довготривалих досліджень гранична доза становитиме 2000 мг/кг маса тіла/день для введення речовини тривалістю до 14 днів, та 2000 мг/кг маса тіла/день для введення речовини тривалістю довше 14 днів. Очікуваний вплив на людину може визначати потребу в використанні вищого рівня дозування під час тестування на граничний вміст.

1.5.5. Призначення доз

Досліджувана речовина, зазвичай, вводиться з їжею, використовуючи зонд для штучного харчування або відповідну інтубаційну трубку, або шляхом інтраперитонеальної ін'єкції. Інші шляхи введення можуть використовуватися, якщо вони є обґрунтованими. Максимальний об'єм рідини, що вводиться за один раз з їжею або ін'єкцією, залежить від розміру піддослідної тварини. Об'єм не має перевищувати 2 мл/100 г маси тіла. Використання об'ємів, більших за ці, має бути обґрунтованим. За винятком подразнюючих чи роз'їдаючих речовин, які зазвичай проявляють ускладнені впливи при більшій концентрації, варіативність досліджуваного об'єму потрібно мінімізувати шляхом пристосування концентрації до забезпечення постійного об'єму на всіх рівнях дозування.

1.5.6. Підготовка хромосом

Відразу після знищення тварини береться кістковий мозок, піддається впливу гіпотонічного розчину і фіксується. Потім клітини розподіляються по поверхні мікроскопічних препаратів і зафарбовуються.

1.5.7. Аналіз

Мітотичний індекс слід визначати як міру цититоксичності щонайменше на 1000 клітин на тварину для всіх піддослідних тварин (включаючи позитивні контрольні групи) та тварин з негативних контрольних групп, яких не піддають впливу речовини.

Потрібно проаналізувати щонайменше 100 клітин кожної тварини. Їх кількість можна зменшити, якщо спостерігається велика кількість аберацій. Всі мікроскопічні препарати, включаючи препарати позитивної та негативної контрольних груп, повинні отримати незалежний код перед мікроскопічним аналізом. Оскільки процедури приготування мікроскопічних препаратів часто призводять до розриву метафаз із втратою хромосом, оцінені клітини мають таким чином містити кількість центромерів, що дорівнює кількості 2n +- 2.

2. ДАНІ

2.1. ОБРОБКА РЕЗУЛЬТАТІВ

Індивідуальні дані тварин мають бути представлені у формі таблиці. Експериментальною одиницею є тварина. Щодо кожної тварини потрібно визначити кількість оцінених клітин, кількість аберацій на одну клітину та кількість клітин зі структурними хромосомними абераціями. Різні типи структурних хромосомних аберацій потрібно заносити в список разом з їх кількістю і частотою для груп, які піддають дії речовини, і контрольних груп. Гепи фіксуються окремо і про них повідомляють, проте, зазвичай не включають до загальної частоти аберацій. Якщо немає доказів підтвердження різниці реакції в залежності від статі, для статистичного аналізу можливе об'єднання даних щодо обох статей.

2.2. ОЦІНКА ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

Є кілька критеріїв для визначення позитивного результату, оскільки збільшення кількості клітин з хромосомними абераціями, пов'язане з дозуванням, або чітке збільшення кількості клітин з абераціями у групі, якій вводилася єдина доза при одноразовому заборі зразків. Перш за все необхідно враховувати біологічну релевантність результатів. Можливе використання статистичних методів в якості допоміжних при оцінюванні результатів тестування (6). Статистична значимість не має бути єдиним фактором, що визначає позитивну реакцію. Сумнівні результати мають перевірятися за допомогою подальших досліджень, переважно з використанням модифікації експериментальних умов.

Підвищення поліплоїдії може означати, що досліджувана речовина має потенціал для провокування кількісних хромосомних аберацій. Збільшення ендоредуплікацій може означати, що досліджувана речовина має потенціал для пригнічення розвитку клітинного циклу (7)(8).

Досліджувана речовина, результати якої не відповідають вищезазначеним критеріям, вважається не мутагенною в цьому тестуванні.

Хоча більшість експериментів дає чітко позитивні або негативні результати, в поодиноких випадках сукупність даних виключає можливість визначеного судження про активність досліджуваної речовини. Результати можуть залишатись сумнівними або дискутивними, не зважаючи на кількість проведених експериментів.

Позитивні результати тесту in vivo на хромосомну аберацію означають, що досліджувана речовина викликає хромосомні аберації у кістковому мозку досліджуваних біологічних видів. Негативні результати означають, що за досліджуваних умов досліджувана речовина не викликає структурних хромосомних аберацій у кістковому мозку досліджуваних біологічних видів.

Імовірність того, що досліджувана речовина або її метаболіти досягнуть загального кровообігу або, особливо, цільової тканини (наприклад, системна токсичність), підлягають обговоренню.

3. ЗВІТНІСТЬ

3.1. ЗВІТ ПРО ПРОВЕДЕННЯ ТЕСТУ

Звіт про проведення тесту має містити наступну інформацію:

Розчинник/середовище:

- обґрунтування для вибору розчинника.

- розчинність та стабільність досліджуваної речовини в розчиннику/середовищі, якщо це відомо.

Піддослідні тварини:

- біологічні види/лінії тварин, що використовуються,

- кількість, вік і стать тварин

- походження, умови утримання, дієта, і т.д.

- вага кожної тварини на початку тестування, включаючи діапазон ваги тіла, середні та стандартні відхилення для кожної групи,

Умови тестування:

- позитивні та негативні контрольні групи (з використанням розчинника або середовища),

- дані досліджень з виявлення діапазону, якщо вони проводилися,

- обґрунтування вибору рівня дозування,

- докладна інформація щодо приготування досліджуваної речовини,

- докладна інформація застосування досліджуваної речовини,

- обґрунтування вибору маршруту введення,

- методи перевірки того, що досліджувана речовина досягла загального кровообігу або цільової тканини, у випадку застосування,

- перехід від концентрації досліджуваної речовини у їжі/питній воді (в мільйонних долях) до поточної дози (мг/кг маса тіла/день), у випадку застосування,

- докладна інформація щодо якості їжі і води,

- детальний опис введення речовини та графіки забору зразків,

- методи вимірювання токсичності,

- ідентичність речовини, що спричиняє блокування метафази, її концентрація та тривалість введення,

- методи підготовки мікроскопічних препаратів,

- критерії для оцінки аберацій,

- кількість проаналізованих клітин на одну тварину,

- критерії віднесення дослідження до позитивного, негативного, або сумнівного розряду.

Результати:

- ознаки токсичності,

- мітотичний індекс,

- тип і кількість аберацій, наведені окремо для кожної тварини,

- загальна кількість аберацій у групі з середніми показниками та стандартними відхиленнями,

- загальна кількість клітин з абераціями у групі з середніми показниками та стандартними відхиленнями,

- зміни в плоїдності, якщо вони помітні,

- співвідношення дози і реакції, де можливо,

- статистичний аналіз, якщо він має місце,

- дані паралельних негативних контрольних групп,

- історично встановлені дані негативних контрольних груп з діапазонами, середніми показниками та стандартними відхиленнями,

- дані паралельних позитивних контрольних груп.

Обговорення результатів.

Висновки.

4. ПОСИЛАННЯ

(1) Adler, I.D., (1984) Cytogenetic Tests in Mammals. В: Mutagenicity Testing: a Practical Approach. S.Venitt and J.M.Parry (Eds). IRL Press, Oxford, Washington D.C., p. 275-306.

(2) Preston, R.J., Dean, B.J., Galloway, S., Holden, H., McFee, A.F. and Shelby, M. (1987). Mammalian In Vivo Cytogenetic Assays: Analysis of Chromosome Aberrations in Bone Marrow Cells. Mutation Res., 189, p. 157-165.

(3) Richold, M., Chandley, A., Ashby, J., Gatehouse, D.G., Bootman, J. and Henderson, L., (1990) In Vivo Cytogenetic Assays. В: D.J. Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, p. 115-141.

(4) Tice, R.R., Hayashi, M., MacGregor, J.T., Anderson, D., Blakey, D.H., Holden, H.E., Kirsch-Volders, M., Oleson Jr., F.B., Pacchierotti, F., Preston, R.J., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S. and Vannier, B., (1994) Report from the Working Group on the In Vivo Mammalian Bone Marrow Chromosomal Aberration Test. Mutation Res., 312, p. 305-312.

(5) Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis, A.R., Botham, P.A., Doe, J., Esdaile, D.J., Gatehouse, D.G., Hodson-Walker, G., Morton, D.B., Kirkland, D.J. and Richold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose setting in In vivo Mutagenicity Assays. Mutagenesis, 7, p. 313-319.

(6) Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G. and Savage, J.R.K. (1989). Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays. В: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report Part III. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. D.J. Kirkland, (Ed.) Cambridge University Press, Cambridge. p. 184-232.

(7) Locke-Huhle, C., (1983) Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation induced G2 arrest. Mutation Res. 119, с. 403-413.

(8) Huang, Y., Change, C. and Trosko, J.E., (1983) Aphidicolin-induced endoreduplication in Chinese hamster cells. Cancer Res., 43, p. 1362-1364.

B.12. МУТАГЕННІСТЬ - МІКРОЯДЕРНИЙ ТЕСТ IN VIVO НА ЕРИТРОЦИТАХ ССАВЦІВ

1. МЕТОД

Цей метод відтворює метод, описаний у ТІ ОЄСР 474, Мікроядерний Тест на Еритроцитах Ссавців (1997).

1.1. ВСТУП

Мікроядерний тест in vivo на еритроцитах ссавців використовується для виявлення пошкоджень хромосом веретена поділу еритробластів, спричинених досліджуваною речовиною, шляхом аналізу еритроцитів, взятих з кісткового мозку та/або клітин периферичної кровоносної системи тварин, зазвичай гризунів.

Метою мікроядерного тесту є визначення речовин, що спричиняють цитогенетичні пошкодження, результатом яких є формування мікроядер, які містять уповільнені фрагменти хромосом або цілі хромосоми.

Якщо еритробласт кісткового мозку розвивається в поліхромний еритроцит, головне ядро виштовхується; будь-яке мікроядро, що сформувалося, може залишитись в іншій без'ядерній цитоплазмі. Візуалізація мікроядер в цих клітинах полегшена через відсутність у них головного ядра. Збільшення концентрації мікроядерних поліхромних еритроцитів у піддослідних тварин є показником індукованих хромосомних пошкоджень.

Зазвичай для цього тесту використовується кістковий мозок гризунів, оскільки поліхромні еритроцити виробляються у цій тканині. Вимірювання мікроядерних незрілих (поліхромних) еритроцитів у периферичній крові є однаково прийнятним для будь-якого біологічного виду, в межах якого проявилася нездатність селезінки видаляти мікроядерні еритроцити або адекватна чутливість для виявлення речовин, що спричиняють кількісні хромосомні аберації. Мікроядра можна вирізнити за допомогою кількох критеріїв. Вони включають визначення присутності чи відсутності кінетохорної або центромірної ДНК в мікроядрах. Концентрація мікроядерних незрілих (поліхромних) еритроцитів є основною кінцевою точкою. Кількість зрілих (нормохромних) еритроцитів в периферичній крові, що містить мікроядра у заданій кількості зрілих еритроцитів, може також використовуватись, як кінцева точка аналізу, якщо тварин постійно піддають дії речовини впродовж чотирьох тижнів або довше.

Цей мікроядерний тест in vivo на еритроцитах ссавців має особливе значення для оцінки мутагенної загрози, оскільки він дає змогу розглянути фактори метаболізму in vivo, фармакокінетику та процеси репарації ДНК, хоча вони можуть змінюватися в залежності від біологічного виду, тканини та генетичних кінцевих точок. Аналіз in vivo також є корисним для подальших досліджень мутагенного впливу, визначеного за допомогою системи in vitro.

Якщо є докази того, що досліджувана речовина або реактивні метаболіти не досягнуть цільової тканини, застосування цього тесту не є доцільним.

Дивіться також Загальний вступ, Частину B.

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ

Центромер (Кінетохор): зона(и) хромосоми, яка(і) з'єднує волокна мітотичного веретена під час поділу клітин, надаючи змогу дочірнім хромосомам впорядковано рухатись до полюсів дочірніх клітин.

Мікроядра: маленькі ядра, відділені від головних ядер клітин і додаткові до них, що утворюються під час телофази мітозу (мейозу) шляхом уповільнення фрагментів хромосом або цілих хромосом.

Нормохромний еритроцит: зрілий еритроцит, якому не вистачає рибосом; його можна відрізнити від незрілих, поліхромних еритроцитів за плямами, що сприяють виділенню рибосом.

Поліхромний еритроцит: незрілий еритроцит, в проміжній стадії розвитку, який все ще містить рибосоми і його можна відрізнити від зрілих, нормохромних еритроцитів за плямами, що сприяють виділенню рибосом.

1.3. ПРИНЦИП МЕТОДУ ТЕСТУВАННЯ

Тварин піддають впливу досліджуваної речовини, використовуючи відповідний шлях введення. Якщо використовується кістковий мозок, тварин знищують у зазначений час після втручання, кістковий мозок витягується, препарати готуються і зафарбовуються (1)(2)(3)(4)(5)(6)(7). Якщо використовується периферична кров, кров беруть у зазначений час після піддавання дії речовини, готують і зафарбовують мазкові препарати (4)(8)(9)(10). Для досліджень з використанням периферичної крові між останнім введенням речовини і збором клітин має пройти якомога менше часу. Препарати аналізують з метою виявлення присутності мікроядер.

1.4. ОПИС МЕТОДУ ТЕСТУВАННЯ

1.4.1. Підготовка

1.4.1.1. Вибір біологічних видів тварин

Якщо використовується кістковий мозок, дослідження рекомендується проводити на мишах або щурах, хоча можливе також використання інших придатних видів ссавців. Якщо використовується периферична кров, дослідження рекомендується проводити на мишах. Проте, можливе використання будь-яких придатних біологічних видів ссавців, у яких проявилася нездатність селезінки видаляти мікроядерні еритроцити або адекватна чутливість для виявлення речовин, що спричиняють кількісні хромосомні аберації. Слід залучити до тестування лабораторні лінії здорових молодих тварин, що зазвичай використовуються. На початку дослідження коливання ваги тварин має бути мінімальною і не перевищувати +- 20% від середньої ваги для кожної статі.

1.4.1.2. Умови утримання і годування

1.4.1.3. Підготовка тварин

Здорових молодих дорослих тварин навмання призначають в піддослідну групу. Тварини ідентифікуються окремо. Тварин пристосовують до лабораторних умов протягом щонайменше п'яти днів. Клітки повинні розташовуватись таким чином, щоб мінімізувати можливі впливи їх місця розташування.

1.4.1.4. Підготовка доз

Тверді досліджувані речовини слід розчинити або усунути за допомогою відповідного розчинника або середовища і розбавити, якщо це є доцільним, перед обробкою клітин. Рідкі досліджувані речовини можна ввести безпосередньо або розбавити перед введенням. Слід застосовувати свіжі препарати досліджуваної речовини, якщо тільки дані щодо стабільності не виявляють прийнятності зберігання.

1.4.2. Умови тестування:

1.4.2.1. Розчинник/середовище:

Розчинник/середовище не мають спричиняти токсичних впливів при використаному рівні дозування, а також не має бути підозри на хімічну реакцію розчинника/середовища з досліджуваною речовиною. Якщо використовується не добре відомий розчинник/середовище, їх включення повинне підтверджуватись посиланнями, що доводять їхню сумісність. Рекомендується там, де можливо, використовувати спочатку водний розчинник/середовище.

1.4.2.2. Контрольні групи

Паралельні позитивні та негативні контрольні групи (з використанням розчинника або середовища) мають входити до складу групи кожної статі при кожному тестуванні. За вийнятком введення досліджуваної речовини, за тваринами в контрольній групі доглядають так само, як і за тваринами піддослідних груп.

Позитивні контрольні групи утворюють мікроядра in vivo при рівнях дозування, при яких очікувалося зростання по відношенню до вихідних даних, яке можна виявити. Концентрації для позитивних контрольних груп слід обирати таким чином, щоб впливи чітко проявлялися, проте, щоб ідентичність кодованих мікроскопічних препаратів не одразу виявлялася пристроєм для зчитування. Можливим є варіант введення речовини позитивній контрольній групі іншим шляхом, ніж вводилася досліджувана речовина, потім зразок береться тільки один раз. Окрім того, у випадку наявності може розглядатись застосування хімічної речовини, що використовується для позитивного контролю з огляду на клас. До речовин для позитивного контролю належать:

------------------------------------------------------------------
|            Речовина           |  Номер РСХ   |  Номер ЄРІКХР   |
|-------------------------------+--------------+-----------------|
|Етилметансульфонат             |    62-50-0   |    200-536-7    |
|-------------------------------+--------------+-----------------|
|N-Етил-N-нитрозосечовина       |   759-73-9   |    212-072-2    |
|-------------------------------+--------------+-----------------|
|Мітоміцин C                    |    50-07-7   |    200-008-6    |
|-------------------------------+--------------+-----------------|
|Циклофосфамід                  |    50-18-0   |    200-015-4    |
|Циклофосфаміду моногідрат      |  6055-19-2   |                 |
|-------------------------------+--------------+-----------------|
|Триетилнемеламін               |    51-18-3   |    200-083-5    |
------------------------------------------------------------------

Негативні контрольні групи, яким вводиться тільки розчинник або середовище, а в інших випадках вводяться ті ж речовини, що і досліджуваним групам, мають включатися до кожного часу відбору проб, якщо тільки не є прийнятною міжтваринна варіативність, і концентрація клітин з мікроядрами виявляється завдяки історично встановленим даним з контролю. Якщо зразки у негативних контрольних групп беруться один раз, найкращим часом є перший час відбору проб. Окрім того, контрольні групи, що не піддавалися впливу досліджуваної речовини, теж повинні використовуватись, якщо немає історично встановлених або опублікованих даних з контролю, що показують відсутність шкідливих та мутагенних впливів обраного розчинника.

Якщо використовується периферична кров, може також розглядатися варіант забору зразків перед введенням речовини у якості паралельного негативного контролю, але тільки для короткотривалих досліджень периферичної крові (наприклад, 1-3 введення), коли результати будуть у межах очікуваного згідно з історично встановленими даними з контролю діапазону.

1.5. ПРОЦЕДУРА

1.5.1. Кількість і стать тварин

Кожна піддослідна і контрольна група мають включати щонайменше п'ять придатних для аналізу тварин кожної статі (11). Якщо на час дослідження наявні дані інших досліджень на таких самих видах з використанням такого самого шляху введення, що демонструють відсутність суттєвої різниці у токсичності, пов'язаної зі статтю тварин, буде достатньо проведення тестування на одній статі. Якщо вплив хімічних речовин на людину може залежати від статі, як наприклад для деяких фармацевтичних засобів, випробування слід проводити на тваринах відповідної статі.

1.5.2. Графік введення

Немає рекомендацій щодо стандартного графіку введення речовини (тобто, 1, 2, чи більше введень впродовж 24 годин). Зразки з розширеного режиму введення дози приймаються до тих пір, поки не проявиться позитивний вплив для цього дослідження або, для негативного дослідження, до тих пір, поки не проявиться токсичність або не буде застосована гранична доза, і дозування не буде продовжене до часу збору зразків. Досліджувані речовини можуть також вводитися розділеною дозою, тобто робиться два введення у той самий день з перервою не більше ніж у кілька годин для полегшення введення великого об'єму речовини.

Проведення тесту можливе з використанням двох способів:

а) тваринам одноразово вводиться досліджувана речовина. Зразки кісткового мозку беруться щонайменше двічі, починаючи не раніше ніж через 24 години, але й не пізніше ніж 48 годин, після введення речовини з відповідними інтервалам між забором зразків. Забір зразків раніше ніж через 24 години після введення речовини має бути виправданим. Зразки периферичної крові беруться щонайменше двічі, починаючи не раніше ніж через 36 годин, але й не пізніше ніж 72 години, після введення речовини з відповідними інтервалам між забором зразків. Якщо позитивний результат отримано при одному заборі зразків, додатковий забір зразків непотрібен.

b) якщо речовина вводиться два чи більше разів на день (наприклад, два чи більше введення за 24-годинний проміжок часу), зразки слід брати один раз між 18 та 24 годинами після останнього введення для кісткового мозку та один раз між 36 та 48 годинами після останнього введення для периферичної крові (12); додатково можливе використання іншого часу для забору зразків, якщо це потрібно.

1.5.3. Рівень дозування

Якщо дальнометричне дослідження проводиться тому, що немає придатних наявних відповідних даних, воно має проводитися в тій самій лабораторії з використанням тих самих біологічних видів, ліній, статі та режиму введення, що використовувались у основному дослідженні (13). Якщо проявляється токсичність, для першого часу забору зразка використовується три рівні дозування. Ці рівні дозування повинні покривати діапазон від максимальної до незначної токсичності або її відсутності. При подальшому заборі зразків слід використовувати лише найвищу дозу. Найвища доза визначається як доза, за якої з'являються такі ознаки токсичності, які при вищих рівнях дозування з дотриманням того самого режиму можуть спричиняти смерть. Речовини зі специфічними видами біологічної активності при низьких нетоксичних дозах (такі, як гормони та мітогени) можуть бути винятками з критеріїв встановлення дозування і мають оцінюватись в окремих випадках. Найвища доза може також визначатися як доза, за якої з'являються деякі показники токсичності у кістковому мозку (наприклад, зменшення долі незрілих еритроцитів у загальній кількості еритроцитів кісткового мозку чи периферичної крові).

1.5.4. Тестування на граничний вміст

Якщо тестування на одному рівні дозування, який становить щонайменше 2000 мг/кг маси тіла з використанням введення за один раз, або двох введень у той же день, не спричиняє видимих токсичних впливів, і якщо генотоксичність не передбачається з огляду на дані щодо структурно подібних речовин, то можливо, не виникне необхідності в проведенні розгорнутого дослідження з використанням трьох рівнів дозування. Для більш довготривалих досліджень гранична доза становитиме 2000 мг/кг маса тіла/день для введення речовини тривалістю до 14 днів, та 2000 мг/кг маси тіла/день для введення речовини тривалістю довше 14 днів. Очікуваний вплив на людину може визначати потребу в використанні вищого рівня дозування під час тестування на граничний вміст.

1.5.5. Призначення доз

Досліджувана речовина, зазвичай, вводиться з їжею, використовуючи зонд для штучного харчування або відповідну інтубаційну трубку, або шляхом інтраперитонеальної ін'єкції. Інші шляхи введення можуть використовуватися, якщо вони є виправданими. Максимальний об'єм рідини, що вводиться за один раз з їжею або ін'єкцією, залежить від розміру піддослідної тварини. Об'єм не має перевищувати 2 мл/100 г маси тіла. Використання об'ємів, більших за ці, має бути виправданим. За винятком подразнюючих чи роз'їдаючих речовин, які зазвичай проявляють ускладнені впливи при більшій концентрації, варіативність досліджуваного об'єму потрібно мінімізувати шляхом пристосування концентрації до забезпечення постійного об'єму на всіх рівнях дозування.

1.5.6. Препарат кісткового мозку/крові

Клітини кісткового мозку, зазвичай, беруть зі стегна або великої берцової кістки одразу після знищення тварини. Як правило, клітини відокремлюються зі стегна або великої берцової кістки, препаруються і зафарбовуються згідно усталених методів. Периферичну кров беруть з хвостової вени або іншої придатної кровоносної судини. Клітини крові одразу зафарбовуються суправітально (8)(9)(10), або готуються мазкові препарати, а потім зафарбовуються. Використання специфічного зафарбовування ДНК (наприклад, акридин оранжевий (14) або хехст 33258 плюс піролін-Y (15)) може знищити деякі артефакти, пов'язані з використанням неспецифічного зафарбовування ДНК. Ця перевага не виключає використання стандартних видів зафарбовування (наприклад, за допомогою барвника Гімза). Додаткові системи (наприклад, целюлозні колонки для усування клітин з ядром (16)) також можуть використовуватись за умови, якщо про ці системи відомо, що вони адекватно використовуються для мікроядерного препарування в лабораторії.

1.5.7. Аналіз

Частка незрілих еритроцитів у загальній кількості еритроцитів (незрілих + зрілих) визначається для кожної тварини шляхом підрахунку суми щонайменше 200 еритроцитів для кісткового мозку або 1000 еритроцитів для периферичної крові (17). Всі мікроскопічні препарати, включаючи препарати позитивної та негативної контрольних груп, повинні отримати незалежний код перед мікроскопічним аналізом. Щонайменше 200 незрілих еритроцитів на одну тварину оцінюються з точки зору частки мікроядерних незрілих еритроцитів. Додаткову інформацію можна отримати шляхом оцінки зрілих еритроцитів на вміст мікроядер. При аналізі мікроскопічних препаратів частка незрілих еритроцитів у загальній кількості еритроцитів має становити не менше 20% від контрольного значення. Якщо тварин постійно піддають дії речовини впродовж чотирьох тижнів або довше, щонайменше 2000 зрілих еритроцитів на одну тварину також можуть оцінюватися з точки зору долі мікроядер. Системи для автоматизованого аналізу (аналізу зображення і цитометрії потоку клітинних суспензій) є прийнятними альтернативами ручного способу оцінювання, якщо він є відповідним чином обґрунтованим та затвердженим.

2. ДАНІ

2.1. ОБРОБКА РЕЗУЛЬТАТІВ

Індивідуальні дані тварин мають бути представлені у формі таблиці. Експериментальною одиницею є тварина. Кількість оцінених незрілих еритроцитів, мікроядерних незрілих еритроцитів, і кількість незрілих еритроцитів у загальній кількості еритроцитів має вноситись до списку окремо для кожної піддослідної тварини. Якщо тварин постійно піддають дії речовини впродовж чотирьох тижнів або довше, дані щодо зрілих еритроцитів теж потрібно наводити, якщо вони були зібрані. Частка незрілих еритроцитів у загальній кількості еритроцитів та, у випадку застосування, кількість мікроядерних еритроцитів наводиться для кожної тварини. Якщо немає доказів на підтвердження різниці в реакції в залежності від статі, для статистичного аналізу можливе об'єднання даних щодо обох статей.

2.2. ОЦІНКА ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

Є кілька критеріїв для визначення позитивного результату, такі як збільшення кількості клітин з мікроядерними клітинами, пов'язане з дозуванням, або чітке збільшення кількості мікроядерних клітин у групі, якій вводилася єдина доза при одноразовому заборі зразків. Перш за все необхідно враховувати біологічну релевантність результатів. Можливе використання статистичних методів в якості допоміжних при оцінюванні результатів дослідження (18)(19). Статистична значимість не має бути єдиним фактором, що визначає позитивну реакцію. Сумнівні результати мають перевірятися за допомогою подальших досліджень, переважно з використанням модифікації експериментальних умов.

Позитивні результати мікроядерного тесту означають, що речовина викликає утворення мікроядер, що є результатом хромосомних ушкоджень або ушкоджень веретена поділу еритробластів досліджуваних біологічних видів. Негативні результати означають, що за досліджуваних умов досліджувана речовина не викликає утворення мікроядер у незрілих еритроцитах досліджуваних біологічних видів.

Ймовірність того, що досліджувана речовина або її метаболіти досягнуть загального кровообігу або, особливо, цільової тканини (наприклад, системна токсичність), підлягають обговоренню.

3. ЗВІТНІСТЬ

ЗВІТ ПРО ПРОВЕДЕННЯ ТЕСТУВАННЯ

Звіт про проведення тестування має містити наступну інформацію:

Розчинник/середовище:

- обґрунтування для вибору розчинника.

- розчинність та стабільність досліджуваної речовини в розчиннику/середовищі, якщо це відомо.

Піддослідні тварини:

- біологічні види/лінії тварин, що використовуються,

- кількість, вік і стать тварин,

- походження, умови утримання, дієта, і т.д.,

- вага кожної тварини на початку випробування, включаючи діапазон ваги тіла, середні та стандартні відхилення для кожної групи.

Умови тестування:

- дані позитивних та негативних контрольних груп (з використанням розчинника або середовища),

- дані досліджень з виявлення діапазону, якщо вони проводилися,

- обґрунтування вибору рівня дозування,

- докладна інформація щодо приготування досліджуваної речовини,

- докладна інформація застосування досліджуваної речовини,

- обґрунтування вибору маршруту введення,

- докладна інформація щодо якості їжі і води,

- детальний опис введення речовини та графіки забору зразків,

- методи підготовки мікроскопічних препаратів,

- методи вимірювання токсичності,

- критерії оцінювання мікроядерних незрілих еритроцитів,

- кількість проаналізованих клітин на одну тварину,

- критерії віднесення дослідження до позитивного, негативного, або сумнівного розряду.

Результати:

- ознаки токсичності,

- доля незрілих еритроцитів у загальній кількості еритроцитів,

- кількість мікроядерних незрілих еритроцитів, наведена окремо для кожної тварини,

- середні +- стандартні відхилення мікроядерних незрілих еритроцитів на групу,

- співвідношення дози і реакції, де можливо,

- статистичний аналіз та застосовані методи,

- паралельні та історично встановлені дані негативних контрольних груп,

- дані паралельних позитивних контрольних груп.

- Обговорення результатів.

- Висновки.

4. ПОСИЛАННЯ

(1) Heddle, J.A., (1973) A Rapid In Vivo Test for Chromosomal Damage, Mutation Res., 18, p. 187-190.

(2) Schmid, W., (1975) The Micronucleus Test, Mutation Res., 31, p. 9-15.

(3) Heddle, J.A., Salamone, M.F., Hite, M., Kirkhart, B., Mavournin, K., MacGregor, J.G. and Newell, G.W. (1983). The Induction of Micronuclei as a Measure of Genotoxicity. Mutation Res., 123, p. 61-118.

(4) Mavournin, K.H., Blakey, D.H., Cimino, M.C., Salamone, M.F. and Heddle, J.A., (1990) The In Vivo Micronucleus Assay in Mammalian Bone Marrow and Peripheral Blood. A report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 239, p. 29-80.

(5) MacGregor, J.T., Schlegel, R. Choy, W.N., and Wehr, C.M., (1983) Micronuclei in Circulating Erythrocytes: A Rapid Screen for Chromosomal Damage During Routine Toxicity Testing in Mice. В 'Developments in Science and Practice of Toxicology', Ed. A.W.Hayes, R.C. Schnell and T.S. Miya, Elsevier, Amsterdam, p. 555-558.

(6) MacGregor, J.T., Heddle, J.A. Hite, M., Margolin, G.H., Ramel, C., Salamone, M.F., Tice, R.R., and Wild, D., (1987) Guidelines for the Conduct of Micronucleus Assays in Mammalian Bone Marrow Erytrocytes. Mutation Res., 189, p. 103-112.

(7) MacGregor, J.T., Wehr, C.M., Henika, P.R., and Shelby, M.E., (1990) The in vivo Erythrocyte Micronucleus Test: Measurement at Steady State Increases Assay Efficiency and Permits Integration with Toxicity Studies. Fund. Appl. Toxicol., 14, p. 513-522.

(8) Hayashi, M., Morita, T., Kodama, Y., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr., (1990) The Micronucleus Assay with Mouse Peripheral Blood Reticulocytes Using Acridine Orange-Coated Slides. Mutation Res., 245, p. 245-249.

(9) The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test, (1992) Micronucleus Test with Mouse Peripheral Blood Erythrocytes by Acridine Orange Supravital Staining: The Summary Report of the 5th Collaborative Study by CSGMT/JEMMS. MMS. Mutation Res., p. 278, 83-98.

(10) The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (CSGMT/JEMMS. MMS: The Mammalian Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan), (1995) Protocol recommended for the short-term mouse peripheral blood micronucleus test. Mutagenesis, 10, p. 153-159.

(11) Hayashi, M., Tice, R.R., MacGregor, J.T., Anderson, D., Blackey, D.H., Kirsch-Volders, M., Oleson, Jr. F.B., Pacchierotti, F., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S. and Vannier, B., (1994) In Vivo Rodent Erythrocyte Micronucleus Assay. Mutation Res., 312, p. 293-304.

(12) Higashikuni, N. and Sutou, S., (1995) An optimal, generalised sampling time of 30 +- 6 h after double dosing in the mouse peripheral blood micronucleus test. Mutagenesis, 10, p. 313-319.

(13) Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis, A.R., Botham, P.A., Doe, J., Esdaile, D.J., Gatehouse, D.G., Hodson-Walker, G., Morton, D.B., Kirkland, D.J. and Rochold, M., (1992) Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in In Vivo Mutagenicity Assays. Mutagenesis, 7, p. 313-319.

(14) Hayashi, M., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr., (1983) An Application of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test. Mutation Res., 120, p. 241-247.

(15) MacGregor, J.T., Wehr, C.M. and Langlois, R.G., (1983) A Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y. Mutation Res., 120, p. 269-275.

(16) Romagna, F. and Staniforth, C.D., (1989) The automated bone marrow micronucleus test. Mutation Res., 213, p. 91-104.

(17) Gollapudi, B. and McFadden, L.G., (1995) Sample size for the estimation of polychromatic to normochromatic erythrocyte ratio in the bone marrow micronucleus test. Mutation Res., 347, p. 97-99.

(18) Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, D.G. and Henderson, L., (1990) In Vivo Cytogenetics Assay. В: D.J. Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity tests. UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part I, revised. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, p. 115-141.

(19) Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G. and Savage, J.R.K., (1989) Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays. В: D.J. Kirkland (Ed.) Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report Part III. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, p. 184-232.

B.13/14. МУТАГЕННІСТЬ: ТЕСТ НА ЗВОРОТНУ МУТАЦІЮ З ВИКОРИСТАННЯМ БАКТЕРІЙ

1. МЕТОД

Цей метод відтворює метод, описаний у ТІ ОЕСР 471, Бактеріальний Тест на Зворотну Мутацію (1997).

1.1. ВСТУП

Для бактеріального тесту на зворотну мутацію використовуються штами тифозної сальмонели та кишкової палички, що потребують амінокислоти для виявлення точкових мутацій, які спричиняють заміну, додавання чи делецію однієї або кількох пар основ ДНК (1)(2)(3). Принцип бактеріального тесту на зворотну мутацію полягає у виявленні мутацій, що повертають до початкового стану мутації, присутні в піддослідних штамах і відновлюють функціональну властивість бактерії синтезувати необхідну амінокислоту. Бактерії-ревертанти виявляють за їх здібністю до зростання за відсутності амінокислоти, якої потребує материнський піддослідний штам.

Точкові мутації є причиною багатьох генетичних хвороб людини і є суттєві докази того, що точкові мутації в онкогенах і генах-супрессорах соматичних клітин, пов'язані з утворенням пухлин у людини і піддослідних тварин. Бактеріальний тест на зворотну мутацію швидкий, недорогий, має відносно легкий механізм проведення. Багато з піддослідних штамів мають декілька характеристик, які роблять їх більш чутливими для визначення мутацій, включаючи чутливі послідовності ДНК на ділянках реверсії, збільшену проникність клітин для великих молекул та знищення систем репарації ДНК або посилення вразливих для небезпечних впливів процесів репарації ДНК. Специфічність піддослідних штамів може надати деяку корисну інформацію щодо типів мутацій, що викликані генотоксичними реагентами. Для бактеріального тесту на зворотну мутацію наявна велика база даних результатів для широкого діапазону структур, а також розроблені усталені методології для тестування хімічних речовин з різними фізико-хімічними властивостями, включаючи летючі складові.

Дивіться також Загальний вступ, Частину B.

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ

Тест на зворотну мутацію як тифозної сальмонели , так і кишкової палички виявляє мутацію в штамах, що потребують амінокислоти (гістидин або триптофан відповідно) для розробки штаму, незалежного від зовнішнього постачання амінокислоти.

Мутагени заміщення пари основ є реагентами, які спричиняють базові зміни в ДНК. У тесті на зворотну мутацію ця зміна може відбуватися як на ділянці вихідної мутації, так і на другій ділянці бактеріального геному.

Мутаген, що викликає мутації зі зсувом рамки: реагенти, що спричиняють додавання або делеції однієї чи більше пар основ у ДНК, змінюючи, таким чином, рамку зчитування в РНК.

1.3. ПОЧАТКОВИЙ РОЗГЛЯД

Для бактеріального тесту на зворотну мутацію використовують клітини, що відносяться до прокаріотів, які відрізняються від клітин ссавців такими показниками, як поглинання, метаболізм, хромосомна структура та процеси репарації ДНК. Дослідження, що проводяться in vitro, зазвичай вимагають використання екзогенного джерела метаболічної активації. Система метаболічної активації in vitro не може повністю імітувати умов функціонування організму ссавців in vivo. Таким чином, тест не надає повної інформації про мутагенний і канцерогенний потенціал речовини при застосуванні до ссавців.

Бактеріальний тест на зворотну мутацію, зазвичай, застосовується в якості початкового обстеження на генотоксичну активність та, зокрема, інтенсивності стимуляції точкових мутацій. З обширної бази даних видно, що велика кількість хімічних речовин, які є позитивними в цьому тесті, також проявляють мутагенну активність в інших тестах. Є приклади мутагенних реагентів, що не виявляються під час цього тесту, причини цих недоліків можна віднести на рахунок специфічної природи визначеної кінцевої точки, різниці в метаболічній активації, або різниці в біодоступності. З іншого боку, фактори, що підвищують чутливісь бактеріального тесту на зворотну мутацію, можуть призвести до переоцінки мутагенної активності.

Бактеріальний тест на зворотну мутацію може не підходити для оцінки певних класів хімічних речовин, наприклад, сполук з високим бактерицидним ефектом (наприклад, певних антибіотиків) і тих, які вважаються (або відомі) як такі, що особливим чином змінюють систему реплікації клітин ссавців (наприклад, деякі топоізомеразні інгібітори та певні нуклеозидні аналоги). В таких випадках тести на мутацію ссавців можуть бути більш доцільними.

Хоча багато сполук, що дають позитивний результат у цьому дослідженні, є канцерогенами ссавців, це співвідношення не є абсолютним. Воно залежить від класу хімічних речовин, і є канцерогени, що не виявляються за допомогою цього дослідження, оскільки вони діють через інші, негенотоксичні, механізми, що відсутні в бактеріальних клітинах.

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

Суспензії бактеріальних клітин піддають впливу досліджуваної речовини як в присутності екзогенної системи метаболічної активації, так і за її відсутності. У чашковому методі включення ці суспензії змішуються з агаровою накладкою та одразу поміщаються у чашку на мінімальний шар субстрату. У методі преінкубації піддослідна суміш вирощується, а потім змішується з агаровою накладкою перед тим, як помістити її у чашку на мінімальний шар субстрату. Для обох технік після двох чи трьох днів вирощування колонії-ревертанти підраховуються та порівнюються з кількістю спонтанних колоній-ревертантів у чашках для контролю розчинника.

Для здійснення бактеріального тесту на зворотну мутацію описано декілька процедур. Серед цих загально використовуваних методів є чашковий метод включення (1)(2)(3)(4), метод преінкубації (2)(3)(5)(6)(7)(8), метод флуктуації (9)(10) та метод тимчасового призупинення (11). Також описані модифікації методів для проведення тестування на газах і пароподібних речовинах (12).

Процедури, описані в межах методу, мають відношення перш за все до чашкового включення та методів преінкубації. Обидва з них придатні для проведення експериментів як з метаболічною активацією, так і без неї. Деякі речовини можна визначити більш ефективно, використовуючи метод преінкубації. Ці речовини належать до класів хімічних речовин, які включають аліфатичні нітрозаміни короткого ланцюга, двохвалентні метали, альдегіди, азобарвники та діазосполуки, піролізідинові алкалоїди, сполуки та нітросполуки алілу (3). Також визнано, що певні класи мутагенів не завжди визначаються при використанні стандартних процедур, таких, як чашковий метод включення або метод преінкубації. Це явище розглядається як "вийнятки", і для визначення цих мутагенів наполегливо рекомендується використання альтернативних процедур. Можна ідентифікувати наступні "винятки" (разом з прикладами процедур, які можуть використовуватись для їх визначення): азобарвники та діазосполуки (3)(5)(6)(13), гази та летючі хімічні речовини (12)(14)(15)(16) та глікозиди (17)(18). Відхилення від стандартної процедури має бути науково виправданим.

1.5. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

1.5.1. Підготовка

1.5.1.1. Бактерії

Свіжі культури бактерій вирощують до пізньої експоненційної 9

або ранньої стаціонарної фази росту (приблизно 10  клітин на  мл).
Культури  в  пізній  стаціонарній фазі використовувати непотрібно.
Необхідно,  щоб культури,  які використовуються для  експерименту,
містили  високий титр життєздатних бактерій.  Титр може виявлятися
завдяки історично встановленим даним з контролю кривих росту або в
процесі  кожного  аналізу шляхом визначення кількості життєздатних
клітин під час чашкового експерименту.

Рекомендована температура вирощування - 37 град.C.

Потрібно використати щонайменше п'ять штамів бактерій. Вони мають включати чотири штами тифозної сальмонели (TA 1535; TA 1537 або TA97a або TA97; TA98; та TA100), які продемонстрували свою надійність і репродуктивну реактивність під час лабораторних досліджень. Ці чотири штами тифозної сальмонели мають пари основ генетичного коду в первинній реверсивній ділянці і, як відомо, можуть не визначати певних окислюючих мутагенів, реагентів перехресного зшивання та гідразинів. Такі речовини можна визначити за допомогою штамів кишкової палички WP2 або тифозної сальмонели TA102 (19), які мають пару основ кислотної обробки в первинній реверсивній ділянці. Таким чином, рекомендованою комбінацією штамів є:

- тифозна сальмонела TA1535, та

- тифозна сальмонела TA1537 або TA97 або TA97a, та

- тифозна сальмонела TA98, та

- тифозна сальмонела TA100, та

- кишкова паличка WP2 uvrA або WP2 uvrA (pKM101), або тифозна сальмонела TA102.

Для виявлення мутагенів перехресного зшивання бажано включати TA102 або додавати спеціальний штам репарації ДНК кишкової палички (наприклад, кишкова паличка WP2 або кишкова паличка WP2 (pKM.101))

Для препарату вихідної культури, перевірки маркерів та зберігання потрібно використовувати встановлені процедури. Потреба в амінокислоті для росту повинна демонструватися для кожного замороженого препарату вихідної культури (гістидин для штамів тифозної сальмонели та триптофан для штамів кишкової палички). Інші фенотипові властивості також мають бути перевірені; йдеться про наступні характеристики: присутність чи відсутність R-плазмід там, де це доцільно (тобто, резистентність штамів TA98, TA100 та TA97a або TA97, WP2 uvrA та WP2 uvrA (pKM101) до ампіциліну та резистентність штаму TA102 до ампіциліну+тетрацикліну); присутність характерних мутацій (тобто, мутація rfa в тифозній сальмонелі через чутливість до кристалвіолету та мутація uvrA в кишковій паличці через чутливість до ультрафіолетового світла) (2)(3). Штами також повинні призводити до спонтанних чашкових підрахунків колоній-ревертантів в межах діапазонів частоти, виявлених завдяки лабораторним історично встановленим даним з контролю та переважно в діапазоні, зазначеному в літературі.

1.5.1.2. Субстрат

Відповідний мінімальний агар (наприклад, що містить мінімальний субстрат E Фогеля-Боннера та глюкозу) та верхній шар агару, що містить гістидин та біотин або триптофан, використовується для кількох поділів клітин.

1.5.1.3. Метаболічна активація

Бактерії повинні піддаватись впливу досліджуваної речовини як в присутності відповідної системи метаболічної активації, так і за її відсутності. Найчастіше використовується система доповненої коферментами пост-мітохондріальної фракції (S9), приготованої з печінок гризунів, оброблених ензимами, включаючи такі агенти, як Арохлор-1254 (1)(2) або суміш фенобарбіталу та нафтофлавону (18)(20)(21). Пост-мітохондріальна фракція, зазвичай, використовується в концентраціях в діапазоні від 5 до 30% в об'ємному співвідношенні в суміші S9. Вибір та стан системи метаболічної активації можуть залежати від класу хімічних речовин, що випробовуються. В деяких випадках може бути доцільним використання більш ніж однієї концентрації пост-мітохондріальної фракції. Для азобарвників та діазосполук найбільш придатним може бути використання спрощеної системи метаболічної активації (6)(13).

1.5.1.4. Досліджувана речовина/Підготовка

Тверді досліджувані речовини слід розчинити або усунути за допомогою відповідного розчинника або середовища і розбавити, якщо це є доцільним, перед обробкою бактерій. Рідкі досліджувані речовини можна додавати безпосередньо до досліджуваних систем та/або розбавити перед введенням. Слід застосовувати свіжі препарати, якщо тільки дані щодо стабільності не виявляють прийнятності зберігання.

Не має бути підозри на хімічну реакцію розчинника/середовища з досліджуваною речовиною, вони також повинні бути придатними для виживання бактерій і сумісними з діяльністю S9(22). Якщо використовується не добре відомий розчинник/середовище, їх включення має підтверджуватись даними, що доводять їхню сумісність. Рекомендується там, де можливо, використовувати спочатку водний розчинник/середовище. При тестуванні речовин, нестабільних при взаємодії з водою, використовувані органічні розчинники не мають містити води.

1.5.2. Умови тестування:

1.5.2.1. Піддослідні штами (див. 1.5.1.1)

1.5.2.2. Концентрація для впливу

При визначенні найвищої кількості досліджуваної речовини, що використовується, слід розглянути такі критерії, як цитотоксичність та розчинність в останній піддослідній суміші.

Можливо, буде корисним визначення токсичності та нерозчинності в ході підготовчого експерименту. Цитотоксичність можна визначити за зменшенням кількості колоній-ревертантів, очищенням чи зменшенням вихідного газону або ступенем виживання культур, підданих дії речовини. Цитотоксичність речовини може підвищуватися в присутності систем метаболічної активації. Нерозчинність в останній суміші слід оцінювати як преципітацію за наявних умов тестування; вона має визначатись неозброєним оком.

Рекомендована максимальна концентрація для тестування розчинних не цитотоксичних речовин складає 5 мг/чашку або 5 мл/чашку. Для не цитотоксичних речовин, які не є розчинними при концентрації 5 мг/чашку або 5 мл/чашку, один або більше випробуваних варіантів концентрацій мають бути нерозчинними в останній піддослідній суміші. Досліджувані речовини, що є токсичними вже при концентрації нижчій, ніж 5 мг/чашку або 5 мл/чашку, мають досліджуватись до виявлення цитотоксичної концентрації. Осад не повинен змінювати результати оцінювання.

Слід використовувати щонайменше п'ять різних придатних для аналізу концентрацій досліджуваної речовини з приблизно половиною занесених в журнал інтервалів (тобто, Кк 10) між точками тестування для початкового експерименту. Менші інтервали є доцільними, якщо реакцію на концентрацію виявлено. Можливість тестування при концентрації вище 5 мг/чашку або 5 мл/чашку розглядається, якщо речовини, що піддаються оцінці, містять суттєву кількість потенційно мутагенних домішків.

1.5.2.3. Позитивний та негативний контроль

Паралельні штам-специфічні позитивні та негативні контрольні групи (за розчинником або середовищем), як з метаболічною активацією, так і без неї, мають входити до складу кожного аналізу. Слід відбирати концентрації для позитивного контролю, що демонструють ефективність при кожному аналізі.

Для аналізу за участю системи метаболічної активації слід відбирати стандартні речовини для позитивного контролю на основі типу штамів бактерій, що використовуються.

Наступні речовини є прикладами для застосування у відповідних групах позитивного контролю для аналізу з використанням метаболічної активації.

------------------------------------------------------------------
|  Номери РСХ  |  Номери ЄРІКХР  |             Назви             |
|--------------+-----------------+-------------------------------|
|   781-43-1   |    212-308-4    |9,10-диметил-антрацен          |
|--------------+-----------------+-------------------------------|
|    57-97-6   |    200-359-5    |7,12-диметилбенз(альфа)антрацен|
|--------------+-----------------+-------------------------------|
|    50-32-8   |    200-028-5    |бензо(альфа)пірен              |
|--------------+-----------------+-------------------------------|
|   613-13-8   |    210-330-9    |2-аміноантрацен                |
|--------------+-----------------+-------------------------------|
|    50-18-0   |                 |циклофосфамід                  |
|--------------+-----------------+-------------------------------|
|  6055-19-2   |    200-015-4    |циклофосфаміду моногідрат      |
------------------------------------------------------------------

Наступна речовина є відповідним засобом позитивного контролю для спрощеного методу метаболічної активації:

------------------------------------------------------------------
|   Номер РСХ  |   Номер ЄРІКХР  |             Назва             |
|--------------+-----------------+-------------------------------|
|    573-58-0  |    209-358-4    |конго червоний                 |
------------------------------------------------------------------

2-аміноантрацен не слід використовувати в якості єдиного індикатора ефективності суміші S9. Якщо використовується 2-аміноантрацен, кожну дозу S9 потрібно охарактеризувати за допомогою мутагену, що вимагає метаболічної активації з використанням мікросомальних ензимів, наприклад бензо(альфа)пірену, диметилбензантрацену.

Наступні речовини є прикладами для застосування у відповідних групах штам-специфічного позитивного контролю для аналізу з використанням екзогенної системи метаболічної активації.

------------------------------------------------------------------
|Номери РСХ|Номери ЄРІКХР|       Назви       |        Штам       |
|----------+-------------+-------------------+-------------------|
|26628-22-8|  247-852-1  |натрієвий азид     |TA 1535 та TA 100  |
|----------+-------------+-------------------+-------------------|
| 607-57-8 |  210-138-5  |2-нітрофлуорен     |TA 98              |
|----------+-------------+-------------------+-------------------|
|  90-45-9 |  201-995-6  |9-аміноакридин     |TA 1537, TA 97 та  |
|          |             |                   |TA 97a             |
|----------+-------------+-------------------+-------------------|
|17070-45-0|  241-129-4  |ОКВ 191            |TA 1537, TA 97 та  |
|          |             |                   |TA 97a             |
|----------+-------------+-------------------+-------------------|
|  80-15-9 |  201-254-7  |Гідропероксид      |TA 102             |
|          |             |кумолу             |                   |
|----------+-------------+-------------------+-------------------|
|  50-07-7 |  200-008-6  |Мітоміцин C        |WP2 uvrA та TA102  |
|----------+-------------+-------------------+-------------------|
|  70-25-7 |  200-730-1  |N-етил-N-нітро-N-  |WP2, WP2 uvrA та   |
|          |             |нітрозогуанидин    |WP2 uvrA (pKM101)  |
|----------+-------------+-------------------+-------------------|
|  56-57-5 |  200-281-1  |4-нітроквинолін-1- |WP2, WP2 uvrA та   |
|          |             |оксид              |WP2 uvrA (pKM101)  |
|----------+-------------+-------------------+-------------------|
|3688-53-7 |             |Фурилфурамід (AF2) |плазмідовмісні     |
|          |             |                   |штами              |
------------------------------------------------------------------

Можна використати інші відповідні еталонні речовини для позитивного контролю. Застосування хімічної речовини, що використовується для позитивного контролю з огляду на клас може розглядатись, якщо є доступним.

До складу мають входити негативні контрольні групи, що складаються тільки з розчинника або тільки з середовища, без досліджуваної речовини, яким вводяться ті ж речовини, що і піддослідним групам. Окрім того, контрольні групи, що не піддавалися впливу досліджуваної речовини, теж повинні використовуватись, якщо немає історично встановлених даних з контролю, що показують відсутність шкідливих та мутагенних впливів обраного розчинника.

1.5.3. Процедура

Для чашкового методу включення (1)(2)(3)(4) без метаболічної активації, зазвичай, 0,05 мл або 0,1 мл досліджуваних розчинів, 8 0,1 мл свіжої бактеріальної культури (що містить приблизно 10 життєздатних клітин) та 0,5 мл стерильного буферного розчину змішуються з 2,0 мл верхнього шару агару. Для аналізу з метаболічною активацією, зазвичай, 0,5 мл суміші для метаболічної активації, що містить відповідну кількість пост-мітохондріальної фракції (в діапазоні від 5 до 30% в об'ємному співвідношенні в суміші для метаболічної активації) змішується з верхнім шаром агару (2,0 мл) та бактеріями і розчином досліджуваної речовини/досліджуваним розчином. Вміст кожної пробірки перемішується та наливається на поверхню чашки з мінімальною кількістю агару. Верхній шар агару дозволяється перевести в твердий стан перед вирощуванням.

Для методу преінкубації (2)(3)(5)(6) досліджувана речовина/досліджуваний розчин попередньо вирощується з 8

піддослідним штамом (що містить приблизно 10  життєздатних клітин)
стерильним буферним  розчином   системи   метаболічної   активації
(0,5 мл) зазвичай впродовж 20 хвилин або довше при 30-37 град.C до
того,  як змішується з  верхнім  шаром  агару  та  наливається  на
поверхню  чашки з мінімальною кількістю агару.  Зазвичай,  0,05 мл
або 0,1 мл досліджуваної речовини/досліджуваного розчину,  0,1  мл
бактерій  та  0,5  мл  суміші S9 або стерильного буферного розчину
змішуються з 2,0 мл верхнього шару  агару.  Під  час  преінкубації
слід вентилювати пробірки за допомогою шейкеру.

Для адекватної оцінки варіації слід використовувати потрійний метод вирощування на чашках Петрі для кожного рівня дозування. Використання подвійного методу вирощування на чашках Петрі є доцільним, якщо воно є науково виправданим. Випадкова втрата чашки не обов'язково веде до визнання недійсними результатів аналізу.

Газоподібні та летючі речовини тестуються за допомогою відповідних методів, таких як запечатані ємкості (12)(14)(15)(16).

1.5.4. Вирощування

Всі штами вирощуються на чашках при 37 град.C впродовж 48-72 годин. Після періоду вирощування підраховується кількість колоній-ревертантів на чашку.

2. ДАНІ

2.1. ОБРОБКА РЕЗУЛЬТАТІВ

Дані мають бути представлені у вигляді кількості колоній-ревертантів на чашку. Також потрібно навести кількість колоній-ревертантів як у негативних (контроль за розчинником і контроль без дії речовини, якщо використовується), так і у позитивних чашках контролю. Для досліджуваної речовини та позитивних і негативних контрольних груп (без дії речовини та/або за розчинником) мають бути представлені індивідуальні чашкові підрахунки, середня кількість колоній-ревертантів на чашку та стандартні відхилення.

Немає вимог до перевірки чіткої позитивної реакції. Сумнівні результати мають перевірятися за допомогою подальших досліджень, переважно з використанням модифікації експериментальних умов. Негативні результати потрібно підтверджувати в окремих випадках. У випадках, коли підтвердження негативних результатів не вважається необхідним, потрібно навести обґрунтування. Модифікація параметрів дослідження з метою розширення діапазону оцінюваних умов буде розглядатися в подальших експериментах. Параметри дослідження, що можуть бути модифіковані, включають в себе просторовий розподіл концентрації, метод піддавання впливу речовини (чашкове включення або преінкубація рідини) та умови метаболічної активації.

2.2. ОЦІНКА ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

Є кілька критеріїв для визначення позитивного результату, такі як збільшення відносно досліджуваного рівня, пов'язане з концентрацією, та/або відтворюване збільшення при одній або декількох варіантах концентрацій у кількості колоній-ревертантів на чашку щонайменше в одному штамі як з системою метаболічної активації, так і без неї (23). Перш за все необхідно враховувати біологічну релевантність результатів. Можливе використання статистичних методів в якості допоміжних при оцінюванні результатів тестування (24). Проте, статистична значимість не має бути єдиним фактором, що визначає позитивну реакцію.

Досліджувана речовина, результати тестування якої не відповідають вищезазначеним критеріям, вважається немутагенною при цьому тестуванні.

Хоча більшість експериментів дає чітко позитивні або негативні результати, в поодиноких випадках сукупність даних виключає можливість однозначного судження про активність досліджуваної речовини. Результати можуть залишатись сумнівними або проблематичними, не зважаючи на кількість повторень експерименту.

Позитивні результати бактеріального тесту на зворотну мутацію означають, що речовина викликає точкові мутації шляхом заміни основ або зсувів рамки в геномі як тифозної сальмонели, так і кишкової палички. Негативні результати означають, що за досліджуваних умов досліджувана речовина не є мутагенною для досліджуваних біологічних видів.

3. ЗВІТНІСТЬ

ЗВІТ ПРО ПРОВЕДЕННЯ ТЕСТУВАННЯ

Звіт про проведення тестування містити наступну інформацію:

Розчинник/середовище:

- обґрунтування для вибору розчинника/середовища,

- розчинність та стабільність досліджуваної речовини в розчиннику/середовищі, якщо це відомо.

Штами:

- використовувані штами,

- кількість клітин на культуру,

- характеристики штамів.

Умови тестування:

- кількість досліджуваної речовини на чашку (мг/чашку або мл/чашку) з обґрунтуванням вибору дозування і кількістю чашок на одну концентрацію,

- використовуване середовище,

- тип і склад системи метаболічної активації, включаючи прийнятності,

- процедури введення речовини.

Результати:

- ознаки токсичності,

- ознаки преципітації,

- індивідуальні чашкові підрахунки,

- середня кількість колоній-ревертантів на чашку та стандартні відхилення,

- співвідношення дози і реакції, де можливо,

- статистичний аналіз, якщо він має місце,

- паралельні дані позитивних та негативних контрольних груп (за розчинником або середовищем), з діапазонами, середніми показниками та стандартними відхиленнями,

- історично встановлені дані позитивних та негативних контрольних груп (за розчинником або середовищем), з діапазонами, середніми показниками та стандартними відхиленнями.

Обговорення результатів.

Висновки.

4. ПОСИЛАННЯ

(1) Ames, B.N., McCann, J. and Yamasaki E., (1975) Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, p. 347-364.

(2) Maron, D.M. and Ames, B.N., (1983) Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, p. 173-215.

(3) Gatehouse, D., Haworth, S., Cebula, T., Gocke, E., Kier, L., Matsushima, T., Melcion, C., Nohmi, T., Venitt, S. and Zeiger, E., (1994) Recommendations for the Performance of Bacterial Mutation Assays. Mutation Res., 312, p. 217-233.

(4) Kier, L.D., Brusick D.J., Auletta, A.E., Von Halle, E.S., Brown, M.M., Simmon, V.F., Dunkel, V., McCann, J., Mortelmans, K., Prival, M., Rao, T.K. and Ray V., (1986) The Salmonella typhimurium/Mammalian Microsomal Assay: A Report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program. Mutation Res., 168, p. 69-240.

(5) Yahagi, T., Degawa, M., Seino, Y.Y., Matsushima, T., Nagao, M., Sugimura, T. and Hashimoto, Y., (1975) Mutagenicity of Carcinogen Azo Dyes and their Derivatives, Cancer Letters, 1, p. 91-96.

(6) Matsushima, M., Sugimura, T., Nagao, M., Yahagi, T., Shirai, A. and Sawamura, M., (1980) Factors Modulating Mutagenicity Microbial Tests. В: Short-term Test Systems for Detecting Carcinogens. Ed. Norpoth K.H. and Garner, R.C., Springer, Berlin-Heidelberg-New York. p. 273-285.

(7) Gatehouse, D.G., Rowland, I.R., Wilcox, P., Callender, R.D. and Foster, R., (1980) Bacterial Mutation Assays. В: Basic Mutagenicity Tests: UKEMS Part 1 Revised. Ed.D.J. Kirkland, Cambridge University Press, p. 13-61.

(8) Aeschacher, H.U., Wolleb, U. and Porchet, L., (1987) Liquid Preincubation Mutagenicity Test for Foods. J. Food Safety, 8, p. 167-177.

(9) Green, M.H.L., Muriel, W.J. and Bridges, B.A., (1976) Use of a simplified fluctuation test to detect low levels of mutagens. Mutation Res., 38, p. 33-42.

(10) Hubbard, S.A., Green, M.H.L., Gatehouse, D. and J.W. Bridges (1984) The Fluctuation Test in Bacteria. В: Handbook of Mutagenicity Test Procedures. 2nd Edition. Ed. Kilbey, B.J., Legator, M., Nichols, W. and Ramel, C., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, p. 141-161.

(11) Thompson, E.D. and Melampy, P.J., (1981) An Examination of the Quantitative Suspension Assay for Mutagenesis with Strains of Salmonella typhimurium. Environmental Mutagenesis, 3, p. 453-465.

(12) Araki, A., Noguchi, T., Kato, F. and T. Matsushima (1994) Improved Method for Mutagenicity Testing of Gaseous Compounds by Using a Gas Sampling Bag. Mutation Res., 307, p. 335-344.

(13) Prival, M.J., Bell, S.J., Mitchell, V.D., Reipert, M.D. and Vaughn, V.L., (1984) Mutagenicity of Benzidine and Benzidine-Congener Dyes and Selected Monoazo Dyes in a Modified Salmonella Assay. Mutation Res., 136, p. 33-47.

(14) Zeiger, E., Anderson, B.E., Haworth, S., Lawlor, T. and Mortelmans, K., (1992) Salmonella Mutagenicity Tests. V. Results from the Testing of 311 Chemicals. Environ. Mol. Mutagen., 19, p. 2-141.

(15) Simmon, V., Kauhanen, K. and Tardiff, R.G., (1977) Mutagenic Activity of Chemicals Identified in Drinking Water. In Progress in Genetic Toxicology, D.Scott, B.Bridges and F.Sobels (Eds.) Elsevier, Amsterdam, p. 249-258.

(16) Hughes, T.J., Simmons, D.M., Monteith, I.G. and Claxton, L.D., (1987) Vaporisation Technique to Measure Mutagenic Activity of Volatile Organic Chemicals in the Ames/Salmonella Assay. Environmental Mutagenesis, 9, p. 421-441.

(17) Matsushima, T., Matsumoto, A., Shirai, M., Sawamura, M., and Sugimura, T., (1979) Mutagenicity of the Naturally Occurring Carcinogen Cycasin and Synthetic Methylazoxy Methane Conjugates in Salmonella typhimurium. Cancer Res., 39, p. 3780-3782.

(18) Tamura, G., Gold, C., Ferro-Luzzi, A. and Ames, B.N., (1980) Fecalase: A Model for Activation of Dietary Glycosides to Mutagens by Intestinal Flora. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, p. 4961-4965.

(19) Wilcox, P., Naidoo, A., Wedd, D.J. and Gatehouse, D.G., (1990) Comparison of Salmonella typhimurium TA 102 with Escherichia coli WP2 Tester strains. Mutagenesis, 5, p. 285-291.

(20) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T., (1976) A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer or Metabolic Activation Systems. В: 'In vitro metabolic Activation in Mutagenesis Testing' Eds. F.J. de Serres et al. Elsevier, North Holland, p. 85-88.

(21) Elliot, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C., (1992) Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in vitro Genotoxicity Assays. Mutagenesis, 7, p. 175-177.

(22) Maron, D., Katzenellenbogen, J. and Ames, B.N., (1981) Compatibility of Organic Solvents with the Salmonella/Microsome Test. Mutation Res., p. 88343-350.

(23) Claxton, L.D., Allen, J., Auletta, A., Mortelmans, K., Nestmann, E. and Zeiger, E., (1987) Guide for the Salmonella typhimurium/Mammalian Microsome Tests for Bacterial Mutagenicity. Mutation Res. 189, с. 83-91.

(24) Mahon, G.A.T., Green, M.H.L., Middleton, B., Mitchell, I., Robinson, W.D. and Tweats, D.J., (1989) Analysis of Data from Microbial Colony Assays. В: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Part II. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. Ed. Kirkland, D.J., Cambridge University Press, p. 28-65.

B.15. ДОСЛІДЖЕННЯ МУТАГЕННОСТІ ТА СКРИНІНГ НА ГЕНЕТИЧНІ МУТАЦІЇ КАНЦЕРОГЕННОЇ ДІЇ - ПИВНІ ДРІЖДЖІ

1. МЕТОД

1.1. ВСТУП

Дивіться Загальний вступ, Частину B.

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ

Дивіться Загальний вступ, Частину B.

1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ

Немає.

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

Різноманітність гаплоїдних і диплоїдних штамів заквасок пивних дріжджі можна використовувати для вимірювання виходу генних мутацій, спричинених хімічними речовинами як з метаболічною активацією, так і без неї.

Використовуються системи прямих мутацій у гаплоїдних штамах, такі, як вимірювання мутацій від червоних мутантів, що потребують аденіну, (ade-1, ade-2), до подвійних білих мутантів, що потребують аденіну, і системи відбору, такі, як провокування резистентності до канаваніну та циклогексиміду.

Найбільш усебічно оцінена система зворотної мутації включає в себе використання гаплоїдного штаму XV 185-14C, який несе нонсенс-мутації охри ade 2-1, arg 4-17, lys 1-1 та trp 5-48, які є зворотними завдяки мутагенам заміни основ, що викликають направлені мутації або мутації супресорів охри. XV 185-14C також несе маркер his 1-7, міссенс-мутації здебільшого повертаються до початкового стану шляхом мутацій у зворотний бік, та маркер hom 3-10, що повертається до початкового стану завдяки мутагену, що викликає мутації зі зсувом рамки.

В диплоїдних штамах пивних дріжджі в єдиним загальновикористовуваним штамом є D , який є гомозиготним 7

за ilv 1-92.

1.5. КРИТЕРІЇ ЯКОСТІ

Немає.

1.6. ОПИС МЕТОДУ ВИПРОБУВАНЬ

Підготовка

Розчини піддослідних хімічних речовин та контрольна речовина повинні готуватися безпосередньо перед проведенням тестування з використанням відповідного середовища. У випадку з органічними сполуками, які не є розчинними у воді, потрібно використовувати не більше 2% розчину органічних розчинників, таких як етанол, ацетон чи диметилсульфоксид (ДМСО). Остаточна концентрація середовища не повинна відчутно впливати на життєздатність клітин і характеристики їх росту.

Метаболічна активація

Клітини повинні піддаватись впливу досліджуваної хімічної речовини як в присутності відповідної екзогенної системи метаболічної активації, так і за її відсутності.

Найчастіше використовується система доповненої коферментами пост-мітохондріальної фракції з печінок гризунів, попередньо оброблених реагентами з включенням ензимів. Використання інших біологічних видів, тканин, пост-мітохондріальних фракцій або процедур також може бути доцільним для метаболічної активації.

Умови тестування:

Лінії-аналізатори

Гаплоїдний штам XV 185-14C та диплоїдний штам D найбільше 7

використовуються  в  дослідженнях генної мутації.  Також може бути
більш доцільним використання інших штамів.

Середовище

Відповідне середовище для культур використовується для визначення кількості одиниць, що вижили, і мутантів.

Використання негативних і позитивних контрольних груп

Позитивний контроль, контроль без піддавання впливу досліджуваної речовини та контроль за розчинником мають здійснюватись одночасно. Потрібно використовувати відповідні речовини позитивного контролю для кожної окремої кінцевої точки мутації.

Концентрація для впливу

Слід використовувати щонайменше п'ять концентрацій досліджуваної речовини з адекватними проміжками між ними. Для токсичних речовин найвища досліджувана концентрація не повинна зменшувати показника одиниць, що вижили, менш ніж на 5-10%. Відносно нерозчинні у воді речовини потрібно випробовувати до їх межі розчинності з використанням відповідних процедур. Для нетоксичних речовин, що вільно розчиняються у воді, найвища концентрація визначається для кожного окремого випадку.

Умови інкубації

Чашки вирощують від чотирьох до семи днів при 28-30 град.C у темряві.

Частота спонтанних мутацій

Субкультури повинні використовуватись зі спонтанною частотою мутацій в межах прийнятого звичайного діапазону.

Кількість повторень

Для аналізу фототрофів, що утворилися в результаті генної мутації, та життєздатності клітин потрібно використати щонайменше три чашки для повторення для кожної концентрації. У випадку проведення експериментів з використанням таких маркерів, як hom 3-10 з низьким рівнем мутації, кількість використовуваних чашок потрібно збільшити для отримання статистично відповідних даних.

Процедура

Піддавання пивних дріжджів впливу речовини, зазвичай, здійснюється згідно з процедурою випробування рідин, включаючи як стаціонарні клітини, так і клітини у стадії росту. Початковий експеримент потрібно здійснити на клітинах у стадії росту: 7

1-5 x   10    клітин/мл  піддають  впливу  досліджуваної  хімічної
речовини впродовж   18   годин   при   температурі  28-37  град.C,
збовтуючи;  відповідна кількість  елементів  системи  метаболічної
активації  додається під час введення речовини,  коли це доцільно.
Наприкінці періоду дії речовини клітини центрифугують, змивають та
висівають  у  відповідне культуральне середовище.  Після інкубації
чашки оцінюють за ступенем виживання  клітин  та  генних  мутацій.
Якщо   перший   експеримент  дає  негативні  результати,  потрібно
провести другий експеримент з використанням клітин у  стаціонарній
фазі.  Якщо  перший експеримент дає позитивні результати,  їх слід
підтвердити    шляхом    проведення    відповідного    незалежного
експерименту.

2. ДАНІ

Дані мають бути представлені у формі таблиці з зазначенням кількості підрахованих колоній, кількості мутантів, частоти мутацій і виживання. Всі результати слід підтверджувати шляхом незалежного експерименту. Дані слід оцінювати, використовуючи відповідний статистичний метод.

3. ЗВІТНІСТЬ

3.1. ЗВІТ ПРО ПРОВЕДЕННЯ ТЕСТУ

За можливості звіт про проведення тесту має містити наступну інформацію:

- використовувані штами,

- умови проведення тесту: клітини у стаціонарній фазі або клітини у стадії росту, склад середовища, температура і тривалість інкубації, система метаболічної активації,

- умови піддавання дії речовини: рівень введення, процедура і тривалість введення, температура введення, позитивний та негативний контроль,

- кількість підрахованих колоній, кількість мутантів, частота мутацій і виживання, співвідношення дози/реакції, у випадку застосування, статистична оцінка даних,

- обговорення результатів,

- інтерпретація результатів.

3.2. ОЦІНКА ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ

Дивіться Загальний вступ, Частину B.

4. ПОСИЛАННЯ

Дивіться Загальний вступ, Частину B.

B.16. МІТОТИЧНА РЕКОМБІНАЦІЯ - ПИВНІ ДРІЖДЖІ

1. МЕТОД

1.1. ВСТУП

Дивіться Загальний вступ, Частину B.

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ

Дивіться Загальний вступ, Частину B.

1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ

Немає.

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

Мітотична рекомбінація в пивних дріжджах може визначатися між генами (або, більш узагальнено, між геном і його центромером) та всередині генів. Перший варіант називається мітотичним кросинговером зі взаємним генеруванням продуктів, в той час, як останній найчастіше не є взаємним і називається конверсією гена. Кросинговер, зазвичай, аналізується за виробленням рецесивних гомозиготних колоній або секторів, утворених в гетерозиготному штамі, в той час, як конверсія гена аналізується за виробленням фототрофічних ревертантів, утворених в ауксотрофному гетероалельному штамі з двома різними дефектними алелями одного й того ж гену. Найбільш часто використовуваними штамами для визначення мітотичної конверсії гена є D4 (гетероалельний в ade 2 та trp 5), D7 (гетероалельний у trp 5), BZ34 (гетероалельний в arg 4) та JDl (гетероалельний в his 4 та trp 5). Мітотичний кросинговер, що продукує червоні та рожеві гомозиготні сектори, може оцінюватись через D або D (який також використовується для 5 7

вимірювання мітотичної  конверсії  гена  та  зворотної  мутації  в
ilv 1-92),  обидва  штами  є  гетероалельними  для комплементарних
алелів ade 2.

1.5. КРИТЕРІЇ ЯКОСТІ

Немає.

1.6. ОПИС МЕТОДУ ВИПРОБУВАНЬ

Підготовка

Розчини піддослідних хімічних речовин та контрольні або базові сполуки повинні готуватися безпосередньо перед проведенням тесту з використанням відповідного середовища. У випадку з органічними сполуками, які є нерозчинними у воді, потрібно використовувати не більше 2% розчину органічних розчинників, таких як етанол, ацетон чи диметилсульфоксид (ДМСО). Остаточна концентрація середовища не повинна відчутно впливати на життєздатність клітин і характеристики їх росту.

Метаболічна активація

Клітини повинні піддаватись впливу досліджуваної хімічної речовини як в присутності відповідної екзогенної системи метаболічної активації, так і за її відсутності. Найчастіше використовується система доповненої коферментами пост-мітохондріальної фракції з печінок гризунів, попередньо оброблених реагентами з включенням ензимів. Використання інших біологічних видів, тканин, пост-мітохондріальних фракцій або процедур також може бути доцільним для метаболічної активації.

Умови тестування:

Штами-аналізатори

Штамами, що найчастіше використовуються, є диплоїди D , D , 4 5 D та JD1. Може бути більш доцільним використання інших штамів. 7

Середовище

Відповідне середовище для культур використовується для визначення кількості одиниць, що вижили, і частоти мітотичної рекомбінації.

Використання негативних і позитивних контрольних груп

Концентрація для впливу

Потрібно використовувати щонайменше п'ять концентрацій досліджуваної речовини з адекватними проміжками між ними. Серед фактів, які потрібно взяти до уваги, слід зазначити цитотоксичність та розчинність. Найнижча концентрація може не впливати на життєздатність клітин. Для токсичних хімічних речовин найвища досліджувана концентрація не повинна зменшувати показника одиниць, що вижили, менш ніж на 5-10%. Відносно нерозчинні у воді хімічні речовини потрібно випробовувати до їх межі розчинності з використанням відповідних процедур. Для нетоксичних речовин, що вільно розчиняються у воді, найвища концентрація визначається для кожного окремого випадку.

Клітини можна піддавати впливу досліджуваної речовини як під час стаціонарної фази, так і під час росту на періоди не більше 18 годин. Проте, якщо передбачається використання культур впродовж більшого періоду часу, культури потрібно мікроскопічно дослідити на предмет утворення спор, за умови присутності яких результати тестування вважатимуться недійсними.

Умови інкубації

Чашки вирощують у темряві від чотирьох до семи днів при 28-30 град.C. Чашки, що використовуються для аналізу червоних та рожевих гомозиготних секторів, утворених шляхом мітотичного кросинговеру, потрібно тримати в холодильнику (при температурі близько 4 град.C) впродовж 1-2 днів перед оцінюванням, що дає змогу розвиватися відповідним пігментованим колоніям.

Частота спонтанних мітотичних рекомбінацій

Суб-культури повинні використовуватись зі спонтанною частотою мутацій при мітотичних рекомбінаціях в межах прийнятого звичайного діапазону.

Кількість повторень

Для аналізу фототрофів, що утворилися в результаті мітотичної конверсії генів, та життєздатності потрібно використати щонайменше три чашки для повторення для кожної концентрації. У випадку проведення аналізу рецесивної гомозиготності, утвореної шляхом мітотичного кросинговеру, кількість чашок слід збільшити для забезпечення відповідної кількості колоній.

Процедури

1-5 х  10   клітин/мл  піддають  впливу   досліджуваної   хімічної
речовини   впродовж   18   годин  при  температурі  28-37  град.C,
збовтуючи;  відповідна кількість  елементів  системи  метаболічної
активації додається під час введення речовини, коли це доцільно.

Наприкінці періоду дії речовини клітини центрифугують, змивають та висівають у відповідне культуральне середовище. Після інкубації чашки оцінюють за ступенем виживання клітин та мітотичної рекомбінації.

Якщо перший експеримент дає негативні результати, потрібно провести другий експеримент з використанням клітин у стаціонарній фазі. Якщо перший експеримент дає позитивні результати, їх слід підтвердити шляхом незалежного експерименту.

2. ДАНІ

Дані мають бути представлені у формі таблиці з зазначенням кількості підрахованих колоній, кількості рекомбінацій, колоній, що вижили, та частоти рекомбінацій.

Результати потрібно підтверджувати шляхом незалежного експерименту.

Дані слід оцінювати, використовуючи відповідний статистичний метод.

3. ЗВІТНІСТЬ

3.1. ЗВІТ ПРО ПРОВЕДЕННЯ ТЕСТУ

За можливості, звіт про проведення тесту має містити наступну інформацію:

- використовувані штами,

- умови тестування: клітини у стаціонарній фазі або клітини у стадії росту, склад середовища, температура і тривалість інкубації, система метаболічної активації,

- умови піддавання дії речовини: концентрація введення, процедура і тривалість введення, температура введення, позитивний та негативний контроль,

- кількість підрахованих колоній, кількість рекомбінантів, частота рекомбінацій і виживання, співвідношення дози/реакції, у випадку застосування, статистична оцінка даних,

- обговорення результатів,

- інтерпретація результатів.

3.2. ОЦІНКА ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ

Дивіться Загальний вступ, Частину B.

4. ПОСИЛАННЯ

Дивіться Загальний вступ, Частину B.

B.17. МУТАГЕННІСТЬ - ТЕСТ IN VITRO НА ГЕННУ МУТАЦІЮ КЛІТИН ССАВЦІВ

1. МЕТОД

Цей метод відтворює метод, описаний у ТІ ОЕСР 476, Тест In Vitro на Генну Мутацію Клітин Ссавців (1997).

1.1. ВСТУП

Тест in vitro на генну мутацію клітин ссавців можна використовувати для визначення генних мутацій, спричинених хімічними речовинами. Придатними лініями клітин є клітини лімфоми мишей L5178Y, штами клітин китайського хом'яка CHO, CHO-AS52 та V79 та лімфобластоїдні клітини людини TK6 (1). В цих лініях клітин найбільш часто використовувані генетичні кінцеві точки вимірюють мутацію в тимідин-кіназі (ТК) та гіпоксантин-гуаніновій фосфорибосил трансферази (ГГФТ) та трансгену ксантин-гуаніновій фосфорибосил трансферази (КГФТ). Тести на мутації ТК, ГГФТ та КГФТ визначають різні спектри генетичних процесів. Аутосомне розташування ТК та КГФТ дає можливість виявлення генетичних процесів (наприклад, великих делецій), що не виявляються у локусі ГГФТ X-хромосом (2)(3)(4)(5)(6).

Для тесту in vitro на генну мутацію клітин ссавців можна використовувати культури усталених ліній клітин або штамів клітин. Клітини для використання відбираються, спираючись на здатність культури до зростання та стабільність частоти спонтанних мутацій.

Дослідження, що проводяться in vitro, зазвичай вимагають використання екзогенного джерела метаболічної активації. Ця система метаболічної активації не може повністю імітувати умов функціонування організму ссавців in vivo. Необхідно подбати про те, щоб уникнути умов, які призводять до результатів, які не відображають спадкової мутагенності. Результати, які не відображають спадкової мутагенності, можуть походити від змін pH, осмотичного тиску або високого рівня цитотоксичності (7).

Це дослідження використовується для обстеження на можливі мутагени і канцерогени у ссавців. Багато сполук, що дають позитивний результат у цьому дослідженні, є канцерогенами ссавців; проте, немає абсолютного співвідношення між цим дослідженням та канцерогенністю. Співвідношення залежить від класу хімічних речовин, і збільшується кількість даних, які доводять існування канцерогенів, що не виявляються за допомогою цього дослідження, оскільки є припущення, що вони діють через інші, не генотоксичні, механізми або механізми, відсутні у бактеріальних клітинах (6).

Дивіться також Загальний вступ, Частину B.

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ

Пряма мутація: генна мутація від материнського типу до мутантної форми, яка спричиняє зміну або втрату ензимної активності функції закодованого протеїну.

Мутагени заміщення пари основ: речовини, що спричиняють заміну однієї або кількох пар основ у ДНК.

Мутагени, що викликають мутації зі зсувом рамки: речовини, що спричиняють додавання чи делецію одиничних чи множинних пар основ у молекулі ДНК.

Час експресії фенотипу: період, впродовж якого незмінні генні продукти вичерпуються з клітин, що нещодавно мутували.

Частота мутацій: кількість виявлених клітин-мутантів, поділена на кількість життєздатних клітин.

Відносне загальне зростання: збільшення кількості клітин з часом у порівнянні з контрольною популяцією клітин; підраховуються як продукт росту суспензії по відношенню до часу для ефективності клонування негативної контрольної групи задля негативного контролю.

Відносне зростання суспензії: збільшення кількості клітин за період експресії по відношенню до негативної контрольної групи.

Життєздатність: ефективність клонування клітин, що піддаються дії речовини, за час знаходження у чашці за селективних умов після періоду експресії.

Виживання: ефективність клонування клітин, що піддаються дії речовини, по завершенні періоду цієї дії; виживання, зазвичай, виражається по відношенню до ступеню виживання у контрольній популяції клітин.

1.3. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

Клітини, позбавлені тимідин-кінази (ТК) завдяки мутації TK+/- -> TK-/- є стійкими до цитотоксичних впливів аналогу піримідину трифлюоротимідину (ТФТ). Спеціальні клітини тимідин-кінази чутливі до ТФТ, що спричиняє пригнічення клітинного метаболізму та припиняє подальший поділ клітин. Таким чином, клітини-мутанти здатні розростатися в присутності ТФТ, в той час як звичайні клітини, що містять тимідин-кіназу, до цього нездатні. Подібним чином, клітини, позбавлені ГГФТ або КГФТ, відбирають за ознакою резистентності до 6-тіогуаніну (ТГ) та 8-азагуаніну (АГ). Властивості досліджуваної речовини слід детально розглядати, якщо випробування основного аналогу або сполуки, пов'язаної з селективним реагентом, проводиться в рамках будь-якого тесту на генну мутацію клітин ссавців. Наприклад, будь-яка підозрювана вибіркова токсична дія досліджуваної речовини на мутантні або не мутантні клітини повинна досліджуватись. Таким чином, дія системи/реагента відбору має бути підтверджена, якщо досліджувані хімічні речовини структурно пов'язані з селективним реагентом.

Клітини у вигляді суспензії або моношарової культури піддаються впливу досліджуваної речовини як в присутності системи метаболічної активації, так і за її відсутності, на відповідний період часу та пасеруються з метою визначення цитотоксичності та для надання змоги вираження фенотипу перед відбором мутантів (9)(10)(11)(12)(13). Цитотоксичність, зазвичай, визначається за допомогою вимірювання відносної ефективності клонування (коефіцієнту виживання) або відносного показника загального росту культур по закінченні періоду дослідження. Культури, піддані дії речовини, утримуються в середовищі росту впродовж достатнього періоду часу, характерного для кожного відібраного локусу та типу клітини, з метою надання змоги максимально наближеного до оптимального вираження фенотипу спровокованих мутацій. Частота мутацій визначається за допомогою висівання певного числа клітин у середовище, що містить селективний реагент для визначення клітин-мутантів, та у середовище без селективного реагенту для визначення ефективності клонування (життєздатності). По завершенні відповідного періоду інкубації колонії підраховують. Частота мутацій виводиться з кількості колоній-мутантів у селективному середовищі та кількості колоній у неселективному середовищі.

1.4. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

1.4.1. Підготовка

1.4.1.1. Клітини

Різноманітність типів клітин, доступна для використання в цьому тесті, включає субклони клітин L5178Y, CHO, CHO-AS52, V79 або TK6. Типи клітин, що використовуються в цьому тесті, повинні мати явну чутливість до хімічних мутагенів, високу ефективність клонування та стабільну частоту спонтанних мутацій. Клітини потрібно перевіряти на зараження мікоплазмою; при виявленні зараження їх не слід використовувати.

Тест має бути розроблено з урахуванням попередньо визначеної чутливості та сили впливу. Кількість клітин, культур та концентрацій використаної досліджуваної речовини повинна відображати ці визначені параметри (14). Мінімальна кількість життєздатних клітин, що переживають піддавання дії речовини і використовуються на кожній стадії дослідження, має обумовлюватись частотою спонтанних мутацій. Основною рекомендацією є використовувати кількість клітин, що є принаймні вдесятеро інверсивнішою за частоту спонтанних мутацій. Проте, рекомендується 6

використовувати  щонайменше  10    клітин.   Адекватні   історично
встановлені  дані  про  систему  клітин  мають бути доступними для
зазначення послідовних результатів дослідження.

1.4.1.2. Середовище і умови для культур

Для підтримання культур потрібно використовувати відповідне середовище та умови вирощування (ємкості для культур, температури, концентрації CO і вологості). Середовище слід вибирати згідно з 2

системами  відбору  та  типу  клітин,  що  використовувалися   для
дослідження.  Особливо важливо,  щоб умови для культур обиралися з
забезпеченням оптимальних умов для росту клітин  під  час  періоду
експресії  та  здатності формувати колонії як мутантних,  так і не
мутантних клітин.

1.4.1.3. Підготовка культур

Клітини розводяться з вихідної культури, висіваються в культуральне середовище та вирощуються при 37 град.C. Перед проведенням тесту культури можуть потребувати очищення від раніше існуючих мутантних клітин.

1.4.1.4. Метаболічна активація

Клітини повинні піддаватись впливу досліджуваної речовини як в присутності відповідної системи метаболічної активації, так і за її відсутності. Найчастіше використовується система доповненої коферментами пост-мітохондріальної фракції (S9), приготованої з печінок гризунів, оброблених ензимами, включаючи такі агенти, як Арохлор-1254 (15)(16)(17)(18) або суміш фенобарбіталу та нафтофлавону (19)(20).

Пост-мітохондріальна фракція, зазвичай, використовується в концентраціях в діапазоні від 1-10% в об'ємному співвідношенні в кінцевому піддослідному середовищі. Вибір та стан системи метаболічної активації можуть залежати від класу хімічних речовин, що випробовуються. В деяких випадках може бути доцільним використання більш ніж однієї концентрації пост-мітохондріальної фракції.

Кількість подій, включаючи створення ліній клітин, що експресують специфічні аміноацил-РНК-синтетази, за допомогою генної інженерії, може надати потенціал для ендогенної активації. Вибір ліній клітин для використання має бути науково виправданим (наприклад, відповідністю цитохрому P450 ізоензиму для метаболізму досліджуваної речовини).

1.4.1.5. Досліджувана речовина/Підготовка

Тверді досліджувані речовини слід розчинити або довести до стану суспензії за допомогою відповідного розчинника або середовища і розбавити, якщо це є доцільним, перед обробкою клітин. Рідкі досліджувані речовини можна додавати безпосередньо до досліджуваних систем та/або розбавити перед введенням. Слід застосовувати свіжі препарати досліджуваної речовини, якщо тільки дані щодо стабільності не виявляють прийнятності зберігання.

1.4.2. Умови тестування:

1.4.2.1. Розчинник/середовище:

Не має бути підозри на хімічну реакцію розчинника/середовища з досліджуваною речовиною, вони також повинні бути придатними для виживання клітин і сумісними з діяльністю S9. Якщо використовується не добре відомий розчинник/середовище, їх включення має підтверджуватись даними, що доводять їхню сумісність. Рекомендується там, де можливо, використовувати спочатку водний розчинник/середовище. При тестуванні речовин, нестабільних при взаємодії з водою, використовувані органічні розчинники не мають містити води. Воду можна усунути шляхом додавання молекулярного сита.

1.4.2.2. Концентрація для впливу

При визначенні найвищої концентрації слід розглянути такі критерії, як цитотоксичність, розчинність в досліджуваних системах та зміни pH або осмотичного тиску.

Цитотоксичність потрібно визначати в присутності та за відсутності метаболічної активації в ході основного експерименту, використовуючи відповідний показник цілісності та росту клітин, такий, як відносна ефективність клонування (життєздатність) або відносний показник загального росту. Можливо, буде корисним визначення цитотоксичності та розчинності в ході підготовчого експерименту.

Потрібно використати щонайменше чотири концентрації, придатних до аналізування. У випадку цитотоксичності три концентрації повинні покривати діапазон від максимальної до незначної або відсутньої токсичності; це зазвичай означає, що рівні концентрації мають бути відділені більше, ніж фактором між 2 та Кк 10. Якщо максимальна концентрація визначається на основі цитотоксичності, вона має складати приблизно 10-20% (але не менше 10%) відносної життєздатності (відносної ефективності клонування) або відносного показника загального росту. Для відносно не цитотоксичних речовин максимальна концентрація для проведення тесту має становити 5 мг/мл, 5 мю л/мл або 0,01 Моль, яка є найнижчою.

Відносно нерозчинні речовини слід випробовувати до їх межі розчинності, використовуючи відповідні умови для культур. Докази нерозчинності мають визначатися в останньому досліджуваному середовищі, в якому клітини піддавали впливу. Може бути корисно оцінити розчинність на початку і в кінці тестування, тому що розчинність може змінюватися протягом періоду впливу в досліджуваній системі завдяки присутності клітин, S9, сироватки, і т.д. Нерозчинність можна визначити неозброєним оком. Осад не повинен змінювати результати оцінювання.

1.4.2.3. Контрольні групи

Паралельні позитивні та негативні контрольні групи (за розчинником або середовищем), як з метаболічною активацією, так і без неї, мають входити до складу кожного експерименту. При використанні метаболічної активації хімічна речовина, що використовується для позитивної контрольної групи, має бути такою, що вимагає активації для мутагенної реакції.

До речовин для позитивного контролю належать:

------------------------------------------------------------------
|  Умови для |  Локус  |      Речовина      |  Номер  |  Номер   |
|метаболічної|         |                    |   РСХ   |  ЄРІКХР  |
|  активації |         |                    |         |          |
|------------+---------+--------------------+---------+----------|
|Відсутність |ГГФТ     |Етилметансульфонат  | 62-50-0 | 200-536-7|
|екзогенної  |         |--------------------+---------+----------|
|метаболічної|         |Етилннитрозосечовина|759-73-9 | 212-072-2|
|активації   |---------+--------------------+---------+----------|
|            |ТК       |Метилметансульфонат | 66-27-3 | 200-625-0|
|            |(маленькі|                    |         |          |
|            |та великі|                    |         |          |
|            |колонії) |                    |         |          |
|            |---------+--------------------+---------+----------|
|            |КГФТ     |Етилметансульфонат  | 62-50-0 | 200-536-7|
|            |         |--------------------+---------+----------|
|            |         |Етилннитрозосечовина|759-73-9 | 212-072-2|
|------------+---------+--------------------+---------+----------|
|Присутність |ГГФТ     |3-метилхолантрен    | 56-49-5 | 200-276-4|
|екзогенної  |         |--------------------+---------+----------|
|метаболічної|         |N-нітрозодиметиламін| 62-75-9 | 200-549-8|
|активації   |         |--------------------+---------+----------|
|            |         |7,12-               | 57-97-6 | 200-359-5|
|            |         |диметилбензантрацен |         |          |
|            |---------+--------------------+---------+----------|
|            |ТК       |Циклофосфамід       | 50-18-0 | 200-015-4|
|            |(маленькі|--------------------+---------+----------|
|            |та великі|Циклофосфаміду      |6055-19-2|          |
|            |колонії) |моногідрат          |         |          |
|            |         |--------------------+---------+----------|
|            |         |Бензо(альфа)пірен   | 50-32-8 | 200-028-5|
|            |         |--------------------+---------+----------|
|            |         |3-метилхолантрен    | 56-49-5 | 200-276-5|
|            |---------+--------------------+---------+----------|
|            |  КГФТ   |N-нітрозодиметиламін| 62-75-9 | 200-549-8|
|            |         |(для високих рівнів |         |          |
|            |         |S-9)                |         |          |
|            |         |--------------------+---------+----------|
|            |         |Бензо(альфа)пірен   | 50-32-8 | 200-028-5|
------------------------------------------------------------------

Можна використати інші відповідні еталонні речовини для позитивного контролю, якщо, наприклад, в лабораторії є історична база даних з 5-бромо-2'-дезоксиуридину (номер РСХ 59-14-3, номер ЄРІКХР 200-415-9), ця еталонна речовина також може бути використана. За наявності може розглядатись застосування хімічної речовини, що використовується для позитивного контролю з огляду на клас.

Негативна контрольна група, що складається окремо з розчинника або середовища у досліджуваному середовищі, якому вводяться ті ж речовини, що і досліджуваним групам, також має бути включена. Окрім того, контрольні групи, що не піддавалися впливу досліджуваної речовини, теж повинні використовуватись, якщо немає історично встановлених даних з контролю, що показують відсутність шкідливих та мутагенних впливів обраного розчинника.

1.4.3. Процедура

1.4.3.1. Введення досліджуваної речовини

Клітини, що розростаються, потрібно піддати впливу досліджуваної речовини як за участю, так і без метаболічної активації. Дія речовини має тривати відповідний період часу (зазвичай, ефективним є період від трьох до шести годин). Період дії можна подовжити на один або більше клітинних циклів.

При кожній випробуваній концентрації можуть використовуватись як подвійні, так і одиночні культури. При використанні одиночних культур кількість використовуваних концентрацій слід збільшити з метою забезпечення достатньої кількості культур для аналізу (наприклад, принаймні вісім концентрацій, придатних до аналізування). Слід використовувати подвійні культури для негативного (за розчинником) контролю.

Газоподібні та летючі речовини випробовуються за допомогою відповідних методів, таких як запечатані ємкості для культур (21)(22).

1.4.3.2. Вимірювання частоти виживання, мутацій та життєздатності

По закінченні періоду впливу клітини змивають та вирощують з метою визначення частоти виживання та визначення вираження мутантного фенотипу. Вимірювання цитотоксичності за допомогою визначення відносної ефективності клонування (життєздатності) або відносного показника загального росту культур, зазвичай, починають по закінченні періоду дослідження.

Кожний локус має визначені мінімальні часові вимоги для наближеного до оптимального вираження фенотипу новоутворених мутантів (ГГФТ та КГФТ вимагають щонайменше 6-8 днів, а ТК - щонайменше 2 дні). Клітини вирощують у середовищі як із селективним реагентом (реагентами), так і без нього (них) з метою визначення кількості мутантів та ефективності клонування, відповідно. Вимірювання життєздатності (що використовується для підрахунку частоти мутацій) починається по закінченні періоду вираження; для цього клітини поміщають в чашку з неселективним середовищем.

Якщо досліджувана речовина дає позитивну реакцію у тестуванні на L5178Y TK+/-, потрібно провести калібрування колоній принаймні щодо однієї з досліджуваних культур (в найвищій позитивній концентрації) та в негативній та позитивній контрольних групах. Якщо досліджувана речовина дає негативну реакцію у тестуванні на L5178Y TK+/-, потрібно провести калібрування колоній в негативній та позитивній контрольних групах. У дослідженнях з використанням TK6TK+/- також можна використовувати калібрування колоній.

2. ДАНІ

2.1. ОБРОБКА РЕЗУЛЬТАТІВ

Дані повинні включати визначення цитотоксичності та життєздатності, підрахунки колоній та частоти мутацій для досліджуваних та контрольних культур. Якщо досліджувана речовина дає позитивну реакцію у тестуванні на L5178Y TK+/-, колонії оцінюють, використовуючи критерії малих та великих колоній на принаймні одній концентрації досліджуваної речовини (в найвищій позитивній концентрації) та на негативній та позитивній контрольних групах. Молекулярну та цитогенетичну природу мутантів як у малих, так і у великих колоніях, було детально досліджено (23)(24). У тестуванні на TK+/-колонії оцінюють, використовуючи критерії колоній з нормальним ростом (великих) та з повільним ростом (малих). Для мутантних клітин, що зазнали усебічних генетичних пошкоджень, час подвоєння збільшується і, таким чином, відбувається формування малих колоній. Ці пошкодження, зазвичай, знаходиться у проміжку від повних генних до видимих у каріотипах хромосомних аберацій. Провокування появи мутантів малих колоній було пов'язано з хімічними речовинами, які викликають значні хромосомні аберації (26). Менш уражені клітини-мутанти доростають до розмірів материнських клітин і формують великі колонії.

Слід надати дані про життєздатність (відносну ефективність клонування) або відносний показник загального росту. Частота мутацій повинна виражатись у вигляді кількості клітин-мутантів по відношенню до кількості клітин, що вижили.

Потрібні індивідуальні дані. Також всі дані повинні бути підсумовані у формі таблиці.

Немає вимог щодо перевірки чіткої позитивної реакції. Сумнівні результати мають перевірятися шляхом проведення подальших досліджень, переважно з використанням модифікації експериментальних умов. Негативні результати потрібно підтверджувати в окремих випадках. У випадках, коли підтвердження негативних результатів не вважається необхідним, потрібно навести обґрунтування. Модифікація параметрів дослідження з метою розширення діапазону оцінюваних умов буде розглядатися в подальших експериментах як з сумнівним, так і з негативним результатом. Параметри дослідження, що можуть бути модифіковані, включають в себе просторовий розподіл концентрації та умови метаболічної активації.

2.2. ОЦІНКА ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

Є кілька критеріїв для визначення позитивного результату, такі як збільшення, пов'язане з концентрацією, або відтворюване збільшення частоти мутацій. Перш за все необхідно враховувати біологічну релевантність результатів. Можливе використання статистичних методів в якості допоміжних при оцінюванні результатів тестування. Статистична значимість не має бути єдиним фактором, що визначає позитивну реакцію.

Досліджувана речовина, результати тестування якої не відповідають вищезазначеним критеріям, вважається немутагенною в цій системі.

Хоча більшість досліджень дає чітко позитивні або негативні результати, в поодиноких випадках сукупність даних виключає можливість визначеного судження про активність досліджуваної речовини. Результати можуть залишатись сумнівними або проблематичними, не зважаючи на кількість повторень експерименту.

Позитивні результати тесту in vitro на генну мутацію клітин ссавців означають, що досліджувана речовина викликає генні мутації у використаних для тестування культивованих клітинах ссавців. Позитивна відтворювана реакція на концентрацію є більш значущою. Негативні результати означають, що в умовах тестування досліджувана речовина не викликає генних мутацій у використаних для тестування культивованих клітинах ссавців.

3. ЗВІТНІСТЬ

ЗВІТ ПРО ПРОВЕДЕННЯ ТЕСТУВАННЯ

За можливості, звіт про проведення тестування має містити наступну інформацію:

Розчинник/середовище:

- обґрунтування для вибору середовища/розчинника,

- розчинність та стабільність досліджуваної речовини в розчиннику/середовищі, якщо це відомо.

Клітини:

- тип і джерело клітин,

- кількість клітинних культур,

- кількість клітинних пасажів, у випадку застосування,

- метод збереження культури клітин, у випадку застосування,

- відсутність мікоплазми.

Умови тестування:

- обґрунтування для вибору концентрацій і кількості культур, включаючи, наприклад, дані про цитотоксичність та обмеження щодо розчинності, якщо вони є доступними,

- склад середовища, концентрація CO , 2

- концентрація досліджуваної речовини,

- об'єм середовища і доданої досліджуваної речовини,

- температура вирощування,

- час вирощування,

- тривалість дії речовини,

- щільність клітин під час дії речовини,

- тип і склад системи метаболічної активації, включаючи прийнятності,

- позитивні та негативні контрольні групи,

- тривалість періоду вираження (включаючи кількість висіяних клітин, субкультур та графіки федінгу, якщо це є доцільним),

- селективні реагенти,

- критерії віднесення тестування до позитивного, негативного, або сумнівного розряду,

- методи, використані для рахування кількості життєздатних клітин та клітин-мутантів,

- визначення колоній, розмір і тип яких розглядалися (включаючи визначення "малих" та "великих" колоній, якщо це є доцільним).

Результати:

- ознаки токсичності,

- ознаки преципітації,

- дані про pH та осмотичний тиск впродовж періоду введення досліджуваної речовини, якщо визначено,

- розмір колонії, якщо він оцінювався, принаймні для негативної та позитивної контрольних груп,

- компетентність лабораторії для визначення мутантів малих колоній за допомогою системи L5178Y TK+/-, де це доцільно,

- співвідношення дози і реакції, де можливо,

- статистичний аналіз, якщо він має місце,

- паралельні дані позитивних та негативних контрольних груп (розчинник або середовище),

- історично встановлені дані позитивних та негативних контрольних груп (розчинник або середовище), з діапазонами, середніми показниками та стандартними відхиленнями,

- частота мутацій.

Обговорення результатів.

Висновки.

4. ПОСИЛАННЯ

(1) Moore, M.M., DeMarini, D.M., DeSerres, F.J. and Tindall, K.R. (Eds.), (1987) Banbury Report 28: Mammalian Cell Mutagenesis, Cold Spring Harbor Laboratory, New York.

(2) Chu, E.H.Y. and Malling, H.V., (1968) Mammalian Cell Genetics. II. Chemical Induction of Specific Locus Mutations in Chinese Hamster Cells In Vitro, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 61, p. 1306-1312.

(3) Liber, H.L. and Thilly, W.G., (1982) Mutation Assay at the Thymidine Kinase Locus in Diploid Human Lymphoblasts. Mutation Res., 94, p. 467-485.

(4) Moore, M.M., Harington-Brock, K., Doerr, C.L. and Dearfield, K.L., (1989) Differential Mutant Quantitation at the Mouse Lymphoma TK and CHO HGPRT Loci. Mutagenesis, 4, p. 394-403.

(5) Aaron, C.S. and Stankowski, Jr.L.F., (1989) Comparison of the AS52/XPRT and the CHO/HPRT Assays: Evaluation of Six Drug Candidates. Mutation Res., 223, p. 121-128.

(6) Aaron, C.S., Bolcsfoldi, G., Glatt, H.R., Moore, M., Nishi, Y., Stankowski, Jr.L.F., Theiss, J. and Thompson, E., (1994) Mammalian Cell Gene Mutation Assays Working Group Report. Report of the International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Mutation Res., 312, p. 235-239.

(7) Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B.C., (1991) Genotoxicity Under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9. Mutation Res., 257, p. 147-204.

(8) Clive, D., McCuen, R., Spector, J.F.S., Piper, C. and Mavournin, K.H., (1983) Specific Gene Mutations in L5178Y Cells in Culture. A Report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program. Mutation Res., 115, p. 225-251.

(9) Li, A.P., Gupta, R.S., Heflich, R.H. and Wasson, J.S., (1988) A Review and Analysis of the Chinese Hamster Ovary/Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase System to Determine the Mutagenicity of Chemical Agents: A Report of Phase III of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program. Mutation Res., 196, p. 17-36.

(10) Li, A.P., Carver, J.H., Choy, W.N., Hsie, A.W., Gupta, R.S., Loveday, K.S., O'Neill, J.P., Riddle, J.C., Stankowski, L.F.Jr. and Yang, L.L., (1987) A Guide for the Performance of the Chinese Hamster Ovary Cell/Hypoxanthine-Guanine Phosphoribosyl Transferase Gene Mutation Assay. Mutation Res., 189, p. 135-141.

(11) Liber, H.L., Yandell, D.W and Little, J.B., (1989) A Comparison of Mutation Induction at the TK and HPRT Loci in Human Lymphoblastoid Cells: Quantitative Differences are Due to an Additional Class of Mutations at the Autosomal TK Locus. Mutation Res., 216, p. 9-17.

(12) Stankowski, L.F. Jr., Tindall, K.R. and Hsie, A.W., (1986) Quantitative and Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate-and ICR 191-Induced Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate-and ICR 191-Induced Mutation in AS52 Cells. Mutation Res., 160, p. 133-147.

(13) Turner, N.T., Batson, A.G. and Clive, D., (1984) Procedures for the L5178Y/TK+/- - TK+/- Mouse Lymphoma Cell Mutagenicity Assay. В: Kilbey, B.J. et al (eds.) Handbook of Mutagenicity Test Procedures, Elsevier Science Publishers, New York, p. 239-268.

(14) Arlett, C.F., Smith, D.M., Clarke, G.M., Green, M.H.L., Cole, J., McGregor, D.B. and Asquith, J.C., (1989) Mammalian Cell Gene Mutation Assays Based upon Colony Formation. В: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D.J., Ed., Cambridge University Press, p. 66-101.

(15) Abbondandolo, A., Bonatti, S., Corti, G., Fiorio, R., Loprieno, N. and Mazzaccaro, A., (1977) Induction of 6-Thioguanine-Resistant Mutants in V79 Chinese Hamster Cells by Mouse-Liver Microsome-Activated Dimethylnitrosamine. Mutation Res., 46, p. 365-373.

(16) Ames, B.N., McCann, J. and Yamasaki, E., (1975) Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, p. 347-364.

(17) Clive, D., Johnson, K.O., Spector, J.F.S., Batson, A.G. and Brown M.M.M., (1979) Validation and Characterisation of the L5178Y/TK+/- Mouse Lymphoma Mutagen Assay System. Mutat. Res., 59, p. 61-108.

(18) Maron, D.M. and Ames, B.N., (1983) Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, p. 173-215.

(19) Elliott, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C., (1992) Alternatives to Aroclor 1254-Induced S9 in In Vitro Genotoxicity Assays. Mutagenesis, 7, p. 175-177.

(20) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T., (1976) A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems. В: In vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, de Serres, F.J., Fouts, J.R., Bend, J.R. and Philpot, R.M. (eds), Elsevier, North-Holland, p. 85-88.

(21) Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T., (1982) CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids. В: Tice, R.R., Costa, D.L., Schaich, K.M. (eds). Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, p. 91-103.

(22) Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L., (1983) Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay. Environmental Mutagenesis, 5, p. 795-801.

(23) Applegate, M.L., Moore, M.M., Broder, C.B., Burrell, A. and Hozier, J.C., (1990) Molecular Dissection of Mutations at the Heterozygous Thymidine Kinase Locus in Mouse Lymphoma Cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, p. 51-55.

(24) Moore, M.M., Clive, D., Hozier, J.C., Howard, B.E., Batson, A.G., Turner, N.T. and Sawyer, J., (1985) Analysis of Trifluorothymidine-Resistant (TFTr) Mutants of L5178Y/TK+/- Mouse Lymphoma Cells. Mutation Res., 151, p. 161-174.

(25) Yandell, D.W., Dryja, T.P. and Little, J.B., (1990) Molecular Genetic Analysis of Recessive Mutations at a Heterozygous Autosomal Locus in Human Cells. Mutation Res., 229, p. 89-102.

(26) Moore, M.M. and Doerr, C.L., (1990) Comparison of Chromosome Aberration Frequency and Small-Colony TK-Deficient Mutant Frequency in L5178Y/TK+/- - 3.7.2C Mouse Lymphoma Cells. Mutagenesis, 5, p. 609-614.

B.18. ПОШКОДЖЕННЯ ТА РЕПАРАЦІЯ ДНК - НЕРЕПАРТИВНИЙ СИНТЕЗ ДНК - КЛІТИНИ ССАВЦІВ IN VITRO

1. МЕТОД

1.1. ВСТУП

Дивіться Загальний вступ, Частину B.

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ

Дивіться Загальний вступ, Частину B.

1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ

Немає.

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

Тест на нерепаративний синтез ДНК (НСД) визначає синтез репарації ДНК після ексцизії та усунення ділянки ДНК, що містить зону з пошкодженням, спричиненим хімічними та фізичними агентами. Тест ґрунтується на введенні тимідину, міченого тритієм (3H-TdR), в ДНК клітин ссавців, які знаходяться не в S-фазі клітинного циклу. Поглинання 3H-TdR може визначатись за допомогою авторадіографії або сцинтиляційного рахунку (СР) ДНК, взятої з клітин, що піддавалися дії речовини. Клітини ссавців у культурі, якщо тільки вони не є первинними гепатоцитами щурів, піддаються дії випробуваних агентів як в присутності екзогенної системи метаболічної активації, так і за її відсутності. НСД також може вимірюватись в системах in vivo.

1.5. КРИТЕРІЇ ЯКОСТІ

Немає.

1.6. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

Підготовка

Досліджувані хімічні речовини та контрольні або еталонні речовини потрібно готувати в середовищі росту, розчинити або усунути за допомогою відповідного середовища, а потім розбавити у середовищі росту для використання в процесі аналізу. Остаточна концентрація середовища не повинна впливати на життєздатність клітин.

Первинні культури гепатоцитів щурів, лімфоцитів людини або усталених ліній клітин (наприклад, диплоїдних фібробластів людини) можуть використовуватись для аналізу.

Клітини повинні піддаватись впливу досліджуваної хімічної речовини як в присутності відповідної системи метаболічної активації, так і за її відсутності.

Умови тестування:

Кількість клітин

Для кожної експериментальної точки необхідні принаймні дві клітинні культури для визначення НСД за допомогою авторадіографії і шість (або менше, якщо це є науково виправданим) - за допомогою СР.

Використання негативних і позитивних контрольних груп

Паралельні позитивні та негативні контрольні групи (без піддавання впливу досліджуваної речовини/або за середовищем), як з метаболічною активацією, так і без неї, мають входити до складу кожного експерименту.

Приклади позитивного контролю для аналізу гепатоцитів щурів включають 7,12-диметилбензатрацен (7,12-ДМБА) або 2-ацетиламінофлуорен (2-ААФ). Випадок використання усталених ліній клітин 4-нітроквінолін-N-оксид (4-НКО) є прикладом для позитивного контролю як для авторадіографічного, так і для СР-аналізу, що проводиться без метаболічної активації; N-диметилнітрозамін є прикладом сполуки для позитивного контролю за умови використання систем метаболічної активації.

Концентрація для впливу

Потрібно використовувати різні концентрації досліджуваної речовини у відповідному діапазоні, що дозволяє визначити реакцію. Найвища концентрація може викликати певні цитотоксичні ефекти. Відносно нерозчинні в воді сполуки потрібно тестувати до їх межі розчинності. Для нетоксичних хімічних речовин, що вільно розчиняються у воді, найвища досліджувана концентрація визначається для кожного окремого випадку.

Клітини

Для підтримання культур потрібно використовувати відповідне середовище росту, концентрацію CO , температуру і вологість. 2

Усталені  лінії клітин потрібно періодично перевіряти на зараження
мікоплазмою.

Метаболічна активація

Система метаболічної активації не використовується з первинними культурами гепатоцитів. Усталені лінії клітин та лімфоцити повинні піддаватись впливу досліджуваної речовини як в присутності відповідної системи метаболічної активації, так і за її відсутності.

Процедура

Підготовка культур

Короткострокові культури гепатоцитів щурів створюються за допомогою способу, що дозволяє щойно розчиненим у відповідному середовищі гепатоцитам приєднуватись до поверхні, що росте.

Культури лімфоцитів людини готують шляхом використання відповідних технік.

Піддавання культур дії досліджуваної речовини

Первинні гепатоцити щурів

Щойно ізольовані гепатоцити щурів піддають дії досліджуваної речовини в середовищі, що стримує 3H-TdR на певний період часу. Наприкінці періоду введення речовини середовище виливається з ємкості, де знаходяться клітини, які потім промивають, фіксують та висушують. Мікроскопічні препарати потрібно занурити у авторадіографічну емульсію (можна використати як альтернативу плівку зі зйомною емульсією), піддати впливу речовини, проявити, зафарбувати та підрахувати.

Усталені лінії клітин і лімфоцити

Техніки авторадіографії: клітинні культури піддають впливу досліджуваної речовини впродовж певного періоду, після чого їх піддають дії 3H-TdR. Час визначається, виходячи з природи речовини, активності систем метаболізму та типу клітин. Щоб визначити пік НСД, слід додати 3H-TdR або одночасно з досліджуваною речовиною, або через кілька хвилин після введення досліджуваної речовини. На вибір між цими двома процедурами можуть впливати можливі взаємодії між досліджуваною речовиною та 3H-TdR. Для визначення різниці між НСД та напівконсервативною реплікацією ДНК, останню слід інгібітувати, наприклад, шляхом використання аргінін-недостатнього середовища, низького вмісту сироватки або гідроксикарбаміду в культуральному середовищі.

Ср-вимірювання НСД: перед введенням досліджуваної речовини входження клітин в S-фазу слід блокувати, як описано вище; потім клітини слід піддати впливу досліджуваних хімічних речовин, як описано в процедурі для авторадіографії. Наприкінці інкубаційного періоду ДНК потрібно вилучити з клітин і визначити загальний вміст ДНК та об'єм 3H-TdR з визначеною інкорпорацією.

Слід зазначити, що, коли у вищезазначених техніках використовуються лімфоцити людини, пригнічення напівконсервативної реплікації ДНК не є необхідним для культур, які не було піддано стимуляції.

Аналіз

Авторадіографічні визначення

Про визначенні НСД в клітинах культури ядра S-фази не підраховуються. Потрібно підрахувати щонайменше 50 клітин на концентрацію. Мікроскопічні препарати перед підрахунком слід закодувати. На кожному мікроскопічному препараті потрібно обрахувати декілька віддалених випадкових полів. Кількість інкорпорацій 3H-TdR в цитоплазму повинна визначатись шляхом обрахування трьох зон ядра певних розмірів в цитоплазмі кожної обрахованої клітини.

Визначення СР

Для кожної концентрації і в контрольних групах для визначення СР методом НСД слід використовувати достатню кількість культур.

Всі результати потрібно підтверджувати шляхом незалежного експерименту.

2. ДАНІ

Дані мають бути представлені у формі таблиці.

2.1. АВТОРАДІОГРАФІЧНІ ВИЗНАЧЕННЯ

Об'єм 3H-TdR в цитоплазмі та кількість гранул, знайдених на клітинному ядрі, повинні фіксуватись окремо.

Для описання розподілу об'єму 3H-TdR в цитоплазмі та кількості гранул на ядро можливе використання середнього показника, медіани та моди.

2.2. ВИЗНАЧЕННЯ СР

Для визначень СР інкорпорація 3H-TdR має вноситись до звіту, як кількість розпадків на хвилину/мг ДНК. Середня кількість розпадків на хвилину/мг ДНК зі стандартним відхиленням може використовуватись для опису розподілу інкорпорації.

Дані слід оцінювати, використовуючи відповідний статистичний метод.

3. ЗВІТНІСТЬ

3.1. ЗВІТ ПРО ПРОВЕДЕННЯ ТЕСТУВАННЯ

За можливості звіт про проведення тестування має містити наступну інформацію:

- клітини, що використовувались, щільність та кількість пасажів за час дії речовини, кількість клітинних культур,

- методи, що використовувались для збереження клітинних культур, включаючи середовище, температуру і концентрацію CO , 2

- досліджувану речовину, середовище, концентрації та обґрунтування для вибору концентрацій, використаних для аналізу,

- детальний опис систем метаболічної активації,

- графік введення,

- позитивні та негативні контрольні групи,

- техніки авторадіографії, що використовувались,

- процедури, що використовувались для блокування входження клітин в S-фазу,

- процедури, що використовувались для вилучення ДНК та визначення загального вмісту ДНК у межах визначення СР,

- співвідношення дози і реакції, де можливо,

- статистичну оцінку,

- обговорення результатів,

- інтерпретацію результатів.

3.2. ОЦІНКА ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ

Дивіться Загальний вступ, Частину B.

4. ПОСИЛАННЯ

Дивіться Загальний вступ, Частину B.

B.19. АНАЛІЗ ОБМІНУ СЕСТРИНСЬКИМИ ХРОМАТИДАМИ IN VITRO

1. МЕТОД

1.1. ВСТУП

Дивіться Загальний вступ, Частину B.

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ

Дивіться Загальний вступ, Частину B.

1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ

Немає.

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

Аналіз обміну сестринськими хроматидами (ОСХ) є короткостроковим дослідженням на визначення взаємних обмінів ДНК між двома сестринськими хроматидами хромосоми, що знаходяться у процесі дуплікації. ОСХ являють собою взаємний обмін продуктами реплікації ДНК на ймовірно гомологічних локусах. Процес обміну, ймовірно, включає в себе розрив і возз'єднання ДНК, хоча про молекулярну основу цих процесів є мало відомостей. Виявлення ОСХ вимагає деяких середніх значень для сестринських хроматид, яким надаються окремі етикетки, що може досягатися інкорпорацією бромдезоксиуридину (БДУ) в хромосомну ДНК для двох клітинних циклів.

Клітини ссавців in vitro піддаються впливу досліджуваної хімічної речовини як з екзогенною системою метаболічної активації у ссавців, так і без неї, якщо це є доцільним, і вирощуються культури за два цикли реплікації в середовищі, що містить БДУ. Після піддавання дії інгібітору веретена (наприклад, колхіцину) для накопичення клітин у метафазоподібній стадії мітозу (с-метафазі) клітини збирають і роблять хромосомні препарати.

1.5. КРИТЕРІЇ ЯКОСТІ

Немає.

1.6. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

1.6.1. Підготовка

- Первинні культури (лімфоцити людини) або усталені лінії клітин (наприклад, клітини яєчників китайського хом'яка) можуть використовуватись для аналізу. Лінії клітин потрібно перевіряти на зараження мікоплазмою.

- потрібно використовувати відповідне середовище та умови вирощування (наприклад, температуру, ємкості для культур, концентрацію CO і вологість). 2

- досліджувані речовини можуть бути приготовані у культуральному середовищі, розчинені або доведені до стану суспензії у відповідних середовищах перед обробкою клітин. Остаточна концентрація середовища в культуральній системі не повинна відчутно впливати на життєздатність клітин та їх рівень росту, а впливи на частоту ОСХ можна відслідковувати за допомогою контролю розчинника.

- клітини повинні піддаватись впливу досліджуваної речовини як в присутності екзогенної системи метаболічної активації у ссавців, так і за її відсутності. Як альтернатива, там, де використовуються типи клітин із внутрішньою метаболічною активністю, рівень та природа активності має відповідати досліджуваному класу хімічних речовин.

1.6.2. Умови тестування:

Кількість клітин

Для кожної експериментальної точки потрібно використовувати щонайменше подвійні культури.

Використання негативних і позитивних контрольних груп

Позитивні контрольні групи з використанням як сполуки прямої дії, так і сполуки, що вимагає метаболічної активації, повинні бути включені у кожний експеримент, також потрібно проводити контроль за середовищем.

Нижче наведено приклади речовин, що можуть використовуватися для позитивного контролю:

- сполука прямої дії:

- етилметансульфонат,

- сполука непрямої дії:

- циклофосфамід.

Якщо це є доцільним, можливе включення додаткового позитивного контролю для того самого хімічного класу, що й хімічна речовина, що тестується.

Концентрація для впливу

Потрібно використовувати щонайменше три концентрації досліджуваної речовини з адекватними проміжками між ними. Найвища концентрація повинна обумовити значний токсичний вплив, але не має впливати на адекватність реплікації клітин. Відносно нерозчинні в воді речовини слід тестувати до межі розчинності з використанням відповідних процедур. Для нетоксичних речовин, що вільно розчиняються у воді, найвища концентрація досліджуваної речовини визначається для кожного окремого випадку.

1.6.3. Процедура

Підготовка культур

Усталені лінії клітин генеруються з вихідних культур (наприклад, шляхом трипсинізації або відриву), що висіваються в ємкості для культур за відповідної щільності та інкубуються при температурі 37 град.C. Для моношарових культур кількість клітин на ємкість слід відрегулювати таким чином, щоб культури зливалися не набагато більше, ніж на 50% на час збору. В якості альтернативи, клітини можуть використовуватись у суспензійній культурі. Культури лімфоцитів людини готують шляхом застосування відповідних технік та вирощуються при температурі 37 град.C.

Піддавання дії речовини

Клітини в експоненціальній фазі росту піддають впливу досліджуваної речовини на відповідний період часу; в більшості випадків ефективність досягається за 1-2 години, але у певних випадках період дії можна подовжити до двох повних клітинних циклів. Клітини з достатньою внутрішньою метаболічною активністю повинні піддаватись впливу досліджуваної хімічної речовини як в присутності відповідної системи метаболічної активації, так і за її відсутності. По закінченні періоду впливу з клітин змивають досліджувану речовину та вирощують культури за два цикли реплікації за наявності БДУ. В якості альтернативної процедури, клітини можна одночасно піддавати впливу досліджуваної хімічної речовини та БДУ на повний період вирощування культури, що складає два клітинних цикли.

Культури лімфоцитів людини піддають дії речовини, коли вони знаходяться в напівсинхронному стані.

Клітини аналізують на етапі другого поділу після дії речовини, щоб переконатись, що найбільш чутливі стадії клітинного циклу було піддано впливу хімічної речовини. З усіма культурами, до яких додається БДУ, слід працювати в темряві або при тьмяному світлі від ламп розжарювання до моменту збору клітин з метою мінімізації фотолізу ДНК, що містить БДУ.

Збір клітин

Клітинні культури піддають дії інгібітору веретена (наприклад, колхіцину) впродовж часу від 1 до 4 годин до моменту збору. Кожну культуру збирають і обробляють окремо для підготовки хромосом.

Підготовка хромосомних препаратів і зафарбовування хромосом

Хромосомні препарати роблять за допомогою стандартних цитогенетичних технік. Зафарбовування мікроскопічних препаратів може здійснюватись з використанням декількох технік (наприклад, флуоресценція плюс метод Гімза).

Аналіз

Кількість клітин, підданих аналізу, має засновуватися на спонтанній контрольній частоті ОСХ. Як правило, для ОСХ аналізують щонайменше 25 метафаз, що добре розрослися, на культуру. Мікроскопічні препарати отримують перед аналізом. В лімфоцитах людини аналізуються тільки метафази, що містять 46 центромерів. В усталених лініях клітин аналізуються тільки метафази, що містять +- 2 центромери модального числа. Слід зазначити, чи мала місце центромерна зміна етикетки, оцінена як ОСХ. Результати потрібно підтверджувати шляхом незалежного експерименту.

2. ДАНІ

Дані мають бути представлені у формі таблиці. Кількість ОСХ для кожної метафази та кількість ОСХ на хромосому для кожної метафази має вноситись до списку окремо для всіх піддослідних і контрольних культур.

Дані слід оцінювати, використовуючи відповідний статистичний метод.

3. ЗВІТНІСТЬ

3.1. ЗВІТ ПРО ПРОВЕДЕННЯ ТЕСТУВАННЯ

За можливості звіт про проведення тестування має містити наступну інформацію:

- клітини, що використовувались, метод збереження культури клітин,

- умови тестування: склад середовища, концентрація CO , 2 концентрація досліджуваної речовини, використане середовище, температура інкубації, період дії, використаний інгібітор веретена, його концентрація і тривалість його введення, використаний тип системи активації клітин ссавців, позитивні та негативні контрольні групи,

- кількість клітинних культур на експериментальну точку,

- детальний опис техніки, що використовувалась для підготовки мікроскопічних препаратів,

- кількість проаналізованих метафаз (дані наводяться окремо для кожної культури),

- середня кількість ОСХ на клітину і на хромосому (дані наводяться окремо для кожної культури),

- критерії для оцінки ОСХ,

- обґрунтування вибору дози,

- співвідношення дози і реакції, у випадку застосування,

- статистичну оцінку,

- обговорення результатів,

- інтерпретацію результатів.

3.2. ОЦІНКА ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ

Дивіться Загальний вступ, Частину B.

4. ПОСИЛАННЯ

Дивіться Загальний вступ, Частину B.

B.20. РЕЦЕСИВНИЙ ТЕСТ НА ЛЕТАЛЬНІСТЬ, ПОВ'ЯЗАНУ ЗІ СТАТЕВИМИ ВІДМІННОСТЯМИ, У ДРОЗОФІЛИ ЧОРНОЧЕРЕВОЇ

1. МЕТОД

1.1. ВСТУП

Дивіться Загальний вступ, Частину B.

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ

Дивіться Загальний вступ, Частину B.

1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ

Немає.

1.4. ПРИНЦИПИ МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

Рецесивний тест на летальність, пов'язану зі статевими відмінностями (РЛСВ) у дрозофіли чорночеревої, виявляє випадки мутацій, як точкових, так і невеликих делецій, у зародкових лініях комах. Цей тест є аналізом подальшої мутації, що здатний до скринінгу на мутації приблизно у 800 локусах у X-хромосомі, що являє собою біля 80% всіх локусів X-хромосоми. X-хромосома являє собою приблизно одну п'яту частину всього галоїдного геному.

Мутації у X-хромосомі дрозофіли чорночеревої є фенотиповими та виражені у комах чоловічої статі, носіїв мутантного гена. Коли мутація є летальною у гемізиготному стані, висновок про її присутність робиться, спираючись на відсутність одного класу нащадків-самців з двох, які були нормально народжені гетерозиготною самицею. РЛСВ-тест користується перевагами, наданими цими фактами, використовуючи особливим чином мічені та упорядковані хромосоми.

1.5. КРИТЕРІЇ ЯКОСТІ

Немає.

1.6. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

Підготовка

Лінії

Можна використовувати самців чітко визначеної лінії дикого типу та самиць лінії Мюллер-5. Також можна використовувати відповідним чином позначені лінії самиць із множинними інвертованими X-хромосомами.

Досліджувана речовина

Досліджувані речовини слід розчинити у воді. Речовини, які є нерозчинними у воді, можна розчинити або усунути за допомогою відповідного середовища (наприклад, суміші етанолу та Tween-60 або 80), потім розбавити водою або фізіологічним розчином перед введенням. Слід уникати диметилсульфоксиду (ДМСО) у якості середовища.

Кількість тварин

Тест має бути розроблено з урахуванням попередньо визначеної чутливості та сили впливу. Частота спонтанних мутацій, що спостерігається у відповідній контрольній групі, дуже впливатиме на кількість хромосом, підданих дії речовини, що є об'єктом аналізу.

Маршрут введення

Вводити речовину можна перорально, за допомогою ін'єкції або з використанням газів і пароподібних речовин. Федінг досліджуваної речовини може здійснюватися у розчині цукру. За необхідності, речовини можна розчинити у 0,7%-розчині NaCl та вприснути у грудну клітину чи черевну порожнину.

Використання негативних і позитивних контрольних груп

Слід залучати до тестування негативні (за середовищем) та позитивні контрольні групи. Проте, у випадку наявності відповідних історично встановлених даних з контролю, в паралельних контрольних групах потреби немає.

Рівні впливу

Потрібно використовувати три рівні впливу. Для попередньої оцінки можна використати один рівень впливу досліджуваної речовини, який є рівнем максимально допустимої концентрації або таким, що викликає певні ознаки токсичності. Для нетоксичних речовин слід використовувати вплив максимальної застосовної концентрації.

Процедура

Самців дикого типу (віком від 3 до 5 днів) піддають дії досліджуваної речовини та індивідуально спарюють з надлишком незапліднених самиць лінії Мюллер-5 або іншої відповідно маркованої (із множинними інвертованими X-хромосомами) лінії. Самиць замінюють на свіжих незапліднених кожні 2-3 дні, щоб охопити весь зародковий цикл клітини. Нащадків цих самиць оцінюють з точки зору летальних впливів, що відповідають впливам на зрілу сперму, сперматиди на середній або пізній стадії, сперматиди на ранній стадії, сперматоцити та сперматогонії під час дії речовини.

Гетерозиготні самиці F1 з вищенаведеного схрещування можуть спарюватись індивідуально (тобто, одна самиця на пробірку) з їх братами. В поколінні F2 кожна культура оцінюється за критерієм відсутності самців дикого типу. Якщо здається, що культура походить від самиці F1, що є носієм летальної батьківської X-хромосоми (тобто, не спостерігається самців з хромосомою, що була піддана дії речовини), дочок цієї самиці з тим самим генотипом слід протестувати, щоб встановити, чи летальність повторюється у наступному поколінні.

2. ДАНІ

Дані мають бути внесені в таблицю таким чином, щоб відобразити кількість піддослідних X-хромосом, кількість безплідних самців та кількість летальних хромосом для кожної концентрації впливу та для кожного періоду спарювання кожного піддослідного самця. Потрібно повідомляти про кількість скупчень різних розмірів на самця. Результати потрібно підтверджувати шляхом окремого експерименту.

Для оціночних рецесивних летальних тестів на базі статевих відмінностей слід використовувати відповідні статистичні методи. Потрібно розглянути і оцінити в певному статистичному ключі утворення скупчень рецесивних летальних генів, що походять від одного самця.

3. ЗВІТНІСТЬ

3.1. ЗВІТ ПРО ПРОВЕДЕННЯ ТЕСТУВАННЯ

За можливості звіт про проведення тестування має містити наступну інформацію:

- лінія: використовувані лінії чи штами, вік комах, кількість піддослідних самців, кількість безплідних самців, кількість утворених культур F2, кількість культур F2 без потомства, кількість хромосом, що є носіями виявленого летального гену у кожному зародковому циклі клітини.

- критерії визначення розміру піддослідних груп,

- умови тестування, детальний опис введення речовини та графік вибірки, рівень введення, дані щодо токсичності, негативних (за середовищем) та позитивних контрольних груп, якщо це є доцільним,

- критерії для оцінки летальних мутацій,

- співвіднесення дози/реакції, де можливо,

- оцінка даних,

- обговорення результатів,

- інтерпретація результатів.

3.2. ОЦІНКА ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ

Дивіться Загальний вступ, Частину B.

4. ПОСИЛАННЯ

Дивіться Загальний вступ, Частину B.

B.21. ТЕСТИ IN VITRO НА ТРАНСФОРМАЦІЮ КЛІТИН ССАВЦІВ

1. МЕТОД

1.1. ВСТУП

Дивіться Загальний вступ, Частину B.

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ

Дивіться Загальний вступ, Частину B.

1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ

Немає.

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

Системи культур клітин ссавців можна використовувати для виявлення змін фенотипу in vitro, спричинених хімічними речовинами, і пов'язаних зі злоякісною трансформацією in vivo. Широко використовуються такі клітини, як C3H10T1/2, 3T3, SHE, клітини щурів, що досліджують за методом Фішера; дослідження ґрунтуються на змінах морфології клітин, формуванні фокусу або змінах якірної залежності в напівтвердому агарі. Існують менш широко використовувані системи для визначення фізіологічних або морфологічних змін в клітинах внаслідок піддавання впливу канцерогенних хімічних речовин. Жодна з кінцевих точок тесту in vitro не має встановленого механістичного зв'язку з раком. Деякі з тестових систем здатні визначати провокуючі пухлини фактори. Цитотоксичність може визначатися за допомогою вимірювання впливу досліджуваного матеріалу на здатність до формування колоній (ефективність клонування) або швидкість росту культур. Вимірювання цитотоксичності полягає у встановленні того факту, що введення досліджуваної хімічної речовини було токсикологічно доцільним, але воно не може використовуватись для підрахунку трансформації: частота в усіх аналізах з деяких пір може включати подовжену інкубацію та/або повторний посів на чашках.

1.5. КРИТЕРІЇ ЯКОСТІ

Немає.

1.6. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

Підготовка

Клітини

Різноманітність ліній клітин або первинних клітин доступна в залежності від тесту на трансформацію, що використовується. Дослідник має переконатись у тому, що клітини у тесті, що проводиться, демонструють відповідні зміни фенотипу після піддавання їх впливу відомих канцерогенів і що тест, який проводиться в лабораторії дослідника, є вагомим та надійним, що доведено документально.

Середовище

Середовище та умови експерименту повинні відповідати методу аналізу трансформацій, що використовується.

Досліджувана речовина

Досліджувані речовини можуть бути приготовані у культуральному середовищі, розчинені або усунені у відповідні середовища перед обробкою клітин. Остаточна концентрація середовища в культуральній системі не повинна впливати на життєздатність клітин та їх швидкість росту або ступінь трансформацій.

Метаболічна активація

Клітини повинні піддаватись впливу досліджуваної речовини як в присутності відповідної системи метаболічної активації, так і за її відсутності. В якості альтернативи, коли використовуються типи клітин із внутрішньою метаболічною активністю, має бути відомо, що рівень та природа активності відповідає досліджуваному класу хімічних речовин.

Умови тестування:

Використання негативних і позитивних контрольних груп

Позитивні контрольні групи з використанням як сполуки прямої дії, так і сполуки, що вимагає метаболічної активації, повинні бути включені у кожний експеримент, також потрібно використовувати негативний контроль за середовищем.

Нижче наведено приклади речовин, що можуть використовуватися для позитивного контролю:

- Хімічні речовини прямої дії:

- Етилметансульфонат,

- бета-пропіолактон.

- Сполуки, які потребують метаболічної активації:

- 2-ацетиламінофлуорен,

- 4-диметиламіноазобензен,

- 7,12-диметилбензантрацен.

Якщо це є доцільним, потрібне включення додаткового позитивного контролю для того самого хімічного класу, що й сполука, яка тестується.

Концентрація для впливу

Потрібно використовувати декілька концентрацій досліджуваної речовини. Ці концентрації мають призводити до токсичних впливів, пов'язаних з концентрацією, найвища концентрація, що спричиняє низький рівень виживання, а показник виживання при найнижчій концентрації є приблизно таким самим, як і у негативній контрольній групі. Відносно нерозчинні в воді речовини потрібно випробовувати до межі розчинності з використанням відповідних процедур. Для нетоксичних речовин, що вільно розчиняються у воді, найвища концентрація досліджуваної речовини визначається для кожного окремого випадку.

Процедура

Клітини повинні піддаватись впливу на відповідний період часу в залежності від системи випробування, що використовується, і в цей період може входити повторне введення дози, яке супроводжується зміною середовища (і, за необхідності, приготуванням свіжої суміші для метаболічної активації), якщо період впливу подовжується. Клітини без достатньої внутрішньої метаболічної активності повинні піддаватись впливу досліджуваної речовини як в присутності відповідної системи метаболічної активації, так і за її відсутності. По закінченні періоду впливу з клітин змивають досліджувану речовину та вирощують культури, забезпечуючи умови, потрібні для появи трансформованого фенотипу, що спостерігається, та визначеного ступеню трансформацій. Всі результати підтверджуються шляхом незалежного експерименту.

2. ДАНІ

Дані мають бути представлені у формі таблиці і можуть відображатися у різних формах, в залежності від методу аналізу, який використовується, наприклад, чашкові підрахунки, позитивні чашки або кількість трансформованих клітин. Де це доцільно, виживання виражається у відсотковому співвідношенні контрольних рівнів, а частота трансформацій - як кількість трансформантів на кількість одиниць, що вижили. Дані слід оцінювати, використовуючи відповідний статистичний метод.

3. ЗВІТНІСТЬ

3.1. ЗВІТ ПРО ПРОВЕДЕННЯ ТЕСТУВАННЯ

За можливості звіт про проведення тестування має містити наступну інформацію:

- тип клітин, що використовувались, кількість клітинних культур, методи збереження клітинних культур,

- умови тестування: концентрація досліджуваної речовини, використане середовище, тривалість інкубації, тривалість та частота введення, щільність клітин під час дії речовини, тип використаної системи екзогенної метаболічної активації, позитивні та негативні контрольні групи, специфікація фенотипу, що спостерігається, використана система відбору (якщо це є доцільним), обґрунтування вибору дози,

- методи, використані для підрахунку кількості життєздатних та трансформованих клітин,

- статистичну оцінку,

- обговорення результатів,

- інтерпретацію результатів.

3.2. ОЦІНКА ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ

Дивіться Загальний вступ, Частину B.

4. ПОСИЛАННЯ

Дивіться Загальний вступ, Частину B.

B.22. ТЕСТ НА ДОМІНУВАННЯ ЛЕТАЛЬНИХ НАСЛІДКІВ У ГРИЗУНІВ

1. МЕТОД

1.1. ВСТУП

Дивіться Загальний вступ, Частину B.

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ

Дивіться Загальний вступ, Частину B.

1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ

Немає.

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

Домінування летальних наслідків спричиняє смерть ембріону або зародку. Індукція домінування летальних наслідків через вплив хімічної речовини означає, що речовина спричинила пошкодження зародкової тканини піддослідних видів. Те, що домінування летальних наслідків обумовлено хромосомними пошкодженнями, (структурними та кількісними аномаліями), є загальноприйнятим фактом. Смерть ембріону при введенні речовини самицям також може бути результатом токсичних впливів.

Як правило, самців піддають впливу досліджуваної сполуки, а потім вони спарюються з незаплідненими самицями, яким не вводили речовину. Різні зародкові цикли клітини можуть досліджуватись окремо з використанням послідовних інтервалів між спарюваннями. Збільшення кількості мертвих імплантатів на самицю в піддослідній групі по відношенню до мертвих імплантатів на самицю в контрольній групі відображає постімплантаційну втрату. Передімплантаційна втрата може оцінюватись, засновуючись на підрахунку жовтих тіл або на порівнянні загальної кількості імплантатів на самицю в піддослідній та контрольній групах. Загальне домінування летальних наслідків є сукупністю перед- та післяімплантаційних втрат. Підрахунок загального домінування летальних наслідків засновується на порівнянні кількості імплантатів на самицю в піддослідній групі по відношенню до живих імплантатів на самицю у контрольній групі. Зменшення кількості імплантатів у певних інтервалах може бути результатом лізису клітин (тобто, сперматоцитів та/або сперматогоніїв).

1.5. КРИТЕРІЇ ЯКОСТІ

Немає.

1.6. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

Підготовка

Якщо це можливо, досліджувані речовини слід розчинити або довести до стану суспензії за допомогою ізотонічного фізіологічного розчину. Хімічні речовини, які є нерозчинними у воді, можна розчинити або довести до стану суспензії за допомогою відповідного середовища. Використане середовище не має як взаємодіяти з досліджуваною хімічною речовиною, так і спричиняти токсичних впливів. Слід застосовувати свіжі препарати досліджуваної хімічної речовини.

Умови тестування:

Маршрут введення

Досліджувана сполука, як правило, може вводитися тільки один раз. Може застосовуватись і повторний графік введення, що засновується на токсикологічній інформації. Звичайними шляхами введення є пероральна інтубація або інтраперитонеальна ін'єкція. Можуть бути доцільними інші шляхи введення.

Піддослідні тварини

Дослідження рекомендується проводити на мишах або щурах. Здорових і повністю статевозрілих тварин відбирають навмання і розподіляють в піддослідну і контрольну групи.

Кількість і стать

Повинна використовуватись достатня кількість піддослідних самців, беручи до уваги спонтанні варіації біологічного характеру, що оцінюються. Обрана кількість має ґрунтуватись на заздалегідь визначеній чутливості до виявлення та силі значущості. Наприклад, у типовому тесті кількість самців у кожній групі в залежності від дози повинна бути достатньою для забезпечення запліднення від 30 до 50 самиць за інтервал спарювання.

Використання негативних і позитивних контрольних груп

Як правило, паралельні позитивні та негативні контрольні групи (за середовищем) мають входити до складу кожного експерименту. Якщо прийнятні результати позитивної контрольної групи отримані в результаті раніше проведених у тій самій лабораторії експериментів, ці результати можна використати замість паралельної позитивної контрольної групи. Речовини для позитивного контролю для демонстрації чутливості до тесту слід використовувати у відповідному низькому дозуванні (наприклад, ММС внутрішньобрюшинно, 10 мг/кілограм).

Рівні дозування

Зазвичай, слід використовувати три рівні впливу. Під дією високої дози у піддослідних тварин з'являються ознаки токсичності або зниженої фертильності. В певних випадках може бути достатньо одноразового введення дози високого рівня.

Тестування на граничний вміст

Нетоксичні речовини повинні випробовуватись у дозі 5 мг/кілограм за одне введення або 1 г/кілограм/день, використовуючи повторювані введення.

Процедура

Є доступними декілька графіків введення речовини. Найчастіше використовується одноразове введення досліджуваної речовини. Можна використати інші графіки введення.

Окремі самці послідовно спарюються з однією або двома незаплідненими самицями, яким не вводили речовину, з відповідними інтервалами після введення речовини. Самиць потрібно залишити з самцями принаймні на час одного естрального циклу або до спарювання, яке визначається наявністю сперми у вагіні або у вагінальній пробці.

Кількість спарювань після введення речовини регулюється графіком введення та має гарантувати, що з усіх зародкових циклів клітини після введення речовини буде взято зразки.

Самиць знищують у другій половині вагітності, а вміст матки досліджують на предмет визначення кількості мертвих та живих імплантатів. Можливе проведення дослідження яєчників для визначення кількості жовтих тіл.

2. ДАНІ

Дані мають бути внесені в таблицю таким чином, щоб відобразити кількість вагітних самців та кількість невагітних самиць. Про результати кожного спарювання, включаючи ідентичність кожного самця та самиці, потрібно повідомляти окремо. Щодо кожної самиці в тиждень спарювання потрібно фіксувати рівень дозування, отриманий самцями, частоту виявлення живих та мертвих імплантатів.

Підрахунок загального домінантного летального ефекту засновується на порівнянні кількості імплантатів на самицю в піддослідній групі по відношенню до живих імплантатів на самицю в контрольній групі. Співвідношення кількості мертвих і живих імплантатів в піддослідній групі порівняно з тим самим співвідношенням у контрольній групі аналізується з метою визначення постімплантаційних втрат.

Якщо дані фіксуються із зазначенням смертності на ранніх та на пізніх стадіях, це має бути чітко відображено у таблицях. Якщо оцінюється передімплантаційна втрата, це має бути відображено у звіті. Передімплантаційна втрата може розраховуватись як різниця між кількістю жовтих тіл та кількістю імплантатів або як зменшення середньої кількості імплантатів на матку в порівнянні з даними контрольної групи.

Дані оцінюють, використовуючи відповідні статистичні методи.

3. ЗВІТНІСТЬ

3.1. ЗВІТ ПРО ПРОВЕДЕННЯ ТЕСТУВАННЯ

За можливості звіт про проведення тестування має містити наступну інформацію:

- біологічні види, штам, вік та вага використовуваних тварин, кількість тварин кожної статі в експериментальній і контрольній групах,

- досліджувана речовина, середовище, досліджені рівні дозування та обґрунтування вибору дози, позитивні та негативні контрольні групи, дані щодо токсичності,

- шлях та графік введення,

- графік спарювання,

- метод, що використовується для визначення того, що спарювання вже відбулося,

- час знищення,

- критерії для оцінки домінування летальних наслідків,

- співвідношення дози і реакції, у випадку застосування,

- статистичну оцінку,

- обговорення результатів,

- інтерпретацію результатів.

3.2. ОЦІНКА ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ

Дивіться Загальний вступ, Частину B.

4. ПОСИЛАННЯ

Дивіться Загальний вступ, Частину B.

B.23. ТЕСТ НА ХРОМОСОМНУ СПЕРМАТОГОНІАЛЬНУ АБЕРАЦІЮ ССАВЦІВ

1. МЕТОД

Цей метод відтворює метод, описаний у ТІ ОЕСР 483, Тест на Хромосомну Сперматогоніальну Аберацію Ссавців (1997).

1.1. ВСТУП

Метою тесту in vivo на хромосомну сперматогоніальну аберацію є визначення тих речовин, які спричиняють структурні хромосомні аберації у сперматогоніальних клітинах ссавців (1)(2)(3). Структурні аберації можуть бути двох типів: хромосомні або хроматидні. При використанні більшості хімічних мутагенів спровоковані аберації належать до хроматидного типу, але трапляються також аберації хромосомного типу. Цей метод було розроблено не для вимірювання кількісних аберацій і, зазвичай, він не використовується з цією метою. Хромосомні мутації та пов'язані з ними явища є причиною багатьох генетичних хвороб людини.

Цей тест визначає хромосомні явища в сперматогоніальних зародкових клітинах та, таким чином, очікується, що за допомогою цього тесту можливо буде передбачити індукцію мутацій зародкових клітин, що передаються у спадок.

Зазвичай, для цього дослідження використовуються гризуни. Цей цитогенетичний тест in vivo визначає хромосомні аберації у сперматогоніальних мітозах. Інші цільові клітини не є предметом даного методу.

Для визначення аберацій хроматидного типу у сперматогоніальних клітинах, перший мітотичний поділ, що відбувається після введення речовини, має досліджуватись до того, як ці ураження буде втрачено в процесі подальшого поділу клітин. Додаткову інформацію зі сперматогоніальних стволових клітин, підданих дії речовини, можна отримати шляхом аналізу хромосом у фазі мітозу на аберації хромосомного типу в діакінезі метафази I, коли піддані дії речовини клітини стають сперматоцитами.

Цей тест in vivo призначений виявити, чи мутагени соматичних клітин також діють на зародкові клітини. Окрім того, сперматогоніальний тест є доцільним для оцінки мутагенної загрози, оскільки він дає змогу розглянути фактори метаболізму in vivo, фармакокінетику та процеси репарації ДНК.

Кількість поколінь сперматогоніїв є присутнім в сім'яниках зі спектром чутливості до впливу хімічних речовин. Таким чином, виявлені аберації являють собою загальну реакцію сперматогоніальних популяцій клітин, підданих дії речовини, з домінуванням більш численних диференційованих сперматогоніальних клітин. В залежності від їх положення в сім'яниках різні покоління сперматогоніїв можуть або не можуть стати об'єктом загального кровообігу через фізичний або фізіологічний бар'єр з клітин Сертолі та гемато-тестикулярний бар'єр.

Якщо є докази того, що досліджувана речовина або реактивні метаболіти не досягнуть цільової тканини, проведення цього дослідження не є доцільним.

Дивіться також Загальний вступ, Частину B.

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ

Геп: ахроматичне ушкодження, менше за ширину хроматиди, і з мінімальним порушенням орієнтації хроматид.

Кількісна аберація: зміна кількості хромосом відносно характеристик нормальної кількості у використаних тварин.

Структурна аберація: зміна в структурі хромосом, що визначається при мікроскопічному дослідженні метафазної стадії поділу клітини, яка спостерігається у вигляді делецій, внутрішнього або взаємного обміну.

1.3. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

Тварин піддають впливу досліджуваної речовини, використовуючи відповідний шлях введення, і знищують у зазначений час після втручання. Перед знищенням тварин піддають дії речовин, що спричиняють блокування метафази (наприклад, колцеміду(R) або колхіцину). Потім виготовляють хромосомні препарати з зародкових клітин і зафарбовують їх, і метафазні клітини аналізують на предмет хромосомних аберацій.

1.4. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

1.4.1. Підготовка

1.4.1.1. Вибір біологічних видів тварин

Зазвичай, використовують самців мишей та китайських хом'яків. Проте, можливе використання самців інших придатних біологічних видів ссавців. Слід залучити для проведення тестувань лабораторні лінії здорових молодих дорослих тварин, що зазвичай використовуються. На початку дослідження коливання ваги тварин має бути мінімальним і не перевищувати +- 20% від середньої ваги.

1.4.1.2. Умови утримання і годування

1.4.1.3. Підготовка тварин

Здорових молодих дорослих самців призначають в піддослідну групу із застосуванням методу випадкового відбору. Клітки повинні розташовуватись таким чином, щоб мінімізувати можливі впливи на їх місце розташування. Тварини ідентифікуються окремо. Тварин пристосовують до лабораторних умов протягом щонайменше п'яти днів до початку проведення дослідження.

1.4.1.4. Підготовка доз

Тверді досліджувані речовини слід розчинити або довести до стану суспензії за допомогою відповідного розчинника або середовища і розбавити, якщо це є доцільним, перед обробкою клітин. Рідкі досліджувані речовини можна ввести безпосередньо або розбавити перед введенням. Слід застосовувати свіжі препарати досліджуваної речовини, якщо тільки дані щодо стабільності не виявляють прийнятності зберігання.

1.4.2. Умови тестування:

1.4.2.1. Розчинник/середовище:

Розчинник/середовище не повинне спричиняти токсичних впливів при використаному рівні дозування, а також не має бути підозри на хімічну реакцію розчинника/середовища з досліджуваною речовиною. Якщо використовується не добре відомі розчинники/середовища, їх включення має підтверджуватись даними, що доводять їхню сумісність. Рекомендується там, де можливо, використовувати спочатку водний розчинник/середовище.

1.4.2.2. Контрольні групи

Паралельні позитивні та негативні контрольні групи (з використанням розчинника або середовища) мають входити до складу кожного тестування. За винятком введення досліджуваної речовини, за тваринами в контрольній групі доглядають так само, як і за тваринами піддослідних груп.

Позитивні контрольні групи дають структурні хромосомні аберації in vivo в сперматогоніальних клітинах при введенні у рівнях дозування, за яких очікувалося зростання по відношенню до вихідних даних, яке можна виявити.

Концентрації для позитивних контрольних груп слід обирати таким чином, щоб впливи чітко проявлялися, проте, щоб ідентичність кодованих мікроскопічних препаратів не одразу виявлялася пристроєм для зчитування.

Можливим є варіант введення речовини позитивній контрольній групі іншим шляхом, ніж вводилася досліджувана речовина, потім зразок береться тільки один раз. Окрім того, за наявності, може розглядатись застосування хімічної речовини, що використовується для позитивного контролю з огляду на клас. До речовин для позитивного контролю належать:

------------------------------------------------------------------
|           Речовина            |  Номер РСХ   |  Номер ЄРІКХР   |
|-------------------------------+--------------+-----------------|
|Циклофосфамід                  |    50-18-0   |    200-015-4    |
|Циклофосфаміду моногідрат      |  6055-19-2   |                 |
|-------------------------------+--------------+-----------------|
|Циклогексиламін                |   108-91-8   |    203-629-0    |
|-------------------------------+--------------+-----------------|
|Мітоміцин C                    |    50-07-7   |    200-008-6    |
|-------------------------------+--------------+-----------------|
|Мономерний акриламід           |    79-06-1   |    201-173-7    |
|-------------------------------+--------------+-----------------|
|Триетілнемеламін               |    51-18-3   |    200-083-5    |
------------------------------------------------------------------

Негативні контрольні групи, яким вводиться тільки розчинник або середовище, а в інших випадках вводяться ті ж речовини, що і досліджуваним групам, мають включатися до кожного часу відбору проб, якщо тільки не є прийнятною міжтваринна варіативність і концентрація клітин з хромосомними абераціями виявлена завдяки історично встановленим даним з контролю. Окрім того, контрольні групи, що не піддавалися впливу досліджуваної речовини, теж повинні використовуватись, якщо немає історично встановлених або опублікованих даних з контролю, що показують відсутність шкідливих та мутагенних впливів обраного розчинника.

1.5. ПРОЦЕДУРА

1.5.1. Кількість тварин

Кожна піддослідна і контрольна група має включати щонайменше п'ять придатних до аналізу самців.

1.5.2. Графік введення

Досліджувані речовини переважно вводяться один раз або двічі (тобто за один або за два прийоми). Досліджувані речовини можуть також вводитися розділеною дозою, тобто робиться два введення у той самий день з перервою не більше, ніж у кілька годин, для полегшення введення великого об'єму речовини. Інший графік введення має бути науково виправданим.

Для групи з найвищою дозою потрібно два рази брати зразки після піддавання дії речовини. Оскільки на кінетику клітинного циклу може впливати досліджувана речовина, потрібно зробити один ранній і один пізній забір зразків у часовому інтервалі від 24 до 48 годин після піддавання дії речовини. У випадку використання інших, крім найвищого, рівнів дозування, потрібно взяти зразки через 24 години або 1,5 тривалості клітинного циклу після піддавання дії речовини, якщо інший час забору зразків не вважається більш доцільним для виявлення впливів(6).

Додатково можливе використання іншого часу для забору зразків. Наприклад, у випадку використання хімічних речовин, які можуть викликати уповільнення хромосом, або можуть впливати на S-незалежні ефекти, можливо, буде доцільним інший час забору зразків(1).

Доцільність повторного графіку введення потрібно визначати для кожного окремого випадку. Після застосування повторного графіку введення, тварин знищують через 24 години (1,5 тривалості клітинного циклу) після останнього введення речовини. Можливе використання додаткового забору зразків.

Перед знищенням тваринам вколюється внутрішьобрюшинно відповідна доза речовини, що спричиняє блокування метафази (наприклад, колцеміду(R) або колхіцину). Після того зразки з тварин беруться через відповідні інтервали часу. Для мишей цей інтервал складає приблизно від трьох до п'яти годин, для китайських хом'яків - від чотирьох до п'яти годин.

1.5.3. Рівень дозування

Речовини зі специфічними видами біологічної активності при низьких нетоксичних дозах (такі, як гормони та мітогени) можуть бути винятками з критеріїв встановлення дозування і мають оцінюватись в окремих випадках. Найвища доза може також визначатися як доза, за якої з'являються деякі показники токсичності у сперматогоніальних клітинах (наприклад, зменшення співвідношення сперматогоніальних мітозів у першій та другій мейотичних метафазах; це зменшення не має перевищувати 50%).

1.5.4. Тестування на граничний вміст

Якщо тестування на одному рівні дозування, який становить щонайменше 2000 мг/кг маси тіла/день з використанням введення за один раз, або двох введень у той же день, не спричиняє видимих токсичних впливів, і якщо генотоксичність не передбачається з огляду на дані щодо структурно подібних речовин, то можливо, не виникне необхідності в проведенні розгорнутого дослідження з використанням трьох рівнів дозування. Очікуваний вплив на людину може визначати потребу в використанні вищого рівня дозування під час тестування на граничний вміст.

1.5.5. Призначення доз

Досліджувана речовина, зазвичай, вводиться з їжею, використовуючи зонд для штучного харчування або відповідну інтубаційну трубку, або шляхом внутрішньобрюшинної ін'єкції. Інші шляхи введення можуть використовуватися, якщо вони є виправданими. Максимальний об'єм рідини, що вводиться за один раз з їжею або ін'єкцією, залежить від розміру піддослідної тварини. Об'єм не має перевищувати 2 мл/100 г маси тіла. Використання об'ємів, більших за ці, має бути виправданим. За винятком подразнюючих чи роз'їдаючих речовин, які, зазвичай, проявляють ускладнені впливи при більшій концентрації, варіативність досліджуваного об'єму потрібно мінімізувати шляхом пристосування концентрації до забезпечення постійного об'єму на всіх рівнях дозування.

1.5.6. Підготовка хромосом

Одразу після знищення тварини беруться клітинні суспензії з одного або обох тестів, піддаються впливу гіпотонічного розчину і фіксуються. Потім клітини розподіляються по поверхні мікроскопічних препаратів і зафарбовуються.

1.5.7. Аналіз

Потрібно проаналізувати щонайменше 100 метафаз, що добре розрослися, на кожну тварину (мінімум 500 метафаз на групу). Їх кількість можна зменшити, якщо спостерігається велика кількість аберацій. Всі мікроскопічні препарати, включаючи препарати позитивної та негативної контрольних груп, повинні отримати незалежний код перед мікроскопічним аналізом. Оскільки процедури фіксування часто призводять до розриву метафаз із втратою хромосом, оцінені клітини повинні містити кількість центромерів, що дорівнює кількості 2n +- 2.

2. ДАНІ

2.1. ПРЕДСТАВЛЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

Дані по кожній окремій тварині повинні бути представлені у вигляді таблиць. Експериментальною одиницею вважається тварина. Для кожної окремої тварини необхідно оцінити кількість клітин зі структурними хромосомними абераціями і кількість структурних аберацій. Різні типи структурних хромосомних аберацій повинні бути записані з їхніми номерами і частотою аберацій для групи, що проходила лікування і для контрольної групи. Різниця записується окремо, але, як правило, не включається до загальної частоти аберацій.

При виявленні мітозу або мейозу, співвідношення між сперматогеніальними мітозами і першою та другою мейотичними метафазами визначається як значення цитотоксичності для всіх тварин, що проходили лікування і тварин негативної контрольної групи в зразку зі 100 клітин, що діляться, на одну тварину для визначення можливого цитотоксичного ефекту. При виявленні мітозу, показник мітозу повинен складати принаймні 1 000 клітин на кожну тварину.

2.2. ОЦІНКА ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

Існують декілька критеріїв, що визначають позитивний результат, таких як, збільшення відносної кількості клітин з хромосомною аберацією в залежності від дози, або безпосереднє збільшення клітин з абераціями в одній дозі під час відбору окремої проби. В першу чергу необхідно врахувати біологічну актуальність результатів. Статистичні методи можуть використовуватись в якості допоміжних методів при оцінюванні результатів(8). Статистична значимість не повинна бути єдиним фактором, що визначає позитивний результат. Неоднозначні результати необхідно перевірити повторно, бажано за змінених експериментальних умов.

Дослідна речовина, для якої результати не відповідають вищезазначеним критеріям, вважається не мутагенною в цьому досліді.

Не дивлячись на те, що більшість експериментів дає однозначно позитивні або негативні результати, в незначній кількості випадків отримані дані виключають можливість зробити точний висновок щодо активності дослідної речовини. Результати можуть залишатись неоднозначними або спірними незалежно від кількості повторень досліду.

Позитивні результати дослідження сперматогеніальної хромосомної аберації в живому організмі показують, що дослідна речовина викликає структурні хромосомні аберації в статевих клітинах тварин, що досліджуються. Негативні результати показують, що за даних умов проведення досліду, дослідна речовина не викликає структурні хромосомні аберації в статевих клітинах тварин, що досліджуються.

Вірогідність того, що дослідна речовина або її метаболіти досягнуть цільової тканини має бути обговорена.

3. ЗВІТНІСТЬ

ЗВІТ ПРО ПРОВЕДЕНИЙ ДОСЛІД

Звіт про проведений дослід повинен містити наступну інформацію:

Розчинник/середовище:

- обґрунтування для вибору розчинника,

- розчинність та стабільність дослідної речовини в розчиннику/середовищі, якщо це відомо.

Піддослідні тварини:

- породи/види, що використовувались,

- кількість і вік тварин,

- джерело, умови проживання, дієта, і т.ін.,

- вага кожної окремої тварини на початку досліду, включаючи діапазон ваги тіла, середнє і стандартне відхилення для кожної групи.

Умови досліду:

- дані дослідження з пошуку діапазону доз, якщо таке проводилось,

- обґрунтування вибору дозування,

- обґрунтування способу вживання,

- опис приготування дослідної речовини,

- опис способу вживання дослідної речовини,

- обґрунтування часу на умертвіння піддослідної тварини,

- перехід від концентрації дослідної речовини для дієти/пиття (ppm) до дійсної дози (мг/кг від ваги тіла/день), якщо застосовується,

- дані щодо якості їжі і пиття,

- детальний опис графіку прийому і відбору зразків,

- метод вимірювання токсичності,

- ідентифікація речовини, що зупиняє метафазу, її концентрація і період лікування,

- методи підготовки мікроскопічних препаратів,

- критерії оцінювання аберацій,

- кількість клітин, що аналізувались по кожній тварині,

- критерії оцінювання результатів як позитивних, негативних або неоднозначних.

Результати:

- ознаки токсичності,

- індекс частоти мітозів,

- співвідношення клітин зі сперматогеніальним мітозом до першої і другої мейотичної метафаз,

- тип і кількість аберацій, представлених окремо по кожній тварині,

- загальна кількість аберацій на групу,

- кількість клітин з абераціями на групу,

- залежність реакції від дози, якщо можливо,

- статистичний аналіз, якщо є,

- дані паралельних негативних контрольних групп,

- дані паралельних позитивних контрольних груп,

- зміни в плоїдності, якщо вони помітні.

Обговорення результатів,

Висновки.

4. ПОСИЛАННЯ

(1) Adler, I.D. (1986) Clastrogenic Potential in Mouse Spermatogonia of Chemical Mutagens Related to their Cell-Cycle Specifications. In: Genetic Toxicology of Environmental Chemicals, Part B: Genetic Effects and Applied Mutagenesis, Ramel, C., Lambert, B. And Magnusson, J. (Eds.) Liss, New York, p. 477-484.

(2) Adler, I.D. (1984) Cytogenetic tests in Mammals. In: Mutagenicity Testing: a Practical Approach. Ed.S.Vennit and J.M.Parry. IRL Press, Oxford, Washington DC, p. 275-306.

(3) Evans, E.P., Breckon, G. And Ford, C.E., (1964) An Air-Drying Method for Meotic Preparations from Mammalian Testes. Cytogenetics and Cell Genetics, 3, p. 289-294.

(4) Richold, M., Ashby, J., Chandley, A.Gagtehouse, D.G. and Henderson, L., (1990) In Vivo Cytogenic Assays, In: D.J.Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, p. 115-141.

(5) Yamamoto, K. And Kikuchi, Y., (1978) A New Method for Preparation of Mammalian Spermatogonial Chromosomes. Mutation Res., 52, p. 207-209.

(6) Adler, I.D. , Shelby M.D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, W., Pacchierotti, F., Shibuye, T. and Tanka N., (1914) International Workshop on Standardization of Genotoxicity Test Procedures. Summary Report of the Working Group on Mammalian Germ Cell Tests., Mutation Res., 312, p. 313-318.

(7) Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis, A.R., Botham, P.A., Doe, J., Esdaile, D.J., Gatehouse, D.G., Hodson Walker, G., Morton, D.B., Kirkland, D.J. and Richold, M., (1992) Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working group: Dose setting: In Vivo Mutagenicity Assays. Mutagenesis, 7, p. 313-319.

(8) Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlet, G.E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G. and Savage, J.R.K., (1989) Statistical Analysis of In Vivo Cytogenic Assays In: D.J. Kirkland (Ed.) Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, report, Part III. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, p. 184-232.

В.24. КРАПЕЛЬНИЙ ТЕСТ НА ПІДДОСЛІДНИХ МИШАХ

1. МЕТОД

1.1. ВСТУП

Дивіться Загальний вступ до частини В.

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ

Дивіться Загальний вступ до частини В.

1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ

Відсутні.

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

Цей вид тестування належить до тестування in vivo, при якому на мишей, що виношують ембріонів діють хімічними речовинами. Цільові клітини в ембріонах, що розвиваються є меланобластами, а цільові гени є генами, що відповідають за пігментацію шерсті тварини. Ембріони, що розвиваються, є гетерозиготними для окремої кількості генів, що відповідають за колір шерсті тварини. Мутація в домінантну алель або втрата домінантної алелі (в різних генетичних випадках) такого гену в меланобласті призводить до вираження рецесивного фенотипу в похідних клітинах, завдяки чому виникають плями відмінного кольору на шерсті піддослідної миші. Кількість потомства з такими плямами і мутації записуються, а їхня частота порівнюється з потомством, отриманим від ембріонів, що піддавались виключно дії розчину. Крапельний тест на піддослідних мишах визначає очікувану соматичну мутацію в фетальних клітинах.

1.5. ЯКІСНІ КРИТЕРІЇ

Відсутні.

1.6. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

Підготовка

Якщо це можливо, дослідні речовини розчиняються або суспендуються в ізотонічному розчині. Хімічні речовини, що не розчиняються в воді розчиняються або суспендуються у відповідному середовищі. Середовище, що використовується, не повинно ні взаємодіяти з дослідним хімікатом, ні викликати токсичний ефект. Необхідно використовувати свіжі препарати дослідного хімікату.

Піддослідні тварини

Миші штаму Т (нон-агуті, а/а4 шиншилового офарблення, з ch ch

червоними очима,  c  p/c  p4 коричневі, b/b; димчасті, з короткими
вухами,  d se/d se; зі строкатими плямами, s/s) схрещувались або з
мишами штаму НТ (безбарвні,  нон-агуті,  брахіоподи,  ра а br/pa a
bp;  сірі пухнасті миші,  ln fz/ln fz; з перламутровим офарбленням
ре/ре), або з C5BL (нон-агуті а/а). Інші види схрещування, такі як
схрещування  NMRI  (нон-агуті,  а/аж   альбіноси,   с/с)   з   DBA
(нон-агуті,    а/а;   коричневі   b/b;   безбарвні   d/d)   можуть
здійснюватись за умови,  що в результаті  від  них  буде  отримано
потомство нон-агуті.

Кількість і стать

Відповідні жіночі особини проходили процедуру для народження ними відповідної кількості життєздатного потомства для кожного рівня дозування. Відповідний розмір зразка визначався за кількістю плям, що спостерігались у мишей, що проходили процедуру і за набором контрольних даних. Негативні результати вважались прийнятними тільки за умови, якщо було оцінено принаймні 300 особин потомства, отриманого від жіночих особин, що отримали найвищу дозу.

Використання негативних і позитивних контрольних груп

Необхідно надати дані щодо паралельної контрольної групи мишей, що піддавалися дії середовища (негативний контроль). Можуть бути використані історично встановлені дані контрольної групи тієї ж лабораторії для підвищення результатів тесту за умови, що ці дані є гомогенними. Дані, отримані щодо позитивної контрольної групи, в тій самій лабораторії, в результаті приймання хімічної речовини, яка відома як така, що викликає мутагенність, надаються, якщо не виявлено мутагенності дослідної речовини.

Спосіб приймання

Звичайним способом приймання є пероральна інтубація або інттраперітонеальна ін'єкція для вагітних жіночих особин. В разі необхідності застосовується приймання шляхом інгаляції або іншим способом.

Рівні доз

Застосовується щонайменш два рівні дозування, включаючи один, що виявляє ознаки токсичності або зменшення розміру посліду. Для нетоксичних хімікатів використовується максимальна можлива доза.

Процедура

Звичайно препарат приймається один раз на 8, 9 або 10 день вагітності, рахуючи з дня, в який вперше було помічено вагінальну пробку. Ці дні відповідають дням 7,25, 8,25 і 9,25 після зачаття. В ці дні допускається прийом наступних доз.

Аналіз

Потомству присвоюються коди і проводиться його оцінювання на предмет наявності плям в період між третім і четвертим тижнем після народження. Розрізняють три класи плям:

(а) білі плями розміром 5 мм середньо-черевної лінії, які, можливо є наслідком умертвіння клітин (WMVS);

b) жовті, подібні до агуті цятки, що виступають на сосках, статевих органах, горлі, в пахвовій та паховій зонах, а також в зоні середини лоба, які, можливо, є наслідком різниці (MDS); а також

с) забарвлені і білі плями, безсистемно розташовані на шерсті, які, можливо, є наслідком соматичних мутацій (RS).

Всі три класи зареєстровані як результати, але тільки останній RS має генетичну придатність. Проблему розрізнення MDS і RS можна розв'язати шляхом дослідження проб шерсті під флуоресцентним мікроскопом.

Слід відзначити очевидні морфологічні відхилення, що проявляються у потомства.

3. ЗВІТНІСТЬ

3.1. ЗВІТИ З ДОСЛІДЖЕНЬ

Звіт з досліджень повинен, якщо це можливо, містити в собі наступну інформацію:

- штами, що використовувались при схрещуванні,

- середня кількість вагітних самок в дослідній групі і контрольних групах,

- середня кількість посліду в дослідній групі і контрольних групах на момент народження, а також після закінчення годування,

- об'єм дози (доз) дослідної хімічної речовини,

- розчинник, що використовувався,

- день вагітності, в який було дано дослідну речовину,

- спосіб приймання дослідної речовини,

- загальна кількість потомства, що досліджується з WMVS, MDS і RS в дослідній групі і контрольних групах,

- значні морфологічні відхилення,

- зв'язок між рівнем дози і реакцією особин з RS, якщо це можливо,

- статистичний аналіз,

- аналіз результатів,

- інтерпретація результатів,

3.2. АНАЛІЗ ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ

Дивіться Загальний вступ, частина В

4. ПОСИЛАННЯ

Дивіться Загальний вступ, частина В

В.25. СПАДКОВА ТРАНСЛОКАЦІЯ У МИШЕЙ

1. МЕТОД

1.1. ВСТУП

Дивіться Загальний вступ, частина В

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ

Дивіться Загальний вступ, частина В

1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ

Відсутня.

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

Дослідження спадкової транслокації у мишей показують структурні і кількісні хромосомні зміни в зародкових клітинах ссавців, що регенеровані в першим поколінні потомства. Типи виявлених хромосомних змін є двосторонньою транслокацією, а також у випадку потомства жіночої статі - втратою хромосоми Х. Носії транслокації і самки генотипу ХО показують знижену плідність, яка використовується при відборі потомства F з метою здійснення 1

цитогенетичного   аналізу.   Повна   безплідність   є    наслідком
транслокацій   певного  типу  (хромосом  Х-аутосом  і  типу  c-t).
Транслокації спостерігаються в  мейотичних  клітинах  в  діакінезі
метафази  I  у чоловічих особин,  також F ,  самців або чоловічого
                                         1
потомства самок F .  Самки генотипу ХО цитогенічно ідентифікуються
                 1
завдяки  наявності тільки 39 хромосом в клітинах кісткового мозку,
що проходять стадію мітозу.

1.5. ЯКІСНІ КРИТЕРІЇ

Відсутні

1.6. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

Підготовка

Дослідну речовину розчиняють в ізотонічному розчині солі. Хімічні речовини, що не розчиняються в воді розчиняються або суспендуються у відповідному середовищі. Необхідно використовувати свіжі препарати дослідного хімікату. Якщо середовище використовується щоб полегшити введення дози, воно не повинно ні взаємодіяти з дослідною сполукою, ні викликати токсичний ефект.

Спосіб приймання

Звичайним способом приймання є пероральна інтубація або інттраперітонеальна ін'єкція. В разі необхідності застосовується приймання речовини іншим способом.

Піддослідні тварини

З метою полегшення годування і цитологічної верифікації цей дослід проводиться на мишах. Вимоги щодо штаму мишей відсутні. Однак, середня кількість посліду повинна бути більшою за вісім особин і бути відносно постійним.

Необхідно використовувати здорових, статево зрілих тварин.

Кількість тварин

Необхідна кількість тварин залежить від частоти спонтанних транслокацій, а також мінімального ступеню індукцій, необхідного для позитивного результату.

Дослідження звичайно проводиться шляхом аналізу потомства самців F . Необхідно дослідити принаймні 500 самців потомства F в 1 1 даній групі дозування. У випадку включення самок потомства F 1 необхідно 300 самців і 300 самок.

Використання негативних і позитивних контрольних груп

Необхідно забезпечити доступ до даних, що отримані з паралельних і базових контрольних груп. У випадку доступності результатів позитивної контрольної групи, що отримані в результаті останніх дослідів в тій самій лабораторії, ці результати можна застосовувати замість паралельної позитивної контрольної групи.

Рівні доз

Досліджується один рівень дози, як правило, найвищий рівень дози, що пов'язаний з мінімальним проявом токсичності, але не має впливу на репродуктивну поведінку або виживання. Для встановлення зв'язку між дозою і реакцією необхідно вживання двох додаткових менших доз. Для нетоксичних хімічних речовин використовується максимальна прийнятна доза.

Процедура

Впливання дослідною речовиною і спарювання

Вимагаються дві гармонограми приймання речовини. Найчастіше використовується одноразовий прийом дослідної речовини. Також можна застосовувати прийом дослідної речовини сім днів на тиждень впродовж близько 35 днів. Кількість спарювань після закінчення прийому речовини регулюється гармонограмою досліджень з метою гарантованого отримання проб з усіх фаз зародкової клітини. Після закінчення періоду спарювання самок необхідно помістити в окремі клітки. У випадку початку родів у самок необхідно зареєструвати дату, кількість посліду, а також стать потомства. Все потомство, що містить в собі особини самців відзвичаюється від ссання, а потомство, що містить жіночі особини відкидається, окрім випадків, коли воно використовується в дослідженні.

Дослідження транслокації гетерозиготності

Застосовується один з двох можливих методів:

- дослідження плідності потомства F з наступної верифікацією 1

можливих   носіїв   транслокації   через  проведення  цитогенічних
аналізів,

- цитогенічні аналізи всього чоловічого потомства F без 1

попередньої селекції шляхом дослідження плідності.

а) Дослідження плідності

Змінена плідність особини F може бути підтверджена на 1

підставі спостереження розмірів потомства і/або аналізу  наявності
самок-маток.

Необхідно визначити критерії для встановлення нормальної і зниженої плідності штаму мишей, що використовуються в досліді.

Дослідження кількості посліду: самці F , призначені для 1

дослідження розміщуються в клітках окремо від  самок  або  з  того
самого  експерименту,  або  з колонії.  Клітки оглядаються щоденно
починаючи з 18 дня після спарювання.  Кількість посліду,  а  також
стать потомства F  записується після народження,  наступні посліди
                 2
відкидаються.  У  випадку  дослідження   жіночого   потомства   F
                                                                 1
потомство  F   малих  послідів  зберігається  з  метою  проведення
            2
подальших дослідів.  Жіночі носії  транслокації  перевіряються  за
допомогою  аналізів  транслокацій  у їхнього чоловічого потомства.
Самки ХО розпізнаються за  зміною  відношення  показника  статі  у
їхнього  потомства  з  1:1  на 1:2 чоловічих особин до жіночих.  В
наступній  процедурі  звичайні  тварини  F   відсторонюються   від
                                          1
подальших досліджень,  якщо перший послід F  досяг або перебільшив
                                           2
встановлену кількість;  в зворотному випадку досліджується  другий
або третій послід F .
                   2

Тварини F , яких не можна віднести до звичайних тварин після 1

закінчення дослідження трьох послідів F  або піддаються подальшому
                                       2
дослідженню  шляхом  аналізу  вмісту  утроби,  або   безпосередньо
піддаються цитогенічному аналізу.

Аналіз вмісту утроби: Зниження розміру посліду з носіями транслокації викликане зародковою смертю, так, що високий рівень мертвих імплантів є проявом наявності транслокації у тварин, що досліджуються. Кожний досліджуваний самець F використовується для 1

запліднення  двох  або  трьох  самок.  Факт зачаття встановлюється
шляхом щоденного ранкового  контролю  вагінальних  пробок.  Жіночі
особини  умертвляються  на  14-16  день,  після  чого реєструється
наявність живих і мертвих імплантів в їхніх утробах.

b) Цитогенічний аналіз

Препарати з яєчок готуються за допомогою техніки сушення повітрям. Носії транслокації розпізнаються за наявністю полівалентних конфігурацій в діакінезі метафази І в основних сперматоцитах. Дослідження принаймні двох клітин з полівалентними зв'язками є підставою для підтвердження того факту, що тварини мають носій транслокації.

Всіх самців F необхідно піддати цитогенічному аналізу, якщо 1

не проводилось жодної селекції під час розмноження.  Необхідно під
мікроскопом позначити  мінімум  25  клітин  діакінезу  метафази  I
даного   самця.  Аналіз  мітотичних  метафаз  в  сперматогоніях  в
кістковому мозку вимагається  у  самців  F   з  малими  яєчками  і
                                          1
дефектом мейозу до діакінезу,  або у самок з підозрою на наявність
генотипу ХО.  Наявність незвичайно довгої і/або короткої хромосоми
в  кожній  з  10  клітин  є доказом особливої чоловічої стерильної
транслокації   (c-t  типу).   Деякі  транслокації  Х-аутосом,   що
викликають  чоловічу  стерильність  можуть  бути  виявлені  тільки
шляхом бендингового   аналізу   мітотичних   хромосом.   Наявність
39 хромосом в усіх 10 мітозах є доказом стану ХО у жіночих особин.

2. ДАНІ

Дані необхідно представити в формі таблиці.

При кожному спарюванні необхідно реєструвати середній розмір посліду, а також статеве співвідношення в потомстві, що походить з батьківської пари при народженні і в період, коли тварини відзвичаюються від ссання.

Для оцінювання плідності тварин F представляються середні 1

кількості  потомства,  що  походить  від звичайного спарювання,  а
також кількість живих і неживих імплантів від  кожного  спарювання
особин F , де зареєстровано наявність носіїв транслокації. З метою
        1
виконання аналізу вмісту утроби  необхідно  зареєструвати  середню
кількість  живих  і  мертвих імплантів потомства,  що походить від
звичайного спарювання,  а також докладні кількості живих і неживих
імплантів для кожного потомства, де зареєстровано наявність носіїв
транслокації.

Для виконання цитогенічного аналізу діакінезу метафази I, кількість полівалентних конфігурацій, також реєструється загальна кількість спарювань і тривалість спарювання.

Відносно безплідних особин F необхідно зареєструвати 1

загальну  кількість спарювань,  а також час спарювання.  Необхідно
надати  вагу   яєчок,   а   також   детальний   опис   результатів
цитогенічного аналізу.

Відносно самок ХО реєструється середня кількість посліду, статеве співвідношення потомства F , а також результати 2

цитогенічного аналізу.

Якщо можливо, потомство F з носіями транслокації піддаються 1

попередній селекції шляхом дослідження плідності,  таблиці повинні
містити  в  собі  інформацію,  скільки  з  цих  транслокацій  було
підтверджено як гетерозиготні транслокації.

Необхідно зареєструвати дані негативних і позитивних досліджень контрольних груп.

3. ЗВІТНІСТЬ

3.1. ЗВІТИ З ДОСЛІДЖЕНЬ

Звіт з досліджень повинен, якщо це можливо, містити в собі наступну інформацію:

- штами мишей, вік тварин, вага тварин, що досліджуються,

- кількість батьківських тварин кожної статі в групі, що досліджується і в контрольних групах,

- умови дослідження, докладний опис дослідження, дози, розчинники, план спарювання,

- кількість і стать потомства даної самки, кількість і стать потомства, що вигодовувалось для аналізу транслокації,

- час і критерії транслокаційного аналізу,

- кількість, а також докладний опис носіїв транслокації, включаючи дані, що стосуються розмноження і дані, що стосуються вмісту утроби у відповідних випадках,

- цитогенічні процедури і деталі мікроскопіного аналізу, найкраще надати разом зі знімками,

- статистичний аналіз,

- аналіз результатів,

- інтерпретація результатів.

3.2. АНАЛІЗ ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ

Дивіться Загальний вступ, частина В

4. ПОСИЛАННЯ

Дивіться Загальний вступ, частина В

1. МЕТОД

Цей метод дослідження субхронічної токсичності пероральним шляхом є копією OECD TG 408 (1998).

1.1. ВСТУП

При дослідженні і оцінюванні характеристик токсичності хімічної речовини визначення субхронічної токсичності пероральним шляхом при вживанні повторних доз проводиться після отримання попередньої інформації щодо токсичності в результаті 28-денних досліджень гострої або хронічної токсичності. В результаті 90-денного дослідження отримують інформацію щодо можливої небезпеки для здоров'я, яка, очевидно, може виникнути після повторного прийому препарату впродовж тривалого часу, який включає в себе момент припинення лактації і зростання до зрілості. Дослідження надає інформацію щодо основних токсичних ефектів, визначає органи-мішені і можливість акумуляції, а також надає можливість оцінити рівень дози препарату, що може викликати прихований побічний ефект, що в свою чергу може бути використано для вибору рівнів доз для тривалих досліджень і для визначення критеріїв безпеки для людини.

Цей метод робить особливий наголос на неврологічному аспекті і описує вплив на імунологічну і дітородну систему. Також слід наголосити на необхідності ретельного клінічного нагляду за тваринами для отримання щонайповнішої інформації. Це дослідження повинно надати можливість визначити хімічні речовини, які є потенціальними чинниками нейротоксичного або імунологічного ефекту, або можуть впливати на дітородні органи, що може викликати необхідність подальшого більш глибокого дослідження.

Також дивіться Загальний вступ, частина В.

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ

Доза: є кількість речовини, що подається. Доза виражається в масі (г, мг), або як вага дослідної речовини на одиницю маси тіла тварини, що досліджується (наприклад, мг/кг), або як стала харчова концентрація (ppm).

Дозування: є загальним поняттям, що включає в себе дозу, частоту її вживання і час приймання дози.

NOAEL: є скороченням від поняття, що визначає рівень, при якому не спостерігається шкідливих наслідків, а також є найвищим рівнем дози, при якому не спостерігається шкідливих ефектів, які залежать від речовини, що подаються.

1.3. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

Досліджувана речовина приймається перорально щодня мірними дозами окремими групами піддослідних тварин, один рівень дози на групу впродовж 90 днів. Впродовж періоду приймання речовини за тваринами здійснюється ретельний нагляд на предмет виявлення ознак токсичності. Проводиться розтин тварини, що помирають, або яких вбивають впродовж тестування, після завершення досліду тварин, що вижили, також вбивають, після чого проводиться їх розтин.

1.4. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

1.4.1. Підготовка тварин

1.4.2. Підготовка доз

Дослідна речовина подається через зонд або з їжею чи питтям. Метод перорального вживання залежить від мети дослідження і фізичних/хімічних властивостей дослідного матеріалу.

При необхідності дослідна речовина розчиняється або підвішується у відповідному середовищі. Рекомендується за можливістю спочатку розглянути можливість використання водного розчину/суспензії, потім олійного розчину/емульсії (наприклад, в кукурудзяній олії), а потім використання розчинів в інших середовищах. Для всіх середовищ, крім води, необхідно визначити токсичні характеристики. Необхідно визначити стабільність дослідної речовини в умовах вживання.

1.4.3. Умови проведення досліду

1.4.3.1. Піддослідні тварини

Рекомендується використовувати щурів, але також придатними є інші породи гризунів, наприклад, миші. Необхідно використовувати штами здорових дорослих тварин, що звичайно використовуються в лабораторних дослідах. Вік самки повинен складати менше одного року, вони не повинні бути вагітними. Дозування повинно розпочатись якнайшвидше після припинення лактації, в кожному випадку до досягнення віку дев'яти тижнів. На початку дослідження зміна ваги тварин повинна бути мінімальною і не перевищувати +- 20% середньої ваги для кожної статі. У випадку, коли дослідження проводяться в якості попередніх досліджень перед вивченням хронічної довготривалої токсичності, для обох досліджень необхідно використовувати тварин того самого штаму і джерела.

1.4.3.2. Кількість і стать

Принаймні 20 тварин (10 самців і 10 самок) необхідно використовувати для кожного рівня дози. Якщо планується умертвіння впродовж досліду, кількість необхідно збільшити на кількість тварин, що планується вмертвити до закінчення дослідження. Спираючись на попередній досвід про хімічні і близькі до них речовини необхідно розглянути можливість включення додаткової сателітної групи кількістю 10 тварин (по 5 кожної статі) для контрольної групи і групи, що отримує найвищу дозу з метою нагляду після досліду на предмет реверсивності або тривалості будь-яких токсичних наслідків. Час такого нагляду встановлюється у відповідності до виявлених наслідків.

1.4.3.3. Рівні доз

Використовуються принаймні три рівні доз з одночасним поточним контролем, окрім випадку проведення досліду на граничний вміст (див. 1.4.3.4.). Рівні доз визначаються на підставі повторної дози, або на підставі досліджень діапазону, а також повинні враховувати всі існуючі токсикологічні і токсикоз-кінетичні дані, доступні щодо існуючої речовини або пов'язаних з нею матеріалів. Враховуючи обмеження, викликані фізико-хімічною природою і біологічним ефектом дослідної речовини, рівень найвищої дози вибирається з метою викликання токсичних проявів, але вибрана доза не повинна призводити до смерті або значних ушкоджень. Зменшення дозування застосовується з метою демонстрації реакції, пов'язаної з дозуванням і рівня при якому не спостерігається шкідливих наслідків (NOAEL) при найнижчій дозі. Двократні або чотирикратні інтервали є оптимальними для встановлення рівнів дозування, що знижуються, а введення четвертої дослідної групи є часто необхідним при використанні дуже значних інтервалів (наприклад, більше ніж коефіцієнт 6-10) між дозуваннями.

Контрольною групою повинна бути група, яка не піддається дії препарату, або яка піддається дії середовища, якщо для вживання дослідної речовини використовується середовище. Тварини в контрольній групі поза часом ненадання їм дослідної речовини знаходяться в тих самих умовах, що і тварини в дослідних групах. Якщо використовується середовище-носій, контрольна група повинна отримати його в максимально можливому об'ємі. Якщо дослідна речовина подається з харчуванням і призводить до зменшення раціону, контрольна група з харчової пари може бути корисною при розрізненні між зменшенням, що викликане смаком і зменшенням, викликаним токсикологічними змінами в моделі дослідження.

Наступні характеристики середовища-носія та інших добавок повинні розглядатись як відповідні: вплив на засвоюваність, розподіл, метаболізм, або утримання дослідної речовини; вплив на хімічні якості дослідної речовини, що можуть змінити її токсичні характеристики; і вплив на споживання їжі або води або харчового статусу тварин.

1.4.3.4. Дослід на граничний вміст

Якщо тестування при одному Рівні доз, еквівалентному 1 000 мг/кг маси тіла/день при використанні процедур, описаних для цього досліду призводить до непомітного шкідливого ефекту, а також якщо наявність токсичності не очікується на підставі даних щодо структурно-пов'язаних речовин, в проведенні повного дослідження трьох рівнів доз нема необхідності. Дослід на граничний вміст застосовується за винятком ситуацій, коли небезпека для людей викликає потребу застосування вищого рівня дози.

1.5. ПРОЦЕДУРА

1.5.1. Вживання доз

Тваринам надається дослідна речовина через сім днів кожного тижня впродовж 90 днів. Кожний інший спосіб дозування, наприклад, п'ять днів на тиждень вимагає обґрунтування. Якщо дослідна речовина подається через зонд, процедура виконується поданням одиничної дози з використанням трубки або катетера. Максимальний об'єм рідини, що надається за один раз, залежить від розміру піддослідної тварини. Об'єм не повинен перевищувати 1 мл/100 г маси тіла, окрім випадків використання водного розчину, при яких використовуються водні розчини з пропорцією 2 мл/100 г маси тіла. За виключенням речовин, що викликають подразнення або корозію, які звичайно викликають загострення при більш значних концентраціях, необхідно мінімізувати змінність об'єму дослідної речовини шляхом регулювання концентрації для того, щоб забезпечити постійність об'єму на всіх рівнях дозування.

Для речовин, які подаються з їжею або питною водою, важливо забезпечити, щоб об'єм дослідної речовини не перешкоджав нормальному харчуванню або водному балансу. Якщо дослідна речовина подається з їжею - застосовується або постійна концентрація в їжі (ppm), або постійний рівень дози відносно маси тіла тварини; якщо застосовуються альтернативні варіанти, це повинно бути зазначено окремо. Для речовин, які подаються через зонд, доза повинна подаватись кожного дня в той самий час і регулюватись таким чином, щоб забезпечити постійний рівень дозування відносно маси тіла тварини. При проведенні попереднього 90-денного дослідження перед дослідженням токсичності, в обох випадках повинна застосовуватись та сама дієта.

1.5.2. Огляди

Період нагляду повинен складати щонайменш 90 днів. Для тварин в сателітній групі складається графік оглядів, при цьому у відповідний період тварини не піддаються дії препарату для виявлення їхньої стійкості до токсичного ефекту або здатності відновлюватись після нього.

Загальні клінічні огляди проводяться принаймні раз на день, бажано в один і той самий час, приймаючи до уваги піковий період очікуваного ефекту після дозування. Клінічний стан тварин необхідно реєструвати. Принаймні два рази на день, звичайно, на початку і в кінці кожного дня всі тварини оглядаються на предмет клінічних проявів і смертності.

Принаймні раз перед першим проявом (в межах порівняння) і один раз на тиждень після цього всі тварини повинні пройти ретельне клінічне обстеження. Ці обстеження проводяться за межами клітки, де живе тварина, бажано в стандартному місці і в один і той самий час. Результати повинні бути ретельно записані, бажано використовувати систему балів, створену лабораторією, яка проводить тестування. Необхідно докласти зусиль для забезпечення мінімальних змін умов огляду. Виявлені прояви повинні включати в себе зміну шкіри, хутра, очей, слизистих оболонок, наявність секреції і екскрецій, а також автономної активності (наприклад, очі, що сльозяться, пілоерекція, зміна розміру зіниць, зміна дихання), але не обмежуватись ними. Необхідно також зареєструвати такі прояви, як: зміна ходи, постави і реакції на догляд, а також наявність клонічних або тонічних рухів, стереотипної поведінки (надмірне вмивання, повторюваний рух по колу) або аномальної поведінки (наприклад, нанесення собі ушкоджень, рух задом наперед) (1).

Офтальмологічні дослідження за допомогою офтальмоскопу або подібного приладу повинно здійснюватись перед вживанням доз досліджуваної речовини і після закінчення дослідів, найкраще для всіх тварин, але принаймні в групі з високим рівнем дозування і в контрольній групі. При виявленні змін в очах, необхідно повторно дослідити всіх тварин.

До завершення періоду дії, але в жодному випадку не раніше ніж на 11 тиждень необхідно провести дослідження сенсорної реактивності на різні типи дії(1) (наприклад, слухова, візуальна і пропріоцептивна дія) (2), (3), (4), також необхідно провести оцінку сили стискання і оцінку моторної діяльності (6). Наступні деталі процедур, які можуть бути проведені після цього описані у відповідних посиланнях. Однак, можуть бути використані також альтернативні процедури.

Функціональні спостереження, що повинні бути проведені до кінця досліду можуть бути опущені, якщо дані, отримані на основі функціональних спостережень при проведенні інших дослідів і щоденних клінічних оглядів не виявляють функціонального дефіциту.

В окремих випадках функціональні огляди також можуть бути опущені для груп, що проявляють ознаки токсичності в ступеню, що може значно вплинути на результати функціонального досліду.

1.5.2.1. Вага тіла і споживання їжі/води

Всіх тварин зважують принаймні раз на тиждень. Оцінювання об'єму споживання їжі проводиться принаймні раз на тиждень. Якщо дослідна речовина приймається з водою, також принаймні раз на тиждень необхідно оцінити об'єм споживання води. Споживання води також приймається до уваги при дослідах, де речовина подається з їжею або через зонд, впродовж яких режим прийому води може бути змінено.

1.5.1.1. Гематологія і клінічна біохімія

Зразки крові відбираються з зазначеного місця і зберігаються, якщо це необхідно, у відповідних умовах. На кінець дослідного періоду зразки збираються до або в процесі процедури для умертвіння тварин.

Необхідно виконати наступні гематологічні дослідження в кінці дослідного періоду після того, як зібрані проміжні проби крові: гематокрит, концентрація гемоглобіну, кількість еритроцитів, загальна і диференційна кількість лейкоцитів, кількість тромбоцитів і час/потенціал згортання крові.

На пробах крові кожної тварини необхідно провести визначення клінічної біохімії для основних досліджень токсичних наслідків в тканинах, а саме має бути визначена: дія на нирки і внутрішні органи, ця процедура проводиться також перед або в процесі умертвіння тварин (відділення від тих, що помирають і/або вбиті в продовж досліду). Подібно до гематологічних досліджень може бути виконано відбір проб в ході досліджень для проведення клінічних біохімічних дослідів. Рекомендується утримування тварин впродовж ночі до відбору проб крові (1). При аналізі в плазмі або сироватці необхідно визначити наявність: натрію, калію, глюкози, загальний обсяг холестерину, сечовини, азоту сечовини крові, креатиніну, загальний обсяг протеїну і альбуміну, а також два або більше ензими, що вказують на печінково-клітковий ефект (такі як аланін амінотрансфераза, аспартат амінотрансфераза, алкалін фосфатаза, гама глуматил транспептидаза і сорбітолдегідрогеназа). Також може бути проведено оцінювання кількості додаткових ензимів (печінкового або іншого походження) і жовчних кислот, в результаті якого в окремих випадках можна отримати корисну інформацію.

----------------

(1) Для проведення окремих досліджень сироватки і плазми, особливо на предмет наявності глюкози, бажано утримання тварин від їжі впродовж ночі. Основною причиною такого утримання є те, що розбіжність результатів, отриманих при неутриманні тварин від їжі, може приховати ефект, що важко виявити і таким чином, створити труднощі при інтерпретації результатів. З іншого боку, утримання від їжі впродовж ночі може вплинути на загальний метаболізм тварин і, зокрема, при поданні дослідної речовини з харчуванням, може змінити щоденний вплив дослідної речовини. При застосуванні утримання від їжі впродовж ночі, необхідно виконати клінічні біохімічні дослідження після проведення функціонального огляду.

Факультативно можна провести аналіз сечі, яка відбирається у відповідності до визначеного графіку, впродовж останнього тижня дослідження, в результаті такого аналізу оцінюється: зовнішній вигляд, об'єм, осмолялність або питома густина, рН, наявність білку, глюкози і крові, кров'яних клітин.

Також до уваги приймаються результати дослідження стану сироватки на предмет виявлення загальних ушкоджень шкіри. Інші речовини повинні бути визначені, якщо відомі властивості речовини можуть або існують підозри, що вони можуть впливати на метаболізм, такими речовинами є: кальцій, фосфор, тривалі тригліцериди, специфічні гормони, метагемоглобін і холінестраза. Наявність цих речовин визначається для хімікатів окремих класів або в кожному конкретному випадку.

Взагалі необхідно застосовувати гнучкий підхід в залежності від порід і ефекту від даної речовини, що виявляється і/або передбачається.

Якщо історичні вихідні дані не відповідають вимогам, необхідно звернути увагу на те, чи є необхідність до початку дозування у визначенні гематологічних змінних і змінних клінічної біохімії; взагалі не рекомендується отримання цих даних до початку дослідження (7).

1.5.2.3. Загальний розтин

Наступні тканини повинні бути законсервовані в найбільш придатному середовищі, що є придатним для тканин обох типів і запланованих чергових гістопатологічних досліджень: всі загальні ушкодження, мозок (всі репрезентативні ділянки, включаючи півкулі головного мозку і спинний мозок/варулієв міст), хребет (на трьох рівнях: шийному, середньо-грудному і поперековому), слизові оболонки, щитовидні залози, паращитовидні залози, зобні залози, стравохід, слинні залози, шлунок, великий и малий кишечник (включаючи Пейерові бляшки), печінку, підшлункову залозу, нирки, надпечінкову залозу, селезінку, серце, трахею і легені (законсервовані шляхом наповнення фіксатором і занурення), аорту, гонади, матки, інші статеві органи, жіночі грудні залози, простату, сечовий міхур, жовчний міхур (миша), лімфатичні вузли (бажано один лімфатичний вузол, що покриває шлях прийому препарату, а другий вузол такий, що знаходиться на відстані від шляху прийому препарату для, того, щоб послідкувати систематичний вплив), периферійний нерв (сідничний або тибіальний) бажано якнайближче до м'язу, ділянку кісткового мозку (і/або свіжий аспірат кісткового мозку), шкіру, очі (якщо спостерігались зміни впродовж офтальмологічного дослідження). Клінічні та інші результати можуть викликати необхідність дослідження додаткових тканин. Також повинні бути збережені будь-які органи, що можуть вважатись органами-мішенями на підставі відомих властивостей дослідної речовини.

1.5.2.4. Гістопатологія

Необхідно провести повну гістопатологію збережених органів і тканин всіх тварин контрольної групи і групи, що отримувала найбільшу дозу. Ці дослідження проводяться для тварин всіх інших груп дозування при наявності змін в групі, що отримувала найбільшу дозу, пов'язаних з дією препарату.

Всі значні ушкодження повинні бути досліджені.

При використанні сателітної групи проводиться гістопатологія на тканинах і органах, визначених, як такі, що реагують, в групах, що приймали препарат.

2. ДАНІ І ЗВІТНІСТЬ

2.1. ДАНІ

Необхідно представити індивідуальні дані. Додатково всі дані повинні бути зведені в таблицю, в якій представляється загальна кількість тварин в кожній групі на початку дослідження, кількість тварин, що вмерли під час досліду або кількість тварин, яких безболісно умертвили, а також час, впродовж якого настала смерть або безболісне умертвіння, кількість тварин, що має ознаки отруєння, опис ознак отруєння, що спостерігаються, включаючи час появи, тривалість, ступінь тяжкості кожного токсичного випадку, кількість тварин, у яких виявлено патологічні зміни, тип патологічних змін і відсоток тварин, що складає кожний тип патологічних змін.

В окремих випадках кількісні результати повинні оцінюватись відповідними і загальноприйнятими статистичними методами. Статистичні методи і данні, що піддаються аналізу, повинні вибиратись під час приготування проекту досліджень.

2.1.1. ЗВІТ З ДОСЛІДУ

Звіт з досліду повинен містити в собі наступну інформацію:

2.2.1. Речовина, що вживається при дослідженні:

- фізичний характер, чистота і фізико-хімічні властивості,

- ідентифікаційні дані,

- середовище (якщо застосовується): обґрунтування вибору середовища, якщо відрізняється від води.

2.2.2. Види тварин, що використовуються при дослідженні:

- породи і штам, що використовувались,

- кількість, вік і стать тварин,

- джерело, умови проживання, харчування і т.ін.,

- вага кожної тварини на початку дослідження.

2.2.3. Умови дослідження:

- раціональне обґрунтування вибраного рівня дозування,

- докладна інформація щодо складу дослідної речовини/приготування їжі, прийнята концентрація, стабільність і однорідність приготування,

- докладна інформація щодо подачі дослідної речовини,

- дійсна доза (мг/кг вага тіла/день), показник конверсії їжа/питна вода концентрації дослідної речовини (ppm) до дійсної дози, якщо застосовується,

- докладна інформація щодо якості їжі і води.

2.2.4. Результати:

- вага тіла і зміна ваги тіла,

- споживання їжі і пиття, якщо застосовується,

- реакція на отруєння згідно зі статтю і рівнем дози, включаючи ознаки отруєння,

- характер, ступінь і час тривання клінічних ознак (виліковний або невиліковний стан),

- результати офтальмологічного досліду,

- оцінка сенсорних характеристик або стискання і моторних характеристик (якщо можна оцінити),

- гематологічні дослідження з відповідними допусками рівнів,

- біохімічні клінічні дослідження з відповідними допусками рівнів,

- остаточна вага тіла, вага органів і пропорції ваги орган/тіло,

- результати розтину,

- детальний опис гістопатологічних результатів,

- дані, що стосуються засвоєння, якщо доступні,

- статистична обробка результатів, де необхідно.

Обговорення результатів.

Висновки.

3. ПОСИЛАННЯ

(1) IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotixicity Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document No. 60.

(2) Tupper, D.E., Wallace R.B. (1980). Utility of the Neurologic Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp., 40, pp. 999-1003.

(3) Gad, S.C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J.Toxicol. Envorin. Health, 9, pp. 691-704.

(4) Moser, V.C, Mc Daniel, K.M., Phillips, P.M. (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol., 108, pp. 267-283.

(5) Meyer O.A., Tilson H.A., Byrd W.C., Riley M.T, (1979). A Method for Routine Assessment of Fore-and Hind-limb grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxivol., 1, pp. 233-236.

(6) Crofton K.M., Howard J.L., Moser V.C., Gill M.W., Reiter L.W., Tilson H. A., MacPhail R.C. (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13, pp. 599-609.

(7) Weingard K., Brown G., Hall R. Et al. (1996). "Harmonisation of Animal Clinic Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies", Fundam. & Appl. Toxicol., 29, pp. 198-201.

1. МЕТОД

Цей метод дослідження субхронічної токсичності пероральним шляхом є копією OECD TG 409 (1998).

1.1. ВСТУП

Це дослідження надає можливість визначити негативні наслідки при дії хімічного препарату у тварин, що не належать до гризунів, цей метод використовується тільки:

- у випадку, коли результати, отримані в інших дослідах, вимагають пояснення/характеристики для іншого виду тварин, що не є гризунами, або

- у випадку, коли токсикологічні дослідження показують, що використання цього виду тварин, що не є гризунами, є найбільш оптимальним вибором серед лабораторних тварин, або

- у випадку, коли інші відповідні причини доводять необхідність використання тварин, що не є гризунами.

Також дивіться Загальний вступ, частина В.

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ

Доза: є кількістю речовини, що подається. Доза виражається в масі (г, мг), або як вага дослідної речовини на одиницю маси тіла тварини, що досліджується (наприклад, мг/кг), або як стала харчова концентрація (ppm).

Дозування: є загальним поняттям, що включає в себе дозу, частоту її вживання і час приймання дози.

1.3. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

Досліджувана речовина приймається перорально щодня мірними дозами окремими групами піддослідних тварин, один рівень дози на групу впродовж 90 днів. Впродовж періоду приймання речовини за тваринами здійснюється ретельний нагляд на предмет виявлення ознак отруєння. Проводиться розтин тварини, що помирають, або яких вбивають впродовж тестування, після завершення досліду тварин, що вижили, також вбивають, після чого проводиться їх розтин.

1.4. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

1.4.1. Вибір видів тварин

Звичайно, при дослідженні тварин, що не є гризунами, використовують собак певної породи: часто використовуються гончі собаки. Також можуть використовуватись інші види тварин, наприклад, свині, малі свині. Використання приматів не рекомендується, а якщо вони використовуються, то їх використання необхідно обґрунтувати. Для дослідів відбираються молоді здорові тварини, у випадку використання собак, бажано використовувати тварин від чотирьох до шести місяців, але не старше дев'яти місяців. Якщо це дослідження передує довгостроковому дослідженню хронічної токсичності, в обох дослідах необхідно використовувати ті самі види/породи тварин.

1.4.2. Підготовка тварин

Для проведення попередніх експериментальних процедур необхідно використовувати здорових молодих тварин, що пройшли акліматизацію в лабораторних умовах. Тривалість акліматизації залежить від відібраних видів тварин і їхнього джерела. Рекомендованим періодом є щонайменш п'ять днів для собак і свиней вищезазначених порід, взятих з постійних колоній і щонайменш два тижні для тварин з зовнішніх джерел. Піддослідні тварини повинні бути охарактеризовані за породою, штамом, джерелом, статтю, вагою і/або віком. Тварини повинні бути випадково відібрані для контрольних і дослідних груп. Клітки повинні бути розташовані таким чином, щоб мінімізувати можливі ефекти, викликані розташуванням клітки. Кожній тварині присвоюється унікальний ідентифікаційний номер.

1.4.3. Підготовка доз

Дослідна речовина подається з їжею, питтям, через зонд або в капсулах. Метод перорального вживання залежить від мети дослідження і фізико-хімічних властивостей дослідного матеріалу.

1.5. ПРОЦЕДУРА

1.5.1. Кількість і стать тварин

Принаймні вісім тварин (4 самці і 4 самки) необхідно використовувати для кожного рівня дози. Якщо планується умертвіння впродовж досліду, кількість необхідно збільшити на таку кількість тварин, щоб забезпечити відповідну якість оцінювання токсичного ефекту. Спираючись на попередній досвід про хімічні і близькі до них речовини необхідно розглянути можливість включення додаткової сателітної групи кількістю вісім (по чотири кожної статі) для контрольної групи і групи, що отримує найвищу дозу з метою нагляду після досліду на предмет реверсивності або тривалості будь-яких токсичних наслідків. Час такого нагляду встановлюється у відповідності до виявлених наслідків.

1.5.2. Рівні доз

Використовуються принаймні три рівні доз з одночасним поточним контролем, окрім випадку проведення досліду на граничний вміст (див. 1.5.3). Рівні доз визначаються на підставі повторної дози, або на підставі досліджень діапазону, а також повинні враховувати всі існуючі токсикологічні і токсикоз-кінетичні дані, доступні щодо існуючої речовини або пов'язаних з нею матеріалів. Враховуючи обмеження, викликані фізико-хімічною природою і біологічним ефектом дослідної речовини, рівень найвищої дози вибирається з метою викликання токсичних проявів, але вибрана доза не повинна призводити до смерті або значних ушкоджень. Зменшення дозування застосовується з метою демонстрації реакції, пов'язаної з дозуванням і рівня при якому не спостерігається шкідливих наслідків (NOAEL) при найнижчій дозі. Двократні або чотирикратні інтервали є оптимальними для встановлення рівнів дозування, що знижуються, а введення четвертої дослідної групи є часто необхідним при використанні дуже значних інтервалів (наприклад, більше ніж коефіцієнт 6-10) між дозуваннями.

1.5.3. Дослід на граничний вміст

1.5.4. Вживання доз

Тваринам надається дослідна речовина через сім днів кожного тижня впродовж 90 днів. Кожний інший спосіб дозування, наприклад, п'ять днів на тиждень вимагає обґрунтування. Якщо дослідна речовина подається через зонд, процедура виконується поданням одиничної дози з використанням трубки або катетера. Максимальний об'єм рідини, що надається за один раз, залежить від розміру піддослідної тварини. Звичайно об'єм повинен бути мінімально можливим. За виключенням речовин, що викликають подразнення або корозію, які звичайно викликають загострення при більш значних концентраціях, необхідно мінімізувати змінність об'єму дослідної речовини шляхом регулювання концентрації для того, щоб забезпечити постійність об'єму на всіх рівнях дозування.

Для речовин, які подаються з їжею або питною водою, важливо забезпечити, щоб об'єм дослідної речовини не перешкоджав нормальному харчуванню або водному балансу. Якщо дослідна речовина подається з їжею - застосовується або постійна концентрація в їжі (ppm), або постійний рівень дози відносно маси тіла тварини; якщо застосовуються альтернативні варіанти, це повинно бути зазначено окремо. Для речовин, які подаються через зонд або в капсулах, доза повинна подаватись кожного дня в той самий час і регулюватись таким чином, щоб забезпечити постійний рівень дозування відносно маси тіла тварини. При проведенні попереднього 90-денного дослідження перед дослідженням хронічної токсичності, в обох випадках повинна застосовуватись та сама дієта.

1.5.2. Огляди

Принаймні раз перед першим проявом (в межах порівняння) і один раз на тиждень після цього всі тварини повинні пройти ретельне клінічне обстеження. Ці обстеження проводяться за межами клітки, де живе тварина, бажано в стандартному місці і в один і той самий час. Необхідно докласти зусиль для мінімізації зміни умов, в яких проводиться огляд. Ознаки токсикації повинні бути ретельно записані, включаючи час прояву ознаку, ступінь і тривалість. Огляди повинні включати в себе огляд на предмет зміни шкіри, хутра, очей, слизистих оболонок, наявність секреції і екскрецій, а також автономної активності (наприклад, очі, що сльозяться, пілоерекція, зміна розміру зіниць, зміна дихання), але не обмежуватись ними. Необхідно також зареєструвати такі прояви, як: зміна ходи, постави і реакції на догляд, а також наявність клонічних або тонічних рухів, стереотипної поведінки (надмірне вмивання, повторюваний рух по колу).

1.5.5.1. Вага тіла і споживання їжі/води

1.5.5.2. Гематологія і клінічна біохімія

Гематологія, включаючи гематокрит, концентрацію гемоглобіну, кількість еритроцитів, загальну і диференційну кількість лейкоцитів, кількість тромбоцитів і потенціал згортання крові: час згортання крові, протромбінів час або тромбопластиновий час, повинна бути досліджена на початку дослідження, а потім щомісяця або всередині дослідного періоду і в кінці дослідного періоду.

Визначення клінічної біохімії для основних досліджень токсичних наслідків в тканинах, а саме, дія на нирки і внутрішні органи, проводиться на пробах крові тварин, отриманих на початку досліду, після щомісячних досліджень і в кінці дослідного періоду. При дослідженні розглядаються електролітний баланс, вуглеводний обмін речовин, функція печінки і нирок. На вибір того чи іншого досліду впливає визначений спосіб дії дослідної речовини. Тварини повинні утримуватись від вживання їжі до відбору проб крові.

Пропонується визначити наявність: кальцію, фосфору, хлориду, натрію, калію, глюкози, що міститься в організмі до вживання їжі, аланін амінотрансфераза, аспартат амінотрансфераза, орнітин декарбоксилаза, гама глуматил транспептидаза і сорбітолдегідрогеназа, азоту сечовини, альбуміну, кретину в крові, загальний об'єм білірубіну і загальний об'єм протеїну сироватки.

Аналіз сечі необхідно провести на початку, в середини і в кінці досліду, сеча відбирається у відповідності до визначеного графіку. В результаті такого аналізу оцінюється: зовнішній вигляд, об'єм, осмолялність або питома густина, рН, наявність білку, глюкози і крові, кров'яних клітин. Додаткові параметри можуть також бути визначені при необхідності для продовження дослідження виявленого ефекту.

Крім того, необхідно взяти до уваги результати дослідів щодо визначення ознак загального ушкодження тканин. Крім того, для здійснення відповідного токсикологічного аналізу необхідно провести аналіз: ліпідів, гормонів, кислотно-лужного балансу, метагемоглобіну, холінестеразне інгібірування. Додаткові клінічні біохімічні показники можуть бути визначені при необхідності для продовження дослідження виявленого ефекту.

Взагалі необхідно застосовувати гнучкий підхід в залежності від видів тварин і ефекту від даної речовини, що виявляється і/або передбачається.

1.5.5.3. Загальний розтин

Наступні тканини повинні бути законсервовані в найбільш придатному середовищі, що є придатним для тканин обох типів і запланованих чергових гістопатологічних досліджень: всі загальні ушкодження, мозок (всі репрезентативні ділянки, включаючи півкулі головного мозку і спинний мозок/варулієв міст), хребет (на трьох рівнях: шийному, середньо-грудному і поперековому), слизові оболонки, очі, щитовидні залози, пара-щитовидні залози, зобні залози, стравохід, слинні залози, шлунок, великий і малий кишечник (включаючи Пейерові бляшки), печінку, жовчний міхур, підшлункову залозу, нирки, печінкову залозу, селезінку , серце, трахею і легені, аорту, гонади, матки, інші статеві органи, жіночі грудні залози, простату, сечовий міхур, лімфатичні вузли (бажано один лімфатичний вузол, що покриває шлях прийому препарату, а другий вузол такий, що знаходиться на відстані від шляху прийому препарату для, того, щоб прослідкувати систематичний вплив), периферійний нерв (сідничний або тибіальний) бажано якнайближче до м'язу, ділянку кісткового мозку (і/або свіжий аспірат кісткового мозку) і шкіру. Клінічні та інші результати можуть викликати необхідність дослідження додаткових тканин. Також повинні бути збережені будь-які органи, що можуть вважатись органами-мішенями на підставі відомих властивостей дослідної речовини.

1.5.5.4. Гістопатологія

Всі значні ушкодження повинні бути досліджені.

2. ДАНІ І ЗВІТНІСТЬ

2.1. ДАНІ

2.2. ЗВІТ З ДОСЛІДУ

Звіт з досліду повинен містити в собі наступну інформацію:

2.2.1. Речовина, що вживається при дослідженні:

- фізичний характер, чистота і фізико-хімічні властивості,

- ідентифікаційні дані,

- середовище (якщо застосовується): обґрунтування вибору середовища, якщо відрізняється від води.

2.2.2. Види тварин, що використовуються при дослідженні:

- породи і штам, що використовувались,

- кількість, вік і стать тварин,

- джерело, умови проживання, харчування і т.ін.,

- вага кожної тварини на початку дослідження.

2.2.3. Умови дослідження:

- раціональне обґрунтування вибраного рівня дозування,

- докладна інформація щодо подачі дослідної речовини,

- докладна інформація щодо якості їжі і води.

2.2.4. Результати:

- вага тіла і зміна ваги тіла,

- споживання їжі і пиття, якщо застосовується,

- реакція на отруєння згідно зі статтю і рівнем дози, включаючи ознаки отруєння,

- характер, ступінь і час тривання клінічних ознак (виліковний або невиліковний стан),

- результати офтальмологічного досліду,

- гематологічні дослідження з відповідними допусками рівнів,

- біохімічні клінічні дослідження з відповідними допусками рівнів,

- остаточна вага тіла, вага органів і пропорції ваги орган/тіло,

- результати розтину,

- детальний опис гістопатологічних результатів,

- дані, що стосуються засвоєння, якщо доступні,

- статистична обробка результатів, де необхідно.

Обговорення результатів.

Висновки.

1. МЕТОД

1.1. ВСТУП

Дивіться Загальний вступ до частини В.

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ

Дивіться Загальний вступ до частини В.

1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ

Відсутні.

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

Дослідна речовина щоденно наноситься на шкіру рівномірними дозами декільком групам піддослідних тварин, одна доза на групу впродовж 90 днів. В період приймання дози тварини піддаються щоденному огляду з метою виявлення ознак токсичності. Тварини, що помирають впродовж досліду піддаються розтину, а після закінчення досліду тварини, що залишились, умертвляються і також піддаються розтину.

1.5. ЯКІСНІ КРИТЕРІЇ

Відсутні.

1.6. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

1.6.1. Підготовка

Тварини знаходяться в умовах проживання і харчування, визначених для дослідження щонайменш впродовж п'яти днів до початку дослідження. Перед початком дослідження молоді і здорові тварини випадково розподіляються за дослідними і контрольними групами. До початку досліду шерсть піддослідних тварин підстригається в потиличній зоні тулуба. Можна застосувати гоління, але воно повинно бути виконано за 24 години перед початком досліду. Наступна стрижка або гоління виконується, як правило, через тиждень. Під час стрижки або гоління необхідно зважати на те, щоб не пошкодити шкіру. Необхідно очистити не менше 10% поверхні шкіри для випробування дослідної речовини. Необхідно взяти до уваги масу тварин під час прийняття рішення щодо поверхні шкіри, яка очищується, а також щодо поверхні її покриття. Досліджуючи тверді речовини, які можуть витертись в окремих випадках, дослідну речовину необхідно змочити водою або у відповідному середовищі, щоб забезпечити відповідний контакт зі шкірою. Рідкі дослідні речовини, як правило, застосовуються в нерозчиненому вигляді. Звичайно речовина наноситься від п'яти до семи днів на тиждень.

1.6.2. Умови проведення досліду

1.6.2.1. Піддослідні тварини

Можна використовувати дорослих щурів, кроликів або морських свинок. На початку дослідження розбіжність в вазі не повинна перевищувати +- 20% середньої ваги. У випадку проведення суб-хронічних досліджень в якості попередніх досліджень перед тривалими дослідженнями, не обхідно використовувати тварин того самого штаму і джерела.

1.6.2.2. Кількість і стать

Принаймні 20 тварин (10 самців і 10 самок) зі здоровою шкірою необхідно використовувати для кожного рівня дози. Самки не повинні бути вагітними і не повинні бути такими, що народжували раніше. Якщо планується умертвіння впродовж досліду, кількість необхідно збільшити на кількість тварин, що планується вмертвити до закінчення досліду. Сателітна група кількістю 20 тварин (по 10 тварин кожної статі) може піддаватись дії підвищеної дози впродовж 90 днів з подальшим оглядом на предмет відновлення, стійкості, або запізненого прояву наслідків токсичності через 28 днів після виконання процедур досліду.

1.6.2.3. Рівні доз

Використовуються принаймні три рівні доз разом з контрольною дозою або контролем середовища, якщо воно застосовується. Час експозиції речовини повинен дорівнювати принаймні шести годинам щоденно. Речовину необхідно застосовувати в той самий час кожного дня, а кількість речовини, що застосовується регулюється у відповідності до інтервалів часу (тижневих або двотижневих) для підтримання однакового рівня дозування у відповідності до маси тіла тварини. Крім дії дослідною речовиною, тварини в контрольній групі знаходяться в тих самих умовах, що і тварини в дослідних групах. Якщо для полегшення дозування використовується середовище-носій, контрольна група, що приймає його, отримує таке саме дозування, що і дослідні групи і таку саму дозу, що і група, яка отримує найбільшу дозу. Найвища доза повинна викликати токсичний ефект, але не призводити (або призводити до незначних) летальних наслідків. Найнижчий рівень дози не повинен викликати очевидних проявів токсичності. У випадку оцінювання впливу на людину, найнижчий рівень повинен перевищувати рівень, що застосовується для людини. В ідеальному випадку середній рівень дози повинен викликати мінімальний очевидний токсичний ефект. При використанні декількох середніх доз, рівні доз повинні визначатись таким чином, щоб забезпечити градацію токсичних ефектів. В групах, що отримують низьку і середню дозу і в контрольній групі рівень летальних випадків повинен бути низьким для можливості якісної оцінки результатів.

Якщо застосування дослідної речовини призводить до значних подразнень шкіри, необхідно зменшити концентрацію, що може призвести до зниження або зникнення інших токсичних ефектів в групі, що приймає найвищу дозу. Якщо шкіра отримує нове ушкодження, може виникнути необхідність в завершені поточних дослідів і початку дослідів при більш низькій концентрації.

1.6.3. Дослід на граничний вміст

Якщо в результаті попереднього тестування при Рівні доз, еквівалентному 1 000 мг/кг або при вищому рівні, яке проводилось в зв'язку з можливою дією на організм людини, не було виявлено токсичного ефекту, наступні дослідження можуть виявитись непотрібними.

1.6.4. Період нагляду

Піддослідні тварини повинні щодня піддаватись огляду з метою виявлення ознак токсичності. Необхідно записувати час смерті, час появи і зникнення ознак токсичності.

1.6.5. Процедура

Тварини розміщуються в окремих клітках. Тварини піддаються дії дослідної речовини в ідеальному випадку впродовж 90 днів 7 днів на тиждень.

Для тварин в будь-якій сателітній групі складається графік оглядів, якого слід дотримуватись впродовж наступних 28 днів, не піддаючи тварин дії дослідної речовини для визначення відновлення або не відновлення після токсичного ефекту. Час експозиції повинен складати шість годин на день.

Дослідна речовина рівномірно розподіляється на ділянці шкіри, що складає приблизно 10% від загальної площі тіла. З високотоксичними речовинами площа поверхні повинна бути меншою, але вони повинна бути покрита, якщо це можливо, тонкою рівномірною плівкою.

Під час експозиції дослідна речовина входить в контакт зі шкірою за допомогою марлі і тасьми, що не викликає подразнень. Наступне досліджуване місце повинно бути накрито відповідним чином з метою утримання марлі і дослідної речовини і для того, щоб тварини не були здатні проковтнути дослідну речовину. З метою уникнення проковтування дослідної речовини можна застосувати спеціальні засоби безпеки, але утримання тварин в повній нерухомості не рекомендується.

Після закінчення часу експозиції решту дослідної речовини слід усунути, у випадку, коли це можливо - за допомогою води або іншого методу для очищення шкіри.

Всі тварини повинні піддаватись щоденному огляду, а прояви токсичності повинні реєструватись, включаючи час їх з'явлення, ступінь і час тривання. При огляді тварин в клітках необхідно виявляти зміни, що з'явились на їхній шкірі і хутрі, зміни в очах і слизовій оболонці, а також зміни дихальної системи, кровообігу, автономної і центральної нервової системи, соматомоторної активності і схеми поведінки. Щотижня необхідно проводити оцінювання обсягу харчування і зважування тварин. Регулярний огляд тварин є необхідним для забезпечення того, щоб тварини впродовж досліду не загинули з причин канібалізму, автолізу тканин або зміщення. В кінці дослідного періоду всі тварини, що вижили, в групах, що не є сателітними, піддаються розтину. Тварини, що вмирають видаляються з групи і також піддаються розтину.

Звичайно виконуються наступні види огляду, включаючи контроль:

(а) офтальмологічний огляд з використанням офтальмоскопу або еквівалентного придатного обладнання здійснюється до нанесення дослідної речовини і після закінчення досліду, бажано для всіх тварин, але принаймні, для групи, що отримувала найвищу дозу і для контрольної групи. При виявлені будь-яких змін в очах, необхідно оглянути всіх тварин.

(b) гематологічний огляд, включаючи гематокрит, концентрацію гемоглобіну, кількість еритроцитів, загальну і диференційну кількість лейкоцитів, кількість тромбоцитів і потенціал згортання крові: час згортання крові, протромбінів час або тромбопластиновий час проводиться в кінці дослідного періоду.

(с) Визначення клінічної біохімії крові проводиться в кінці дослідного періоду. При дослідженні розглядаються електролітний баланс, вуглеводний обмін речовин, функція печінки і нирок. На вибір того чи іншого досліду впливає визначений спосіб дії дослідної речовини. Тварини повинні утримуватись від вживання їжі до відбору проб крові. Пропонується визначити наявність: кальцію, фосфору, хлориду, натрію, калію, глюкози (в період утримання від їжі в залежності від виду тварини), глютамінової пировиноградної транзамінази сироватки(1), глютамінової щавелево-уксусної транзамінази сироватки(2), орнітин декарбоксилаза, гама глуматил транспептидаза, азоту сечовини, альбуміну, кретину в крові, загальний об'єм білірубіну і загальний об'єм протеїну сироватки. Крім того, для здійснення відповідного токсикологічного аналізу необхідно провести аналіз: ліпідів, гормонів, кислотно-лужного балансу, метагемоглобіну, холінестеразне активності. Додаткові клінічні біохімічні показники можуть бути визначені при необхідності для продовження дослідження виявленого ефекту.

----------------

(1) Зараз відомий як аланін амінотрансфераза сироватки.

(2) Зараз відомий як аспарат амінотрансфераза сироватки.

(d) Звичайно, в проведені аналізу сечі нема необхідності, окрім випадків, коли проведення такого аналізу рекомендується в зв'язку з наявною або очікуваною токсичністю.

Якщо історичні вихідні дані не відповідають вимогам, необхідно звернути увагу на те, чи є необхідність до початку дозування у визначенні параметрів гемулогічної і клінічної біохімії;

Загальний розтин

Всі піддослідні тварини підлягають повному детальному загальному розтину, який включає в себе детальне вивчення зовнішньої поверхні тіла, всіх отворів, а також черепної, грудної і черепної порожнин і їхнього вмісту. Печінку, нирки і надниркові залози повинні якнайшвидше після розтину бути зважені в мокрому стані для уникнення висихання. Наступні органи і тканини повинні бути законсервовані в найбільш придатному середовищі для можливих запланованих чергових гістопатологічних досліджень: всі загальні ушкодження, мозок, включаючи ділянки спинного мозку/варулієва моста, слизові оболонки, щитовидні залози/пара-щитовидні залози, будь-які зобні тканини, (трахею) легені, серце, аорту, слинні залози, печінку, селезінку, нирки, надниркові залози, підшлункові залози, гонади, матки, інші статеві органи, жовчний міхур (якщо є), стравохід, шлунок, дванадцятипала кишка, тонка кишка, підвздошна кишка, сліпа кишка, товста кишка, пряма кишка, сечовий міхур, лімфатичні вузли (жіночі грудні залози), (стегнова мускулатура), периферійні нерви, (очі) (грудна кістка з кістковим мозком) (стегно, включаючи суглобну поверхню), (хребет на трьох рівнях: шийному, середньогрудному і поперековому), і (сльозова залоза, пальпебральна частина якої розташована під верхнім зовнішнім краєм орбіти). Тканини, зазначені в дужках, оглядаються тільки при виявлені ознак токсичності, або якщо вони є органами-мішенями.

Гістопатологічні дослідження

(а) Необхідно провести повну гістопатологію нормальної і досліджуваної ділянки шкіри, а також органів і тканин тварин контрольної групи і групи, що отримувала найбільшу дозу.

(b) Всі значні ушкодження повинні бути досліджені.

(d) При використанні щурів, легені тварин в групах, що отримували середню і низьку дози піддаються гістопатологічному дослідженню для виявлення інфекції, оскільки це дозволяє якісно оцінити стан тварин. В наступних гістопатологічних дослідженнях, звичайно, нема потреби в цих групах, але вони завжди повинні проводитись на органах, в яких виявлено значне ушкодження в групі, що отримувала найвищу дозу.

(е) При використанні сателітної групи гістопатологічні дослідження проводяться на тканинах і органах, що ідентифіковані як такі, що виявляють ефект в інших піддослідних групах.

2. ДАНІ

2.1. ДАНІ

Необхідно представити індивідуальні дані. Додатково всі дані повинні бути зведені в таблицю, в якій представляється загальна кількість тварин в кожній групі на початку дослідження, кількість тварин, у яких виявлені ушкодження, тип ушкоджень і процентне відношення тварин, у яких виявлено кожний тип ушкоджень. Результати оцінюються у відповідності до прийнятного статистичного методу. Може використовуватись будь-який статистичний метод.

3. ЗВІТНІСТЬ

3.1. ЗВІТ З ДОСЛІДУ

Звіт з досліду повинен містити в собі наступну інформацію:

- породи, штам, джерело тварин, що використовувались, оточуючі умови, дієту,

- умови дослідження,

- рівень дози (включаючи середовище-носія, якщо використовується) і концентрацію,

- дані щодо токсичної реакції у відповідності до статі і дозування,

- рівень, при якому відсутній ефект, якщо можливо,

- час смерті впродовж дослідження і факт виживання тварин до закінчення досліду,

- опис токсичного або інших ефектів,

- час тривалості кожного аномального прояву і їхніх наслідків,

- відсутність наслідків,

- дані, що стосуються маси тіла і спожитої їжі,

- висновки офтальмологічних досліджень,

- види і всі результати гематологічного досліду,

- види клінічних і біохімічних досліджень, а також всі їх результати (включаючи результати всіх аналізів сечі),

- результати розтину,

- детальний опис гістопатологічних дослідів,

- статистична обробка результатів, якщо можливо,

- аналіз результатів,

- інтерпретація результатів.

3.2. АНАЛІЗ ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ

Дивіться Загальний вступ до частини В.

4. ПОСИЛАННЯ

Дивіться Загальний вступ до частини В

1. МЕТОД

1.1. ВСТУП

Дивіться Загальний вступ до частини В.

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ

Дивіться Загальний вступ до частини В.

1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ

Відсутні.

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

Декілька груп піддослідних тварин піддаються щоденній дії дослідної речовини в мірних дозах впродовж визначеного часу, один вид концентрації вживається в даній групі впродовж 90 днів. У випадку використання середовища-носія з метою отримання відповідної концентрації дослідної речовини в повітрі, необхідно використовувати контрольну групу для оцінювання середовища-носія. В період приймання дози тварини піддаються щоденному огляду з метою виявлення ознак токсичності. Тварини, що помирають впродовж досліду піддаються розтину, а після закінчення досліду тварини, що залишились, умертвляються і також піддаються розтину.

1.5. ЯКІСНІ КРИТЕРІЇ

Відсутні.

1.6. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

1.6.1. Підготовка

Тварини знаходяться в умовах проживання і харчування, визначених для дослідження щонайменш впродовж 5 днів до початку дослідження. Перед початком дослідження молоді і здорові тварини випадково розподіляються за дослідними і контрольними групами. При необхідності до дослідної речовини може бути додано відповідне середовище-носія для отримання необхідної концентрації речовини в повітрі. У випадку вживання будь-якого середовища-носія або інших добавок для полегшення введення дози, необхідно упевнитись, що вони не викликають жодних токсичних наслідків. Базові дані можуть використовуватись у відповідності до потреб.

1.6.2. Умови проведення досліду

1.6.2.1. Піддослідні тварини

У випадку відсутності протипоказань бажано використовувати щурів. Необхідно використовувати види молодих здорових тварин, які звичайно використовуються для лабораторних дослідів. На початку дослідження розбіжність в вазі не повинна перевищувати +- 20% середньої ваги. У випадку проведення суб-хронічних досліджень в якості попередніх досліджень перед тривалими дослідженнями, необхідно використовувати тварин того самого штаму і джерела.

1.6.2.2. Кількість і стать

Принаймні 20 тварин (10 самців і 10 самок) піддаються дії кожної концентрації речовини. Самки не повинні бути вагітними і не повинні бути такими, що народжували раніше. Якщо планується умертвіння впродовж досліду, кількість необхідно збільшити на кількість тварин, що планується вмертвити до закінчення досліду. Сателітна група кількістю 20 тварин (по 10 тварин кожної статі) може піддаватись дії підвищеної дози впродовж 90 днів з подальшим оглядом на предмет відновлення, стійкості, або запізненого прояву наслідків токсичності через 28 днів після виконання процедур досліду.

1.6.2.3. Концентрація

У випадку використання середовища-носія вимагаються принаймні три рівні концентрації, для контрольної групи і контрольної групи для оцінювання середовища-носія (з концентрацією середовища-носія, що відповідає концентрації при найбільшій дозі). За винятком застосування дослідної речовини тварини з контрольної групи повинні знаходитись в таких самих умовах, що і тварини з дослідної групи. Найвища концентрація повинна викликати токсичні наслідки, але не викликати або викликати незначну кількість летальних випадків. У випадку оцінювання впливу на людину, найнижчий рівень повинен перевищувати рівень, що застосовується для людини. В ідеальному випадку середній рівень дози повинен викликати мінімальний очевидний токсичний ефект. При використанні декількох середніх доз, рівні доз повинні визначатись таким чином, щоб забезпечити градацію токсичних ефектів. В групах, що отримують низьку і середню дозу і в контрольній групі рівень летальних випадків повинен бути низьким для можливості якісної оцінки результатів.

1.6.2.4. Час експозиції

Денна норма часу експозиції повинна складати декілька годин після врівноваження концентрації в комірках. Інші часові рамки тривалості експозиції можуть застосовуватись з метою виконання особливих вимог.

1.6.2.5. Обладнання

Тварини досліджуються з використанням інгаляційного обладнання, розробленого з метою підтримки динамічної циркуляції повітря при щонайменш 12 змінах повітря на годину з метою забезпечення відповідної кількості кисню, а також рівномірного розподілу повітря з вмістом дослідної речовини. У випадку застосування камери, її проект повинен мінімізувати стикання піддослідних тварин, а також мінімізувати їх контакт з дослідною речовиною шляхом інгаляції. Як правило, для стабілізації повітря в камері, загальна кількість піддослідних тварин не повинна перевищувати 5% об'єму дослідної камери. Можуть використовуватись орально-назальні, головні камери, а також камери для всього тіла; використання перших двох типів камер мінімізує можливість прийому дослідної речовини іншими шляхами.

1.6.2.6. Період нагляду

Піддослідні тварини повинні щодня піддаватись огляду з метою виявлення ознак токсичності під час всього періоду дослідження, а також періоду регенерації. Необхідно записувати час смерті, час появи і зникнення ознак токсичності.

1.6.3. Процедура

Тварини піддаються дії дослідної речовини щодня, від п'яти до семи днів на тиждень впродовж 90 днів. Для тварин в будь-якій сателітній групі складається графік оглядів, якого слід дотримуватись впродовж наступних 28 днів, не піддаючи тварин дії дослідної речовини для визначення відновлення або не відновлення після токсичного ефекту. Температура, при якій проводиться дослід повинна підтримуватись на рівні 22 +- 3 град.С. В ідеальному випадку, рівень відносної вологості повинен підтримуватись в межах 30%-70%, але в окремих випадках (наприклад, використовування аерозолів) цей рівень не застосовується. Під час дії речовини їжа і вода не приймаються.

Необхідно використовувати систему динамічної інгаляції з відповідною системою контролю аналітичної концентрації. Для встановлення відповідної концентрації дії речовини рекомендується проведення контрольного випробування. Потік повітря необхідно відрегулювати таким чином, щоб забезпечити однорідні умови в камері. Система повинна забезпечувати досягнення необхідних умов в найкоротший можливий строк.

Необхідно виконати вимірювання або моніторинг:

а) темпу зміни повітря (постійного);

b) дійсної концентрації дослідної речовини, виміряної в зоні дихання. Впродовж денного періоду експозиції концентрація не повинна відхилятись більше ніж на +- 15% від основного значення. Однак, у випадку пилу і аерозолів цей рівень контролю може виявитись недосяжним, в цьому випадку приймається більш широкий діапазон. Впродовж всього періоду дослідження щоденна концентрація повинна підтримуватись на максимально можливому постійному рівні. Впродовж розробки генераторної системи необхідно провести аналіз розміру часток для встановлення стабільності аерозольної концентрації. Впродовж експозиції необхідно проводити аналіз так часто, як це необхідно для визначення постійності розподілу розміру часток;

(с) температури і вологості;

(d) впродовж подальшої експозиції виконуються огляди з їх систематичною реєстрацією; окремі записи ведуться для кожної окремої тварини. Всі тварини оглядаються щодня з записом ознак токсичності, включаючи час їх з'явлення, ступінь і тривалість. Огляди тварин в клітках повинні включати в себе: зміни їх шкіри, очей, слизової оболонки, дихальних шляхів, кровообігу, автономної і центральної нервової системи, соматомоторних характеристик, а також схеми поведінки. Необхідно виконувати виміри обсягу споживання їжі, а також зважування тварин раз на тиждень. Регулярний огляд тварин є необхідним для забезпечення того, щоб тварини впродовж досліду не загинули з причин канібалізму, автолізу тканин або зміщення. В кінці дослідного періоду всі тварини, що вижили, в групах, що не є сателітними, піддаються розтину. Тварини, що вмирають видаляються з групи і також піддаються розтину після настання смерті.

Всі тварини, включаючи тварин з контрольних груп, звичайно піддаються наступним дослідам:

Звичайно виконуються наступні види огляду, включаючи контроль:

(а) офтальмологічний огляд з використанням офтальмоскопу або еквівалентного придатного обладнання здійснюється до початку дії дослідної речовини і після закінчення досліду, бажано для всіх тварин, але принаймні, для групи, що отримувала найвищу дозу і для контрольної групи. При виявлені будь-яких змін в очах, необхідно оглянути всіх тварин.

(с) Визначення клінічної біохімії крові проводиться в кінці дослідного періоду. При дослідженні розглядаються електролітний баланс, вуглеводний обмін речовин, функція печінки і нирок. На вибір того чи іншого досліду впливає визначений спосіб дії дослідної речовини. Пропонується визначити наявність: кальцію, фосфору, хлориду, натрію, калію, глюкози (в період утримання від їжі в залежності від виду тварини), глютамінової пировиноградної транзамінази сироватки(1), глютамінової щавелево-уксусної транзамінази сироватки(2), орнітин декарбоксилаза, гама глуматил транспептидаза, азоту сечовини, альбуміну, кретину в крові, загальний об'єм білірубіну і загальний об'єм протеїну сироватки. Крім того, для здійснення відповідного токсикологічного аналізу необхідно провести аналіз: ліпідів, гормонів, кислотно-лужного балансу, метагемоглобіну, холінестеразне активності. Додаткові клінічні біохімічні показники можуть бути визначені при необхідності для продовження дослідження виявленого ефекту.

----------------

(1) Зараз відомий як аланін амінотрансфераза сироватки.

(2) Зараз відомий як аспарат амінотрансфераза сироватки.

(d) Звичайно, в проведенні аналізу сечі нема необхідності, окрім випадків, коли проведення такого аналізу рекомендується в зв'язку з наявною або очікуваною токсичністю.

Якщо дані основні досліди є недостатніми, необхідно визначити гематологічні і біохімічні параметри до початку дозування.

Загальний розтин

Всі піддослідні тварини підлягають повному детальному загальному розтину, який включає в себе детальне вивчення зовнішньої поверхні тіла, всіх отворів, а також черепної, грудної і черепної порожнин і їхнього вмісту. Печінку, нирки і надниркові залози повинні якнайшвидше після розтину бути зважені в мокрому стані для уникнення висихання. Наступні органи і тканини повинні бути законсервовані в найбільш придатному середовищі для можливих запланованих чергових гістопатологічних досліджень: всі загальні ушкодження, легені - видаляються неушкодженими, легені зважуються і обробляються фіксатором для збереження структури легень (обприскування фіксатором є ефективною процедурою), назо-фарингальні тканини, мозок, включаючи ділянки спинного мозку/варулієва мосту, мозкову кору, слизові оболонки, щитовидні залози/пара-щитовидні залози, трахею, легені, серце, аорту, слинні залози, печінку, селезінку, нирки, надниркові залози, підшлункові залози, гонади, матки (інші статеві органи), (шкіру), жовчний міхур (якщо є), стравохід, шлунок, дванадцятипала кишка, тонка кишка, підвздошна кишка, сліпа кишка, товста кишка, пряма кишка, сечовий міхур, лімфатичні вузли (жіночі грудні залози), (стегнова мускулатура), периферійні нерви, (очі), грудна кістка з кістковим мозком, (стегно, включаючи суглобну поверхню) і (хребет на трьох рівнях: шийному, середньо-грудному і поперековому). Тканини, зазначені в дужках, оглядаються тільки при виявлені ознак токсичності, або якщо вони є органами-мішенями.

Гістопатологічні дослідження

(а) Необхідно провести повну гістопатологію дихального тракту та інших органів і тканин всіх тварин контрольної групи і групи, що отримувала найбільшу дозу.

(b) Всі значні ушкодження повинні бути досліджені.

(d) Легені тварин в групі в низьким та середнім дозуванням також піддаються гістопатологічному дослідженню; оскільки таке дослідження надає можливість якісного оцінювання здоров'я тварин. В наступних гістопатологічних дослідженнях, звичайно, нема потреби в цих групах, але вони завжди повинні проводитись на органах, в яких виявлено значне ушкодження в групі, що отримувала найвищу дозу.

2. ДАНІ

Дані повинні бути зведені в таблицю, в якій представляється загальна кількість тварин в кожній групі на початку дослідження, кількість тварин, у яких виявлені ушкодження, тип ушкоджень і процентне відношення тварин, у яких виявлено кожний тип ушкоджень. Результати оцінюються у відповідності до прийнятного статистичного методу. Може використовуватись будь-який статистичний метод.

3. ЗВІТНІСТЬ

3.1. ЗВІТ З ДОСЛІДУ

Звіт з досліду повинен містити, якщо можливо, в собі наступну інформацію:

- породи, штам, джерело тварин, що використовувались, оточуючі умови, дієту,

- умови дослідження,

- опис апарату, для розповсюдження речовини: включаючи конструкцію, тип, габарити, джерело повітря, система для генерації часток і аерозолів, метод кондиціонування повітря, обробка відпрацьованого повітря і метод розміщення тварин в дослідних камерах, якщо вона використовується. Необхідно описати пристрій для вимірювання температури, вологи, при необхідності, стабільність концентрації аерозолю або розміру частки.

Дані, що стосуються досліду: повинні бути представлені у вигляді таблиці як середні значення і показники змінності (наприклад, стандартне відхилення) і повинні включати в себе:

(а) обсяг повітряного потоку в інгаляційному обладнанні;

(b) температуру і вологість повітря;

(с) номінальну концентрацію (загальний обсяг дослідної речовини, що подається в інгаляційне обладнання, поділений на об'єм повітря);

(d) природу середовища, якщо використовується,

(e) дійсну концентрацію в дослідній зоні дихання;

(f) середній розмір частки (якщо цього вимагає ситуація),

- дані щодо токсичної реакції у відповідності до статі і концентрації,

- відсутність наслідків,

- час умертвіння тварин під час досліджень або інформація про те, чи вижили тварини до часу закінчення досліджень,

- опис наслідків токсичності або інших наслідків,

- час спостерігання кожного аномального прояву і наступні дії,

- дані, що стосуються ваги тіла і харчування,

- результати офтальмологічного досліду,

- застосовані гематологічні дослідження, а також всі результати,

- види клінічних біохімічних досліджень, а також всі їх результати (включаючи результати всіх аналізів сечі),

- результати розтину,

- детальний опис гістопатологічних дослідів,

- статистичну обробку результатів, у відповідних випадках,

- аналіз результатів,

- інтерпретацію результатів.

3.2. АНАЛІЗ ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ

Дивіться Загальний вступ до частини В.

4. ПОСИЛАННЯ

Дивіться Загальний вступ до частини В.

В.30. ТЕСТ НА ХРОНІЧНУ ТОКСИЧНІСТЬ

1. МЕТОД

1.1. ВСТУП

Дивіться Загальний вступ до частини В.

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ

Дивіться Загальний вступ до частини В.

1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ

Відсутні.

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

Дослідна речовина звичайно подається впродовж семи днів на тиждень відповідним способом, кільком групам піддослідних тварин, одна доза на групу, впродовж більшої частини їх життя. Впродовж і після дії дослідної речовини піддослідні тварини щоденно оглядаються на предмет виявлення ознак токсичності.

1.5. ЯКІСНІ КРИТЕРІЇ

Відсутні.

1.6. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

1.6.1. Підготовка

1.6.2. Умови проведення досліду

1.6.2.1. Піддослідні тварини

Ідеальним видом тварин є щури.

На основі результатів попередньо проведених дослідів можуть використовуватись інші види тварин (гризуни і не гризуни). В дослідах приймають участь види тварин, що звичайно використовуються для лабораторних досліджень, дозування повинно початись якнайшвидше після припинення лактації.

На початку дослідження розбіжність в вазі не повинна перевищувати +- 20% середньої ваги. У випадку проведення суб-хронічних пероральних досліджень в якості попередніх досліджень перед тривалими дослідженнями, необхідно використовувати тварин того самого штаму і джерела.

Кількість і стать

У випадку використання гризунів необхідно використовувати принаймні 40 тварин (20 самців і 20 самок) для кожного рівня дози і формування контрольної групи. Самки не повинні бути вагітними і такими, що раніше не народжували. Якщо планується умертвіння впродовж досліду, кількість необхідно збільшити на кількість тварин, що планується вмертвити до закінчення досліду.

У випадку використання видів тварин, що не є гризунами, кількість тварин повинна бути меншою, але не меншою, ніж чотири особини даної статі в даній групі.

1.6.2.3. Рівні доз і частота експозиції

Необхідно застосовувати три рівні доз в доповнення до паралельної контрольної групи. Найвища доза повинна викликати визначені ознаки токсичності, не призводячи до надмірного рівня смертності.

Найнижча доза не повинна викликати жодних ознак токсичності.

Рівень середньої дози (доз) повинен знаходитись між найвищим і найнижчим рівнем.

При виборі рівнів доз необхідно взяти до уваги дані попередніх тестувань токсичності і дослідів.

Необхідно застосовувати звичайну денну частоту експозиції. Якщо хімічна речовина подається з питною водою або з їжею, необхідно забезпечити її наявність впродовж тривалого часу.

1.6.2.4. Контрольні групи

Необхідно використовувати контрольну групу, умови утримання якої не відрізняються від умов утримання тварин в інших групах окрім надання хімічної речовини.

В особливих випадках, наприклад, при інгаляційних дослідах, в яких використовуються аерозолі, або емульгатор, біологічна активність яких не охарактеризована при проведенні пероральних дослідів, необхідно використовувати негативну контрольну групу. Тварини в негативній контрольній групі утримуються в тих самих умовах, що і тварини в дослідних групах, але їм не надається жодного препарату або середовища-носія.

1.6.2.5. Спосіб приймання

Застосовуються два основні способи приймання: пероральний та інгаляційний. Вибір способу приймання залежить від фізичних і хімічних характеристик дослідної речовини і можливим способом дії речовини на організм людини.

Використання способу, при якому шкіра піддається дії хімічної речовини, викликає значні практичні труднощі. Хронічне систематичне отруєння через шкіру, як правило, може бути передбачене на підставі результатів інших пероральних дослідів а також, на підставі знань про тривалу абсорбцію шкірою, які отримані з попередніх досліджень дії хімічних речовин на шкіру.

1.6.2.6. Пероральні дослідження

Якщо дослідна речовина споживається через шлунково-кишковий тракт, і якщо система травлення є подібною до системи травлення людини, бажано використовувати пероральний спосіб прийому речовини, якщо не існує будь-яких протипоказань. Тварини можуть отримувати дослідну речовину, розчинену в питній воді або в капсулах. В ідеальному випадку застосовується щоденне дозування впродовж семи днів на тиждень, оскільки дозування впродовж п'яти днів на тиждень може призвести до одужання тварин або виводу токсичної речовини впродовж періоду, в який не приймається токсична речовина, що в свою чергу призведе до неточності в оцінюванні результатів. Однак, на підставі, перш за все, практичного досвіду, дозування впродовж п'яти днів на тиждень вважається прийнятним.

1.6.2.7. Інгаляційні дослідження

Оскільки інгаляційні дослідження викликають певні технічні проблеми, пов'язані з більшою складність в порівнянні з іншими шляхами вживання, в цьому розділі представлено більш детальний опис способу приймання. Необхідно зауважити, що використання внутрішньо-трахеального введення може виявитись прийнятною альтернативою в окремих ситуаціях.

В обох випадках тварини звичайно піддаються сталій концентрації дослідної речовини. Основною відмінністю між періодичною і тривалою дією є те, що в першому випадку тварини мають 17-18 годин для того, щоб одужати від щоденної дії хімічної речовини, і більш тривалий період під час вихідних днів.

Вибір періодичної або тривалої дії залежить від мети дослідження і впливу на людину, який імітується під час досліду. Однак, необхідно врахувати окремі технічні складності. Наприклад, переваги тривалої дії для моделювання умов зовнішнього середовища можуть компенсуватись необхідністю поїння і годування тварин, а також необхідність відтворення більш складних (і надійних) аерозолів і випарів, методів генерації і моніторингу.

1.6.2.8. Дослідні камери

Тварини досліджуються з використанням інгаляційних камер, що забезпечують динамічну циркуляцію повітря при щонайменш 12 змінах повітря на годину з метою забезпечення відповідної кількості кисню, а також рівномірного розподілу повітря з вмістом дослідної речовини. Конструкція і вигляд контрольних і дослідних камер повинна бути ідентичною для забезпечення рівних умов в усіх аспектах крім дії дослідної речовини. Незначний негативний тиск всередині камери підтримується для уникнення вивільнення дослідної речовину в зовнішнє середовище. Камери повинні бути влаштовані таким чином, щоб мінімізувати стикання піддослідних тварин. Як правило, для стабілізації повітря в камері, загальна кількість піддослідних тварин не повинна перевищувати 5% об'єму дослідної камери.

Необхідно виконати виміри або моніторинг наступних показників:

(i) потоку повітря: рівень потоку повітря, що проходить через камеру, повинен постійно відстежуватись;

(ii) концентрації: впродовж періоду щоденної дії різниця концентрації дослідної речовини не повинна перевищувати +- 15% середнього значення;

(iii) температури і вологості: для гризунів температура підтримується на рівні 22 +- 2 град.С, а вологість всередині камери 30%-70%, крім випадків, коли для підвішування дослідної речовини в камері використовується вода. Бажано, щоб обидва показника постійно вимірювались;

(iv) вимірювання розміру часток: розподіл розміру часток визначається в атмосфері камери, де використовуються рідкі або тверді аерозолі. Аерозольні частки повинні мати розмір, що дає можливість піддослідним тваринам їх вдихати. Проби середовища камери повинні братись з зони дихання тварин. Проби повітря повинні представляти розподіл часток, дії яких піддаються тварини, на підставі отриманих проб повітря гравіметричним способом визначаються всі підвішені аерозолі, навіть у випадку, коли більшість аерозолів не є придатними для вдихання. Аналіз розміру часток повинен проводитись часто впродовж розробки системи генерації для забезпечення стабільності аерозолю і так часто, як це необхідно впродовж дії речовини для достовірного визначення рівномірності розподілу часток, дії яких піддаються тварини.

1.6.2.9. Час тривання досліду

Тривалість часу дії дослідної речовини повинна складати щонайменш 12 місяців.

1.6.3. Процедура

Принаймні раз на день необхідно проводити детальний клінічний огляд. Додаткові огляди проводяться щодня з вжиттям необхідних заходів для мінімізації втрати тварин для вивчення, наприклад, розтин і заморожування мертвих тварин та ізоляція і умертвіння слабких тварин або тварин, що знаходяться при смерті. Детальні огляди проводиться на предмет виявлення початку і прогресування токсичного ефекту, а також для мінімізації втрати через хвороби, автоліз або канібалізм.

Клінічні прояви, включаючи неврологічні і окулярні зміни, а також смертність необхідно реєструвати для всіх тварин. Необхідно також реєструвати час початку і прогресування токсичного стану, включаючи пухлини, що підозрюються.

Один раз на тиждень впродовж перших 13 тижнів дослідного періоду, а потім через, принаймні, кожні чотири тижні записується вага тіла кожної тварини. Раціон харчування визначається щотижня впродовж перших 13 тижнів дослідження, а потім, приблизно, через три місяці, окрім випадків, коли стан здоров'я або вага тіла вимагають протилежного.

Гематологічне дослідження

Гематологічне дослідження (наприклад, дослідження гемоглобіну, гематокриту, загальної кількості еритроцитів, загальної кількості лейкоцитів, тромбоцитів, або інших показників згортання крові) проводиться через три місяці, потім через шість місяців, а потім приблизно через кожні шість місяців, а після закінчення досліджень на зразках крові, взятих від тварин, що не є гризунами і від 10 щурів обох статей. Якщо можливо, зразки крові необхідно брати від тих самих щурів в кожний період. Необхідно взяти зразки до початку досліджень від тварин, що не є гризунами.

Якщо клінічні дослідження вказують на погіршення стану здоров'я тварин під час досліджень, необхідно провести визначення лейкоцитарної формули уражених тварин.

Визначення лейкоцитарної формули здійснюється на зразках, взятих від тварин в групі з найвищим рівнем дозування і контрольних групах. Визначення лейкоцитарної формули здійснюється для наступної групи (груп) тварин з нижчим рівнем дозування тільки у випадку наявності значних розбіжностей між результатами, отриманими в групі з найвищим рівнем дозування і контрольних групах, або у випадку виявлення патологічних ознак.

Аналіз сечі

Для аналізу відбираються проби сечі від тварин, що не є гризунами і від 10 щурів різної статі, якщо можливо, від тих самих щурів в ті самі інтервали часу, що і гематологічні дослідження. Для окремих тварин або для відповідних проб/статей/груп гризунів визначаються наступні показники:

- вигляд: розміри і вага окремих тварин,

- білок, глюкоза, кетони, прихована кров (напів-кількісно),

- мікроскопія осаду (напів-кількісно).

Клінічна хімія

Через кожні шість місяців і в кінці дослідження відбираються зразки крові від всіх тварин, що не є гризунами і від 10 щурів/стать всіх груп, з метою виконання досліджень клінічної хімії, якщо можливо, зразки крові відбираються від тих самих щурів в кожний період. Необхідно взяти зразки крові у тварин, що не є гризунами. Зі зразків готується плазма крові, крім того, необхідно визначити наступні характеристики:

- загальну концентрацію білку,

- концентрацію альбуміну,

- функціональні дослідження печінки (наприклад, дію алкалін фосфатази, дію глютамінової пировиноградної транзамінази(1), глютамінової щавелево-уксусної транзамінази сироватки(2),гама глуматил транспептидаз, орнітин декарбоксилази,

----------------

(1) Зараз відомий як аланін амінотрансфераза сироватки.

(2) Зараз відомий як аспарат амінотрансфераза сироватки.

- вуглеводний обмін речовин, наприклад, рівень глюкози в крові, відібраної після утримання від їжі,

- дослідження функції нирок, наприклад, дослідження азоту сечовини.

Загальний розтин

Повний загальний розтин здійснюється для всіх тварин, включаючи тих, що вмерли впродовж досліду або були вбиті під час, коли вони знаходились в передсмертному стані. До умертвіння необхідно взяти зразки крові у всіх тварин для визначення лейкоцитарної формули. Всі значно помітні ушкодження, пухлини або ушкодження, що за підозрою є пухлинами, зберігаються. Необхідно докласти зусиль щодо кореляції основних оглядів за допомогою мікроскопічних досліджень.

Всі органи і тканини повинні бути законсервовані для гістопатологічних досліджень. Це звичайно стосується наступних органів і тканин: мозку(3) (варулієва моста, кори мозку) слизові оболонки, щитовидні залози/пара-щитовидні залози, зобні тканини (включаючи трахею), серце, аорту, слинні залози, печінку(3), селезінку, нирки, надниркові залози(3), стравохід, шлунок, дванадцятипалу кишку, тонку кишку, підвздошну кишку, сліпу кишку, товсту кишку, пряму кишку, матку, сечовий міхур, лімфатичні вузли, підшлункову залозу, гонади(3), інші статеві органи, жіночі грудні залози, шкіру, мускулатуру, периферійну нервову систему, хребет на трьох рівнях: шийному, середньо-грудному, поперековому, грудну кістку з кістковим мозком, стегно (включаючи суглоби) і очі. Заповнення легенів і сечового міхура фіксатором є оптимальним способом для збереження цих тканин; заповнення легенів при інгаляційних дослідах є важливим для проведення відповідного гістопатологічного дослідження, необхідно дослідити весь дихальний тракт, включаючи ніс, глотку і дихальне горло.

----------------

(3) Ці органи від 10 тварин різної статі для кожної групи гризунів і тварин, що не є гризунами, плюс щитовидна залоза (з пара-щитовидною залозою) для всіх тварин, що не є гризунами мають бути зважені.

При проведенні інших клінічних досліджень інформація, отримана після проведення цих процедур, повинна бути доступною до мікроскопічного огляду, оскільки вона може виявитись важливою для патологоанатома.

Гістопатологія

Всі очевидні зміни, зокрема, новоутворення, а також інші патологічні зміни в будь-якому органі повинні досліджуватись під мікроскопом. Зокрема, рекомендується здійснити наступні процедури:

а) мікроскопічне дослідження всіх збережених органів і тканин разом з повним описом всіх виявлених змін:

1) всі мертві або омертвленні під час досліду тварини;

2) всі групи, що отримували найвищу дозу і контрольна група;

b) органи або тканини, що виказують відхилення, які викликані або можливо викликані дією дослідної речовини досліджуються також в групах, що отримували малу дозу;

с) у випадку, коли результати досліджень показують значне зниження тривалості життя тварин, або викликають наслідки, які можуть впливати на реакцію на токсичність, необхідно дослідити більш низький рівень дози, як описано вище;

d) інформація, що стосується проявів патологічних змін, що звичайно з'являються у видів тварин, що досліджуються в тих самих лабораторних умовах, тобто, відсутні значні розбіжності в контрольних даних для правильного оцінювання значимості змін, що спостерігаються у піддослідних тварин.

2. ДАНІ

Дані повинні бути зведені в таблицю, в якій представляється загальна кількість тварин в кожній групі на початку дослідження, кількість тварин, у яких виявлені ушкодження і процентне відношення тварин, у яких виявлено кожний тип ушкоджень. Результати оцінюються у відповідності до прийнятного статистичного методу. Може використовуватись будь-який прийнятний статистичний метод.

3. ЗВІТНІСТЬ

ЗВІТ З ДОСЛІДУ

Звіт з досліду повинен містити, якщо можливо, в собі наступну інформацію:

- породи, штам, джерело тварин, що використовувались, оточуючі умови, дієту,

- умови дослідження,

Опис апарату, для розповсюдження речовини:

Включаючи конструкцію, тип, габарити, джерело повітря, система для генерації часток і аерозолів, метод кондиціонування повітря, обробка відпрацьованого повітря і метод розміщення тварин в дослідних камерах, якщо воно використовується. Необхідно описати пристрій для вимірювання температури, вологи, при необхідності, стабільність концентрації аерозолю або розміру частки.

Дані, що стосуються досліду:

Повинні бути представлені у вигляді таблиці як середні значення і показники змінності (наприклад, стандартне відхилення) і повинні включати в себе:

(а) обсяг повітряного потоку в інгаляційному обладнанні;

(b) температуру і вологість повітря;

(d) природу середовища-носія, якщо використовується,

(e) дійсну концентрацію в дослідній зоні дихання;

(f) середній розмір частки (якщо цього вимагає ситуація),

- рівні доз (включаючи середовище, якщо використовується) і концентрацію,

- дані щодо токсичної реакції у відповідності до статі і дози,

- відсутність наслідків,

- час смерті тварин підчас досліджень або інформація про те, чи вижили тварини до часу закінчення досліджень,

- опис наслідків токсичності або інших наслідків,

- час спостерігання кожного аномального прояву і наступні дії,

- дані, що стосуються ваги тіла і харчування,

- результати офтальмологічного досліду,

- застосовані гематологічні дослідження, а також всі результати,

- види клінічних біохімічних досліджень, а також всі їх результати (включаючи результати всіх аналізів сечі),

- результати розтину,

- детальний опис гістопатологічних дослідів,

- статистична обробка результатів, у відповідних випадках,

- аналіз результатів,

- інтерпретація результатів.

3.2. АНАЛІЗ ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ

Дивіться Загальний вступ до частини В.

4. ПОСИЛАННЯ

Дивіться Загальний вступ до частини В

В.31. ДОСЛІДЖЕННЯ ДІЇ ТОКСИЧНИХ РЕЧОВИН НА ПРЕНАТАЛЬНИЙ РОЗВИТОК

1. МЕТОД

Цей метод дослідження є копією OECD TG 414 (2001).

1.1. ВСТУП

Цей метод дослідження токсичності призначений для того, щоб надати загальну інформацію щодо дії дослідної речовини на вагітних піддослідних тварин і організми, що розвиваються в утробі; цей дослід може включати в себе оцінювання материнського ефекту, а також смертності, аномалій або зміни в розвитку плоду. Функціональна недостатність також є важливою частиною дослідження, але не є невід'ємною частиною цього методу. Це дослідження може бути проведене в якості окремого досліду або як додаткове дослідження з використанням методу дослідження нейротоксичності. Для отримання інформації щодо дослідження функціональної недостатності та інших постнатальних ефектів метод вивчення двогенераційної репродуктивної токсичності і негативного невротоксиного впливу на внутрішньоутробний розвиток може вважатись прийнятним.

Цей метод дослідження може вимагати додаткової адаптації в окремих випадках на підставі особливого досвіду, наприклад, психо-хімічних або токсикологічних характеристик дослідної речовини. Така адаптація є прийнятною, коли обґрунтовані наукові докази підтверджують, що така адаптація призведе до отримання більш повних результатів досліду. В такому випадку наукові докази повинні бути ретельно задокументовані в звіті досліду.

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ

Токсикологія внутрішньоутробного розвитку: дослідження негативного впливу на організм, що розвивається, який може мати місце при дії хімічної речовини на організм до зачаття, впродовж пренатального або постнатального розвитку до періоду статевої зрілості. Основні прояви шкідливого впливу на внутрішньоутробний розвиток включають себе: 1) смерть організму, 2) структурні аномалії, 3) зміни в рості організму, 4) функціональна недостатність. Токсикологія внутрішньоутробного розвитку раніше часто згадувалась як тератологія.

Шкідливий ефект: будь-які зміни від вихідних даний, пов'язані з дією речовини, які зменшують здатність організму до виживання, народжування або адаптування до навколишнього середовища. В контексті токсикології внутрішньоутробного розвитку в її широкому розумінні, включає в себе будь-який ефект, що заважає нормальному розвитку плоду до і після народження.

Зміни розвитку: зміни в органах, вазі або розмірі тіла потомства.

Зміни (аномалії): структурні зміни в розвитку, що включають в себе тератоформи і зміни (28).

Тератоформи/значні аномалії: структурні зміни, що вважаються визначними для тварини (можуть також бути летальними) і трапляються рідко.

Зміни/незначні аномалії: структурні зміни, що вважаються незначними або не мають визначного ефекту на тварину; можуть бути транзиторними і можуть зустрічатись відносно часто в контрольних популяціях.

Запліднене яйце: сума дериватів або запліднених яйцеклітин на будь-якій стадії розвитку від запліднення до народження, включаючи поза-зародкові мембрани а також ембріон або плід.

Імплантація (нівація): приєднання зародкового міхура до епітельної вистелки матки, включаючи його проникнення через епітелій матки в розміщення в ендометрії.

Ембріон: рання стадія або стадія розвитку організму, особливо продукту запліднення яйця, що розвивається, після з'явлення довгої осі і до утворення всіх основних структур.

Ембріотоксичність: шкідлива дія на нормальну структуру, розвиток, ріст і/або життєздатність ембріону.

Плід: Ненароджений продукт зачаття в пост-ембріонний період.

Фетотоксичність: шкідлива дія на нормальну структуру, розвиток, ріст і/або життєздатність плоду.

Передчасне припинення вагітності: передчасне видалення з матки продукту зачаття: ембріону або нежиттєздатного плоду.

Резорбція: запліднене яйце, імплантоване в матку, що вмерло і всмокталось або всмоктується.

Рання резорбція: очевидна імплантація без ознак утворення ембріону/плоду.

Пізня резорбція: мертвий ембріон або плід з зовнішніми дегенеративними змінами.

1.3. ЕТАЛОННА РЕЧОВИНА

Відсутні.

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

Звичайно дослідна речовина подається вагітним тваринам принаймні від часу імплантації до дня, що передує дню умертвіння тварини, який повинен бути якомога ближчим до дня народження потомства без ризику втрати даних, отриманих від ранніх родів. Визначений метод не націлений на дослідження виключно періоду органогенезу (наприклад, 5-15 днів у гризунів і 6-18 днів у кролика), але також на наслідки, що виявляються в період, який передує імплантації у відповідних випадках, впродовж всього періоду вагітності до останнього дня перед кесаревим розтином. На короткий термін до кесаревого розтину самки умертвляються, віст маток досліджується, а плоди оцінюються на предмет наявності очевидних внутрішніх аномалій і змін в м'яких і кісних тканинах.

1.5. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

1.5.1. Вибір видів тварин

Рекомендується здійснення дослідження на найбільш придатних видах тварин, а також використання лабораторних видів і штамів, що звичайно використовуються при дослідженні пренатальної токсичності. Бажаною породою гризуна є щур, а серед інших видів тварин, що не є гризунами - кролик. Використання інших видів тварин необхідно обґрунтувати.

1.5.2. Умови утримання і харчування

Температура в дослідних приміщеннях, де здійснюється годування тварин, повинна складати 22 град.С (+- 3 град.) для гризунів і 18 град.С (+- 3 град.) для кроликів. Хоча відносна вологість повинна складати принаймні 30% і бажано, щоб вона не перевищувала 70% поза часом прибирання приміщення, необхідно слідкувати за тим, щоб її рівень знаходився в межах 50-60%. Освітлення повинно бути штучним, з наступним циклом: 12 годин-світло, 12 годин - темно. Для харчування використовується лабораторний корм з необмеженим доступом до питної води.

Процедура запліднення здійснюється в клітках, спеціально призначених для цієї мети. Хоча, бажаним є індивідуальне розміщення запліднених тварин, їх розміщення невеликими групами також є прийнятним.

1.5.3. Підготовка тварин

Необхідно використовувати здорових тварин, що пройшли акліматизацію в лабораторних умовах впродовж щонайменш, п'яти днів і які не були предметом попередніх експериментальних процедур. Піддослідні тварини повинні бути охарактеризовані за породою, штамом, джерелом, статтю, вагою і/або віком. Тварини в усіх дослідних групах повинні, якщо це можливо, мати однакову вагу і вік. Для кожного рівня дози використовуються молоді самки, що не народжували. Самки спарюються з самцями того самого виду і штаму, схрещування потомства тих самих батьків заборонене. Для гризунів днем 0 в вагітності вважається день, в який спостерігається вагінальна пробка або сперма; для кроликів днем 0 звичайно є день спарювання або штучного запліднення, якщо застосовується ця техніка. Запліднені самки повинні бути оцінені для неупередженого відбору до дослідних груп. Клітки повинні бути облаштовані таким чином, щоб мінімізувати можливий ефект, викликаний розташуванням клітки. Кожній тварині присвоюється унікальний ідентифікаційний номер. Запліднені самки повинні бути оцінені для неупередженого відбору до дослідних груп, і якщо самки запліднювались партіями, тварини з кожної партії повинні бути рівномірно розподілені за групами. Так само, самки, що запліднені тими самими самцями, повинні рівномірно розподілятись за групами.

1.6. ПРОЦЕДУРА

1.6.1. Кількість і стать тварин

В кожній дослідній і контрольній групі повинна знаходитись відповідна кількість самок для отримання приблизно 20 самок з місцями імплантації при розтині. Групи, в який кількість тварин з місцями імплантації складає 16 тварин є неприйнятними. Материнська смертність не анулює результатів досліду за умови, якщо вона не перевищує приблизно 10%.

1.6.2. Підготовка доз

При використанні середовища-носія або іншої добавки для полегшення дозування необхідно звернути увагу на наступні характеристики: вплив на засвоюваність, розподіл, метаболізм, або утримання дослідної речовини; вплив на хімічні якості дослідної речовини, що можуть змінити її токсичні характеристики; і вплив на споживання їжі або води або харчового статусу тварин. Середовище-носій не повинне ані мати токсичну дію на внутрішньоутробний розвиток, ані впливати на народжуваність.

1.6.3. Дозування

Звичайно, дослідна речовина подається щодня після імплантації (наприклад, 5 днів після спарювання) до дня, що передує дню, в який здійснюється кесарів розтин. Якщо попередні дослідження, якщо вони проводились, не виявляються високої здатності до предімплантаціної втрати, дію дослідної речовини можна продовжити включаючи весь період вагітності - від спарювання, до дня, в який планується умертвіння тварин. Загальновідомим фактом є те, що неправильне поводження або стрес впродовж періоду вагітності може призвести до пренатальної втрати. Необхідно берегти тварин від небажаних стресів, що не пов'язані з процесом дослідження, а також зі стресом, що походить з зовнішніх джерел, таких як шум.

Використовуються принаймні три рівні доз з одночасним поточним контролем. Здорові тварини неупереджено призначаються в контрольні і дослідні групи. Рівні доз визначаються таким чином, щоб можна було встановити градації токсичного ефекту. Враховуючи обмеження, викликані фізико-хімічною природою і біологічним ефектом дослідної речовини, рівень найвищої дози вибирається з метою викликання деяких ознак негативної дії на внутрішньоутробний розвиток і/або токсичного впливу на материнський організм (клінічні ознаки або зменшення ваги тіла), але вибрана доза не повинна призводити до смерті або значних страждань. Принаймні один середній рівень дози повинен викликати мінімальний очевидний токсичний ефект. Найнижча доза не повинна викликати будь-яких очевидних ознак токсичної дії на материнський організм або внутрішньоутробний розвиток. Зменшення дозування застосовується з метою демонстрації реакції, пов'язаної з дозуванням і рівня при якому не спостерігається шкідливих наслідків (NOAEL) при найнижчій дозі. Двократні або чотирикратні інтервали є оптимальними для встановлення рівнів дозування, що знижуються, а введення четвертої дослідної групи є часто необхідним при використанні дуже значних інтервалів (наприклад, з коефіцієнтом більше 10) між дозуваннями. Також метою є встановлення материнського NOAEL, однак досліди, що не встановлюють такого рівня також є прийнятними(1).

Рівні доз обираються з урахуванням будь-яких наявних даних щодо токсичності, а також додаткової інформації щодо метаболізму або токсикокінезу дослідної речовини або пов'язаних матеріалів. Ця інформація також є корисною для демонстрації адекватності режиму дозування.

Необхідно використовувати паралельну контрольну групу. Ця група піддається дії стимулятора або середовища-носія, якщо для дозування дослідної речовини використовується середовище-носій. Всім групам надається однаковий об'єм дослідної речовини або середовища-носія. Тварини в контрольній групі (групах) знаходяться в тих самих умовах, що і тварини в дослідних групах. Групи, що піддаються дії середовища-носія, отримують його в найбільшому об'ємі (що використовуються для дослідних груп з найменшим рівнем дозування).

1.6.4. Дослід на граничний вміст

Якщо тестування при одному Рівні доз, еквівалентному 1 000 мг/кг маси тіла/день при використанні процедур, описаних для цього досліду, не викликає помітних ознак токсичності ні для вагітних тварин, ні для їх потомства, якщо такий ефект не очікується на підставі наявних даних (наприклад, на підставі структурних або метаболічнно-пов'язаних складових), після чого в використанні трьох рівнів дозування може відпасти необхідність. Очікуваний шкідливий вплив на організм людини може бути підставою для призначення вищої дози, що приймається перорально, при проведенні досліду на граничний вміст. Для інших типів вживання речовини, таких як інгаляція або дія на шкіру, фізико-хімічні властивості дослідної речовини часто можуть визначати і обмежувати максимальний рівень використовуваної речовини (наприклад, нанесення речовини на шкіру не повинно викликати значної місцевої інтоксикації).

1.6.5. Вживання доз

Дослідна речовина або середовище-носій звичайно подається перорально або через трубку. Якщо використовується інший спосіб вживання, лаборант повинен надати обґрунтування вибору такого способу і модифікації, які можуть виявитись необхідними(2)(3)(4). Дослідна речовина подається приблизно в той самий час кожного дня.

Дозування для окремих тварин звичайно призначається на підставі ваги тіла, що була виміряна найпізніше. Однак, необхідно вжити заходів обережності при регулюванні доз впродовж останнього триместру дослідження вагітності. Наявні дані використовуються для вибору доз з метою уникнення материнської інтоксикації. Однак, при виявлені надмірної інтоксикації самок, що піддавались дії дослідної речовини, тварини повинні бути безболісно вбиті. Якщо декілька вагітних тварин виявляють ознаки надмірної інтоксикації, необхідно розглянути можливість ліквідації цієї групи. Якщо дослідна речовина подається через зонд, необхідно здійснювати подачу речовини однією дозою тваринам, що мають шлунковий зонд або катетер. Максимальний об'єм рідини, що подається за один раз залежить від розміру тварини. Об'єм речовини не повинен перевищувати 1 мл/100 г ваги тіла, окрім випадків використання водного розчину, де використовується об'єм 2 мл/100 г ваги тіла. Якщо в якості середовища-носія використовується кукурудзяне масло, об'єм не повинен перевищувати 0,4 мл/100 г ваги тіла. Зміни об'єму дослідної речовини повинні бути мінімізовані шляхом регулювання концентрації для забезпечення постійного об'єму при всіх рівнях дозування.

1.6.6. Огляд вагітних самок

Необхідно проводити і реєструвати клінічні огляди принаймні раз на день, бажано в один і той самий час кожного дня, приймаючи до уваги піковий період очікуваних ефектів після дозування. Умови тварин необхідно реєструвати, включаючи смертність, передсмертний стан, відповідні зміни в поведінці, і а також всі ознаки очевидної інтоксикації.

1.6.7. Вага тіла і споживання їжі

Тварини зважуються в день 0 вагітності або не пізніше, ніж на 3 день настання вагітності, якщо тварини, що були запліднені одночасно надані зовнішнім селекціонером, в перший день дозування, принаймні кожні три дні впродовж періоду дозування і в день запланованого умертвіння.

Об'єм спожитої їжі реєструється кожні три дні, така реєстрація повинна співпадати з днями, в які визначається вага тіла тварин.

1.6.8. Огляд трупу, що піддавався розтину

Самки умертвляються за один день до очікуваного дня родів. Самки, що виявляють ознаки переривання вагітності або передчасного народження до запланованого умертвіння умертвляються і піддаються детальному макроскопічному огляду.

Під час ліквідації або смерті впродовж досліду самки піддається макроскопічному огляду на предмет виявлення будь-яких структурних аномалій або патологічних змін. Оцінка самок при кесаревому розтині і наступному аналізі плоду бажано проводити без отримання інформації щодо піддослідної групи з метою уникнення упередженого ставлення.

1.6.9. Огляд вмісту матки

Негайно після ліквідації або якнайшвидше після смерті матки повинні бути видалені для підтвердження стану вагітності у тварин. Матки, що не мають ознак вагітності, піддаються подальшому огляду (наприклад, методом обробки сульфідом амонію, методом Залевського або будь-яким альтернативним методом для кроликів) для підтвердження відсутності вагітності(5).

Матки, що мають ознаки вагітності, включаючи шийку, повинні бути зважені. Вага маток з ознаками вагітності не визначається у тварин, що померли впродовж досліду.

Для вагітних тварин визначається кількість жовтих тіл.

Вміст маток необхідно оглянути на предмет виявлення мертвих ембріонів або плодів, а також життєздатних плодів. Ступінь резорбції описується для оцінки відносного часу смерті заплідненого яйця (Дивіться розділ 1.2.).

1.6.10. Огляд плодів

Необхідно визначити стать і вагу кожного плоду.

Кожний плід повинен бути оглянутий на предмет виявлення зовнішніх змін(6).

Плоди повинні бути оглянуті на предмет виявлення змін в м'яких або кісткових тканинах (наприклад, зміни, тератоформи або аномалії)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21) (22)(23)(24). Категоризація зміни плодів є бажаною але не обов'язковою.

Після здійснення категоризації необхідно чітко визначити кожну категорію. Особливу увагу необхідно приділити статевим шляхам. Які оглядаються на предмет змін в розвитку.

Для гризунів половина посліду повинна бути підготовлена і оглянута на предмет скелетних змін. Залишок посліду підготовлюється для огляду на предмет змін в м'яких тканинах за допомогою прийнятих або прийнятних методів серійного розтину або технік детального загального розтину.

Для тварин, що не є гризунами, наприклад, для кроликів, необхідно оглянути всі плоди на предмет виявлення як скелетних змін, так і змін в м'яких тканинах. Тіла цих плодів оцінюються за допомогою детального розтину на предмет виявлення змін в м'яких тканинах, який може включати в себе процедури для подальшого оцінювання внутрішньої серцевої структури(25). Голови половини плодів, що оглянути вищезазначеним способом, відтинаються і оглядаються на предмет виявлення змін в м'яких тканинах (включаючи очі, мозок, носові порожнини і язик) з використанням стандартних методів серійного розтину(26) або еквівалентного методу. Тіла цих плодів і неушкоджені плоди, що залишились, препаруються і оглядаються на предмет виявлення скелетних змін з використанням тих самих методів, що використовуються для гризунів.

2. ДАНІ

2.1. ПРЕДСТАВЛЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

Данні записуються окремо для самок і для їх потомства і зводяться в таблицю, в якій показується для кожної дослідної групи і для кожної генерації кількість тварин на початку дослідження, кількість тварин, що вмерли впродовж дослідження або вбитих з причин гуманності час смерті або безболісного умертвіння, кількість вагітних самок, кількість тварин, що виявляють ознаки інтоксикації, опис ознак інтоксикації, що спостерігаються, включаючи час появи ознак, тривалість ознак, і ступінь кожного токсичного ефекту, тип огляду ембріону/плоду і всі відповідні дані, що стосуються посліду.

Числові результати оцінюються відповідним статистичним методом, використовуючи послід як одиницю для аналізу даних. Необхідно використовувати загально прийнятий статистичний метод; статистичні методи відбираються у відповідності до виду дослідження і повинні бути обґрунтовані. Дані щодо тварин, які не вижили до запланованого умертвіння також мають бути повідомлені. Ці дані можуть бути включені для отримання групового середнього значення, коли це необхідно. Актуальність даних, отриманих від таких тварин, і як наслідок, їх включення або виключення з групового середнього значення оцінюється і обґрунтовується в кожному окремому випадку.

2.2. ОЦІНКА РЕЗУЛЬТАТІВ

Результати, отримані в ході дослідження дії токсичних речовин на пренатальний розвиток оцінюються на підставі виявленого ефекту. Оцінювання включає в себе наступну інформацію:

- результати дослідження материнського організму, а також ембріонів/плодів, включаючи оцінку наявності або відсутності реакції на дію дослідної речовини на тварин а також розповсюдження і ступінь виявленого ефекту,

- критерії, що використовуються для категоризації змін зовнішньої поверхні плоду, м'яких тканин і скелету, у випадку, коли проводилась категоризація,

- якщо необхідно, дані історичного контролю для покращення інтерпретації результатів дослідження,

- цифри, що використовуються у підрахунках, всі процентні відношення і коефіцієнти,

- адекватний статистичний аналіз результатів досліду, якщо необхідно, який може включати в себе інформацію щодо методу аналізу для того, щоб незалежний експерт/статистик мав змогу повторно оцінити і переконструювати аналіз.

При отриманні результатів, що свідчать про відсутність будь-якого токсичного ефекту необхідно передбачити проведення подальших досліджень для встановлення засвоєння і біологічної доступності дослідної речовини.

2.3. ІНТЕРПРЕТАЦІЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

Дослідження дії токсичних речовин на пренатальний розвиток надають результати щодо ефекту від повторної дії дослідної речовини на організм вагітних самок і на внутрішньо маточний розвиток їхнього потомства. Результати досліду інтерпретуються разом з результатами, отриманими в ході субхронічних, репродуктивних і токсикокінетичних та інших досліджень. Оскільки наголос робиться як на питаннях загальної інтоксикації в показниках інтоксикації материнського організму, так і на питаннях шкідливої дії на внутрішньоутробний розвиток, результати досліду дозволяють в певній мірі визначити різницю між шкідливою дією на внутрішньоутробний розвиток при відсутності загальної інтоксикації і дією, що проявляється при певних рівнях токсичності, що є також шкідливими для материнського організму(27).

3. ЗВІТНІСТЬ

3.1. ЗВІТ З ДОСЛІДУ

Звіт з досліду повинен містити в собі наступну інформацію про:

Дослідну речовину:

- фізичну природу, і якщо необхідно, фізико-хімічні властивості,

- ідентифікацію, включаючи номер CAS, якщо він відомий/визначений,

- чистоту.

Середовище-носій (якщо використовувалось)

- обґрунтування вибору середовища-носія, якщо відрізняється від води.

Піддослідні тварини:

- вид і штам, що використовувався,

- кількість і вік тварин,

- джерело, навколишні умови, харчування і т.ін.,

- індивідуальна маса тіла тварин на початку дослідження.

Умови дослідження:

- раціональне обґрунтування рівня доз,

- детальний опис формули дослідної речовини/приготування їжі, концентрація, стабільність і однорідність препарату,

- деталі, що стосуються подання дослідної речовини,

- у відповідних випадках перелік концентрацій дослідної речовини в їжі/питній воді (ppm) на окрему дозу мг/кг маси тіла/день,

- умови навколишнього середовища,

- деталі якості їжі і води.

Результати:

Дані щодо реакції на дію дослідної речовини на материнський організм, включаючи без обмежень:

- кількість тварин на початку досліду, кількість тварин, що вижили, кількість вагітних тварин, кількість переривань вагітності, кількість тварин, що народили раніше визначеного часу,

- день смерті впродовж дослідження або факт виживання тварин до кінця дослідження,

- дані щодо тварин, які не дожили до запланованого умертвіння записуються, але не включаються до статистичного порівняння груп,

- день спостерігання кожного аномального клінічного прояву і його подальший розвиток,

- вага тіла, зміна ваги тіла і вага вагітної матки, включаючи в деяких випадках зміну ваги тіла, скоректовану на вагу вагітної матки,

- об'єм спожитої їжі, і об'єм спожитої води, якщо він визначається,

- результати розтину, включаючи вагу матки,

- необхідно включити в звіт значення NOAEL стосовно ефектів на материнський організм і на внутрішньоутробний розвиток.

Критичні точки внутрішньоутробного розвитку за дозами для посліду з імплантами, включаючи:

- кількість жовтих тіл,

- кількість імплантацій, кількість і відсоток мертвих плодів і резорбцій,

- кількість і відсоток до- і після- імплантаційних втрат.

Критичні точки внутрішньоутробного розвитку за дозами для посліду з живими плодами, включаючи:

- кількість і відсоток живого потомства,

- відношення між статями,

- вага тіла плоду, бажано за кожною статтю окремо і разом,

- зовнішні тератоформи, тератоформи м'яких тканин і скелету, а також інші відповідні зміни,

- критерії для категоризації, якщо необхідно,

- загальна кількість і відсоток плодів і посліду з зовнішніми змінами, змінами в м'яких тканинах або скелеті, а також типи і показники індивідуальних аномалій, та інших відповідних змін.

Обговорення результатів.

Висновки.

4. ПОСИЛАННЯ

(1) Kavlock R.J. et al., (1996) A Simulation of the Influence of Study Design on the Estimation of Benchmark Doses for Developmental Toxicity. Risk Analysis 16; p. 399-410.

(2) Kimmel, C.A. and Francis, E.Z., (1990) Proceedings of the Workshop on the Acceptability and Interpretation of Dermal Developmental Toxicity Studies. Fundamental and Applied Toxicology 14; p. 386-398.

(3) Wong, B.A. et al., (1997) Developing Specialized Inhalation Exposure Systems to Address Toxicological Problems. CIIT Activities 17; p. 1-8.

(4) US Environmental Protection Agency, (1985) Subpart E-Specific Organ/Tissue Toxicity, 40 CFR 798.4359: Inhalation Developmental Toxicity Study.

(5) Salewski, E., (1964) Faerbermethode zum Makroskopischen Nachweis von Implantation Stellen am Uterusder Ratte. Naunyn-Schmeidebergs Archiv fur Pharmakologie und Experimentale Pathologie. 247, 367.

(6) Edwards, J.A., (1968) The external Development of the Rabbit and Rat Embryo. In Advances of Teratology. D.H.M. Woolam (ed) Vol. 3. Academic Press, NY.

(7) Inouye, M. (1976) Differential Staining of Cartilage and Bone in Fetal Mouse Skeleton by Alcian Blue and Alizarin Red S.Congenial Anomalies 16, p. 171-173.

(8) Igarashi, E. Et al., (1992) Frequency Of Spontaneous Axial Skeletal Variations Detected by the Double Staining Technique For Ossified and Cartilaginous Skeleton in Rat Foetuses. Congenial Anomalies 32, p. 381-391.

(9) Kimmel, C.A. et al. (1993) Skeletal Development Following Heat Exposure in the Rat. Teratology, 47 p. 229-242.

(10) Marr, M.C. et al. (1998) Comparison of Single and Double Staining for Evaluation of Skeletal Development: The Effects of Ethylene Glycol (EG) in CD Rats. Teratology 37; 476.

(11) Barrow, M.V. and Taylor, W.J. (1969) A Rapid Method for Detecting Malformations in Rat Foetuses. Journal of Morphology, 127, p. 291-306.

(12) Fritz, H. (1974) Prenatal Ossification in Rabbits ss Indicative of Foetal Maturity. Teratology, 11 p. 313-320.

(13) Gibson, J.P. et al. (1966) Use of the Rabbits in Teratogenicity Studies. Toxicology and Applied Pharmacology, 9, p. 398-408.

(14) Kimmel, C.A. and Wilson, J.G. (1973) Skeletal Deviations in Rats: Malformations or Variations & Teratology, 8, p. 309-316.

(15) Marr, M.C. et al. (1992) Developmental Stages of the CD (Spargue-Dawlery) Rat Skeleton after Maternal Exposure to the Ethylene Glycol. Teratology, 46, p. 169-181.

(16) Monie, I.W. et al. (1965) Dissection Procedures for rat Foetuses Permitting Alizarin Red Staining of Skeleton and Histological Study of Viscera. Supplement to the Teratology Workshop Manual, p. 163-173.

(17) Spark, C. And Dawson, A.B. (1928) The Order and Time of appearance of Centers of Ossification in the Fore and Hind Limbs of the Albino Rat, with Special Reference to the Possible Influence of the Sex Factor. American Journal of Anatomy, 41, p. 411-445.

(18) Staples, R.E. and Schnell, V.L. (1964) Refinements in Rapid Clearing Technique in the KOH-Alizarin Red S Method for Fetal Bone. Stain Technology, 39, p. 61-63.

(19) Strong, R.M. (1928) The Order Time and Rate of Ossification of the Albino Rat (Mus Norvegicus Albinus Skeleton. American Journal of Anatomy, 36, p. 313-355.

(20) Stuckhardt, J.L. and Poppe, S.M. (1984) Fresh Visceral Examination of Rat and Rabbit Foetuses Used in Teratogenicity Testing. Teratogenesis, Carciinogenesis, and Mutagenesis, 4, p. 181-188.

(21) Walker, D.G. and Wirtschafter, Z.T. (1957) The Genesis of the Rat Skeleton. Thomas, Springfield, IL

(22) Wilson, J.G. (1965) Embryological Considerations in Teratology. In Teratology: Principles and Techniques, Wilson J.G. and Warkany J. (eds). University of Chicago, Chicago, IL, p. 251-277.

(23) Wilson J.G. and Fraser, F.C. (eds). (1977) Handbook of Teratology, Vol. 4. Plenum, NY.

(24) Varnagy, L. (1980) Use of Recent Fetal Bone Staining Techniques in the Evaluation of the Pesticide Teratogenicity. Acta Vet. Acad. Sci. Hung, 28, p. 233-239.

(25) Staples, R.E. (1974) Detection of visceral Alterations in Mammalian Foetuses. Teratology, 9, p. 37-38.

(26) Van Julsingha, E.B. and C.G. Bennet (1977) A Dissecting Procedure for the Detection of Anomalies in the Rabbit Foetal Head. In: Methods in Prenatal Toxicology Neubert, D., Merker, H.J. and Kwasingroch, T.E. (eds.). University of Chicago, Chicago, IL, p. 126-144.

(27) US Environmental Protection Agency (1991) Guidelines for Developmental Toxicity Risk Assessment. Federal Register, 56, p. 63798-63826.

(28) Wise, D.L. et al. (1997) Terminology of Developmental Abnormalities in Common Laboratory Mammals (Version 1) Teratology, 55, p. 249-292.

В.32. ТЕСТ-проба на канцерогенність

1. МЕТОД

1.1. ВСТУП

Дивіться Загальний вступ до частини В.

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ

Дивіться Загальний вступ до частини В.

1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ

Відсутні.

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

Дослідна речовина звичайно подається сім днів на тиждень відповідним шляхом декільком групам піддослідних тварин, одна доза подається кожній групі впродовж більшої частини життя тварин. Впродовж і після дії дослідної речовини дослідні тварини оглядаються щодня на предмет виявлення інтоксикації, зокрема, на предмет виявлення пухлин.

1.5. ЯКІСНІ КРИТЕРІЇ

Відсутні.

1.6. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

Тварини розміщуються у відповідних умовах проживання і харчування впродовж, принаймні, п'яти днів до початку дослідження. До початку дослідження молоді здорові тварини неупереджено вибираються до дослідних і контрольних груп.

1.6.1. Піддослідні тварини

На підставі результатів попередніх досліджень, можуть використовуватись різні види тварин (гризуни і не гризуни). До дослідів залучаються тварини, що звичайно використовуються під час лабораторних дослідів, дозування починається якнайшвидше після припинення лактації.

На початку досліду розбіжність в вазі тварин не повинна перевищувати +- 20% від середнього значення. При проведенні субхронічного перорального дослідження в якості попереднього дослідження перед довгостроковим дослідженням в обох випадках необхідно використовувати ті самі види/штами.

1.6.2. Кількість і стать

Для гризунів вибирається принаймні 100 тварин (50 самок і 50 самців) для кожного рівня дозування і для контрольної групи. Самки повинні бути такими, що не народжували раніше і не є вагітними. Якщо впродовж досліду планується умертвіння тварин, кількість тварин повинна бути збільшена на кількість тварин, яку планується умертвити до закінчення дослідження.

1.6.3. Рівні доз і частота експозиції

Крім контрольної групи необхідно використовувати принаймні три групи з різними рівнями дозування. В групі з найвищим рівнем дозування мають бути виявлені ознаки мінімальної інтоксикації, такі як незначне уповільнення збільшення маси тіла (менше ніж 10%), без значної зміни звичайної тривалості життя через інші причини, ніж наявність пухлин.

Найнижчий рівень не повинен впливати на нормальний ріст, розвиток і тривалість життя тварини або викликати будь-які прояви інтоксикації. Взагалі цей рівень, повинен бути на 10% нижчим за високий рівень дозування.

Рівень середньої дози повинен знаходитись між високим і низьким рівнями.

При виборі рівня дози до уваги приймаються дані, отримані з попередніх тестів і досліджень токсичності.

Дослідну речовину, як правило, надають кожного дня.

Якщо хімічна речовина подається з питною водою, або змішується з їжею, вона повинна бути постійно доступною.

1.6.4. Контроль

Необхідно використовувати паралельну контрольну групу, умови утримання якої не відрізняються від умов утримання тварин в інших групах окрім надання хімічної речовини.

1.6.5. Спосіб приймання

Застосовуються три основні способи приймання: пероральний, дермальний та інгаляційний. Вибір способу приймання залежить від фізичних і хімічних характеристик дослідної речовини і можливим способом дії речовини на організм людини.

1.6.5.1. Пероральні дослідження

В ідеальному випадку застосовується щоденне дозування впродовж семи днів на тиждень, оскільки дозування впродовж п'яти днів на тиждень може призвести до одужання тварин або виводу токсичної речовини впродовж періоду, в який не приймається токсична речовина, що в свою чергу призведе до неточності в оцінюванні результатів. Однак, на підставі, перш за все, практичного досвіду, дозування впродовж п'яти днів на тиждень вважається прийнятним.

1.6.5.2. Дермальні дослідження

Нанесення речовини на шкіру може використовуватись для імітації основного шляху потрапляння речовини в організм людини і в якості моделювання системи ураження шкіри.

1.6.2.3. Інгаляційні дослідження

Довготривалі дослідження розробляються на підставі впливу, що передбачається на організм людини. Тварини піддаються дії хімічної речовини або щодня впродовж шести годин після регулювання концентрації речовини в камері п'ять днів на тиждень (періодична дія), або у відповідності до оточуючого середовища впродовж 22-24 годин на день впродовж семи днів на тиждень (тривала дія) з годинною перервою щодня, в один і той самий час, для годування і підготовки камери. В обох випадках тварини звичайно піддаються сталій концентрації дослідної речовини. Основною відмінністю між періодичною і тривалою дією є те, що в першому випадку тварини мають 17-18 годин для того, щоб одужати від щоденної дії хімічної речовини, і більш тривалий період під час вихідних днів.

1.6.6. Дослідні камери

Необхідно виконати виміри або моніторинг наступних показників:

(i) потоку повітря: рівень потоку повітря, що проходить через камеру, повинен постійно відстежуватись;

(ii) концентрації: впродовж періоду щоденної дії різниця концентрації дослідної речовини не повинна перевищувати +- 15% середнього значення. Впродовж всього періоду дослідження необхідно підтримувати постійну концентрацію кожного дня;

(iii) температури і вологості: для гризунів температура підтримується на рівні 22 +- 2 град.С, а вологість всередині камери 30%-70%, крім випадків, коли для підвішування дослідної речовини в камері використовується вода, Бажано, щоб обидва показника постійно вимірювались;

1.6.7. Час тривання досліду

Тривалість досліду на канцерогенність складає основну частину життя піддослідних тварин. Припинення досліду відбувається на 18 місяць для мишей і хом'яків і на 24 місяць для щурів; однак, для окремих видів тварин, що мають більш тривалий період життя і/або низький рівень спонтанних пухлин, припинення досліду в такому випадку здійснюється на 24 місяць для мишей і хом'яків і на 30 місяць для щурів. Крім того, припинення такого подовженого досліду є прийнятним у випадку, коли кількість тварин, що вижили, в групі з найнижчим дозуванням або в контрольній групі досягає 25%. При припиненні досліду, при якому спостерігається велика різниця в результатах за окремими статями, тварини кожної статі оцінюються окремо. Якщо тільки група з найвищим рівнем дозування вмирає достроково через очевидні ознаки інтоксикації, це не повинно впливати на час припинення досліду, за умови, що прояви інтоксикації не викликають проблем в інших групах. Для того, щоб негативні результати досліду були прийнятними, не більше 10% кожної групи може бути втрачено під час експерименту через автоліз, канібалізм або проблеми в управлінні, відсоток тварин, що вижили, є не меншим за 50% на 18 місяць для мишей і хом'яків і на 24 місяць для щурів.

1.6.8. Процедура

1.6.8.1. Огляди

Щоденні огляди в клітках повинні включати в себе огляди змін в шкірі і хутрі, очах і слизових оболонках, а також в дихальних системах, системах кровообігу, автономній і центральній нервовій системі, схемі соматомоторної активності і поведінки.

Регулярні огляди тварин є необхідними для уникнення, наскільки це можливо, втрати тварин впродовж досліду через такі причини як канібалізм, автоліз тканин або зміщення. Тварини, що вмирають, умертвляються і піддаються розтину.

Клінічні прояви, а також смертність необхідно реєструвати для всіх тварин. Особливу увагу необхідно звернути на розвиток пухлин: реєструється час початку формування пухлини; розташування, розміри, вигляд і прогресування кожної пухлини, що є значно помітною або відчутною на дотик.

Оцінка обсягу їжі, що споживається (об'єму води, що споживається, коли дослідна речовина подається з питною водою) здійснюється щотижнево впродовж перших 13 тижнів досліду, а потім приблизно через кожні три місяці, окрім випадків, коли стан здоров'я або зміни ваги тіла вимагають протилежного.

Вага тіла кожної тварини записується окремо один раз на день впродовж перших 13 тижнів періоду дослідження і принаймні один раз на чотири тижні після цього.

1.6.8.2. Клінічні дослідження

Гематологія

На 12 місяць, 18 місяць і до безболісного вбивання тварин у тварин береться мазок крові. Визначається лейкоцитарна формула крові на пробах крові тварин з групи з високим рівнем дози і в контрольних групах. Визначення лейкоцитарної формули здійснюється для груп з нижчими рівнями дозування, якщо дані, зокрема, дані, отримані до вбивання тварин, або дані, отримані в результаті патологічного дослідження вказують на таку необхідність.

Загальний розтин

Повний загальний розтин здійснюється для всіх тварин, включаючи тих, що вмерли впродовж досліду або були вбиті під час, коли вони знаходились в передсмертному стані. Всі значно помітні пухлини, ушкодження або ушкодження, що за підозрою є пухлинами, зберігаються.

Наступні органи і тканини повинні бути законсервовані у відповідному середовищі для можливого наступного гістопатологічного дослідження: мозок (включаючи ділянки варулієва моста, кори мозку) слизові оболонки, щитовидні залози/пара-щитовидні залози, зобні тканини, трахея і легені, серце, аорта, слинні залози, печінка, селезінка, нирки, надниркові залози, підшлункова залоза, гонади, матка, інші статеві органи, шкіра, стравохід, шлунок, дванадцятипала кишка, тонка кишка, підвздошна кишка, сліпа кишка, товста кишка, пряма кишка, сечовий міхур, лімфатичний вузол, жіночі грудні залози, стегно, мускулатуру, периферійну нервову систему, грудну кістку з кістковим мозком, стегно (включаючи суглоби), хребет на трьох рівнях: шийному, середньо-грудному і поперековому, очі.

Заповнення легенів і сечового міхура фіксатором є оптимальним способом для збереження цих тканин; заповнення легенів при інгаляційних дослідах є важливим для проведення відповідного гістопатологічного дослідження. При інгаляційних дослідах необхідно зберегти весь дихальний тракт, включаючи ніс, глотку і дихальне горло.

Гістопатологія

(а) Необхідно провести повну гістопатологію всіх органів і тканин всіх тварин, що вмерли або були вбиті впродовж досліду і всіх тварин в контрольних групах і групах з високим рівнем дозуванням;

(b) Всі значно помітні пухлини або ушкодження, що можуть бути пухлинами, повинні бути досліджені під мікроскопом в усіх групах тварин,

с) Якщо наявні значні розбіжності в частоті неопластичних ушкоджень в групах тварин з високим рівнем дозування і контрольних групах, необхідно провести гістопатологію окремих органів або тканин в інших групах,

(d) Якщо виживання в групі з високим рівнем дозування є значно нижчим ніж в контрольній групі, необхідно повністю дослідити групи з нижчим рівнем дозування,

(е) Якщо є очевидні докази в групі з високим рівнем дозування наявності токсичного або іншого ефекту, що можуть вплинути на неопластичну реакцію, необхідно повністю дослідити групи з нижчим рівнем дозування.

2. ДАНІ

Дані повинні бути зведені в таблицю, в якій представляється загальна кількість тварин в кожній групі на початку дослідження, кількість тварин, у яких впродовж досліду виявлені пухлини, час виявлення пухлини і кількість тварин, у яких виявлено пухлини після їх умертвіння. Результати оцінюються у відповідності до прийнятного статистичного методу. Може використовуватись будь-який визнаний статистичний метод.

3. ЗВІТНІСТЬ

3.1. ЗВІТ З ДОСЛІДУ

Звіт з досліду повинен містити, якщо можливо, в собі наступну інформацію:

- породи, штам, джерело тварин, що використовувались, оточуючі умови, дієту,

- умови дослідження:

3.1.1. Опис апарату, для розповсюдження речовини:

включаючи конструкцію, тип, габарити, джерело повітря, систему для генерації часток і аерозолів, метод кондиціонування повітря, обробки відпрацьованого повітря і метод розміщення тварин в дослідних камерах, якщо вона використовується. Необхідно описати пристрій для вимірювання температури, вологи, при необхідності, стабільність концентрації аерозолю або розміру частки.

3.1.2. Дані, що стосуються дії речовини:

повинні бути представлені у вигляді таблиці як середні значення і показники змінності (наприклад, стандартне відхилення) і повинні включати в себе:

(а) обсяг повітряного потоку в інгаляційному обладнанні;

(b) температуру і вологість повітря;

(d) природу середовища, якщо використовується,

(e) дійсну концентрацію в дослідній зоні дихання;

(f) середній розмір частки (якщо цього вимагає ситуація),

- рівні доз (включаючи середовище, якщо використовується) і концентрації,

- частоту появи пухлин за статтю, дозою і типом пухлини,

- час смерті впродовж досліду або факт виживання тварин до умертвіння,

- дані щодо реакцію на токсичність за статтю і дозою,

- опис наслідків токсичності або інших наслідків,

- час спостерігання кожного аномального прояву і наступні дії,

- час виявлення кожного аномального прояву і подальші дії,

- дані щодо харчування і ваги тіла,

- виконані гематологічні досліди і всі результати,

- результати розтину,

- детальний опис гістопатологічних дослідів,

- статистичну обробку результатів з описом використаних методів,

- обговорення результатів,

- інтерпретацію результатів.

3.2. ОЦІНКА ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ

Дивіться Загальний вступ до частини В.

4. ПОСИЛАННЯ

Дивіться Загальний вступ до частини В

В.33. КОМБІНОВАНИЙ ТЕСТ НА ХРОНІЧНУ ТОКСИЧНІСТЬ/КАНЦЕРОГЕННІСТЬ

1. МЕТОД

1.1. ВСТУП

Дивіться Загальний вступ до частини В.

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ

Дивіться Загальний вступ до частини В.

1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ

Відсутні.

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

Метою комбінованого тесту на хронічну токсичність/канцерогенність є визначення хронічного і канцерогенного ефекту дослідної речовини на ссавців під час довготривалої дії.

З цією метою до тесту канцерогенності залучається одна сателітна група, що отримує дослідну речовину і контрольна сателітна група. Під час тесту на кенцерогенність доза, що використовується для сателітної групи може бути вищою, ніж та, що використовується для групи з високою дозою. Тварини під час тесту на кенцерогенність оглядаються на предмет виявлення загальної інтоксикації а також на канцерогенну реакцію. Тварини в сателітній, групі, що отримує дослідну речовину, оглядаються на предмет виявлення загальної інтоксикації.

Дослідна речовина звичайно подається сім днів на тиждень відповідним шляхом декільком групам піддослідних тварин, одна доза на групу впродовж більшої частини життя тварин. Впродовж і після закінчення дії тестової речовини, піддослідні тварини оглядаються щодня на предмет виявлення ознак інтоксикації і розвитку пухлин.

1.5. ЯКІСНІ КРИТЕРІЇ

Відсутні.

1.6. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

1.6.1. Піддослідні тварини

Для досліду бажано використовувати щурів. На підставі результатів попередніх досліджень, можуть використовуватись інші види тварин (гризуни і не гризуни). До дослідів залучаються тварини, що звичайно використовуються під час лабораторних дослідів, дозування починається якнайшвидше після припинення лактації.

На початку досліду розбіжність в вазі тварин не повинна перевищувати +- 20% від середнього значення. При проведення субхронічного перорального дослідження в якості попереднього дослідження перед довгостроковим дослідженням в обох випадках необхідно використовувати ті самі види/штами.

1.6.2. Кількість і стать

Для гризунів вибирається принаймні 100 тварин (50 самок і 50 самців) для кожного рівня дозування і для контрольної групи. Самки повинні бути таким, що не народжували раніше і не є вагітними. Якщо впродовж досліду планується умертвіння тварин, кількість тварин повинна бути збільшена на кількість тварин, яку планується умертвити до закінчення дослідження.

Сателітна група (групи), що піддаються дії речовини, для оцінки наявності іншої патології крім пухлин повинна складати 20 тварин кожної статі, а сателітна контрольна група повинна складатись з 10 тварин кожної статі.

1.6.3. Рівні доз і частота експозиції

З метою проведення тесту на канцерогенність крім контрольної групи необхідно використовувати принаймні три групи з різними рівнями дозування. В групі з найвищим рівнем дозування мають бути виявлені ознаки мінімальної інтоксикації, такі як незначне уповільнення збільшення маси тіла (менше ніж 10%) без значної зміни звичайної тривалості життя через інші причини, ніж наявність пухлин.

Рівень середньої дози повинен знаходитись між високим і низьким рівнями.

При виборі рівня дози до уваги приймаються дані, отримані з попередніх тестів і досліджень токсичності.

З метою проведення тестування хронічної токсичності до тесту залучаються додаткові групи, що отримує дослідну речовину і паралельна контрольна сателітна група. Висока доза для тварин в сателітній групі, що отримує дослідну речовину, повинна викликати явні ознаки інтоксикації.

Дослідну речовину, як правило, надають кожного дня.

Якщо хімічна речовина подається з питною водою, або змішується з їжею, вона повинна бути постійно доступною.

1.6.4. Контроль

1.6.5. Спосіб приймання

1.6.5.1. Пероральні дослідження

1.6.5.2. Дермальні дослідження

1.6.5.3. Інгаляційні дослідження

1.6.6. Дослідні камери

Необхідно виконати виміри або моніторинг наступних показників:

(i) потоку повітря: рівень потоку повітря, що проходить через камеру, повинен постійно відстежуватись;

1.6.7. Час тривання досліду

Тривалість досліду на канцерогенність складає основну частину життя піддослідних тварин. Припинення досліду відбувається на 18 місяць для мишей та хом'яків і на 24 місяць для щурів; однак, для окремих видів тварин, що мають більш тривалий період життя і/або низький рівень спонтанних пухлин, припинення досліду в такому випадку здійснюється на 24 місяць для мишей і хом'яків і на 30 місяць для щурів. Крім того, припинення такого подовженого досліду є прийнятним у випадку, коли кількість тварин, що вижили, в групі з найнижчим дозуванням або в контрольній групі досягає 25%. При припиненні досліду, при якому спостерігається велика різниця в результатах за окремими статями, тварини кожної статі оцінюються окремо. Якщо тільки група з найвищим рівнем дозування вмирає достроково через очевидні ознаки інтоксикації, це не повинно впливати на час припинення досліду, за умови, що прояви інтоксикації не викликають проблем в інших групах. Для того, щоб негативні результати досліду були прийнятними, не більше 10% кожної групи може бути втрачено під час експерименту через автоліз, канібалізм або проблеми в управлінні, відсоток тварин, що вижили, є не меншим за 50% на 18 місяць для мишей і хом'яків і на 24 місяць для щурів.

Сателітні групи, що складаються з 20 тварин кожної статі, які приймають дози і контрольна група з 10 тварин кожної статі, що використовуються для тестування хронічної інтоксикації використовується в досліді принаймні впродовж 12 місяців. Ці тварини умертвляються з наступним оглядом на предмет виявлення патології, пов'язаної з дослідом, неускладненої геронтологічними змінами.

1.6.8. Процедура

1.6.8.1. Огляди

Клінічні огляди проводяться через відповідні проміжки часу для тварин в сателітній групі (групах), що піддаються дії дослідної речовини.

Клінічні прояви, включаючи невробіологічні і окулярні зміни, а також смертність необхідно реєструвати для всіх тварин. Особливу увагу необхідно звернути на розвиток пухлин: реєструється час початку формування пухлини; розташування, розміри, вигляд і прогресування кожної пухлини, що є значно помітною або відчутною на дотик, необхідно також зареєструвати час утворення і прогресування проявів інтоксикації.

1.6.8.2. Клінічні дослідження

Гематологія

Гематологічні дослідження (наприклад, вміст гемоглобіну, показник гематокриту, кількість еритроцитів, загальну кількість лейкоцитів, кількість тромбоцитів та інші характеристики потенціалу згортання крові) необхідно проводити через кожні три місяці, шість місяців і приблизно через кожні шість місяців після цього, після закінчення досліду проби крові збираються у 10 щурів/на стать з усіх груп. Якщо це можливо, проби крові беруться від тих самих тварин в кожний інтервал.

У випадку, коли в результаті огляду в клітках виявлено погіршення здоров'я тварин впродовж досліду, необхідно здійснити визначення лейкоцитарної формули крові уражених тварин. Диференційне визначення лейкоцитарної формули крові виконується на зразках крові тварин з групи, що отримувала найвищу дозу і з тварин контрольної групи. Диференційне визначення лейкоцитарної формули групи (груп) з меншими дозами виконується тільки в тому випадку, коли виявлено значну невідповідність в результатах, отриманих в групі з найвищою дозою і в контрольній групі, або якщо це необхідно у відповідності до результатів патологічних досліджень.

Аналіз сечі

Для аналізу відбираються проби сечі від тварин, що не є гризунами і від 10 щурів/на, якщо можливо, від тих самих щурів в ті самі інтервали часу, що і гематологічні дослідження. Для окремих тварин або для відповідних проб/статей/груп гризунів визначаються наступні показники:

- вигляд: розміри і вага окремих тварин,

- білок, глюкоза, кетони, прихована кров (напів-кількісно),

- мікроскопія осаду (напів-кількісно).

Клінічна хімія

Через кожні шість місяців і в кінці дослідження відбираються зразки крові від всіх тварин, що не є гризунами і від 10 щурів/стать всіх груп, з метою виконання досліджень клінічної хімії, якщо можливо, зразки крові відбираються від тих самих щурів в кожний період. Крім того, до-тестовий зразок необхідно взяти від тварин, що не є гризунами. Зі зразків готується плазма крові, крім того, необхідно визначити наступні характеристики:

- загальну концентрацію білку,

- концентрацію альбуміну,

- функціональні дослідження печінки наприклад, дію алкалін фосфатази, дію глютамінової пировиноградної транзамінази(1), глютамінової щавелево-уксусної транзамінази сироватки(2),гама глуматил транспептидаз, орнітин декарбоксилази,

----------------

(1) Зараз відомий як аланін амінотрансфераза сироватки.

(2) Зараз відомий як аспарат амінотрансфераза сироватки.

- вуглеводний обмін речовин, наприклад, рівень глюкози в крові, відібраної після утримання від їжі,

- дослідження функції нирок, наприклад, дослідження азоту сечовини.

Загальний розтин

Всі органи і тканини повинні бути законсервовані для гістопатологічних досліджень. Це звичайно стосується наступних органів і тканин: мозку(3) (варулієва моста, кори мозку) слизові оболонки, щитовидні залози (включаючи пара-щитовидні залози), зобні тканини (включаючи трахею), серце, аорту, слинні залози, печінку(3), селезінку, нирки(3), надниркові залози(3), стравохід, шлунок, дванадцятипалу кишку, тонку кишку, підвздошну кишку, сліпу кишку, товсту кишку, пряму кишку, сечовий міхур, лімфатичні вузли, підшлункову залозу, гонади(3), інші статеві органи, жіночі грудні залози, шкіру, мускулатуру, периферійну нервову систему, хребет на трьох рівнях (шийному, середньо-грудному, поперековому), грудну кістку з кістковим мозком, стегно (включаючи суглоби) і очі.

----------------

(3) Ці органи від 10 тварин різної статі для кожної групи гризунів мають бути зважені.

Заповнення легенів і сечового міхура фіксатором є оптимальним способом для збереження цих тканин; заповнення легенів при інгаляційних дослідах є важливим для проведення відповідного гістопатологічного дослідження. При проведенні спеціальних досліджень, таких як інгаляційні дослідження, необхідно дослідити весь дихальний тракт, включаючи ніс, глотку і дихальне горло.

При проведенні інших досліджень інформація, отримана після проведення цих процедур, повинна бути доступною до мікроскопічного огляду, оскільки вона може виявитись важливою для патологоанатома.

Гістопатологія

Для дослідження хронічної інтоксикації:

Необхідно виконати огляд всіх збережених органів всіх тварин сателітної групи з високим дозуванням і контрольних груп. При виявлені патології, пов'язаної з дослідною речовиною в сателітній групі з високим дозуванням, органи-мішені всіх інших тварин в інших сателітних групах, що приймають дослідну речовину, піддаються повному і детальному гістологічному огляду, так само, як і тварини, в групах канцерогенного дослідження після завершення такого дослідження.

Для дослідження канцерогенності:

(а) необхідно провести повну гістопатологію органів і тканин всіх тварин, що вмерли, або були вбиті впродовж досліду і всіх тварин в контрольній групі і групі з високим рівнем дозування;

(b) всі очевидні пухлини або ушкодження, що за підозрою є пухлинами повинні досліджуватись під мікроскопом. Зокрема, рекомендується здійснити наступні процедури;

(с) якщо наявні значні розбіжності в частоті неопластичних ушкоджень в групах тварин з високим рівнем дозування і контрольних групах, необхідно провести гістопатологію окремих органів або тканин в інших групах,

(d) якщо виживання в групі з високим рівнем дозування є значно нижчим ніж в контрольній групі, необхідно повністю дослідити групи з нижчим рівнем дозування,

(е) якщо є очевидні докази в групі з високим рівнем дозування наявності токсичного або іншого ефекту, що можуть вплинути на неопластичну реакцію, необхідно повністю дослідити групи з нижчим рівнем дозування.

2. ДАНІ

Дані повинні бути зведені в таблицю, в якій представляється загальна кількість тварин в кожній групі на початку дослідження, кількість тварин, у яких впродовж досліду виявлені пухлини або токсичний ефект, час виявлення пухлини і кількість тварин, у яких виявлено пухлини після їх умертвіння. Результати оцінюються у відповідності до прийнятного статистичного методу. Може використовуватись будь-який визнаний статистичний метод.

3. ЗВІТНІСТЬ

3.1. ЗВІТ З ДОСЛІДУ

Звіт з досліду повинен містити, якщо можливо, в собі наступну інформацію:

- породи, штам, джерело тварин, що використовувались, оточуючі умови, дієту,

- умови дослідження:

3.1.1. Опис апарату, для розповсюдження речовини:

3.1.2. Дані, що стосуються дії речовини:

(а) обсяг повітряного потоку в інгаляційному обладнанні;

(b) температуру і вологість повітря;

(d) природу середовища-носія, якщо використовується,

(e) дійсну концентрацію в дослідній зоні дихання;

(f) середній розмір частки (якщо цього вимагає ситуація),

- рівні доз (включаючи середовище, якщо використовується) і концентрації,

- частоту появи пухлин за статтю, дозою і типом пухлини,

- час смерті впродовж досліду або факт виживання тварин до умертвіння, включаючи сателітну групу,

- дані щодо реакцію на токсичність за статтю і дозою,

- опис наслідків токсичності або інших наслідків,

- час спостерігання кожного аномального прояву і наступні дії,

- офтальмологічні дослідження,

- дані щодо харчування і ваги тіла,

- виконані гематологічні досліди і всі результати,

- дослідження клінічної біохімії і всі результати (включаючи аналіз сечі),

- результати розтину,

- детальний опис всіх гістопатологічних дослідів,

- статистичну обробку результатів з описом використаних методів,

- обговорення результатів,

- інтерпретацію результатів.

3.2. ОЦІНКА ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ

Дивіться Загальний вступ до частини В.

4. ПОСИЛАННЯ

Дивіться Загальний вступ до частини В.

В.34. ДОСЛІДЖЕННЯ РЕПРОДУКТИВНОЇ ТОКСИЧНОСТІ ОДНОЇ ГЕНЕРАЦІЇ

1. МЕТОД

1.1. ВСТУП

Дивіться Загальний вступ до частини В.

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ

Дивіться Загальний вступ до частини В.

1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ

Відсутні.

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

Дослідна речовина подається мірними дозами декільком групам самців і самок. Самцям доза надається впродовж періоду зростання і впродовж принаймні одного циклу сперматогенезу (приблизно 56 днів у мишей і 70 днів у щурів), з метою викликання різноманітних негативних наслідків впливу дослідної речовини на сперматогенез.

Самки з генерації (Р) отримують дози принаймні впродовж останніх двох тічкових циклів для викликання шкідливого впливу дослідної речовини на статеву систему. Після цього тварини спарюються. Дослідна речовина подається особинам обох статей впродовж періоду спарювання, а потім тільки самкам впродовж вагітності і періоду лактації. Використання інгаляційного методу потребує внесення відповідних змін.

1.5. ЯКІСНІ КРИТЕРІЇ

Відсутні.

1.6. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

1.6.1. Підготовка

До початку досліду здорові молоді тварини випадково відбираються до дослідних і контрольних груп. Тварини знаходяться в експериментальних умовах проживання і харчування впродовж, принаймні, п'яти днів до початку досліду. Рекомендується подавати дослідну речовину з їжею або питною водою. Інші шляхи подавання дослідної речовини також є прийнятними. Всі тварини отримують дози дослідної речовини тим самим методом впродовж відповідного експериментального періоду. Якщо використовується середовище-носій або інші добавки для спрощення дозування, вони повинні бути визнані такими, що не викликають токсичного ефекту. Дозування здійснюється сім днів на тиждень.

1.6.2. Піддослідні тварини

Вибір видів тварин

Для досліду бажано використовувати щурів або мишей. Використовуються здорові тварини, що раніше не використовувались для дослідів. Використовуються штами з низькою плодючістю. Піддослідні тварини характеризуються за видом, штамом, статтю, вагою і/або віком.

Для адекватного оцінювання плодючості необхідно дослідити як самців, так і самиць. Лактація всіх піддослідних і контрольних тварин до початку дозування повинна бути припинена.

Кількість і стать

Кожна піддослідна і контрольна група повинна містити достатню кількість тварин для того, щоб приблизно 20 вагітних самок народили в день закінчення досліду або до нього.

Метою досліду є отримання достатньої кількості вагітностей і потомства для забезпечення достовірної оцінки потенціального впливу речовини на плодючість, вагітність і материнську поведінку у тварин і генерації Р, а також на ссання, ріст і розвиток потомства F від зачаття до припинення лактації. 1

1.6.3. Умови досліду

Їжа та вода надається на власний розсуд. При наближенні часу настання пологів самок необхідно розмістити в окремі клітки, призначені для пологів і годування, клітки можуть бути забезпечені спеціальним устілковим матеріалом.

1.6.3.1. Рівні доз

В досліді використовується принаймні три дослідні і одна контрольна група. Якщо використовується середовище-носій для подання дослідної речовини, контрольна група повинна отримувати його в найбільшому можливому об'ємі. Якщо дослідна речовина викликає зниження споживання або використання їжі, доручення контрольної групи з відповідним графіком годування може виявитись необхідним. Якщо доза не обмежується фізико-хімічними або біологічними властивостями речовини, найбільша доза повинна викликати інтоксикацію, але не смертельні випадки в групі тварин батьків Р. Середня доза повинна викликати мінімальні наслідки інтоксикації, що можуть бути віднесені до дослідної речовини, а низька доза не повинна викликати будь-яких очевидних шкідливих ефектів на батьків або потомство. Якщо речовина подається через зонд або в капсулах, дози, що надаються кожній тварині, призначаються у відповідності до ваги тіла кожної тварини і регулюються щотижня у відповідності до зміни ваги тіла. Для самок в період вагітності дози призначаються у відповідності до ваги тіла в день 0 або 6 вагітності, якщо вона є бажаною.

1.6.3.2. Дослід на граничний вміст

У випадку використання речовини з низькою токсичністю, якщо рівень дози 1 000 мг/кг не викликає жодного очевидного впливу на плодючість, в проведенні дослідження інших рівнів доз нема необхідності. Якщо попереднє дослідження при високому Рівні доз при очевидній материнські інтоксикації не виявляє шкідливого впливу на плодючість, в проведенні дослідження інших рівнів доз нема необхідності.

1.6.3.3. Виконання досліду

Графіки експериментів

Щоденне дозування батьківських самців (Р) повинно починатись у віці від п'яти до дев'яти тижнів, після припинення їх годування молоком і акліматизації впродовж приблизно п'яти днів. У випадку використання щурів дозування триває 10 тижнів до спарювання (для мишей - вісім тижнів). Самці умертвляються і досліджуються або в кінці періоду спарювання, або продовжують приймати дослідний раціон для можливого народження другого посліду, вбиваються і досліджуються за певний проміжок часу перед закінченням досліду. Для батьківських самок (Р) дозування має початись після акліматизації впродовж принаймні п'яти днів і тривати принаймні два тижні до спарювання. Щоденне дозування Р самок повинно тривати три тижні періоду спарювання, період вагітності і до припинення лактації потомства F . Необхідно звернути увагу на зміну графіку 1

дозування  на  підставі  іншої  наявної  інформації щодо дослідної
речовини, такої як метаболізм або біо-акумуляція.

Процес спарювання

При дослідженні репродуктивної токсичності використовується пропорція 1:1 (один самець на одну самку) або 1:2 (один самець на дві самки).

При пропорції 1:1 самка перебуває з одним самцем до вагітності або впродовж трьох тижнів. Кожного ранку самки оглядаються на предмет присутності сперми або вагінальних пробок. День 0 вагітності визначається як день, в який помічено вагінальну пробку або сперму.

Пари, які призначені до спарювання оцінюються на предмет ознак безпліддя.

Цей процес може включати в себе такі процедури як надання додаткових можливостей для спарювання з іншими затвердженими самцями або самками, огляд під мікроскопом репродуктивних органів і дослідження тічкового циклу або сперматогенезу.

Розмір посліду

Тварини, що отримують дози речовини, впродовж дослідження плодючості приводять послід в звичайному режимі і вирощують потомство до припинення лактації без стандартизації посліду.

Після того, як стандартизацію здійснено, пропонується наступна процедура. В проміжок часу між днем 1 та 4 після народження розмір кожного посліду регулюється шляхом усунення зайвих новонароджених особин - чотири самки і 4 чотири самці на послід.

Якщо кількість новонароджених самців і самок не складає чотири особини кожної статі на послід, можливі незначні відхилення (наприклад, п'ять самців і три самки). Відхилення є неприйнятними для послідів, кількість новонароджених тварин в яких складає менше восьми особин.

1.6.4. Огляди

Впродовж дослідного періоду кожна тварина піддається огляду принаймні один раз на день. Відповідні зміни в поведінці, ознаки ускладнень або затримки пологів, а також всі ознаки інтоксикації, включаючи смертність повинні бути зареєстровані. В період, що передує спарюванню і в період спарювання обсяг споживання їжі може вимірюватись щодня. Після пологів і впродовж лактації визначення обсягу їжі, що споживається (і визначення обсягу питної води, якщо дослідна речовина подається з питною водою) здійснюється в день зважування посліду. Самці і самки Р зважуються в перший день початку дозування і потім щотижня. Ці огляди проводяться окремо для кожної дорослої тварини.

Період вагітності визначається з дня 0 вагітності. Кожний послід оглядається якнайшвидше після народження для визначення кількості і статі новонароджених особин, кількості мертвонароджених особин, кількості живих новонароджених особин і наявності значних аномалій.

Мертві новонароджені особини і особини, які були вбиті в день 4 зберігаються і досліджуються на предмет виявлення можливих дефектів. Живі новонароджені особини мають бути пораховані, а послід зважено на ранок після народження, в день 4 і 7, а потім щотижня до припинення досліду, коли тварини зважуються окремо.

Фізичні аномалії або аномалії в поведінці самок або потомства мають бути зареєстровані.

1.6.5. Патологія

1.6.5.1. Розтин

В час вбивання або смерті тварин впродовж досліду, тварини генерації Р піддаються макроскопічному огляду на предмет виявлення структурних аномалій або патологічних змін, при цьому особливу увагу необхідно приділити органам репродуктивної системи. Мертві або вмираючі новонароджені особини мають бути оглянуті на предмет виявлення дефектів.

1.6.5.2. Гістопатологія

Яєчники, матки, шийки маток, вагіни, яєчка, епідерміс, сім'яні міхури, простати, згортувальна залоза, гіпофіз і орган (органи)-мішені всіх тварин Р мають бути збережені для мікроскопічного дослідження. У випадку, якщо ці органи залишились не оглянутими в інших дослідах з повторним дозуванням, їх необхідно оглянути під мікроскопом в групах з високим дозуванням і в контрольний групі, також в окремих випадках необхідно оглянути органи тварин, що вмерли впродовж досліду.

Органи, тварин, у яких виявлено ознаки аномалій, мають бути оглянуті у інших тварин Р. В цих випадках необхідно провести мікроскопічне дослідження всіх тканин, що виявляють ознаки значних патологічних змін. Як запропоновано в розділі, що описує процедуру спарювання, репродуктивні органи тварин, що за підозрою є безплідними, піддаються мікроскопічному огляду.

2. ДАНІ

Дані можуть бути представлені у вигляді таблиці, в якій представляється загальна кількість тварин в кожній групі на початку дослідження, кількість плідних тварин, кількість вагітних самок, типи змін і відсоток тварин, що виявляють кожен тип змін.

Якщо можливо, кількісні результати оцінюються відповідним статистичним методом. Може використовуватись будь-який загальноприйнятий статистичний метод.

3. ЗВІТНІСТЬ

ЗВІТ З ДОСЛІДУ

Звіт з досліду повинен містити, якщо можливо, в собі наступну інформацію:

- породи/ штам, що використовувались,

- дані щодо реакції на токсичну речовину у відповідності до статі і дози, включаючи плодючість, вагітність і життєздатність,

- час смерті впродовж досліду або факт виживання тварин до планового умертвіння або до закінчення досліду,

- таблицю, що представляє вагу кожного посліду, середнє значення ваги новонародженої особини і вага кожної тварини при закінченні досліду,

- токсичний або інший ефект на репродуктивні функції, потомства і постнатальне зростання,

- день виявлення кожного випадку аномалії і наступні дії,

- дані щодо ваги тіла тварин Р,

- результати розтину,

- детальний опис всіх мікроскопічних дослідів,

- статистичну обробку результатів, в необхідних випадках,

- обговорення результатів,

- інтерпретацію результатів.

3.2. ОЦІНКА ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ

Дивіться Загальний вступ до частини В.

4. ПОСИЛАННЯ

Дивіться Загальний вступ до частини В.

В.35. ДОСЛІДЖЕННЯ РЕПРОДУКТИВНОЇ ТОКСИЧНОСТІ ДВОХ ГЕНЕРАЦІЙ

1. МЕТОД

Цей метод дослідження є копією OECD TG 416 (2001).

1.1. ВСТУП

Цей метод дослідження репродуктивної токсичності двох генерацій призначений для того, щоб надати загальну інформацію щодо дії дослідної речовини на цілісність і функції жіночої і чоловічої репродуктивної системи, включаючи функції гонад, тічковий цикл, поведінку при спарюванні, зачаття, вагітність, пологи, лактацію, припинення лактації, ріст і розвиток потомства. Дослідження також може надати інформацію про ефект дослідної речовини на смертність новонародженого потомства, смертність, а також попередні дані про пренатальну і постнатальну інтоксикацію в період розвитку і служити посібником для подальших дослідів. Крім того для дослідження росту і розвитку генерації F , цей метод 1

дослідження    також   призначений   для   оцінки   цілісності   і
функціональності чоловічої  і  жіночої  репродуктивної  систем,  а
також  розвитку  генерації F .  Для отримання подальшої інформації
                            2
про інтоксикацію в період розвитку і функціональну  недостатність,
в протокол необхідно внести або додаткові сегменти дослідження, що
охоплюють   методи   інтоксикації   в   період   розвитку    і/або
нейротоксичності  в  період розвитку,  Ці пункти також можуть бути
вивчені при інших дослідженнях,  використовуючи відповідні  методи
дослідження.

1.2. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

Дослідна речовина подається мірними дозами декільком групам самців і самок. Самцям генерації Р доза надається впродовж періоду зростання і впродовж принаймні одного циклу сперматогенезу (приблизно 56 днів у мишей і 70 днів у щурів), з метою викликання різноманітних негативних наслідків впливу дослідної речовини на сперматогенез. Вплив на сперму визначається набором параметрів для сперми (наприклад, морфологія і рухомість сперми), при препаруванні тканин і детальній гістопатології. Якщо дані про сперматогенез отримані в результаті дослідження попереднього дозування впродовж відповідного періоду, наприклад, 90-денне дослідження самців генерації Р не повинно включатись до оцінювання. Якщо існують відповідні рекомендації, проби або числові дані щодо сперми генерації Р зберігаються для подальшого оцінювання. Самки з генерації (Р) отримують дози принаймні впродовж останніх двох тічкових циклів для виявлення шкідливого впливу дослідної речовини на періодичність тічкового циклу. Дослідна речовина надається батьківським тваринам (Р) впродовж їх спарювання, вагітності, і в період припинення лактації потомства F . При припиненні лактації дослідна речовина надається потомству 1

F  впродовж періоду зростання  до  дорослого  віку,  спарювання  і
 1
народження генерації F  до припинення лактації генерації F .
                      2                                   2

Клінічні і патологічні огляди здійснюються для всіх тварин на предмет виявлення ознак інтоксикації з наголосом на вплив на цілісність і функціонування жіночої і чоловічої статевих систем, на зростання і розвиток потомства.

1.3. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

1.3.1. Вибір видів тварин

Для досліду бажано використовувати щурів. Якщо використовуються інші види тварин, необхідно обґрунтувати їх використання з внесенням відповідних змін. Штами з низькою плодючістю або відомі як такі, що мають високий відсоток дефектів розвитку не можуть використовуватись в досліді. На початку досліду розбіжність в вазі тварин повинна бути мінімальною і не перевищувати 20% середньої ваги тварин кожної статі.

1.3.2. Розміщення і умови харчування

Температура в дослідних приміщеннях, де здійснюється годування тварин, повинна складати 22 град.С (+- 3 град.). Хоча відносна вологість повинна складати принаймні 30% і бажано, щоб вона не перевищувала 70% поза часом прибирання приміщення, необхідно слідкувати за тим, щоб її рівень знаходився в межах 50-60%. Освітлення повинно бути штучним, з наступним циклом: 12 годин-світло, 12 годин - темно. Для харчування використовується лабораторний корм з необмеженим доступом до питної води. Вибір дієти залежить від потреби забезпечити відповідний рівень дослідної речовини, якщо вона подається цим способом.

Тварини розміщуються окремо або в клітках невеликими групами, що складаються з тварин тієї самої статі. Процедура спарювання здійснюється в клітках, спеціально призначених для цієї мети. Після отримання підтвердження копуляції самки розміщуються в окремих клітках, призначених для пологів або годування потомства. Спарені тварини також можуть утримуватись малими групами і бути відокремлені за статтю за один або два дня до пологів. Спарених тварин необхідно забезпечити відповідним устілковим матеріалом при наближенні пологів.

1.3.3. Підготовка тварин

необхідно зробити в період припинення лактації  для  тварин,  яких
відібрано  для спарювання.  Записи з зазначенням вихідного посліду
ведуться для всіх вибраних тварин F .  Крім  того,  рекомендується
                                   1
здійснити  індивідуальну  ідентифікацію  новонародженого потомства
якнайшвидше після народження, якщо до уваги приймаються результати
індивідуального     зважування     новонароджених    тварин    або
функціональних дослідів.

Вік батьківських тварин Р повинен складати від п'яти до дев'яти тижнів на початку дозування. Тварини всіх дослідних груп повинні, наскільки це можливо, бути однієї ваги і віку.

1.4. ПРОЦЕДУРА

1.4.1. Кількість і стать тварин

Кожна піддослідна і контрольна група повинна містити достатню кількість тварин для того, щоб приблизно 20 вагітних самок народили в день закінчення досліду або до нього. Для речовин, що викликає небажаний ефект (наприклад, стерильність, надмірну інтоксикацію при вживанні високих доз) це може бути неможливим. Метою є отримання найбільшої можливої кількості вагітностей для оцінювання потенціалу речовини щодо впливу на плодючість, вагітність, материнську поведінку, лактацію, ріст і розвиток потомства F1 від зачаття до зрілості і розвиток їхнього потомства (F2) до припинення лактації. Таким чином, неможливість отримати достатню кількість вагітних тварин (тобто 20) необов'язково робить результати досліду недійсними і така кількість час від часу є прийнятною.

1.4.2. Підготовка доз

Рекомендується, щоб дослідна речовина подавалась перорально (з їжею, питтям або через зонд) окрім випадків коли інший спосіб приймання речовини (наприклад, термальний або інгаляційний) вважається більш прийнятним.

1.4.3. Дозування

Використовуються принаймні три рівні доз з одночасним поточним контролем. Якщо нема обмежень, пов'язаних з фізико-хімічною природою або біологічним ефектом дослідної речовини, найвищий рівень дози вибирається таким чином, щоб викликати інтоксикацію, але не смертність або значні страждання.

У випадку неочікувано-високого рівня смертності, досліди з рівнем смертності менше приблизно 10% батьківських тварин (Р) вважаються прийнятними. Зменшення дозування застосовується з метою демонстрації реакції, пов'язаної з дозуванням і рівня при якому не спостерігається шкідливих наслідків (NOAEL) при найнижчій дозі. Двократні або чотирикратні інтервали є оптимальними для встановлення рівнів дозування, що знижуються, а введення четвертої дослідної групи є часто необхідним при використанні дуже значних інтервалів (наприклад, з коефіцієнтом більше 10) між дозуваннями. При вживанні дослідної речовини з їжею впродовж досліду інтервал між дозами не повинен бути більшим за трьохкратний. Рівні доз обираються з урахуванням будь-яких наявних даних щодо токсичності, особливо результатів, отриманий після повторного вживання дослідної речовини. До уваги також приймається будь-яка наявна інформація щодо метаболізму або кінетики дослідної речовини або пов'язаних матеріалів. Ця інформація також є корисною для демонстрації адекватності режиму дозування.

Паралельна контрольна група не приймає дослідної речовини або використовує середовище-носія, якщо для дозування дослідної речовини використовується середовище-носій. Тварини в контрольній групі знаходяться в однакових умовах дозування з тваринами в дослідній групі окрім приймання дослідної речовини. Групи, що піддаються дії середовища-носія, отримують його в найбільшому об'ємі. Якщо дослідна речовина подається з їжею і викликає зниження споживання або використання їжі, необхідно розглянути можливість використання контрольної групи з однаковим раціоном харчування. Данні з контрольних дослідів, призначені для оцінки впливу зниження споживання їжі на репродуктивні параметри можуть використовуватись замість даних, отриманих з вищезазначеної контрольної паралельної групи.

1.4.4. Дослід на граничний вміст

Якщо пероральний дослід при одному рівні доз, еквівалентному 1 000 мг/кг маси тіла/день при прийманні речовини з їжею або водою, еквівалентний відсоток їжі або питної води, що використовується при здійсненні процедур, описаних для цього досліду не викликає помітного токсичного ефекту ні у батьківських тварин, ні у їхнього потомства і якщо наявність не очікується на підставі даних щодо структурно і/або метаболічно пов'язаних складових, в проведенні повного дослідження декількох рівнів доз нема необхідності. Дослід на граничний вміст застосовується за винятком ситуацій, коли небезпека для людей викликає потребу застосування вищого рівня дози. Для інших типів вживання дослідної речовини, таких як інгаляція або дермальне проникнення, фізико-хімічні властивості дослідної речовини, такі як розчинність, часто можуть визначати або обмежувати максимальний рівень експозиції.

1.4.5. Приймання доз

Тваринам надаються дози дослідної речовини впродовж 7 днів на тиждень. Пероральний шлях прийому дослідної речовини (з їжею, питною водою або через зонд) є бажаним. При використанні інших шляхів прийому речовини необхідно надати відповідні обґрунтування, внесення певних змін може виявитись необхідним. Всім тваринам надаються дози тим самим методом впродовж відповідного експериментального періоду. Якщо дослідна речовина подається через зонд, необхідно використовувати катетер. Об'єм води, що подається за один раз, не повинен перевищувати 1 мл/100 г ваги тіла (0,4 мл/100 ваги тіла є максимальним об'ємом для кукурудзяного масла), окрім випадків, використання водних розчинів, де може використовуватись об'єм 2 мл/100 г ваги тіла. Окрім випадків, де використовуються речовини, що викликають подразнення або корозію, що призводить до загострень при високих концентраціях, необхідно уникати значних розбіжностей в об'ємі дослідної речовини завдяки регулюванню концентрації для забезпечення постійного об'єму при всіх рівнях дозування. При наданні дослідної речовини через зонд новонароджені особини отримують дослідну речовину виключно в непрямий спосіб з молоком до тих пір, поки безпосереднє надання дослідної речовини не почнеться після припинення лактації. При дослідах з наданням речовини з їжею або водою новонароджені особини безпосередньо додатково отримують дослідну речовину, коли вони починають їсти самостійно впродовж останнього тижня лактаційного періоду.

Для речовин, що подаються з їжею або питною водою важливо, щоб об'єм дослідної речовини не порушував нормальний режим харчування або водний баланс. Якщо дослідна речовина подається з їжею може використовуватись або постійна складова харчування (ppm), або постійний рівень дози у відповідності до ваги тіла тварини; якщо використовуються альтернативні методи, необхідно надати відповідні пояснення. Якщо речовина подається через зонд, доза повинна надаватись кожен день в той самий час і регулюватись принаймні щотижня для підтримання постійного рівня дози у відповідності до ваги тіла. При регулюванні рівня дози, що приймається через зонд у відповідності до ваги тіла, необхідно врахувати інформацію, що стосується плацентного розподілу.

1.4.6. Графіки експериментів

Щоденне дозування батьківських самців і самок (Р) повинно починатись у віці від п'яти до дев'яти тижнів. Щоденне дозування самців і самок F починається після припинення лактації; необхідно 1

взяти до уваги,  що у випадках, коли дослідна речовина подається з
їжею або водою,  безпосереднє піддавання новонародженого потомства
дії дослідної речовини може розпочатись впродовж періоду лактації.
Обидві  статі  (Р  і  F )  дозування триває принаймні 10 тижнів до
                       1
спарювання.  Дозування продовжується для обох статей вподовж  двох
тижнів   періоду  спарювання.  Самці  безболісно  умертвляються  і
досліджуються,  якщо  вони  більше  не  потрібні  для   оцінювання
репродуктивних  ефектів.  Для батьківських самок (Р) дозування має
тривати впродовж  періоду  вагітності  і  до  припинення  лактації
потомства F .  Необхідно звернути увагу на зміну графіку дозування
           1
на підставі наявної інформації щодо дослідної речовини,  включаючи
дані  щодо токсичності,  метаболізму або біо-акумуляції.  Доза для
кожної тварини призначається на підставі останньої інформації щодо
ваги  тіла  кожної  тварини.  Однак,  при регулюванні доз впродовж
останнього триместру вагітності необхідно бути обережним.

Піддавання дії  дослідної  речовини  самців  і  самок  Р і F
                                                                 1
повинно тривати до закінчення досліду. Дорослі особини чоловічої і
жіночої  статі  Р і F  безболісно вбиваються.  Якщо вони більше не
                     1
потрібні для оцінки репродуктивного ефекту.  Потомство F ,  що  не
                                                        1
вибрано  для  спарювання  і все потомство F  безболісно вбивається
                                           2
після припинення лактації.

1.4.7. Процес спарювання

1.4.7.1. Батьківське спарювання (Р)

При кожному спарюванні кожна самка перебуває з одним самцем, що отримує той самий рівень дозування (спарювання в пропорції 1:1) до спарювання впродовж трьох тижнів. Кожного дня самки оглядаються на предмет присутності сперми або вагінальних пробок. День 0 вагітності визначається як день, в який помічено вагінальну пробку або сперму. У випадку, коли спарювання є неуспішним, необхідно розглянути можливість повторного спарювання самок з перевіреними самцями тієї самої групи. Дані зі спарювання пар мають бути докладно ідентифіковані. Слід уникати спарювання потомства тих самих батьків.

1.4.7.2. Спарювання F1

Для спарювання потомства F1 в період припинення лактації вибирається, принаймні один самець і одна самка з кожного посліду для спарювання з іншими новонародженими особинами іншого посліду, що піддавались дії такої самої дози для народження генерації F2. Відбір новонароджених особин з кожного посліду необхідно здійснювати неупереджено, слідкуючи за тим, щоб не було значної розбіжності в вазі тіла або в зовнішності між парами посліду. У випадку виявлення таких розбіжностей вибираються найкращі представники кожного посліду. Досвід показує, що відбір необхідно здійснювати на підставі ваги тіла але в деяких випадках відбір за зовнішністю може виявитись більш доцільним. Спарювання потомства F1 не повинно відбуватись до досягнення повної статевої зрілості.

Пери без потомства мають бути оглянуті на предмет виявлення очевидних ознак безпліддя. Цей процес може включати в себе такі процедури як додаткове спарювання з іншими перевіреними самцями або самками, дослідження під мікроскопом репродуктивних органів, дослідження менструального циклу або сперматогенезу.

1.4.7.3. Друге спарювання

В деяких випадках, таких як зміна кількості посліду, пов'язана з вживанням речовини, або виявлення неоднозначного ефекту при першому спарюванні, рекомендується провести повторне спарювання дорослих особин Р або F1 для народження другого посліду. Рекомендується провести повторне спарювання самок або самців, що не народжували потомства з перевіреними особинами протилежної статі. Якщо народження другого посліду вважається необхідним в усіх генераціях, тварини повинні пройти повторне спарювання приблизно через тиждень після припинення лактації останнього посліду.

1.4.7.4. Розмір посліду

Тваринам надається можливість народити послід в нормальних умовах і доглядати за ним до припинення лактації. Стандартизація розміру посліду не є обов'язковою. Якщо виконується стандартизація, метод, що використовується повинен бути детально описаний.

1.5. ОГЛЯДИ

1.5.1. Клінічні огляди

Загальні клінічні огляди проводяться щодня, а у випадку, коли дослідна речовина подається через зонд, при визначенні часу подачі хімічної речовини необхідно приймати до уваги очікуваний піковий період ефектів після дозування. Зміни в поведінці, ознаки ускладнених або затриманих пологів, а також всі ознаки інтоксикації повинні бути зареєстровані. Додатковий, більш детальний огляд кожної тварини проводиться, принаймні, щотижня, цей огляд може проводитись в час зважування тварин. Два рази на день, а у вихідні - один раз на день, якщо це необхідно, всі тварини оглядаються на предмет клінічних проявів і смертності.

1.5.2. Вага тіла і споживання їжі/води батьківських тварин

Батьківські тварини (Р і F1) зважуються на перший день дозування, а потім - принаймні щотижня. Батьківські самки (Р і F1) зважуються мінімум в період вагітності в день 0, 7, 14 і 20 або 21 і впродовж лактації в ті самі дні, в які проводиться зважування посліду, а також вдень, коли тварин умертвляють. Ці огляди проводяться індивідуально для кожної дорослої тварини. Впродовж періоду, що передує спарюванню і впродовж періоду вагітності, об'єм їжі, що споживається повинен вимірюватись, принаймні щотижня. Об'єм води, що споживається, вимірюється щотижня, як мінімум, якщо дослідна речовина подається з питною водою.

1.5.3. Менструальний цикл

Тривалість і періодичність менструального циклу оцінюється для самок Р і F1 шляхом вагінального мазка до спарювання, і, можливо, впродовж спарювання до виявлення ознак спарювання. При отриманні клітин з вагіни/шийки матки необхідно звернути увагу на те, щоб не пошкодити слизову оболонку, що може призвести до псевдо-вагітності (1).

1.5.4. Параметри сперми

Для самців Р і F1 при завершені досліду вага яєчок та епідідимісу записується і по одному органу зберігається для проведення гістопатологічного дослідження (див. Розділ 1.5.7., 1.5.8.1). З групи самців, що складається принаймні з 10 особин груп Р і F1, яєчка та епідідиміс, що залишились, використовуються для виявлення сперматидів, стійких до гомогенізації і резервів сперми в хвості придатку яєчка відповідно. Для цієї самої групи самців сперма з хвоста придатку яєчка або з сім'япроводу збирається для оцінки рухомості і морфології сперми. Якщо спостерігаються ефекти, пов'язані з прийманням дослідної речовини, або у випадку наявності підтверджень на підставі інших досліджень можливих ефектів сперматогенезу, оцінювання сперми здійснюється для всіх самців при всіх рівнях дозування; в інших випадках огляд обмежується оглядом самців Р і F1 контрольної групи і групи з високим рівнем дозування.

Загальна кількість тестикулярних сперматидів, стійких до гомогенізації і сперми, що міститься в хвості придатку яєчка, повинна бути виміряна (2)(3). Резерв сперми, що міститься в хвості придатку яєчка може бути отриманий завдяки концентрації і об'єму сперми, отриманих шляхом ослаблення і/або гомогенізації тканини хвосту придатку, що залишилась.

Рухливість сперми в епідідимісі (або сім'япроводі) оцінюється або записується на відео плівку безпосередньо до вбивання тварин. Необхідно слідкувати за тим, щоб ушкодження сперми при відборі було мінімальним, сперму необхідно розчинити, використовуючи прийнятний метод (4), для проведення аналізу рухливості. Відсоток прогресивно рухливої сперми визначається суб'єктивно або об'єктивно. При проведенні комп'ютерного аналізу рухливості (5)(6)(7)(8)(9)(10) відхилення поступової рухливості знаходиться в межах, визначених користувачем для середньої швидкості по заданій траєкторії, прямолінійності або лінійного показника. Якщо проводиться зйомка проб на відео (11) або зображення записуються будь-яким іншим чином під час розтину, може бути проведено аналіз виключно контрольної групи і групи з найвищим дозуванням самців Р і F1, якщо не спостерігається ефектів, викликаних дією дослідної речовини; в цьому випадку необхідно також дослідити групи з нижчими рівнями дозування. При відсутності відео або цифрових зображень, всі проби всіх груп аналізуються при розтині.

Необхідно провести морфологічний аналіз проб сперми в епідідимісі (або сім'япроводі). Сперма (принаймні 200 на одну пробу) аналізується в вигляді мокрих препаратів, що містять фіксатор (12) і класифікувати як нормальні або ненормальні. Зразками морфологічних аномалій сперми можуть бути зрощування, ізольовані головки, зміна форми головок і/або хвостів. Оцінювання виконується для вибраної групи самців всіх груп дозування або негайно після вбивання тварин, або пізніше на підставі відео або цифрової зйомки. Мазки після додання фіксатора також аналізуються пізніше. В цих випадках контрольна група і група з найвищим дозуванням аналізуються першими. Якщо не виявлено будь-яких ефектів, пов'язаних з дією дослідної речовини (наприклад, впливу на морфологію сперми), нема необхідності в проведені аналізу для інших груп дозування. При виявлені ефектів, пов'язаних з впливом дослідної речовини в групі з найвищим дозуванням, необхідно провести аналіз також для груп з нижчими рівнями дозування.

Якщо будь-які параметри оцінювання сперми вже досліджувались впродовж аналізу загальної токсичності не пізніше, ніж за 90 днів, нема необхідності в повторенні аналізу при дослідженні двох генерацій. Рекомендується, однак, зберегти зразки або цифрові записи сперми генерації Р для того, щоб при необхідності провести їх аналіз.

1.5.5. Потомство

Кожний послід досліджується якнайшвидше після народження (день лактації 0) для визначення кількості і статі новонароджених особин, мертвонароджених особин, живих особин і наявності значних аномалій. Новонароджені особини, що знайдені мертвими в день 0, якщо їх не мацеровано, бажано дослідити на предмет виявлення можливих дефектів і причин смерті, після чого - зберегти з використанням фіксатора. Живих особин необхідно перерахувати і зважити індивідуально при народженні (день лактації 0) або в день 1, а потім у визначення для зважування дні, наприклад, в дні 4, 7, 14 і 21 лактації. Необхідно записувати аномалії фізичного розвитку або поведінки самок або потомства.

Фізичний розвиток потомства реєструється, в основному, як збільшення ваги тіла. Інші фізичні параметри (наприклад, відкриття вух і очей, прорізування зубів, ріст шерсті) можуть надати додаткову інформацію, але ці дані бажано аналізувати в контексті даних статевого дозрівання (наприклад, відкриття вагіни або відділення крайньої плоті від яєчок) (13). Рекомендується провести функціональні дослідження (наприклад, моторної активності, сенсорної функції, рефлекторного онтогенезу) потомства F1 до і/або після припинення лактації, зокрема, ті, що пов'язані зі статевим дозріванням, якщо ці дослідження не є складовою частиною окремих дослідів. Вік, в якому відбулось відкриття вагіни або відділення крайньої плоті від яєчок визначається для потомства F1, що припинило ссання і призначене для спарювання. Аногенітальна відстань вимірюється після народження в день 0 для новонароджених особин F2, якщо спостерігаються зміни в пропорції між статями в групі або відхилення в статевому дозрівання вказують на таку необхідність.

Можна не виконувати функціонального огляду в групах, в яких в інший спосіб явно спостерігаються клінічні ознаки шкідливих ефектів (наприклад, значене зниження приросту ваги і т.ін.). При проведенні функціонального огляду такому огляду не підлягає новонароджене потомство, призначене для спарювання.

1.5.6. Загальний розтин

Під час припинення досліду або смерті тварин впродовж досліду всі батьківські тварини (Р і F1), всі новонароджені особини, у яких виявлено зовнішні аномалії або клінічні ознаки, а також випадково вибрані новонароджені особини/стать/послід від генерацій F1 і F2 піддаються макроскопічному огляду на предмет виявлення будь-яких структурних аномалій або патологічних змін. Особливу увагу необхідно приділити органам репродуктивної системи. Новонароджені особини, яких було безболісно вбито в передсмертному стані, якщо їх не було мацеровано, мають бути оглянуті на предмет виявлення можливих дефектів і/або причин смерті, після чого збережені з використанням фіксатора.

Матки всіх самок, що народжували перший раз, необхідно дослідити способом, який не впливає на результати гістопатологічного дослідження, на предмет виявлення наявності і кількості місць імплантації.

1.5.7. Вага органів

Під час припинення досліду необхідно визначити вагу тіла і вагу наступних органів батьківських тварин Р і F1 (парні органи повинні зважуватись окремо):

- матки, яєчників,

- яєчок, епідідемісу (загальну вагу і вагу хвоста),

- простати,

- сім'яних міхурів з коагуляційними залозами з рідинами, що містяться в них і простати (як один орган),

- мозку, печінки, нирок, селезінки, гіпофізу, щитовидної і надниркової залози і відомих органів-мішеней,

Остаточна вага тіла визначається для новонароджених особин F1 і F2, які вибрані для розтину. Наступні органи вибраних випадково новонароджених особин/статі/посліду (див. Розділ 1.5.6.) повинні бути зважені: мозок, селезінка і зобна залоза.

Результати розтину і визначення ваги тіла оцінюються в контексті оглядів, що проводились під час проведення інших дослідів з повторним дозуванням, коли це є доцільним.

1.5.8. Гістопатологія

1.5.8.1. Батьківські тварини

Наступні органи і тканини батьківських тварин (Р і F1) або представників їх групи мають бути збережені за допомогою фіксатора і зберігатись у відповідному середовищі для гістопатологічного дослідження.

- Вагіна, матка з шийкою, яєчники (збережені у відповідному фіксаторі),

- Одне яєчко (збережене в фіксаторі Буена або подібному фіксаторі), один епідідиміс, сім'яні міхури, простата і коагуляцій на гланда,

- Попередньо ідентифікований орган (органи)-мішені тварин Р і F1, відібраних для спарювання.

Необхідно провести повну гістопатологію збережених органів і тканин, зазначених вище, для всіх груп з високим рівнем дозування і для контрольної групи тварин Р і F1, відібраних для спарювання. Дослідження яєчників тварин Р не є обов'язковим. Органи, що демонструють зміни, викликані дією речовини, також піддаються огляду в групах з низьким і середнім рівнем дозування що дозволяє більш повно проаналізувати NOAE. Крім того необхідно піддати гістопатологічному огляду репродуктивні органи тварин в групах з низьким і середнім рівнем дозування, у яких підозрюється зниження плодючості, наприклад, тварин, спарювання, зачаття, запліднення або народження потомства у яких було неуспішним або тварин з порушеним менструальним циклом, зміненою кількістю, рухомістю або морфологією сперми. Необхідно дослідити всі значні ушкодження, такі як атрофія або пухлини.

Необхідно провести детальний гістопатологічний огляд яєчок (наприклад, з використанням фіксатора Буена, парафінової заливки, поперечного розрізу товщиною 4-5 мю м) для виявлення ефектів, викликаних дією дослідної речовини, таких як затримка сперматидів, втрата шарів або типів статевих клітин, наявність багатоядерних гігантських клітин або відторгнення сперматогенних клітин в порожнині трубчатої протоки (14). Огляд неушкодженого епідідимісу повинен включати в себе огляд головки, тіла і хвостоподібного придатку, цей огляд може супроводжуватись подовжнім розрізом. Епідідиміс оцінюється на предмет інфільтрації лейкоцитів, зміни домінування типу клітин, наявності відхилень в клітинах окремих типів, і фагоцитозу сперми. При оцінювання чоловічих репродуктивних органів необхідно використовувати метод забарвлення PAS або гематоксиліном.

Яєчники після припинення лактації повинні містити в собі первинні фолікули і фолікули, що розвиваються, а також великі жовті лактаційні тільця. Гістопатологічний огляд повинен виявити кількісне зниження популяції первинних фолікул. Кількісна оцінка первинних фолікул проводиться для самок F1; кількість тварин, вибір розрізу яєчників, і розмір розрізу повинні бути статистично прийнятними для оцінювання використовуваної процедури. Дослідження повинно включати в себе визначення кількості первинних фолікул, що можуть комбінуватись з малими фолікулами, що розвиваються для порівняння яєчників тварин групи, що піддавались дії дослідної речовини і тварин контрольної групи (15)(16)(17)(18)(19).

1.5.8.2. Новонароджені тварини, лактацію яких припинено

Тканини і органи, у який виявлено значні відхилення, всіх новонароджених тварин, що мають зовнішні аномалії або клінічні ознаки, а також органи новонароджених тварин, вибраних випадково: тварина/стать/послід з генерацій F1 і F2, яких не вибрано для спарювання, обробляються фіксатором і зберігаються у відповідному середовищі для гістопатологічного огляду. Повна гістопатологічна характеристика збережених тканин складається з особливим наголосом на органи репродуктивної системи.

2. ДАНІ

2.1. ПРЕДСТАВЛЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

Данні записуються окремо і зводяться в таблицю, в якій показується для кожної дослідної групи і для кожної генерації кількість тварин на початку дослідження, кількість тварин, що вмерли впродовж дослідження або безболісно вбитих тварин, час смерті або безболісного умертвіння, кількість плідних тварин, кількість вагітних тварин, кількість тварин, що виявляють ознаки інтоксикації, опис ознак інтоксикації, що спостерігаються, включаючи час появи ознак, тривалість ознак, і ступінь кожного токсичного ефекту, тип огляду батьків і потомства, типи гістопатологічних змін, і всі відповідні дані стосовно посліду.

Числові результати оцінюються відповідним статистичним методом; статистичний метод вибирається як частина схеми досліду і повинен бути обґрунтований. Статистичні моделі, що враховують реакцію на дозу дослідної речовини, можуть виявитись корисними при аналізуванні даних. Звіт повинен включати в себе відповідну інформацію щодо методу аналізу і комп'ютерної програми, що використовувалась, для того, щоб незалежний експерт/статистик мав змогу повторно оцінити і переконструювати аналіз.

2.2. ОЦІНКА РЕЗУЛЬТАТІВ

Результати дослідження репродуктивної токсичності двох генерацій оцінюються у відповідності викликаних до ефектів, включаючи результати розтину і мікроскопічного дослідження. Оцінювання включає в себе зв'язок або відсутність такого, між дозою дослідної речовини і присутністю або відсутністю ознак і складності аномалій, включаючи значні ушкодження, ідентифіковані органи-мішені, погіршення плодючості, клінічні аномалії, погіршення народжуваності і зменшення кількості посліду, зміни ваги тіла, вплив на рівень смертності та інші токсичні ефекти. Фізико-хімічні властивості дослідної речовини, і якщо можливо, токсикокінетичні дані необхідно взяти до уваги при оцінюванні результатів досліду.

Відповідно проведене дослідження репродуктивної токсичності повинно надати достовірну інформацію щодо рівня речовини, який не викликає шкідливих ефектів, і розуміння шкідливих ефектів на народжуваність, пологи, лактацію, постнатальний розвиток, включаючи зростання і статевий розвиток.

2.3. ІНТЕРПРЕТАЦІЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

Дослідження репродуктивної токсичності двох генерацій надають інформацію щодо ефекту від повторної дії дослідної речовини впродовж всіх стадій репродуктивного циклу. Зокрема, дослід надає інформацію щодо репродуктивних параметрів, а також щодо розвитку, дозрівання і виживання потомства. Результати досліду інтерпретуються разом з результатами, отриманими в ході субхронічних, пренатальних, токсикокінетичних та інших досліджень. Результати цього досліду можуть використовуватись для оцінювання необхідності наступного дослідження хімікату. Екстраполяція результатів досліду впливу даної речовини на людину дозволяється в певних межах. Найкращим способом використання результатів є отримання інформації щодо рівнів, що не викликають наслідків і допустимої дози для людей (20)(21)(22)(23).

3. ЗВІТНІСТЬ

3.1. ЗВІТ З ДОСЛІДУ

Звіт з досліду повинен містити в собі наступну детальну інформацію про:

Дослідну речовину:

- фізичну природу, і якщо необхідно, фізико-хімічні властивості,

- ідентифікаційні дані,

- чистоту.

Середовище-носій (якщо використовувалось)

- обґрунтування вибору середовища-носія, якщо відрізняється від води.

Піддослідні тварини:

- вид/штам, що використовувався,

- кількість, вік і стать тварин,

- джерело, умови проживання, харчування, устілковий матеріал, і т.ін.,

- індивідуальна маса тіла тварин на початку дослідження.

Умови дослідження:

- раціональне обґрунтування рівня доз,

- детальний опис формули дослідної речовини/приготування їжі, концентрація,

- стабільність і гомогенність препарату,

- деталі, що стосуються подання дослідної речовини,

- перехід від концентрацій дослідної речовини в їжі/питній воді (ppm) до окремої дози (мг/кг маси тіла/день), якщо застосовується,

- деталі щодо якості їжі і питної води.

Результати:

- споживання їжі і води, якщо застосовується, ефективність їжі (збільшення ваги тіла на грам спожитої їжі), споживання дослідної речовини для тварин P і F1 за виключенням періоду спільного проживання і принаймні до останньої третини періоду лактації;

- дані, що стосуються засвоєння (якщо доступні),

- дані, що стосуються мас тіла тварин P і F1, призначених до спарювання,

- дані, що стосуються мас послідів і новонароджених особин,

- вага тіла під час умертвіння, дані щодо абсолютної і відносної ваги тіла органів батьківських тварин,

- природа, складність і тривалість клінічних наслідків (виліковних або ні),

- час смерті впродовж досліду або факт виживання тварин до умертвіння,

- дані щодо токсичної реакції за статтю і дозами, включаючи показники спарювання, плодючості вагітності, народження, виживання і лактації; звіт повинен містити цифри, що було використано для розрахунку цих показників,

- токсичний або інший ефект на репродукцію, потомство, постнатальний розвиток і т.ін.,

- результати розтину,

- детальний опис всіх результатів гістопатологічних дослідів,

- кількість самок Р і F1 з нормальним циклом і тривалість циклу,

- загальна кількість сперми в хвостоподібному придатку і епідідимісі, відсоток прогресивно рухомої сперми, відсоток морфологічно нормальної сперми і відсоток сперми з виявленими аномаліями,

- час до спарювання, включаючи кількість днів до спарювання,

- період вагітності,

- кількість імплантацій, жовтих тілець, розмір посліду,

- кількість живих новонароджених тварин і пост-імплантаційні втрати,

- кількість новонароджених тварин з виявленими ознаками аномалій, якщо відомо, до звіту необхідно включити кількість карликових тварин,

- дані щодо основних етапів фізичного розвитку новонароджених тварин та інші дані щодо постнатального розвитку, оцінені етапи фізичного розвитку мають бути обґрунтовані,

- дані щодо функціональних оглядів новонароджених і дорослих тварин, якщо застосовуються,

- статистичне представлення результатів, якщо необхідно.

Обговорення результатів.

Висновки, включаючи значення NOAEL для ефекту на організм матері і потомства.

4. ПОСИЛАННЯ

(1) Sadleir, R.M.F.S., (1979) Cycles and Seasons, In: Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertilisation, C.R. Auston and R.V. Short (eds), Cambridge, New York.

(2) Gray, L.E. et al., (1989) A Dose-Reponse Analysis of Methoxychlor-Indiced Alterations of Reproductive Development and Function in the Rat. Fundamental and Applied Toxicology, 12, p. 92-108.

(3) Robb, G.W. et al., (1978). Daily Sperm Production and Epididymal Sperm Reserves of Pubertal and Adult Rats. Journal of reproduction and Fertility 54: 103-107.

(4) Klinefelter, G.R. et al., (1991) The Method of Sperm Collection Significantly Influences Sperm Motion Parameters Following Ethane Dimethanesulfonate Administration in the Rat. Reproductive Toxicology, 5, p. 39-44.

(5) Seed, J. Et al., (1996). Methods for Assessing Sperm Motility, Morphology, and Counts in the Rat, Rabbit, and Dog: a Consensus Report. Reproductive Toxicology, 10(3), p. 237-244.

(6) Chapin, R. E, et al., (1992) Methods for Assessing Rat Sperm Motility. Reproductive Toxicology, 6, p. 267-273.

(7) Klinefelter, G.R. et al., (1992) Direct Effects of Ethane Dimethanesulphonate on Epididymal Function in Adult Rats: an In Vitro Demonstration. Journal of Andrology, 13, p. 409-421.

(8) Slott, V.L. et al., (1991) Rat Sperm Motility Analysis : Methodologic Considerations. Reproductive Toxicology, 5, p. 449-458.

(9) Slott, V.L. and Perreault, S.D., (1993) Computer-Assisted Sperm Analysis of Rodent Epididymal Sperm Motility Using the Hamilton-Thorn Motility Analyzer. In: Methods in Toxicology, Part A., Academic, Orlando, Florida, p. 319-333.

(10) Toth, G.P. et al., (1989) The Automated Analysis of rat Sperm Motility Following Subchronic Epichlorhydrin Administration: Methodologic and Statistical Considerations. Journal of Andrology, 10, p. 401-415.

(11) Working, P.K. and M. Hurtt, (1987) Computerised Videomicrographic Analysis of rat Sperm Motility. Journal of Andrology, 8, p. 330-337.

(12) Linder, R.E. et al., (1992) Endpoints of Spermatoxicity in the Rat After Short Duration Exposures to Fourteen Reproductive Toxicants. Reproductive Toxicology, 6, p. 491-505.

(13) Korbenrot, C.C. et al., (1977) Preputial Separation as an External Sign of Pubertal Dvelopment in the Male Rate. Biological Reproduction, 17, p. 298-303.

(14) Russell, L.D. et al., (1990) Histological and Histopathological Evaluation of the Testis, Cache River Press, Clearwater, Florida.

(15) Heindel, J.J. and R.E. Chapin, (eds) (1993) Part B. Female Reproductive Systems, Methods in Toxicology, Academic, Orlando, Florida.

(16) Heindel, J.J. et al., (1989) Histological Assesment of Ovarian Follicle Number in Mice As a Screen of Ovarian Toxicity. In: Growth Factors and the Ovary, A.N. Hirshfield (ed.), Plenum, New York, p. 421-426.

(17) Manson, J.M. and Y.J. Kang, (1989) Test Methods for Assessing Female Reproductive and Developmental Toxicology. In: Principles and Methods of Toxocilogy, A.W. Hayes (ed.), Raven, New York.

(18) Smith, B.J. et al., (1991) Comparison of Random and Serial Sections in Assessment of Ovarian Toxicity. Reproductive Toxicology, 5, p. 379-383.

(19) Heindel, J.J., (1999) Oocyte Quantitation and Ovarian Histology. In: An Evaluation and Interpretation of Reproductive Endpoints for Human Health Risk Assessment, G. Daston, and C.A. Kimmel, (eds.), ILSI Press, Washington, DC.

(20) Thomas, J.A., (1991) Toxic Responses of the Reproductive System. In: Casarett and Doull's Toxicology, M.O.Amdur, J.Doull, and C.D. Klaassen (eds.), Pergamon, New York.

(21) Zenik, H. And E.D. Clegg, (1989) Assessment of Male Reproductive Toxicity: A Risk Assessment Approach. In: Principles and Methods of Toxicology, A.W. Hayes (ed.), Raven Press, New York.

(22) Palmer, A.K., (1981) In: Developmental Toxicology, Kimmel, C.A. and J. Buekle-Sam (eds.), Raven Press, New York.

(23) Palmer, A.K., (1978) In Handbook of Teratology, Vol. 4, J.G. Wilson and F.C. Fraser (eds.), Plenum Press, New York.

B.36. ТОКСИКОКІНЕТИКА

1. МЕТОД

1.1. ВСТУП

Дивіться Загальний вступ до частини В.

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ

Дивіться Загальний вступ до частини В.

1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ

Відсутні.

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

Дослідна речовина подається відповідним шляхом. В залежності від мети досліду речовина може подаватись одноразово або декількома дозами впродовж визначених періодів одній або декільком групам піддослідних тварин. Таким чином, в залежності від типу дослідження речовина і/або метаболіти визначаються в рідинах, тканинах і/або екскретах.

Дослідження проводяться з дослідною речовиною в "неміченій" або "міченій" формі. Якщо використовується мічення, його слід розташовувати в речовині таким чином, щоб надати якомога більше інформації щодо перетворень складових речовини.

1.5. ЯКІСНІ КРИТЕРІЇ

Відсутні.

1.6. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

1.6.1. Підготовка

Молоді здорові тварини проходять акліматизацію в лабораторних умовах принаймні впродовж п'яти днів до початку досліду. До початку досліду тварини випадково вибираються до дослідних груп. В окремих ситуаціях можуть використовуватись дуже молоді тварини або, що раніше використовувались в дослідах.

1.6.2. Умови проведення досліду

1.6.2.1. Піддослідні тварини

Токсикокінетичні дослідження можуть проводитись на одному або декількох відповідних видах тварин, при цьому необхідно взяти до уваги види тварин, що використовувались або мають бути використані в токсикологічних дослідженнях тієї самої дослідної речовини. Якщо в досліді використовуються гризуни розбіжність в вазі не повинна перевищувати +- 20% від середньої ваги.

1.6.2.2. Кількість і стать

При дослідженні засвоєння і екскреції на початку досліду в кожній групі дозування повинно бути по чотири тварини. Використання окремої статі є не обов'язковим, але в деяких випадках необхідно дослідити обидві статі. Якщо різні статі показують різну реакцію на речовину, необхідно дослідити по чотири тварини кожної статі. У випадку використання тварин, що не є гризунами, можна використовувати тварин меншого розміру. При досліджені розподілу тканини, при визначенні початкової кількості розміру групи необхідно врахувати кількість тварин, що має бути вбито на кожному етапі і кількість етапів досліду.

При дослідженні метаболізму розмір групи визначається у відповідності до задач досліду. Для дослідів з повторним дозуванням і дослідів, що складаються з декількох етапів, при визначенні розміру групи необхідно врахувати кількість етапів і кількість тварин, призначених до умертвіння, однак, ця кількість не повинна бути меншою за дві тварини. Розмір групи повинен бути достатнім для оцінювання характеристик засвоєння, утримання і виводу дослідної речовини і/або її метаболітів (у відповідності до ситуації).

1.6.3. Рівні доз

У випадку досліду з однократною дозою, необхідно використовувати принаймні два рівні доз. В досліді повинна використовуватись низька доза, при якій не спостерігається токсичного ефекту і висока доза, що викликає зміни токсикокінетичних параметрів або при якій викликається токсичний ефект.

У випадку досліду з повторною дозою використання дози низького рівня є достатнім, але в деяких випадках використання високої дози також може виявитись необхідним.

1.6.4. Спосіб приймання

При токсикокінетичних дослідах речовина подається одним і тим самим способом, і у відповідних випадках, з використанням того самого середовища, що використовувалось або повинно було використовуватись в інших дослідах на токсичність. Дослідна речовина звичайно подається групам піддослідних тварин через трубку, з їжею, наноситься на шкіру або приймається інгаляційним способом впродовж визначених періодів. Внутрішньовенне введення дослідної речовини може бути корисним при визначенні відносної засвоюваності речовини, що приймається іншими способами. Крім того, впродовж внутрішньовенного введення дослідної речовини, можна отримати корисну інформацію щодо схеми розподілення.

Необхідно врахувати можливість реакції середовища-носія з дослідною речовиною. Необхідно звернути увагу на різний рівень засвоєння при подачі дослідної речовини через зонд і з їжею і на необхідність чіткого визначення дози, особливо у випадку, коли дослідна речовина подається з їжею.

1.6.5. Період нагляду

Всі тварини повинні оглядатись щодня, а ознаки токсичності та інші відповідні клінічні характеристики - записуватись, включаючи дату початку, ступеню тяжкості і періоду тривання.

1.6.6. Процедура

Після зважування піддослідних тварин, дослідна речовина подається відповідним способом. Піддослідні тварини до прийому дослідної речовини можуть бути утримані від їжі, якщо це вважається необхідним.

Засвоєння

Рівень і ступінь засвоєння дослідної речовини може бути оцінений з використанням різних методів з використанням контрольних груп(1) або без них, наприклад шляхом:

----------------

(1) В цьому методі дослідна група є групою, в якій дослідна речовина подається іншим шляхом, який забезпечує повну біологічну доступність дози.

- визначення об'єму дослідної речовини і/або метаболітів в екскретах, таких як сеча, жовч, кал, повітря, що видихається і об'єму речовини, що залишилась в тілі,

- порівняння біологічної реакції (наприклад, впродовж дослідження гострої токсичності) в дослідній і контрольній і/або сателітній групі,

- порівняння об'єму речовини, що виділяється нирками і/або метаболіту в дослідній і контрольній групах,

- визначення зон у відповідності до величини плазми/часової кривої дослідної речовини і/або метаболітів, а також порівняння з даними контрольної групи.

Розподіл

На даний момент існує два підходи, один або обидва можуть використовуватись з метою проведення аналізу схем розподілу:

- корисна кількісна інформація може бути отримана в результаті авторадіографічної техніки дослідження всього тіла,

- кількісна інформація може бути отримана шляхом омертвлення тварин в різний час після експозиції і визначення концентрації і об'єму дослідної речовини і/або метаболітів в тканинах і органах.

Екскреція

При досліджені екскреції збирається сеча, кал, і повітря, що видихається, в окремих випадках збирається жовч. Об'єм дослідної речовини і/або метаболітів в цих екскретах вимірюється декілька разів після експозиції або до виходу 95% дози, що приймається, або впродовж семи днів, в залежності від того, яка подія настане першою.

В окремих випадках необхідно врахувати вихід дослідної речовини в молоко тварин, що годують потомство.

Метаболізм

Для визначення обсягу і схеми метаболізму біологічні зразки аналізуються за допомогою відповідних технік. Необхідно визначити структури метаболітів і запропонувати відповідні метаболічні шляхи, де є необхідність відповісти на питання, що повстали в результаті попередніх токсикологічних досліджень. Для отримання інформації щодо шляхів метаболізму може бути корисно провести дослідження в лабораторних умовах.

Подальша інформація щодо взаємозв'язку метаболізму і токсичності може бути отримана в результаті біохімічних дослідів, таких як визначення впливу на систему метаболізму ферментів, ослаблення зв'язків ендрогенних небілкових сульфгідрильних складових з макромолекулами.

2. ДАНІ

У відповідності до типу дослідження дані мають бути представлені у вигляді таблиці, проілюстрованої графічно, якщо це необхідно. Для кожної дослідної групи у відповідних випадках необхідно визначити середнє і статистичне відхилення вимірів в зв'язку з часом, дозуванням, тканинами і органами. При застосуванні відповідних методів необхідно визначити область засвоєння, а також кількість і норми екскреції. У випадку дослідження метаболізму необхідно представити структуру ідентифікованих метаболітів і можливі шляхи метаболізму.

3. ЗВІТНІСТЬ

3.1. ЗВІТ З ДОСЛІДУ

У відповідності до типу дослідження звіт з досліду, якщо це можливо, повинен містити в собі наступну детальну інформацію про:

- вид/штам, джерело, умови оточення, дієту,

- характеристики мічених матеріалів, якщо вони використовуються,

- рівні дозування та інтервали між вживанням доз,

- шлях (шляхи) прийому речовини і середовища, що використовуються,

- токсичний та інші ефекти, що спостерігаються,

- метод визначення дослідної речовини і/або метаболітів в біологічних зразках, включаючи повітря, що видихається,

- виміри, представлені в таблиці, стосовно статі, дози, режиму, часу, тканин і органів,

- представлення обсягу і часу засвоєння,

- метод характеризування та ідентифікації метаболітів в біологічних зразках,

- метод біохімічних вимірів, пов'язаних з метаболізмом,

- запропоновані шляхи метаболізму,

- обговорення результатів,

- інтерпретація результатів.

3.2. ОЦІНКА ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ

Дивіться Загальний вступ до частини В.

4. ПОСИЛАННЯ

Дивіться Загальний вступ до частини В.

В.37. ЗАТРИМАНА НЕЙРОТОКСИЧНІСТЬ ФОСФОРОРГАНІЧНИХ РЕЧОВИН ПІСЛЯ ЗНАЧНОЇ ЕКСПОЗИЦІЇ

1. МЕТОД

1.1. ВСТУП

При оцінюванні і аналізі токсичних ефектів речовин важливо взяти до уваги потенціал окремих класів речовин викликати специфічні типи нейротоксичності, які не можуть бути виявлені під час інших досліджень токсичності. Виявлено, що певні фосфорноорганічні речовини викликають затриману нейротоксичність і тому, їх слід розглядати як такі, що мають бути досліджені.

Можуть бути застосовані лабораторні скрінінг-тести для ідентифікації речовин, що можуть викликати затриману поліневропатію; однак, негативні результати лабораторних досліджень не є доказом того, що речовина не викликає нейротоксичного ефекту.

Дивіться Загальний вступ до частини В.

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ

Фосфорорганічні речовини містять вільні фосфорорганічні ефіри, тіоефіри або ангідриди, що є органічними похідними фосфорної кислоти, фосфорної кислоти і фосфороамідних кислот, та їхніх тіопохідних, або інші речовини, що можуть викликати затриману нейротоксичність, що інколи спостерігається в речовинах цього класу.

Затримана нейротоксичність є синдромом, пов'язаним з тривалим затриманим початком атаксії, дистальною аксонопатією хребта і периферійного нерву, а також пригніченням і старінням невропатичної цільової естерази (NTE) в нервовій тканині.

1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ

Дослідні речовини можуть бути перевірені в позитивній контрольній групі з метою демонстрації того факту, що в лабораторних дослідних умовах реакція дослідних тварин значно не змінюється.

Прикладом широко застосовуваного невротоксиканту є три-о-трикрезилфосфат (CAS 78-30-8, Einecs 201-103-5, номенклатура CAS: фосфорна кислота, тріс(2-метилфенил)ефір), також відомий як тріс-о-трикрезилфосфат.

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

Дослідна речовина подається пероральним шляхом єдиною дозою домашнім курям, захищеним від холінергічних ефектів, коли це необхідно. За тваринами ведеться нагляд впродовж 21 дня на предмет виявлення аномалій в поведінці, атаксії і паралічу. Біохімічні аналізи, зокрема, пригнічення невропатії цільової естерази (NTE) проводяться на курях, що випадково вибираються до кожної групи, як правило, через 24 і 48 годин після дозування. Через двадцять один день після експозиції кури, що залишились умертвляються, після чого проводиться гістопатологічний огляд вибраних нервових тканин.

1.5. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

1.5.1. Підготовка

Здорові молоді дорослі кури, що не заражені інфекційними хворобами, не приймали медикаментів, і не мають аномалій в ході випадково відбираються і розподіляються до дослідних і контрольних груп, після чого вони проходять акліматизацію в лабораторних умовах впродовж принаймні п'яти днів до початку досліду.

Клітки або приміщення, що мають достатню площу для того, щоб кури могли вільно пересуватись, для того, щоб можна було оцінити ходу.

Дозування дослідної речовини відбувається звичайно пероральним шляхом з використанням зонду, желатинових капсул або іншим подібним способом. Рідини можуть подаватись нерозчиненими або розчиненими у відповідному середовищі такому як кукурудзяне масло; тверді речовини необхідно розчинити, якщо це можливо, оскільки значні дози твердих речовин в желатинових капсулах можуть не засвоїтись організмом належним чином. Для безводних середовищ необхідно знати токсичні характеристики середовища, а якщо вони не відомі, їх необхідно визначити до початку досліду.

1.5.2. Умови досліду

1.5.2.1. Піддослідні тварини

Рекомендується відбирати молодих дорослих курей в період яйцекладки (Gallus gallus domesticus), віком від восьми до 12 місяців. Використовуються породи і штами стандартного розміру, кури повинні бути вирощені в умовах, що дозволяють їм рухатись вільно.

1.5.2.2. Кількість і стать

Крім дослідної групи використовується контрольна група, що використовує середовище-носія і позитивна контрольна група. Умови, в яких знаходиться контрольна група, що використовує середовище-носія, є ідентичними умовам дослідної групи окрім приймання дослідної речовини.

Кількість птахів в кожній групі повинна бути достатньою для того, щоб можна було умертвити принаймні шість птахів для проведення біохімічного аналізу (по три особини за два етапи). А шість залишити живими для проведення 21-денного огляду на предмет виявлення патології.

Досліди в позитивній контрольній групі можуть поводитись паралельно або може використовуватись остання контрольна група згідно з історією досліду. Група може складатись принаймні з шести курей, що піддавались дії відомого хімікату, що викликає затриману нейротоксичність - три птаха для біохімічного аналізу і три птаха для дослідження патології. Рекомендується періодичне поновлення історичних даних. Нові дані щодо позитивної контрольної групи розробляються у випадках, коли в лабораторії, що проводить дослід змінюється будь-який значний елемент (наприклад, штам, раціон, умови проживання) або умови проведення досліду.

1.5.2.3. Рівні доз

Необхідно провести попередній дослід з використанням відповідної кількості курей і груп з різними рівнями доз для встановлення рівня, що буде використовуватись під час основного досліду. Певний рівень летальності є необхідним при проведенні цього попереднього досліду для визначення адекватної дози для основного досліду. Однак, для уникнення смертності в результаті гострих холінергічних ефектів, можна використовувати атропін або іншу захисну речовину, що відома як така, що не впливає на затриману нейротоксичну реакцію. Можуть використовуватись різноманітні методи досліду для визначення максимальної дози дослідної речовини, що не призводить до смерті (Дивіться метод В.1bis). Історичні дані щодо курей або інша токсикологічна інформація може також бути використана при виборі дози.

Рівень дози дослідної речовини в основному досліді повинен бути якомога вищим, приймаючи до уваги результати попереднього досліду для вибору дози, і найвищу граничну дозу 2 000/мг/кг ваги тіла. Можливі випадки смертності не повинні вплинути на необхідну кількість птахів, що будуть використовуватись в біохімічному аналізі (шість) і в гістологічному дослідженні (шість) впродовж 21 дня. Атропін або інша захисна речовина, що відома як така, що не впливає на затриману нейротоксичну реакцію повинна використовуватись для уникнення смертності внаслідок гострих холінергічних ефектів.

1.5.2.4. Тест на граничний вміст

Якщо в результаті досліду при рівні дози принаймні 2 000 мг/кг ваги тіла з використанням процедур, описаних для цього досліду, не виявлено токсичних ефектів і, якщо токсичність не очікується на підставі даних, отриманих відносно структурно пов'язаних речовин, в проведенні досліду з вищим рівнем дози нема необхідності. Цей тест на граничний вміст застосовується за винятком тих випадків, коли дія дослідної речовини на людину вказує не необхідність застосування вищого рівня дози.

1.5.3. Період нагляду

Період нагляду повинен складати 21 день.

1.5.4. Процедура

Після прийому захисної речовини для уникнення смертності внаслідок гострого холінергічного ефекту, подається одна доза дослідної речовини.

Загальний огляд

Огляди повинні розпочатись негайно після експозиції. Всі кури уважно оглядаються декілька разів впродовж перших двох днів, а потім принаймні один раз на день вподовж 21 дня або до запланованого умертвіння. Всі ознаки токсичності необхідно записати, включаючи час виявлення, тип, ступінь складності і тривалість аномалій в поведінці. Атаксія оцінюється у відповідності до звичайної шкали, що складається принаймні з чотирьох рівнів, випадки виявлення паралічу мають бути записані. Принаймні два рази на тиждень кури, відібрані для патологічного дослідження, виводяться за межі кліток і примушуються до періодичної моторної активності, такої як, піднімання по драбині, для полегшення виявлення мінімального токсичного ефекту. Птахи в передсмертному стані або тварини, що мають значні розлади або біль після виявлення цих ознак повинні бути усунені, безболісно вбиті і піддані розтину.

Вага тіла

Всі кури мають бути зважені безпосередньо до подання дослідної речовини і принаймні один раз на тиждень після цього.

Біохімія

Шість курей, вибраних випадково з дослідної і контрольної групи, що використовували середовище-носія, і три курки з позитивної контрольної групи (якщо ця група досліджується паралельно) вбиваються впродовж декількох днів після дозування, а мозок і поперековий відділ хребта мають бути підготовлені і проаналізовані на предмет виявлення ознак пригнічення невропатичної цільової естерази. Крім того, може виявитись необхідною підготовка і аналіз тканини сідалищного нерву на предмет виявлення ознак пригнічення невропатичної цільової естерази. Звичайно три птаха з контрольної і кожної дослідної групи умертвляються після 24 годин, а три птаха - після 48 годин, оскільки три курки з позитивної контрольної групи мають бути вбиті впродовж 24 годин. Якщо огляд на предмет виявлення клінічних ознак інтоксикації (часто можуть оцінюватись шляхом визначення часу початку холінергічних ознак) вказує на те, що токсична речовина виводиться дуже повільно, доцільнішим може бути взяття проби тканини трьох птахів впродовж кожного з двох термінів між 24 і 72 годиною після дозування.

Аналіз ацетилхолінестерази (AChE) також може бути проведено на цих зразках, якщо це доцільно. Однак, спонтанна реактивація AChE може відбутись in vivo і, таким чином, призвести до недооцінки потенціалу речовини в якості інгібітору AChE.

Загальний розтин

Загальний розтин всіх тварин (вбитих за планом і вбитих в передсмертному стані) повинен включати в себе огляд зовнішнього вигляду мозку і хребта.

Гістопатологічний огляд

2. ДАНІ

Негативні результати в критичних точках, вибраних для цього методу (біохімія, гістопатологія і дослідження поведінки) звичайно не вимагають подальшого дослідження затриманої невпротоксичності. Неоднозначні або неостаточні результати в цих критичних точках можуть вимагати проведення подальших дослідів.

Отримання індивідуальних даних є необхідним. Крім цього, всі дані мають бути зведені в таблицю, де для кожної дослідної групи зазначено кількість тварин на початку досліду, кількість тварин, у яких виявлено ушкодження, вплив на поведінку або біохімію, типи складності цих ушкоджень або впливу, відсоток тварин, у яких виявлено кожен тип ушкоджень і ступінь складності кожного ушкодження або впливу.

Результати цього досліду мають бути оцінені з точки зору ступеню впливу, складності і кореляції поведінкового, біохімічного і гістопатологічного ефектів і будь-яких інших наявних ефектів в дослідній і контрольній групах.

Числові результати повинні бути оцінені відповідним і загальноприйнятим статистичним методом. Статистичні методи, що використовуються, вибираються у відповідності до типу досліду.

3. ЗВІТНІСТЬ

ЗВІТ З ДОСЛІДУ

Звіт з досліду, якщо це можливо, повинен містити в собі наступну інформацію:

3.1. Піддослідні тварини:

- вид, що використовувався,

- кількість і вік тварин,

- джерело, умови проживання і т.ін.,

- індивідуальна вага кожної тварини на початку досліду.

3.2. Умови проведення досліду:

- детальну інформацію щодо приготування дослідної речовини, її стабільності і гомогенності, якщо необхідно,

- обґрунтування вибору середовища-носія,

- детальна інформація щодо способу приймання дослідної речовини,

- детальна інформація щодо якості їжі і води,

- обґрунтування вибору доз,

- описання доз, що приймаються, включаючи інформацію щодо середовища-носія, об'єму і фізичної форми матеріалу, що надається,

- ідентифікація і детальна інформація щодо будь-якої захисної речовини.

3.3. Результати:

- дані щодо ваги тіла,

- дані щодо токсичної реакції у відповідності до групи, включаючи смертність,

- природа, складність і тривалість клінічних наслідків (виліковних або ні),

- детальний опис біохімічних методів і результатів,

- результати розтину,

- детальний опис всіх результатів гістопатологічних досліджень,

- статистичне представлення результатів, якщо необхідно.

Обговорення результатів.

Висновки.

4. ПОСИЛАННЯ

Цей метод є аналогічним до методу OECD TG 418.

В.38. ДЕННЕ ДОСЛІДЖЕННЯ ЗАТРИМАНОЇ НЕЙРОТОКСИЧНОСТІ З ПОВТОРЮВАНОЮ ДОЗОЮ ФОСФОРОРГАНІЧНИХ РЕЧОВИН

1. МЕТОД

1.1. ВСТУП

При оцінюванні і аналізі токсичних ефектів речовин важливо взяти до уваги потенціал окремих класів речовин викликати специфічні типи нейротоксичності, які не можуть бути виявлені під час інших досліджень токсичності. Виявлено, що певні фосфорорганічні речовини викликають затриману нейротоксичність і тому, їх слід розглядати як такі, що мають бути досліджені.

Цей 28-денний дослід, направлений на дослідження нейротоксичності, надає інформацію щодо можливих видів небезпеки для здоров'я, які можуть бути викликані повторною експозицією впродовж обмеженого проміжку часу. Цей дослід надасть інформацію щодо реакції на дозування і дозволить оцінити невиявлений рівень шкідливих ефектів, який може виявитись корисним для визначення критеріїв безпеки щодо експозиції.

Дивіться також Загальний вступ до частини В.

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ

1.3. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

Дослідна речовина щоденно подається пероральним шляхом денними дозами домашнім курям впродовж 28 днів. За тваринами ведеться принаймні щоденний нагляд на предмет виявлення аномалій в поведінці, атаксії і паралічу до спливу 14 днів після отримання останньої дози. Біохімічні аналізи, зокрема, пригнічення невропатії цільової естерази (NTE) проводяться на курях, що випадково вибираються до кожної групи, як правило, через 24 і 48 годин після отримання останньої дози. Через два тижні після отримання останньої дози кури, що залишились умертвляються, після чого проводиться гістопатологічний огляд вибраних нервових тканин.

1.4. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

1.4.1. Підготовка

Дозування дослідної речовини відбувається впродовж семи днів на тиждень пероральним шляхом, бажано з використанням зонду або желатинових капсул. Рідини можуть подаватись нерозчиненими або розчиненими у відповідному середовищі такому як кукурудзяне масло; тверді речовини необхідно розчинити, якщо це можливо, оскільки значні дози твердих речовин в желатинових капсулах можуть не засвоїтись організмом належним чином. Для безводних середовищ необхідно знати токсичні характеристики середовища, а якщо вони не відомі, їх необхідно визначити до початку досліду.

1.4.2. Умови досліду

1.4.2.1. Піддослідні тварини

1.4.2.2. Кількість і стать

Звичайно використовується три дослідні групи і контрольна група, що використовує середовище-носія. Умови, в яких знаходиться контрольна група, що використовує середовище-носія, є ідентичними умовам дослідної групи окрім приймання дослідної речовини.

Кількість птахів в кожній групі повинна бути достатньою для того, щоб можна було умертвити принаймні шість птахів для проведення біохімічного аналізу (по три особини за два етапи), а шість птахів залишити живими для проведення 14-денного огляду після проведеного досліду на предмет виявлення патології.

1.4.2.3. Рівні доз

Рівні доз вибираються з урахуванням результатів дослідження затриманої нейротоксичності після значної експозиції, а також інших наявних токсичних або кінетичних даних щодо дослідної речовини. Найвищий рівень дози вибирається з метою викликання токсичних ефектів, бажано затриманої нейротоксичності, але не смертності або значних страждань. Потім вибираються наступні нижчі рівні доз з метою демонстрації будь-яких реакцій, пов'язаних з дозуванням і не виявлення шкідливих ефектів при найнижчому рівні дозування.

1.4.2.4. Тест на граничний вміст

Якщо в результаті досліду при рівні дози принаймні 1 000 мг/кг ваги тіла з використанням процедур, описаних для цього досліду, не виявлено токсичних ефектів і, якщо токсичність не очікується на підставі даних, отриманих відносно структурно пов'язаних речовин, в проведенні досліду з вищим рівнем дози нема необхідності. Цей тест на граничний вміст застосовується за винятком тих випадків, коли дія дослідної речовини на людину вказує на необхідність застосування вищого рівня дози.

1.4.2.5. Період нагляду

Всі тварини оглядаються принаймні щодня впродовж періоду експозиції і впродовж 14 днів після його закінчення окрім випадків, коли на цей період заплановано загальний розтин.

1.4.3. Процедура

Дослідна речовина надається сім днів на тиждень впродовж 28 днів.

Загальний огляд

Огляди повинні розпочатись негайно після початку надання дослідної речовини. Всі кури уважно оглядаються принаймні щодня в кожний з 28 днів досліду і вподовж 14 днів після дозування до запланованого умертвіння. Всі ознаки токсичності необхідно записати, включаючи час виявлення, тип, ступінь складності і тривалість. Огляди повинні включати в себе огляди на предмет виявлення поведінкових аномалій, але не обмежуватись ними. Атаксія оцінюється у відповідності до звичайної шкали, що складається принаймні з чотирьох рівнів, випадки виявлення паралічу мають бути записані. Принаймні два рази на тиждень кури виводяться за межі кліток і примушуються до періодичної моторної активності, такої як, піднімання по драбині, для полегшення виявлення мінімального токсичного ефекту. Птахи в передсмертному стані або тварини, що мають значні розлади або біль після виявлення цих ознак повинні бути усунені, безболісно вбиті і піддані розтину.

Вага тіла

Біохімія

Шість курей, вибраних випадково з дослідної і контрольної групи, що використовувала середовище-носія вбиваються впродовж декількох днів після отримання останньої дози, а мозок і поперековий відділ хребта мають бути підготовлені і проаналізовані на предмет виявлення ознак пригнічення невропатичної цільової естерази (NTE). Крім того, може виявитись необхідною підготовка і аналіз тканини сідалищного нерву на предмет виявлення ознак пригнічення невропатичної цільової естерази (NTE). Звичайно три птаха з контрольної і кожної дослідної групи умертвляються після 24 годин, а три птаха - після 48 годин після отримання останньої дози. Якщо дані, отримані в результаті дослідження затриманої нейротоксичності після значної експозиції або в результаті інших досліджень (наприклад, дослідження токсикокінезу) вказують на доцільність іншого часу умертвіння після отримання останньої дози, необхідно умертвити тварин в цей час і задокументувати відповідні обґрунтування.

Загальний розтин

Гістопатологічний огляд

Нервові тканини тварин, що вижили впродовж періоду огляду, і не використовувались для біохімічних дослідів, повинні піддатись мікроскопічному огляду. Тканини обробляються фіксатором in situ з використанням техніки перфузії. Необхідно виконати розрізи мозочку (середній подовжній рівень), видовженого мозку, хребта і периферійних нервів. Розріз хребта виконується на потиличному сегменті, середньо-грудній і попереково-крижовій зоні. Необхідно виконати розрізи дистальної зони, тибіального нерву і їх відгалуження до литкового м'язу, а також сідалищного нерву. Розрізи необхідно дослідити, шляхом мієлінового або аксон-специфічного плямування. Початково мікроскопічний огляд повинен бути проведений на збережених тканинах всіх тварин дослідної групи і групи з високим рівнем дозування. У випадку, коли ефекти в групі з високим рівнем дозування є очевидним, необхідно також провести мікроскопічне дослідження курей з груп з середнім і низьким рівнем дозування.

2. ДАНІ

3. ЗВІТНІСТЬ

ЗВІТ З ДОСЛІДУ

Звіт з досліду, якщо це можливо, повинен містити в собі наступну інформацію:

3.1. Піддослідні тварини:

- вид, що використовувався,

- кількість і вік тварин,

- джерело, умови проживання і т.ін.,

- індивідуальна вага кожної тварини на початку досліду.

3.2. Умови проведення досліду:

- детальну інформацію щодо приготування дослідної речовини, її стабільності і гомогенності, якщо необхідно,

- обґрунтування вибору середовища-носія,

- детальна інформація щодо способу приймання дослідної речовини,

- детальна інформація щодо якості їжі і води,

- обґрунтування вибору доз,

- обґрунтування вибору часу для припинення біохімічного досліду, якщо він відрізняється від періодів тривалість 24 і 48 годин.

3.3. Результати:

- дані щодо ваги тіла,

- дані щодо токсичної реакції у відповідності до групи, включаючи смертність,

- рівень неочевидних шкідливих ефектів,

- природа, складність і тривалість клінічних наслідків (виліковних або ні),

- детальний опис біохімічних методів і результатів,

- результати розтину,

- детальний опис всіх результатів гістопатологічних досліджень,

- статистичне представлення результатів, якщо необхідно.

Обговорення результатів.

Висновки.

4. ПОСИЛАННЯ

Цей метод є аналогічним до методу OECD TG 419.

В.39. ДОСЛІДЖЕННЯ ПОЗАПЛАНОВОГО/РЕПАРАТИВНОГО СИНТЕЗУ ДНК НА КЛІТИНАХ ПЕЧІНКИ ССАВЦІВ IN VIVO

1. МЕТОД

Цей метод є аналогічним до методу OECD TG 486, Дослідження репаративного синтезу ДНК на клітинах печінки ссавців In Vivo (1997).

1.1. ВСТУП

Метою дослідження репаративного синтезу ДНК на клітинах печінки ссавців in vivo є ідентифікація дослідних речовин, що викликають репарацію ДНК в клітинах печінки піддослідних тварин (дивіться 1, 2, 3, 4).

Цей дослід in vivo забезпечує метод виявлення генотоксичних ефектів на печінку, викликаних хімічними речовинами. Виявлені критичні точки є показником ушкодження ДНК і подальшої репарації клітин печінки. Звичайно печінка є основним органом, що відповідає за метаболізм засвоюваних складових частин. Таким чином, печінка є прийнятним органом для вимірювання ушкодження ДНК in vivo.

Якщо є докази того, що дослідна речовина не досягне цільової тканини, в застосуванні цього досліду нема необхідності.

Критична точка досліду репаративного синтезу ДНК з клітинами печінки ссавців in vivo визначається прийманням мічених нуклеозідів в клітинах, що не піддавались синтезу ДНК (фаза S). Найширше використовується техніка визначення приймання 3

трітіум-міченого тимідіну ( H-TdR) радіографічним методом. Печінки
щурів,  яких  рекомендується   використовувати   для   дослідження
репаративного синтезу ДНК (UDS) in vivo.  Можуть використовуватись
тканини,  крім тканин печінки, але вони не піддається цьому методу
дослідження.

Виявлення реакції UDS залежить від кількості основ ДНК, що видаляються і замінюються в місці ушкодження. Таким чином дослідження UDS є винятково важливим для виявлення "репарації довгих фрагментів ДНК" (20-30 основ), викликаної дослідною речовиною. Для контрасту визначається "репарація коротких фрагментів ДНК" (1-3 основи) зі значно нижчим рівнем чутливості. Крім того, можуть зустрічатись випадки мутагенності через відсутність репарації, неправильну репарацію або неправильну реплікацію ушкоджень ДНК. Обсяг реакції UDS не визначає надійність процесу репарації. Крім того, можливим є випадок, при якому мутаген реагує з ДНК, але пошкодження ДНК не відновлюється завдяки процесу відновлення шляхом видалення ушкодженої ділянки. Відсутність специфічної інформації щодо мутагенної активності, отриманої в результаті дослідження UDS компенсується потенціальною чутливістю цієї критичної точки, оскільки вона визначається для всього геному.

Дивіться також Загальний вступ до частини В.

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ

Клітини в стадії відновлення: відносна кількість ядрової зернистості (NNG), що є вищою від актуального значення, яке може бути визначено в лабораторії, в якій проводиться дослідження.

Відносна кількість ядрової зернистості (NNG): кількісний показник активності клітин UDS при радіографічних дослідженнях UDS, який визначається шляхом віднімання середньої кількості цитоплазмофих ядер в ядерно-еквівалентних цитоплазматичних зонах (CG) від кількості ядер (NG): NNG=NG-CG. Кількість NNG визначається для окремих клітин, а потім підсумовується для клітин, що культивуються, в паралельних культурах і т.ін.

Репаративний синтез ДНК (UDS): репаративний синтез ДНК після видалення і заміни ділянки ДНК, що містить ушкодження, викликане хімічною речовиною або фізичними факторами.

1.3. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

Дослідження UDS на клітинах печінки ссавців in vivo визначає синтез відновлення ДНК після видалення і заміни ділянки ДНК, що містить ушкодження, викликане хімічними речовинами або фізичними 3

факторами. Звичайно дослід спирається на внесення  H-TdR до клітин
ДНК  печінки,  які  мають  низьку  частотність  клітин  в  фазі  S
                               3
клітинного  циклу.  Приймання   H-TdR  звичайно  визначається   за
допомогою  авторадіографії,  оскільки  ця  техніка  не має високої
чутливості до інтерференції з клітинами  фази  S,  як,  наприклад,
підрахунок імпульсів в рідинній фазі.

1.4. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

1.4.1. Підготовка

1.4.1.1. Вибір видів тварин

Для досліду звичайно використовують щурів, однак, також можна використовувати будь-які інші види ссавців. Звичайно в досліді використовуються види молодих дорослих лабораторних тварин. На початку досліду розбіжність в вазі тварин повинна бути мінімальною і не перевищувати +- 20% середньої ваги тварин кожної статі.

1.4.1.2. Розміщення і умови харчування

Застосовуються загальні умови, зазначені в Загальному вступі до частини В, при цьому рівень вологості повинен знаходитись в межах 50-60%.

1.4.1.3. Підготовка тварин

Здорові молоді тварини випадково відбираються до контрольної і дослідної груп. Клітки облаштовуються таким чином, щоб мінімізувати можливий вплив, викликаний місцем розташування клітки. Тварини ідентифікуються індивідуально і знаходяться в клітках впродовж принаймні п'яти дні до початку досліду для акліматизації в лабораторних умовах.

1.4.1.4. Дослідна речовина/Підготовка

Тверді дослідні речовини до початку дозування розчиняються або підвішуються у відповідних розчинниках або середовищах-носіях і розбавляються, якщо це необхідно. Рідкі дослідні речовини можуть подаватись в нерозчиненому або розчиненому вигляді. Для досліду необхідно використовувати свіжі речовини, окрім випадків, коли дані стабільності демонструють прийнятність зберігання речовини.

1.4.2. Умови досліду

1.4.2.1. Розчинник/Середовище

Розчинник/середовище не повинен викликати токсичних ефектів при рівнях доз, що використовуються, і не повинен за підозрою бути таким, що вступає в хімічну реакцію з дослідною речовиною. Якщо використовуються не добре відомі розчинники/середовища, їх використання в досліді повинно бути обґрунтоване на підставі даних, які вказують на їхню відповідність. Рекомендується, наскільки можливо, в першу чергу розглядати можливість використання водних розчинників/середовищ.

1.4.2.2. Контроль

В кожну незалежну частину експерименту необхідно включити паралельний позитивний і негативний контроль (розчинник/середовище). Окрім прийому дослідної речовини, тварини в контрольній групі повинні знаходитись в тих самих умовах, що і тварини в дослідних групах.

Для позитивного контролю використовуються речовини, що відомі як такі, що викликають UDS, якщо вони подаються при рівні дії речовини, стосовно якого очікується підвищення, яке перевищує фон. Позитивний контроль, при якому вимагається метаболічна активація, використовується при дозах, що виявляють помірну реакцію (4). Дози можуть бути вибрані таким чином, щоб ефект був очевидним, але не відкривав негайно досліднику сутність закодованих мікроскопічних слайдів. Прикладами позитивних контрольних речовин є наступні речовини:

------------------------------------------------------------------
| Періоди відбору |        Речовина       |Номер CAS|Номер Einecs|
|     зразків     |                       |         |            |
|-----------------+-----------------------+---------+------------|
|Ранні періоди    |N-нитрозодиметиламин   |62-75-9  |200-249-8   |
|відбору зразків  |                       |         |            |
|(2-4 години)     |                       |         |            |
|-----------------+-----------------------+---------+------------|
|Пізні періоди    |N-2-флуоренилацетамид  |53-96-3  |200-188-6   |
|відбору зразків  |(2-AAF)                |         |            |
|(12-16 годин)    |                       |         |            |
------------------------------------------------------------------

Можна використовувати інші позитивні контрольні речовини. Шлях приймання позитивної контрольної речовини, що відрізняється від шляху прийому дослідної речовини є прийнятним.

1.5. ПРОЦЕДУРА

1.5.1. Кількість і стать тварин

Для досліду використовується відповідна кількість тварин, враховуючи природні біологічні розбіжності в реакції на дослідну речовину. Кількість тварин повинна складати принаймні три тварини, що підлягають аналізу на групу. У випадку, якщо зібрана значна історична база, необхідна кількість тварин для паралельної позитивної і негативної контрольної групи складає всього одну або дві тварини.

Якщо під час досліду в наявності є дані, отримані в результаті проведення дослідів на тих самих видах тварин, і з використанням того самого способу прийому дослідної речовини, які свідчать про те, що нема значної різниці щодо токсичності за окремими статями, тоді дослід може проводиться на тваринах однієї статі, бажано на самцях. Якщо дія дослідної речовини на організм людини може бути різною у відповідності до статі, наприклад, у випадку деяких фармацевтичних речовин, дослід проводиться на тваринах відповідної статі.

1.5.2. Графік вживання дослідної речовини

Дослідна речовина звичайно подається вподовж єдиного етапу впливу дослідної речовини.

1.5.3. Рівні доз

Звичайно використовується принаймні два рівні доз. Найвища доза визначається, як доза, що виявляє ознаки токсичності, таким чином, щоб вищі рівні доз, що приймаються у відповідності до того самого режиму дозування могли б викликати смертні випадки. Взагалі, нижчі дози повинні складати від 50% до 25% від вищої дози.

Речовини з особливою біологічною активністю при низьких нетоксичних дозах (такі як гормони і мітогени) можуть бути виключенням щодо критерію вибору дози і дози таких речовин визначаються в залежності від кожного конкретного випадку. Якщо поводиться дослід з метою визначення діапазону доз в зв'язку з відсутністю необхідних даних, він повинен проводитись в тій самій лабораторії, з використанням тварин тих самих видів, штамів, статі і з застосуванням того самого режиму дозування, що і при основному досліді.

Найвища доза може також визначатись як доза, що викликає певні ознаки токсичності в печінці (наприклад, пікнотичні ядра).

1.5.4. Тест на граничний вміст

Якщо в результаті досліду при одному рівні дози принаймні 2 000 мг/кг ваги тіла при однократній або двократній дії дослідної речовини, не виявлено токсичних ефектів і, якщо генотоксичність не очікується на підставі даних, отриманих відносно структурно пов'язаних речовин, в проведенні повного досліду нема необхідності. Очікуваний вплив на організм людини може вказувати на необхідність використання вищого рівня дози при проведенні тесту на граничний вміст.

1.5.5. Приймання доз

Дослідна речовина звичайно подається за допомогою зонду з використанням шлункового зонду або відповідного катетера. Інші способи прийому дослідної речовини є прийнятними, якщо їхнє використання обґрунтоване. Однак, використання інтраперітонеального способу не рекомендується, оскільки при такому способі печінка піддається впливу дослідної речовини безпосередньо, а не через систему кровообігу. Максимальний об'єм рідини, який може бути введений через зонд або через ін'єкцію за один раз залежить від розміру піддослідної тварини. Об'єм не повинен перевищувати 2 мл/100 г ваги тіла. Використання об'ємів, що перевищують вищезазначений об'єм необхідно обґрунтувати. Крім речовин, що викликають подразнення або корозію, які звичайно виявляють подразнюючу дію при більших рівнях концентрації, змінність об'єму дослідної речовини необхідно звести до мінімуму для забезпечення однакового об'єму речовини при всіх рівнях доз.

1.5.6. Препарування клітин печінки

Клітини печінки препаруються у тварин, що піддавались дії дослідної речовини, звичайно через 12-16 годин після дозування. Додатковий більш ранній час відбору зразків (звичайно від двох до чотирьох годин після дії речовини) звичайно є необхідним, окрім випадків наявності очевидної позитивної реакції через 12-16 годин. Однак, відбір зразків може здійснюватись в інший час, якщо такий час є обґрунтованим на підставі токсикокінетичних даних.

Короткочасні культури клітин печінки ссавців звичайно визначаються шляхом оббризкування печінки in situ колагеназою і надання можливості нещодавно відділеним клітинам печінки приєднатись до відповідної поверхні. Клітини печінки тварин з негативної контрольної групи повинні мати рівень життєздатності (5) принаймні 50%.

1.5.7. Визначення НСД

Щойно відокремлені клітини печінки ссавців, зазвичай, 3

вирощуються  в  середовищі що містить  H-TdR протягом відповідного
періоду часу,  наприклад,  3-8 год.  По  закінченню  інкубаційного
періоду  слід  відділити  середовище  від клітин,  які далі можуть
вирощуватись в середовищі, що містить надлишок неміченого тимідину
з   метою  зменшення  неінкорпорованої  радіоактивності  (холодний
чейз).  Потім  клітини  промивають,  фіксують  і  висушують.   Для
триваліших інкубаційних періодів немає необхідності у застосуванні
холодного чейзу.  Предметні скельця занурюють в  авторадіографічну
емульсію,  виставляють у темряві (напр.  зберігають у прохолодному
місці протягом 7-14 днів),  і підраховують розвинені, забарвлені і
наявні сріблясті зерна. Предметні скельця готують у співвідношенні
два до трьох для кожної тварини.

1.5.8. Аналіз

Препарати на предметних скельцях мають містити достатню кількість клітин із нормальною морфологією з метою проведення оцінки значення НСД. Препарати досліджуються мікроскопічно на ознаки видимої цитотоксичності (наприклад, пікноз, скорочені рівні введення радіоактивних ізотопів).

Перед підрахунком зерен предметним скельцям має привласнюватися код. Зазвичай, підраховують 100 клітин з кожної тварини з щонайменше двох предметних скелець; підрахунок щонайменше 100 клітин/на тварину має бути виправданим. Підрахунок зерен не здійснюється для ядра S-фази, але співвідношення клітин S-фази може записуватись.

3 Кількість включень H-TdR в ядрі та у цитоплазмі клітин з нормальною морфологією, доказом чого є осад сріблястих зерен, має визначатись відповідними методами.

Кількість зерен визначається за ядром (зерна ядра, ЗЯ) та на еквівалентних ядру ділянках (зерна цитоплазми, ЗЦ). Кількість ЗЦ вимірюється або в найбільш інтенсивно міченій ділянці цитоплазми, або в зернах цитоплазми, прилеглих до ядра, із розрахунку два до трьох. Інші методи підрахунків (наприклад, підрахунок цілісних клітин) можуть використовуватись, якщо вони є виправданими (6).

2. ДАНІ

2.1. ОБРОБКА РЕЗУЛЬТАТІВ

Мають надаватись індивідуальні предметні скельця та дані про тварин. Окрім цього, всі дані слід підсумовувати у формі таблиці. Кількість зерен сітки ядра (ЗСЯ) слід підраховувати для кожної клітини, для кожної тварини і для кожної дози і часу, шляхом віднімання підрахунків ЗЦ з підрахунків ЗЯ. У випадку проведення підрахунків "клітин в репарації", критерії визначення "клітин в репарації" мають обґрунтовуватися та засновуватися на даних негативного історичного або супутнього контролю. Результати, отримані у цифрах, можуть бути оцінені із застосуванням статистичних методів. У випадку застосування статистичних методів, тести мають обиратися та обґрунтовуватися до проведення дослідження.

2.2. ОЦІНЮВАННЯ ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

Приклади критеріїв позитивної/негативної оцінки:

позитивна (i) ЗСЯ вище попередньо встановленого порогу, який підтверджено на основі історичних даних лабораторії; чи

(ii) значення ЗСЯ значно вище за значення, отримане під час супутнього контролю;

негативна (i) ЗСЯ має показник в межах порогу історичного контролю; чи

(ii) ЗСЯ має показник, який є незначно більшим за показник, отриманий під час проведення супутнього контролю.

Слід враховувати біологічну релевантність даних: тобто, мають враховуватися такі параметри, як міжтваринна варіативність, співвідношення реакції на дозування та цитотоксичності. Статистичні методи можуть використовуватись в якості допоміжних під час проведення оцінки результатів дослідження.

Проте, значення статистичного методу не повинно бути єдиним визначальним фактором для позитивної оцінки. Хоча більшість експериментів надають лише позитивні або негативні результати, в поодиноких випадках отримані дані перешкоджають формуванню однозначного судження щодо дії досліджуваної речовини. Результати можуть залишатися сумнівними або під питанням, незалежно від того скільки разів повторювався дослід.

Позитивний результат дослідження НСД клітин печінки ссавців in vivo показує, що досліджувана речовина спричиняє руйнування ДНК в клітинах печінки ссавців in vivo, які можна відновити незапланованим синтезом ДНК in vitro. Негативний результат показує вказує на те, що в умовах проведення дослідження, досліджувана речовина не спричиняє руйнування ДНК, що демонструється під час дослідження проведення даного тесту.

Ймовірність того що досліджувана речовина досягне загальної циркуляції, а саме цільової тканини (наприклад, систематичної токсичності) є дискусійним питанням.

3. ЗВІТНІСТЬ

ЗВІТ ПРО ПРОВЕДЕННЯ ДОСЛІДЖЕННЯ

Звіт про проведення дослідження має містити наступну інформацію:

Розчинник/середовище:

- обґрунтування вибору середовища,

- розчинність та стійкість досліджуваної речовини у розчиннику/середовищі, якщо вони відомі.

Піддослідні тварини:

- різновид/вид, який використовується,

- кількість, вік та стать тварин,

- походження, умови утримування, дієта, та ін.,

- індивідуальна вага тварин на початку дослідження, включаючи індивідуальний діапазон маси тіла, середній показник та відхилення від стандарту для кожної групи.

Умови проведення дослідження:

- позитивний та негативний контроль розчинника,

- дані дальнометричного дослідження, у випадку його проведення,

- обґрунтування вибору рівня дозування,

- докладна інформація щодо приготування досліджуваної речовини,

- докладний інформація щодо застосування досліджуваної речовини,

- обґрунтування напряму застосування,

- методи для перевірки того, що досліджувана речовина досягла загальної циркуляції або цільової тканини, у випадку застосування,

- перехід від концентрації досліджуваної речовини у їжі/питній воді (у мільйонних долях) до поточної дози (мг/кг/маси тіла/на день), у випадку застосування,

- докладна інформація про якість їжі та води,

- докладний опис обробки та графіків відбору зразків,

- методи вимірювання токсичності,

- методи приготування клітин печінки та їх вирощування,

- використана авторадіографічна техніка,

- кількість приготованих предметних скелець та кількість підрахованих клітин,

- критерії оцінювання,

- критерії віднесення дослідження до позитивного, негативного або сумнівного розряду.

Результати:

- індивідуальне предметне скельце, середні показники зерен ядра тварин та груп, зерен цитоплазми та зерен сітки ядра,

- співвідношення доза-реакція, де можливо,

- статистичне оцінювання, за умови проведення,

- ознаки токсичності,

- дані супутнього негативного (розчинник/середовище) та позитивного контролю,

- історичні дані негативного (розчинник/середовище) та позитивного контролю, включаючи діапазон, середні показники та відхилення від стандарту,

- кількість "клітин на відновленні" якщо вони визначені,

- кількість клітин фази S-фази, якщо вони визначені,

- життєздатність клітин.

Обговорення результатів.

Висновки.

4. ПОСИЛАННЯ

(1) Ashby, J., Lefevre, P.A., Burlinson, B. and Penman, M.G., (1985) An Assessment of the In Vivo Rat Hepatocyte DNA Repair Assay. Mutation Res., 156, p. 1-18.

(2) Butterworth, B.E., Ashby, J., Bermudez, E., Casciano, D., Mirsalis, J., Probst, G. and Williams, G., (1987) A Protocol and Guide for the In Vivo Rat Hepatocyte DNA-Repair Assay. Mutation Res., 189, p. 123-133.

(3) Kennelly, J.C., Waters, R., Ashby, J., Lefevre, P.A., Burlinson, B., Benford, D.J., Dean, S.W. and Mitchell, I. de G., (1993) In Vivo Rat Liver UDS Assay. In: Kirkland D.J. and Fox M., (Eds) Supplementary Mutagenicity Tests: UKEM Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part II revised. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, p. 52-77.

(4) Madle, S., Dean, S.W., Andrae, U., Brambilla, G., Burlinson, B., Doolittle, D.J., Furihata, C., Hertner, T., McQueen, C.A. and Mori, H., (1993) Recommendations for the Performance of UDS TestsIn VitroandIn Vivo. Mutation Res., 312, p. 263-285.

(5) Fautz, R., Hussain, B., Efstathiou, E. and Hechenberger-Freudl, C., (1993) Assessment of the Relation Between the Initial Viability and the Attachment of Freshly Isolated Rat Hepatocytes Used for the In Vivo/In Vitro DNA Repair Assay (UDS). Mutation Res., 291, p. 21-27.

(6) Mirsalis, J.C., Tyson, C.K. and Butterworth, B.E., (1982) Detection of Genotoxic Carcinogens in the In Vivo/In Vitro Hepatocyte DNA Repair Assay. Environ. Mutagen, 4, p. 553-562.

B.40. РОЗ'ЇДАННЯ ШКІРИ IN VITRO: ТЕСТ НА ОПІР ДІЇ ЕЛЕКТРИЧНОГО СТРУМУ ЧЕРЕЗ ШКІРУ (ТОДЕСЧШ)

1. МЕТОД

Цей метод еквівалентний методу, описаному у TI OECP 430 (2004).

1.1. ВСТУП

Під роз'їданням шкіри розуміється виникнення необоротного пошкодження шкіри одразу після застосування досліджуваного матеріалу (за визначенням Глобальної Гармонізованої Системи Класифікації та Мічення Хімічних Речовин та Сумішей (ГГС) (1). Цей метод забезпечує процедуру, за якої оцінка роз'їдаючої дії на шкіру не проводиться на живих тваринах.

Оцінка роз'їдаючої дії на шкіру, зазвичай, включала використання піддослідних тварин (2). Через стурбованість болем та стражданням, якого тварини зазнавали під час проведення цього дослідження, було переглянуто метод B.4, який надає можливість визначити роз'їдання шкіри шляхом використання альтернативних методів in vitro, що дозволяють уникнути спричинення болі та страждань тваринам.

Першим кроком для визначення альтернативних методів досліджень, які можна було б використовувати для дослідження роз'їдаючої дії на шкіру, в регулятивних цілях, було проведення попереднього аналізу неупередженої вибірки (3). Після цього офіційний аналіз неупередженої вибірки методів оцінки роз'їдання шкіри in vitro (4)(5) було проведено (6)(7)(8). Результати проведення цих аналізів та іншої опублікованої літератури призвели до появи рекомендацій про те, що наступні тести можуть використовуватись для оцінки роз'їдання шкіри in vivo (9)(10)(11): тестування на моделі людської шкіри (див. метод дослідження B.40 другу частину) та тест на опір дії електричного струму через шкіру (цей метод).

Аналіз неупередженої вибірки та інші матеріали опублікованих досліджень повідомляють, що дослідження дії електричного струму через шкіру щурів (ТОДЕСЧШ) (12)(13) надають можливість чітко розрізняти відомимі роз'їдаючі і не роз'їдаючі шкіру речовини (5)(9).

Дослідження, описане в цьому методі, надає можливість визначити роз'їдаючі шкіру хімічні речовини та суміші. Окрім того, дослідження надає можливість визначити речовини та суміші, які не завдають роз'їдаючого впливу на шкіру, за умови підтвердження цього факту іншою наявною інформацією (наприклад, pH, взаємозв'язок між структурою та роз'їдаючою дією, дані щодо людини та/чи тварини) (1)(2)(11)(14). Дослідження не надає інформації щодо подразнення шкіри, а також не дозволяє вивести під-класифікацію роз'їдаючих шкіру речовин, що дозволяється Глобальною Гармонізованою Системою Класифікації (ГГС) (1).

Для проведення детальної оцінки місцевих впливів на шкіру після одноразової дії на шкіру, рекомендується дотримуватись послідовної стратегії проведення тестувань, що додається до методу проведення дослідження B.4 (2) і надається Глобальною Гармонізованою Системою (1). Ця стратегія проведення тестувань включає проведення досліджень щодо роз'їдання шкіри in vitro (як описано в цьому методі) та щодо подразнення шкіри перед тим, як розглядати можливість проведення тестування на живих тваринах.

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ

Роз'їдання шкіри in vivo: це виникнення необоротних ушкоджень шкіри, а саме видимого некрозу крізь епідерму та у дермі, впродовж чотирьох годин після застосування досліджуваної речовини. Реакції роз'їдання характеризуються язвами, кровотечами, кривавими струпами та наприкінці спостереження на 14-ий день, знебарвленням шкіри через відбілювання шкіри, ділянками повного облисіння, та шрамами. З метою оцінки підозрілих ушкоджень, слід враховувати результати гістопатологічних досліджень.

Опір дії електричного струму через шкіру (ОДЕСЧШ): це показник опору шкіри дії електричного струму, виражений в кіло Омах. Простий та надійний метод оцінювання функції бар'єру шляхом фіксування проходження іонів через шкіру з використанням приладу Місту Уітстона.

1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ

Таблиця 1

Еталонні хімічні реагенти

------------------------------------------------------------------
|         Назва        | N ЄРІКХР |  N РСХ    |                  |
|----------------------+----------+-----------+------------------|
|1,2-Діамінопропан     |201-155-9 |78-90-0    |Сильно роз'їдаюча |
|----------------------+----------+-----------+------------------|
|Акрилова кислота      |201-177-9 |79-10-7    |Сильно роз'їдаюча |
|----------------------+----------+-----------+------------------|
|2-трет. Бутилфенол    |201-807-2 |88-18-6    |Роз'їдаюча        |
|----------------------+----------+-----------+------------------|
|Гідроксид Калію (10%) |215-181-3 |1310-58-3  |Роз'їдаюча        |
|----------------------+----------+-----------+------------------|
|Сірчана кислота (10%) |231-639-5 |7664-93-9  |Роз'їдаюча        |
|----------------------+----------+-----------+------------------|
|Октанова              |204-677-5 |124-07-02  |Роз'їдаюча        |
|кислота (акрилова     |          |           |                  |
|кислота)              |          |           |                  |
|----------------------+----------+-----------+------------------|
|4-Аміно-1,2,4-триазол |209-533-5 |584-13-    |Не роз'їдаюча     |
|----------------------+----------+-----------+------------------|
|Евгенол               |202-589-1 |97-53-0    |Не роз'їдаюча     |
|----------------------+----------+-----------+------------------|
|Фенілетил Бромід      |203-130-8 |103-63-9   |Не роз'їдаюча     |
|----------------------+----------+-----------+------------------|
|Тетрахлоретилен       |204-825-9 |27-18-4    |Не роз'їдаюча     |
|----------------------+----------+-----------+------------------|
|Ізостеаринова кислота |250-178-0 |30399-84-9 |Не роз'їдаюча     |
|----------------------+----------+-----------+------------------|
|4-(Метилен)-          |222-365-7 |3446-89-7  |Не роз'їдаюча     |
|бензальдегід          |          |           |                  |
------------------------------------------------------------------

Більшість еталонних хімічних реагентів обрані з ЄЦОАМД (Європейського центру з оцінки альтернативних методів досліджень) (4). Їхній вибір засновано на наступних критеріях:

(i) однакова кількість речовин, що мають роз'їдаючу та не роз'їдаючу дію;

(ii) наявні в продажі речовини, що охоплюють більшість необхідних для дослідження хімічних класів;

(iii) включення сильно роз'їдаючих так само як і менш роз'їдаючих речовин з метою застосування диференційованого підходу, що засновується на потенціалі роз'їдання;

(iv) вибір хімічних реагентів, які можна використовувати в лабораторії, уникаючи інших, більш серйозних ризиків, таких як роз'їдаюча дія.

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

Матеріал для дослідження застосовується впродовж 24 годин до поверхонь епідерми шкіряних дисків у тестовій системі з двома відсіками, в якій шкіряні диски функціонують як відокремлення між відсіками. Шкірні диски отримують від щурів віком 28-30 днів, які були вбиті гуманним способом. Роз'їдаючі матеріали розпізнають за їх можливістю спричиняти втрату цілісності нашарування рогівки та функції бар'єру, яка визначається як зменшення ОДЕСЧШ нижче порогового рівня (12). Для ОДЕСЧШ щурів, було обрано граничне значення 5 k Омега що засновується на обширних даних щодо великого ряду хімічних речовин, де переважна більшість значень були або набагато вище (часто > 10 k Омега), або набагато нижче (часто < 3 k Омега) цього значення (12). Загалом, речовини які не є роз'їдаючими для тварин, але викликають або не викликають подразнення, не зменшують ОДЕСЧШ нижче цього граничного значення. Крім того, використання інших препаратів шкіри чи іншого обладнання може змінити граничне значення, що викликає потребу у подальшій перевірці.

Етап фіксації барвника включений до процедури тестування на підтвердження позитивних результатів ОДЕСЧШ, включаючи значення близько 5 k Омега. Етап фіксації барвника визначає чи спричинене збільшення іонної проникності фізичним руйнуванням шару рогівки. Метод ОДЕСЧШ, для якого використовують шкіру щурів, прогнозує роз'їдаючу дію in vivo на шкіру кроликів, оцінка яких проводилася відповідно до Методу дослідження B.4 (2). Слід зауважити, що тестування на кроликах in vivo є надзвичайно консервативним порівняно з роз'їдаючою дією на шкіру людини та її подразнення, що виявляються під час проведення тестування на алергічні реакції шкіри (15).

1.5. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

1.5.1. Тварини

Щури є біологічним видом, якому надається перевага, оскільки чутливість їхньої шкіри до хімічних речовин є попередньо доведеною (10). Вік (коли беруть зразки шкіри) та штами щурів є особливо важливими для забезпечення того щоб волосяні фолікули перебували у стадії покою до того як почнеться ріст дорослого волосся.

Шерсть зі спини та боків молодих, приблизно віком 22 дні, щурів жіночої чи чоловічої статі (похідні Вістару або співставлені штами), ретельно видаляється маленькими ножицями. Потім, тварин миють, обережно очищуючи, а острижену ділянку занурюють у розчин антибіотику (який містить, наприклад, стрептоміцин, пеніцилін, хлорамфенікол та амфотерицин у концентраціях, які ефективно перешкоджають росту бактерій). Тварин миють з антибіотиком ще раз на третій чи четвертий день після першого миття та використовують протягом трьох днів після другого миття, коли шар рогівки відновився після видалення шерсті.

1.5.2. Приготування шкіряних дисків

Тварин віком 28-30 днів знищують гуманним способом; цей вік є критичним. Дорсолатеральна шкіра кожної тварини видаляється та очищується від надлишку підшкірного жиру, обережно відділяючи його від шкіри. Шкірні диски діаметром приблизно 20 мм кожний, видаляються. Шкіру можуть зберігати до використання дисків, коли виявляється, що дані позитивного та негативного контролю еквівалентні даним, отриманим зі свіжої шкіри.

Кожен диск розміщують над одним з країв ПТФЕ (політетрафлуороретиленової) трубки, забезпечуючи контакт поверхні епідерми з трубкою. Гумове кільце "O" вставляється під тиском на кінець трубки щоб тримати шкіру на місці, та надлишкова тканина забирається, розміри трубки та кільця "O" показані на Малюнку 2. Потім гумове кільце "O" обережно та герметично закріплюється на кінці ПТФЕ трубки із використанням вазеліну. Трубка опирається на пружинну клему всередині камери рецептора, що містить розчин MgSO 4 (154 мМ) (Малюнок 1). Шкіряний диск має бути повністю занурений у розчин MgSO . Зі шкіри одного щура можна отримати не менше 4

10-15 шкіряних дисків.

До початку тестування, опір дії електричного струму двох шкіряних дисків вимірюється як процедура контролю якості для шкіри кожної тварини. Обидва диски мають давати показники опору, що перевищують 10 k Омега для того, щоб решту дисків використати для тесту. Якщо показники опору є меншими ніж 10 k Омега, то диски, що залишилися з цієї шкіри, слід викинути.

1.5.3. Застосування тестованих та контрольних речовин

Супутній позитивний і негативний контроль мають використовуватись для кожного дослідження з метою забезпечення належного функціонування експериментальної моделі. Потрібно використовувати шкіряні диски з однієї тварини. Речовинами, які рекомендуються для позитивного та негативного контролю, є, відповідно, 10 M хлористоводнева кислота та дистильована вода.

Рідкі досліджувані речовини (150 мю L) застосовуються рівномірно до поверхні епідерми всередині трубки. При проведенні тестування твердих матеріалів, достатня кількість твердої речовини рівномірно наноситься на диск з метою забезпечення покриття всієї поверхні епідерми. Деіонізована вода (150 мю L) додається на верхівку твердої речовини, і трубку обережно збовтують. Для того щоб досягнути максимального контакту зі шкірою, може бути необхідно нагрівання твердих речовин до 30 град.C щоб розплавити чи пом'якшити досліджувану речовину, або подрібнення до гранульованого матеріалу чи порошку.

Три шкіряних диски використовуються для кожного тесту та для кожної контрольної речовини. Тестовані речовини використовуються впродовж 24 годин при температурі 20-23 град.C. Досліджувана речовина видаляється миттям під струменем водопровідної води, при температурі близько 30 град.C до повного усунення речовини.

1.5.4. Вимірювання ОДЕСЧШ

Повний опір шкіри визначається як ОДЕСЧШ та вимірюється із використанням низької напруги, мосту змінного струму Уітстона(13). Загальними технічними характеристиками мосту є робоча напруга 1-3 Вольта, змінна напруга в формі синуса чи прямокутника 50-1 000 Гц, та діапазон вимірювання щонайменше 0,1-30 k Омега. Міст, що використовується під час аналізу значень індуктивності, ємності та опору з використанням неупередженої вибірки становить відповідно , до 2 000 Н, 2 000 мю F,та 2 M Омега, при частоті 100 Гц чи 1 кГц, із використанням послідовних чи паралельних значень. З метою аналізу роз'їдаючої дії при проведенні тесту на ОДЕСЧШ, вимірювання записуються при опорі, частоті 100 Гц та із використанням послідовних значень. Перед вимірюванням електричного опору, напруга на поверхні шкіри зменшується додаванням достатнього об'єму 70% розчину етанолу, щоб покрити епідерму. Через декілька секунд, етанол видаляють з трубки, і тканини потім зволожують шляхом додавання 3 мл розчину MgSO (154 мМ). Електроди 4

мосту розміщують на іншій стороні шкіряного  диску,  щоб  виміряти
опір  у k Омега/для шкіряного диску (Малюнок 1). Розміри електрода
та  його  довжина  виставляються  нижче  зубчатого  затискача,  що
показано на Малюнку 2. Затискач, який приєднується до внутрішнього
електроду,  залишається  на  верхівці   ПТФЕ   трубки,   під   час
вимірювання опору,  з метою повністю повного занурення електроду у
розчин  MgSO .  Зовнішній  електрод  розміщують  всередині  камери
            4
рецептора таким чином,  щоб він залишався на дні камери.  Відстань
між пружинною клемою та дном ПТФЕ  трубки  зберігається  незмінною
(Малюнок  2),  тому  що  ця відстань впливає на отриманий показник
опору. Отже, відстань між внутрішнім електродом та шкіряним диском
має бути сталою і мінімальною (1-2 мм).

Якщо виміряний показник опору є більшим, ніж 20 k Омега, то це може бути через залишки шару досліджуваної речовини на поверхні епідерми шкіряного диску. Може бути вжита спроба подальшого видалення шару, наприклад, герметизація ПТФЕ трубки великим пальцем руки і збовтування її приблизно протягом 10 секунд; розчин MgSO усувають, і вимірювання опору повторюється зі свіжим

4
розчином MgSO .
             4

Властивості та розміри апарату для проведення тестування та процедури експерименту, за умови використання, можуть впливати на отримані величини показники ОДЕСЧШ. Поріг роз'їдання 5 k Омега був розроблений на основі даних, отриманих за допомогою спеціального апарату та процедури, що описані в цьому методі. Різні порогові та контрольні значення можуть застосовуватись, якщо умови тестування були змінені або використовувався інший апарат. Отже, необхідно перевіряти методологію та граничні показники опору, через тестування ряду вторинних еталонних речовин, обраних з поміж хімічних речовин, що використовуються під час аналізу неупередженої вибірки (4)(5), або з хімічних класів, схожих з тестованими речовинами. Перелік відповідних еталонних хімічних речовин наведений у Таблиці 1.

1.5.5. Методи зв'язування барвника

Наслідком піддавання дії деяких не роз'їдаючих речовин може бути зменшення опору нижче межі 5 k Омега, що дозволяє проходження іонів через шар рогівки, при цьому зменшуючи електричний опір (5). Наприклад, нейтральні органічні та хімічні речовини, які мають поверхнево-активні властивості (включаючи детергенти, емульгатори та інші поверхнево-активні речовини), можуть видаляти ліпіди шкіри, що робить бар'єр більш проникним для іонів. Хоча, якщо показники ОДЕСЧШ досліджуваних речовин є меншими або приблизно дорівнюють 5 k Омега за відсутністю видимого пошкодження, оцінка глибини проникнення барвника має здійснюватись на контрольних та досліджуваних тканинах з метою визначення чи отримані показники ОДЕСЧШ були результатом збільшення проникної властивості шкіри, чи роз'їдаючої дії на неї (3)(5). В останньому випадку, де шар рогівки розривається, барвник сульфуродамін B, при застосуванні до поверхні шкіри, швидко проникає у підлягаючу тканину і фарбує її. Цей особливий барвник є стійким до широкого ряду хімічних речовин і не піддається впливу процедури видалення, описаної нижче.

1.5.5.1. Застосування та видалення барвника Сульфуродаміну B

Після оцінки ОДЕСЧШ сульфат магнію видаляється з трубки, і шкіру ретельно обстежують на видиме пошкодження. Якщо очевидного пошкодження немає, то барвник Сульфуродамін B (Кислота Ред 52; C.I. 45100; Номер ЄРІКХР 222-529-8; номер РСХ 3520-42-1), 150 мю L 10% (w/v) розчину в дистильованій воді, застосовується до поверхні епідерми кожного шкіряного диску протягом двох годин. Потім ці диски миють у водопровідній воді при кімнатній температурі протягом приблизно 10 секунд, щоб видалити будь-який надлишковий/вільний барвник. Кожен шкіряний диск ретельно видаляється з ПТФЕ трубки та поміщується у пляшечку (наприклад, ускляну сцинтиляційну пляшечку об'ємом 20 мл) що містить деіонізовану воду (8 мл). Пляшечки злегка збовтують протягом 5 хвилин, для того щоб позбавитись будь-якого додаткового вільного барвника. Ця процедура полоскання потім повторюється, після чого шкіряні диски видаляють і поміщають в пляшечки, що містять 5 мл 30% розчину (w/v) сульфату додецилу натрію (СДН) у дистильованій воді і інкубуються на ніч при температурі 60 град.C.

Після інкубації, кожен диск шкіри видаляється та викидається, а розчин, який залишився, центрифугується впродовж 8 хвилин при температурі 21 град.C (відповідна сила центрифугування приблизно 175 x g). 1 мл зразка надосадової рідини розбавляється у співвідношенні 1 до 5 (v/v) (тобто, 1 мл + 4 мл) 30% (w/v) розчином СДН у дистильованій воді. Оптична щільність (ОЩ) розчину вимірюється при 565 нм.

1.5.5.2. Розрахунок вмісту барвника

Вміст барвника Сульфуродаміну B на одному диску розраховують від показників ОЩ (5) (молярний коефіцієнт поглинання барвника 4

Сульфуродаміну B при 565 нм = 8,7 x 10 ;  молекулярна маса = 580).
Вміст  барвника  визначається  для  кожного  шкіряного   диску   з
використанням   відповідної   калібрувальної  кривої,  а  середній
показник  вмісту  барвника,  потім  обраховується  для   повторних
експериментів.

2. ДАНІ

Показник опору (k Омега) та середнього вмісту барвника (мкг/диск), якщо можливо, щодо досліджуваного матеріалу, так само як і позитивний і негативний контролі повинні подаватись у формі таблиці (дані індивідуального випробовування та середні показники +- S.D.), включаючи дані повторних експериментів, середні та індивідуальні показники.

2.1. ІНТЕРПРЕТАЦІЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

Середні показники ОДЕСЧШ приймаються, якщо показники позитивного та негативного контролю знаходяться в межах прийнятних меж для методу, що застосовується у лабораторії проведення тесту. Прийнятні діапазони опору для методології та апарату описано вище представлен у наступній таблиці:

------------------------------------------------------------------
|  Контроль |          Речовина          |    Діапазон Опору     |
|           |                            |       (k Омега)       |
|-----------+----------------------------+-----------------------|
|Позитивний |10M Хлористоводнева кислота |0,5-1,0                |
|-----------+----------------------------+-----------------------|
|Негативний |Дистильована вода           |10-25                  |
------------------------------------------------------------------

Середні показники зв'язування барвника приймаються за умови, що показники супутнього контролю знаходяться в межах прийнятних для методу діапазонів. Рекомендовані допустимі показники об'єму вмісту барвника для контрольних речовин для описаної вище методології та апарату подаються нижче:

------------------------------------------------------------------
| Контроль |         Речовина         |  Об'єм вмісту барвника   |
|          |                          |        (мг/диск)         |
|----------+--------------------------+--------------------------|
|Позитивний|10M Хлористоводнева       |40-100                    |
|          |кислота                   |                          |
|----------+--------------------------+--------------------------|
|Негативний|Дистильована вода         |15-35                     |
------------------------------------------------------------------

Досліджувану речовину вважають не роз'їдаючою шкіру:

(i) якщо середній показник ОДЕСЧШ, отриманий під час тестування речовини, є більшим ніж 5 k Омега; або

(ii) якщо середній показник ОДЕСЧШ є меншим, ніж 5 k Омега; та

- шкіряний диск немає явних пошкоджень, та

- середній показник вмісту барвника на диску набагато нижче середнього показника вмісту барвника 10M HCl, отриманого при супутньому позитивному контролі.

Досліджувана речовина вважається роз'їдаючою шкіру:

(i) якщо середній показник ОДЕСЧШ є меншим або дорівнює 5 k Омега, та шкіряний диск помітно пошкоджений; або

(ii) якщо середній показник ОДЕСЧШ є меншим ніж або дорівнює 5 k Омега; та

- шкіряний диск немає явних ознак пошкодження, але

- середній показник вмісту барвника на диску є більший ніж, або дорівнює середньому показнику вмісту барвника 10M HCl, отриманого при супутньому позитивному контролі.

3. ЗВІТНІСТЬ

3.1. ЗВІТ ПРО ПРОВЕДЕННЯ ДОСЛІДЖЕННЯ

Звіт про проведення дослідження має містити наступну інформацію:

Досліджувані та контрольні речовини:

- назва(и) хімічної речовини, такі як: назва ЄРІКХР чи РСХ та номер РСХ, якщо відомо,

- чистота та склад речовини чи препарату (у відсотку(ах) на вагу) та фізичні властивості,

- фізико-хімічні властивості, такі як фізичний стан, pH, стійкість, розчинність у воді, що важливі для проведення дослідження,

- обробка досліджуваних/контрольних речовин перед проведенням дослідження тестування у випадку застосування (наприклад, нагрівання, розмелювання),

- стійкість, якщо відома.

Піддослідні тварини:

- використані штами та стать,

- вік тварин, коли їх використовують в якості донорів,

- походження, умови утримування, режим харчування, та ін.,

- докладна інформацію про приготування шкіри.

Умови дослідження:

- калібрувальні криві для апарату для тестування,

- калібрувальні криві для здійснення тесту на зв'язуваність барвника,

- докладна інформація про процедури тестування, що використовувались для вимірювання ОДЕСЧШ,

- докладна інформація про процедури тестування, що використовувались для оцінювання зв'язування барвника; у випадку застосування,

- опис будь-яких змін процедури тестування,

- опис критеріїв оцінювання, які використовують.

Результати:

- складання таблиць даних ОДЕСЧШ та аналізу зв'язуваності барвника (у випадку доцільності) для кожної тварини та кожного зразка шкіри;

- опис будь яких явищ, якщо вони спостерігались.

Обговорення результатів.

Висновки.

4. ПОСИЛАННЯ

(1) OECD, (2001) Harmonised Integrated Classification System for Human Health and Environmental Hazards of Chemical Substances and Mixtures. OECD Series on Testing and Assessment Number 33. ENV/JM/MONO(2001)6, Paris. http://www.olis.oecd.org/olis/2001doc. nsf/LinkTo/env-jm-mono(2001)6.

(2) Testing Method B.4. Acute Toxicity: Dermal Irritation/Corrosion.

(3) Botham, P.A., Chamberlain, M., Barratt, M.D., Curren, R.D., Esdaile, D.J., Gardner, J.R., Gordon, V.C.,Hildebrand, B., Lewis, R.W., Liebsch, M., Logemann, P., Osborne, R., Ponec, M., Regnier, J.F., Steiling, W., Walker, A.P., and Balls, M., (1995) A prevalidation study on in vitro skin corrosivity testing. The report and recommendations of ECVAM Workshop 6. ATLA 23, p. 219-255.

(4) Barratt, M.D., Brantom, P.G., Fentem, J.H., Gerner, I., Walker, A.P., and Worth, A.P. (1998). The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 1. Selection and distribution of the test chemicals. Toxicology. In Vitro 12, p. 471-482.

(5) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.-G., and Liebsch, M., (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology. In Vitro 12, p. 483-524.

(6) OECD, (1996) Final Report of the OECD Workshop on Harmonisation of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods, p. 62.

(7) Balls, M., Blaauboer, B.J., Fentem. J.H., Bruner. L., Combes, R.D., Ekwall, B., Fielder. R.J., Guillouzo, A., Lewis, R.W., Lovell, D.P., Reinhardt, C.A., Repetto, G., Sladowski. D., Spielmann, H., and Zucco, F., (1995) Practical aspects of the validation of toxicity test procedures. The report and recommendations of ECVAM workshops. ATLA 23, p. 129-147.

(8) ICCVAM, (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods)., (1997) Validation and Regulatory Acceptance of Toxicological Test Methods. NIH Publication No 97-3981. National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/guidelines/validate.pdf.

(9) ECVAM, (1998) ECVAM News & Views. ATLA 26, 275-280.

(10) ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods)., (2002) ICCVAM evaluation of EpiDermTM, EPISKINTM (EPI-200), and the Rat Skin Transcutaneous Electrical Resistance (TER) assay: In Vitro test methods for assessing dermal corrosivity potential of chemicals. NIH Publication No 02-4502. National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods, National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/epiddocs/epis_brd.pdf.

(11) OECD (2002) Extended Expert Consultation Meeting on The In Vitro Skin Corrosion Test Guideline Proposal, Berlin, 1st-2nd November 2001, Secretariat's Final Summary Report, 27th March 2002, OECD ENV/EHS, available upon request from the Secretariat.

(12) Oliver, G.J.A., Pemberton, M.A., and Rhodes, C., (1986) An in vitro skin corrosivity test-modificationsand validation. Fd. Chem.Toxicol. 24, 507-512.

(13) Botham, P.A., Hall, T.J., Dennett, R., McCall, J.C., Basketter, D.A., Whittle, E., Cheeseman, M., Esdaile, D.J., and Gardner, J., (1992) The skin corrosivity test in vitro: results of an interlaboratory trial. Toxic.In Vitro6, p. 191-194.

(14) Worth A.P., Fentem J.H., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile D.J., Liebsch, M., (1998) An Evaluation of the Proposed OECD Testing Strategy for Skin Corrosion. ATLA 26, p. 709-720

(15) Basketter, D.A., Chamberlain, M., Griffiths, H.A., Rowson, M., Whittle, E., York, M., (1997) The classification of skin irritants by human patch test. Fd. Chem. Toxicol. 35, p. 845-852.

(16) Oliver G.J.A, Pemberton M.A and Rhodes C., (1988) An In Vitro model for identifying skin-corrosive chemicals. I. Initial Validation. Toxicology In Vitro. 2, p. 7-17.

Малюнок 1 ( 994_b14 )

Малюнок 2 ( 994_b14 )

B.40BIS. РОЗ'ЇДАННЯ ШКІРИ IN VITRO: ДОСЛІДЖЕННЯ ЗРАЗКА ЛЮДСЬКОЇ ШКІРИ

1. МЕТОД

Цей метод еквівалентний методу, описаному у TI OECP 431 (2004).

1.1. ВСТУП

Роз'їдання шкіри пояснюється виникненням необоротного пошкодження тканини шкіри внаслідок застосування досліджуваної речовини (як визначено Глобальною Гармонізованою Системою Класифікації та Мічення Хімічних речовин та Сумішей (ГГС)) (1). Цей метод тестування не потребує використання живих тварин або тканини тварин для оцінки роз'їдаючої дії на шкіру.

Оцінка роз'їдаючої дії на шкіру, зазвичай, включає використання піддослідних тварин (2). Через стурбованість болем та страждання, яких тварини зазнають під час проведення цього дослідження, було переглянуто метод. B.4, який надає можливість визначити роз'їдання шкіри із використанням альтернативних методів in vitro, уникаючи при цьому спричинення болю та страждання тваринам.

Першим кроком для визначення альтернативних методів досліджень, які можна було б використовувати для дослідження роз'їдаючої дії на шкіру, в регулятивних цілях, було проведення попереднього аналізу неупередженої вибірки (3). Після цього офіційний аналіз неупередженої вибірки методів оцінки роз'їдання шкіри in vitro (4)(5) було проведено (6)(7)(8). Результати проведення цих аналізів та іншої опублікованої літератури (9) призвели до появи рекомендацій про те, що наступні тести можуть використовуватись для оцінки роз'їдання шкіри in vivo (10)(11)12)(13): тестування на моделі людської шкіри (див. цей метод) та тест на опір дії електричного струму через шкіру (див. метод тестування В.40).

Аналіз неупередженої вибірки повідомляє, що тестування на моделі людської шкіри (3)(4)(5)(9) надають можливість чітко розрізняти відомі роз'їдаючі і не роз'їдаючі шкіру речовини. У протоколі про проведення тестування може також надаватися інформація про відмінності між гострими роз'їдаючими та менш роз'їдаючими шкіру речовинами.

Дослідження, описане в цьому методі, надає можливість визначити роз'їдаючі шкіру хімічні речовини та суміші. Окрім того, дослідження надає можливість визначити речовини та суміші, які не завдають роз'їдаючого впливу на шкіру, за умови підтвердження цього факту іншою наявною інформацією (наприклад, pH, взаємозв'язок між структурою та роз'їдаючою дією, дані щодо людини та/чи тварини) (1)(2)(13)(14). Дослідження не надає інформації щодо подразнення шкіри, а також не дозволяє вивести під-класифікацію роз'їдаючих шкіру речовин, що дозволяється Глобальною Гармонізованою Системою Класифікації (ГГС) (1).

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ

Життєздатність клітин: параметр, що вимірює загальну активність популяції клітин (наприклад, здатність клітинних мітохондріальних дегідроназ зменшувати кількість життєздатного барвника МТТ), що, залежить від виміряної кінцевої точки та плану проведення тестування, який використовується та співпадає з загальною кількістю та/чи життєздатністю клітин.

1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ

Таблиця 1

Еталонні хімічні речовини

------------------------------------------------------------------
|         Назва        |  EINECS N  |  CAS N   |                 |
|----------------------+------------+----------+-----------------|
|1,2-Диамінопропан     |201-155-9   |78-90-0   |Дуже роз'їдаюча  |
|----------------------+------------+----------+-----------------|
|Акрилова кислота      |201-177-9   |79-10-7   |Дуже роз'їдаюча  |
|----------------------+------------+----------+-----------------|
|2-трет Бутилфенол     |201-807-2   |88-18-6   |Роз'їдаюча       |
|----------------------+------------+----------+-----------------|
|Калій гідроксид (10%) |215-181-3   |1310-58-3 |Роз'їдаюча       |
|----------------------+------------+----------+-----------------|
|Сірчана кислота (10%) |231-639-5   |7664-93-9 |Роз'їдаюча       |
|----------------------+------------+----------+-----------------|
|Октанова кислота      |204-677-5   |124-07-02 |Роз'їдаюча       |
|(каприлова кислота)   |            |          |                 |
|----------------------+------------+----------+-----------------|
|4-аміно-1,2,4-триазол |209-533-5   |584-13-4  |Не роз'їдаюча    |
|----------------------+------------+----------+-----------------|
|Евгенол               |202-589-1   |97-53-0   |Не роз'їдаюча    |
|----------------------+------------+----------+-----------------|
|Фенетил бромід        |203-130-8   |103-63-9  |Не роз'їдаюча    |
|----------------------+------------+----------+-----------------|
|Тетрахлоретилен       |204-825-9   |27-18-4   |Не роз'їдаюча    |
|----------------------+------------+----------+-----------------|
|Ізостеаринова кислота |250-178-0   |30399-84-9|Не роз'їдаюча    |
|----------------------+------------+----------+-----------------|
|4-(метило)-           |222-365-7   |3446-89-7 |Не роз'їдаюча    |
|бензальдегід          |            |          |                 |
------------------------------------------------------------------

(i) однакова кількість речовин, що мають роз'їдаючу та не роз'їдаючу дію;

(ii) наявні в продажі речовини, що охоплюють більшість необхідних для дослідження хімічних класів;

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

Досліджуваний матеріал застосовується до трьохвимірного зразка шкіри людини, що вміщує щонайменше відновлений епідерміс з функціональним шаром рогівки. Роз'їдаючі речовини визначаються за їхньою здатністю спричиняти зменшення життєздатності клітин (що визначено, наприклад, при використанні аналізу на зменшення МТТ (15)) нижче порогового рівня під час встановлених періодів піддавання впливу. Принцип проведення дослідження зразка шкіри людини заснований на припущенні, що роз'їдаючі хімічні речовини можуть проникати до шару рогівки шляхом дифузії чи ерозії, та є цитотоксичними порівняно з прилеглими шарами клітин.

1.4.1. ПРОЦЕДУРА

1.4.1.1. Моделі шкіри людини

Моделі шкіри людини можна сконструювати або придбати (наприклад, моделі торгівельних марок ЕпіДерм(ТМ) та ЕПІСКІН(ТМ)) (16)(17)(18)(19) або розробити та створити лабораторії (20)(21). Визнано, що використання шкіри людини є об'єктом національних та міжнародних етичних міркувань та положень. Будь-яка нова модель повинна бути затвердженою (принаймні в межах, описаних у пункті 1.4.1.1.2). Моделі шкіри людини, які використовуються для цього тесту, мають відповідати наступним вимогам:

1.4.1.1.1. Загальні вимоги до моделі:

Кератиноцити людини мають використовуватись для побудови епітелію. Численні шари життєздатних клітин епітелію мають бути наявними під функціональним роговим шаром. Модель шкіри також може мати шар стромальних клітин. Роговий шар повинен мати багато шарів з необхідним прошарком ліпідів, щоб створювати функціональний бар'єр з такою міцністю, щоб він протистояв швидкому проникненню цитотоксичних маркерів. Захисні властивості моделі шкіри мають запобігати проходженню речовин навколо рогового шару до життєздатної тканини. Проходження досліджуваних хімічних речовин навколо рогового шару призведе до неправильного відтворення моделі шкіри. Модель шкіри не повинна бути заражена бактеріями (включаючи мікоплазму) чи грибками.

1.4.1.1.2. Умови функціонування моделі:

Показник життєздатності, зазвичай, вимірюється використанням MTT або інших метаболічно перетворених життєздатних барвників. У таких випадках оптична щільність (ОЩ) видаленого (розчиненого) барвника з тканини негативного контролю повинна бути принаймні в 20 разів більше ніж ОЩ самої екстракції розчинника (для огляду, див. (22)). Тканина негативного контролю має бути стійкою у культурі (забезпечувати однакові вимірювання життєздатності) на період експозиції під час проведення тесту. Роговий шар має бути достатньо міцним, щоб опиратися швидкому проникненню певних цитотоксичних мічених хімічних речовин (напр. 1% Тритону X-100). Ця властивість може бути оцінена за тривалістю експозиції, що є необхідною для зменшення життєздатності клітин до 50% (ET ) 50 (напр. для моделей ЕпіДерм(ТМ) та ЕПІСКІН(ТМ) це становить > 2 годин). Тканина має виявляти репродуктивність з часом та переважно між лабораторіями. Більше того, вона має бути здатною прогнозувати потенціал роз'їдання еталонних речовин (див. Таблицю 1), якщо вона використовується в обраному протоколі проведення тесту.

1.4.1.2. Нанесення досліджуваних та контрольних речовин

Дві копії тканини використовуються для кожної обробки (період експозиції), включаючи контролі. Для рідких матеріалів, має застосовуватись достатня кількість досліджуваної речовини, для однорідного покриття поверхні шкіри: слід використовувати мінімум 25 мкл/кв.см. Для твердих матеріалів, має застосовуватись достатня кількість речовини для рівномірного покриття шкіри, і вона повинна бути зволожена деіонізованою або дистильованою водою для забезпечення тісного контакту зі шкірою. У випадку необхідності тверді речовини мають бути подрібнені у порошок перед застосуванням. Метод нанесення має підходити для досліджуваної речовини (див. наприклад, посилання 5). Наприкінці періоду експозиції, досліджуваний матеріал слід ретельно змити з поверхні шкіри з використанням відповідного 0,9% буферного розчину, NaCl.

Супутній позитивний і негативний контроль мають використовуватись для кожного дослідження з метою забезпечення відповідного функціонування експериментальної моделі. Рекомендованими речовинами для позитивного контролю є кристалізована оцтова кислота або 8N KOH. Рекомендованими речовинами для негативного контролю є 0,9% розчин NaCl або вода.

1.4.1.3. Вимірювання життєздатності клітин

Лише затверджені методи кількісного аналізу можуть бути використані для вимірювання життєздатності клітин. Більш того, оцінка життєздатності клітин повинна бути сумісною з використанням трьохвимірної побудови тканини. Не характерне зв'язування барвника не повинно перешкоджати вимірюванню життєздатності. Отже, барвники, що зв'язують протеїни та ті, які не зазнають метаболічного перетворення (наприклад, нейтральний червоний) не є придатними. Найбільш вживаним аналізом є відновлення MTT (3-(4,5-Диметилтіазол-2-ил)-2,5-дифенілтетразолін бромід, тіазолил синій: номер ЄРІКХР 206-069-5, номер РСХ 298-93-1)), яке показало точні результати, що можна відтворити(5), проте, інші види аналізів також можуть використовуватись. Зразок шкіри поміщають в розчин MTT з відповідною концентрацією (наприклад, 0,3-1 мг/мл) та інкубаційною температурою на 3 години. Осад блакитного формазану потім видаляється за допомогою розчинника (ізопропанолу), а концентрація формазану вимірюється визначенням ОЩ при довжині хвилі 540-595 нм.

Хімічна дія тестованого матеріалу на життєздатний барвник може імітувати клітинний метаболізм, що призводить до неправильного оцінювання життєздатності. Це трапляється у тому випадку, коли тестовий матеріал був не повністю видалений зі шкіри промиванням (9). Якщо тестована речовина діє безпосередньо на життєздатний барвник, то слід застосовувати додаткові види контролю, для того щоб виявити та усунути вплив тестованих речовин на вимірювання життєздатності (9)(23).

2. ДАНІ

Показники ОЩ для кожної тканини, та дані обрахованої у відсотках життєздатності клітин для досліджуваного матеріалу, позитивних та негативних контролів мають подаватись у формі таблиці, включаючи дані повторних експериментів, за умови проведення, середні та індивідуальні показники.

2.1. ОБРОБКА РЕЗУЛЬТАТІВ

Показники ОЩ, отримані з кожного зразка, можуть використовуватись для обрахування у відсотках життєздатності відповідно до негативного контролю, яка довільно встановлюється на рівні 100%. Середній показник життєздатності клітин у відсотках, що розрізняє роз'їдаючі досліджувані матеріали від не роз'їдаючих (або розрізняє різні класи роз'їдаючих речовин), або статистична процедура(и), що використовуються для оцінки результатів та виявлення роз'їдаючих матеріалів, мають бути чітко визначені та задокументовані, а також вони мають бути виправданими. Загалом, ці середні показники встановлюються під час оптимізації тесту, перевіряються протягом фази попереднього контрольного дослідження та підтверджуються під час проведення аналізу неупередженої вибірки. Наприклад, прогнозування роз'їдаючої дії, пов'язане з моделлю ЕпіДерм(ТМ) викладено у (9):

Досліджувану речовину вважають роз'їдаючою шкіру:

(i) якщо життєздатність після 3-х хвилин експозиції є меншою, ніж 50%; або

(ii) якщо життєздатність через три хвилини експозиції є більшою, ніж або дорівнює 50%, і життєздатність після 1 години впливу експозиції є меншою, ніж 15%.

Досліджувану речовину вважають не роз'їдаючою шкіру:

(i) якщо життєздатність впродовж трьох хвилин експозиції є більшою або дорівнює 50%, і життєздатність після 1 години експозиції є більшою або дорівнює 15%.

3. ЗВІТУВАННЯ

3.1. ЗВІТ ПРО ПРОВЕДЕННЯ ДОСЛІДЖЕННЯ

Звіт про проведення дослідження має містити наступну інформацію:

Досліджувані та контрольні речовини:

- назва(и) хімічних речовин, такі як: назва ЄРІКХР чи РСХ, реєстраційний номер РСХ, якщо відомі,

- відсутність домішок та склад речовини або препарату (у відсотку(ах) на вагу),

- фізико-хімічні властивості такі як фізичний стан, pH, стійкість, розчинність, що важливі для проведення дослідження,

- обробка досліджуваних/контрольних речовин перед проведенням тестування, у випадку застосування (напр. нагрівання, подрібнення),

- стабільність, якщо відома.

Обґрунтування використаної моделі шкіри та протоколу

Умови проведення тесту:

- використана клітинна система,

- інформація про калібрування вимірювального пристрою, який використовується для вимірювання клітинної життєздатності (наприклад, спектрофотометр),

- докладна допоміжна інформація щодо окремої моделі шкіри, яка використовується, включаючи її дійсність,

- докладна інформація про процедуру тестування, яка використовується,

- досліджувані дози, які використовуються,

- опис будь-яких змін процедури дослідження,

- посилання на історичні дані моделі,

- опис використаних критеріїв оцінювання.

Результати:

- складання таблиць даних індивідуальних досліджуваних зразків,

- опис інших явищ, якщо вони спостерігались.

Обговорення результатів.

Висновки.

4. ПОСИЛАННЯ

(1) OECD (2001) Harmonised Integrated Classification System for Human Health and Environmental Hazards of Chemical Substances and Mixtures. OECD Series on Testing and Assessment Number 33. ENV/JM/MONO(2001)6, Paris. http://www.olis.oecd.org/olis/2001doc. nsf/LinkTo/env-jm-mono(2001)6.

(2) Testing Method B.4. Acute Toxicity: Dermal Irritation/Corrosion.

(3) Botham, P.A., Chamberlain, M., Barratt, M.D., Curren, R.D., Esdaile, D.J., Gardner, J.R., Gordon, V.C., Hildebrand, B., Lewis, R.W., Liebsch, M., Logemann, P., Osborne, R., Ponec, M., Regnier, J.F., Steiling, W., Walker, A.P., and Balls, M., (1995) A prevalidation study on in vitro skin corrosivity testing. The report recommendations of ECVAM Workshop 6 ATLA 23, p. 219-255.

(5) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M., (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology In Vitro 12, p. 483-524.

(6) OECD, (1996) Final Report of the OECD Workshop on Harmonisation of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods, p. 62.

(7) Balls, M., Blaauboer, B.J., Fentem, J.H., Bruner, L., Combes, R.D., Ekwall, B., Fielder, R.J., Guillouzo, A., Lewis, R.W., Lovell, D.P., Reinhardt, C.A., Repetto, G., Sladowski, D., Spielmann, H., and Zucco, F., (1995) Practical aspects of the validation of toxicity test procedures. Test report and recommendations of ECVAM workshops. ATLA 23, p. 129-147.

(8) ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods)., (1997) Validation and Regulatory Acceptance of Toxicological Test Methods. NIH Publication No 97-3981. National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/guidelines/validate.pdf.

(9) Liebsch, M., Traue, D., Barrabas, C., Spielmann, H., Uphill, P., Wilkins, S., McPherson, J.P., Wiemann, C., Kaufmann, T., Remmele, M. and Holzhutter, H.G., (2000) The ECVAM prevalidation study on the use of EpiDerm for skin Corrosivity testing. ATLA 28, p. 371-401.

(10) ECVAM, (1998) ECVAM News & Views. ATLA 26, p. 275-280.

(11) ECVAM, (2000) ECVAM News & Views. ATLA 28, p. 365-67.

(12) ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods)., (2002) ICCVAM evaluation of EpiDermTM, EPISKINTM (EPI-200), and the Rat Skin Transcutaneous Electrical Resistance (TER) assay: In Vitro test methods for assessing dermal corrosivity potential of chemicals. NIH Publication No 02-4502. National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods, National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/epiddocs/epis_brd.pdf.

(13) OECD, (2002) Extended Expert Consultation Meeting on The In Vitro Skin Corrosion Test Guideline Proposal, Berlin, 1st-2nd November 2001, Secretariat's Final Summary Report, 27th March 2002, OECD ENV/EHS, available upon request from the Secretariat

(14) Worth, A.P., Fentem, J.H., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R. D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Liebsch, M., (1998) An Evaluation of the Proposed OECD Testing Strategy for Skin Corrosion. ATLA 26, p. 709-720.

(15) Mosmann, T., (1983) Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity asssays. J.Immunol. Meth. 65, p. 55-63.

(16) Cannon, C.L., Neal, P.J., Southee, J.A., Kubilus, J., and Klausner, M., 1994. New epidermal model for dermal irritancy testing. Toxicology In Vitro 8, p. 889-891.

(17) Ponec, M., Boelsma, E., Weerheim, A., Mulder, A., Boutwstra, J., and Mommaas, M., 2000. Lipid and ultrastructural characterisation of reconstructed skin models. International Journal of Pharmaceutics. 203, p. 211-225.

(18) Tinois, E., Gaetani, Q., Gayraud, B., Dupont, D., Rougier, A., Pouradier, D.X., (1994) The Episkin model: Successful reconstruction of human epidermis in vitro. In In vitro Skin Toxicology. Edited by A Rougier, AM Goldberg and HI Maibach, p. 133-140

(19) Tinois E, Tiollier J, Gaucherand M, Dumas H, Tardy M, Thivolet J (1991). In vitro and post-transplantation differentiation of human keratinocytes grown on the human type IV collagen film of a bilayered dermal substitute. Experimental Cell Research 193, p. 310-319

(20) Parentau, N.L., Bilbo, P., Molte, C.J., Mason, V.S., and Rosenberg, H., (1992) The organotypic culture of human skin keratinocytes and fibroblasts to achieve form and function. Cytotechnology 9, p. 163-171.

(21) Wilkins, L.M., Watson, S.R., Prosky, S.J., Meunier, S.F., Parentau, N.L., (1994) Development of a bilayered living skin construct for clinical applications. Biotechnology and Bioengineering 43/8, p. 747-756.

(22) Marshall, N.J., Goodwin, C.J., Holt, S.J., (1995) A critical assessment of the use of microculture tetrazolium assays to measure cell growth and function. Growth Regulation 5, p. 69-84.

(23) Fentem, J.H., Briggs, D., Chesne', C., Elliot, G.R., Harbell, J.W., Heylings, J.R., Portes, P., Rouget, R., and van de Sandt, J.J.M., and Botham, P.A., (2001) A prevalidation study on in vitro tests for acute skin irritation: results and evaluation by the Management Team. Toxicology In Vitro 15, p. 57-93.

B.41. ТЕСТ НА ФОТОТОКСИЧНІСТЬ 3T3 NRU IN VITRO

1. МЕТОД

Цей метод еквівалентний методу, описаному у TI OECP 432 (2004).

1.1. ВСТУП

Фототоксичність визначається як токсична реакція на речовину, яку застосовують до тіла, яка або виявляється або збільшується (очевидно, при нижчих рівнях дозування) після піддавання світлу, або спричиняється опроміненням шкіри після систематичного застосування речовини.

Тест на фототоксичність 3T3 NRU in vitro використовується для визначення фототоксичного потенціалу тестованої речовини, викликаного збудженням хімічного реагенту після експозиції до світла. Тест оцінює фотоцитотоксичність через відповідне зменшення життєздатності клітин, які піддаються дії хімічного реагента за умови присутності/відсутності світла. Речовини, що розпізнають за цим тестом, є ймовірно фототоксичними in vivo, після системного застосування та розподілу по шкірі або після місцевого застосування.

Повідомляють, що багато видів хімічних речовин викликають фототоксичні впливи (1)(2)(3)(4). Їхньою спільною властивістю є здатність поглинати енергію світла в межах діапазону сонячного світла. За першим законом фотохімії (законом Гротгуса Дрейпера), фотореакція потребує достатнього поглинання світлового кванта. Таким чином, перед тим, як розглянути біологічне тестування, УФ/видимий спектр поглинання тестованої хімічної речовини має визначатись згідно Інструкцій щодо проведення тесту ОЕСР 101. Було запропоновано, що якщо молярний коефіцієнт екстинкції /поглинання -1 -1

є меншим,  ніж 10 літрів x  mol    x  cm  ,  то  хімічна  речовина
вірогідно  не є фотореактивною.  Таку хімічну речовину не потрібно
тестувати за допомогою 3T3 NRU-тесту in vitro  на  фототоксичність
або  із  використанням  будь-якого  іншого  біологічного  тесту на
шкідливий вплив фотохімічних реакцій (1)(5). Див. також Додаток 1.

Надійність та значимість тесту на фототоксичність 3T3 NRU in vitro була нещодавно оцінена (6)(7)(8)(9). Тест на фототоксичність 3T3 NRU in vitro виявився пророкуючим гострі фототоксичні явища у тварин та людей in vivo. Цей тест не призначено для прогнозування інших зворотних ефектів, що можуть виникнути внаслідок поєднаної дії хімічної речовини та світла, наприклад, він не спрямований на виявлення фотогенотоксичності, фотоалергії або фотоканцерогенності, а також не дозволяє оцінити фототоксичний потенціал. До того ж, тест не було призначено для виявлення непрямих механізмів фототоксичності, впливів метаболітів тестової речовини, або впливів сумішей.

Тоді як, на теперішній момент використання метаболічних систем є загальною вимогою до всіх тестів in vitro для прогнозування генотоксичного та канцерогенного потенціалу, що стосується фототоксикології, існують лише поодинокі приклади, коли необхідна метаболічна трансформація для хімічної речовини для того щоб діяти у якості фототоксину in vivo або in vitro. Таким чином, здійснення цього тесту з метаболічною системою активації не вважається ні необхідним, ні науково виправданим.

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ

Опромінювання: інтенсивність ультрафіолету (УФ) або видиме відбите світло на поверхні, що вимірюється в Вт/кв.м або мВт/кв.см.

Доза світла: кількість (= інтенсивність x час) ультрафіолету (УФ) або видимого відбитого випромінювання на поверхні, що відображається у Джоулях (= Вт x S) на ділянку поверхні, напр. Дж/кв.м або Дж/кв.см.

УФ діапазони хвиль світла: позначення, рекомендовані МКО (Міжнародна комісія по освітленню), є УФА (315-400 нм), УФВ (280-315 нм) і УФС (100-280 нм). Також використовуються інші позначення; розподіл між УФВ та УФА зазвичай ставлять при 320 нм, а УФА може поділятись на УФ-А1 і УФ-А2 з розподілом при приблизно 340 нм.

Життєздатність клітин: параметр для вимірювання загальної активності популяції клітин (наприклад, поглинання життєздатного барвника нейтрального червоного у клітинних лізосомах), який, залежить від виміряної кінцевої точки та плану проведення тесту, що використовується, і співвідноситься із загальною кількістю та/чи з життєздатністю клітин.

Відносна життєздатність клітин: життєздатність клітин, виражена відносно контролів розчинника (негативних), які проводяться протягом всієї процедури тестування (або +Irr або -Irr), але не обробляються досліджуваною хімічною речовиною.

ФПФ (Фото-Подразнюючий-Фактор): фактор, спричинений порівнянням двох однаково ефективних цитотоксичних концентрацій (IC ) тестованої речовини, отриманий за відсутності (-Irr) та у 50

присутності  (+Irr)  не  цитотоксичного  опромінювання  з  УФА/vis
світла.

IC : концентрація досліджуваної хімічної речовини, при якій 50

життєздатність клітини зменшується на 50%.

СФЕ (Середній показник Фото Ефекту): вимірювання походить від математичного аналізу кривих реакції на концентрацію, які отримують за відсутності (-Irr) та у присутності (+Irr) не цитотоксичного опромінювання з УФА/vis світла.

Фототоксичність: гостра токсична реакція, яка з'являється після першого контакту шкіри з певними хімічними речовинами та подальшого піддавання дії світла, або, яка провокується опроміненням шкіри після систематичного введення хімічної речовини.

1.3. ПРИНЦИП МЕТОДУ ПРОВЕДЕННЯ ТЕСТУ

Тест на фототоксичність 3T3 NRU in vitro має за основу порівняння цитотоксичності хімічної речовини, коли вона тестується у присутності і за відсутності дії не цитотоксичної дози штучного сонячного світла. Цитотоксичність в цьому тесті виражається, як залежне від концентрації зменшення поглинання життєздатного барвника, нейтрального червоного, що вимірюється коли проходить 24 години після обробки тестованою хімічною речовиною та опроміненням (10). НЧ - це слабкий катіоноактивний барвник, який легко проникає до мембран клітини через відсутність дифузії, накопичуючись в середині клітин в лізосомах. Зміни поверхні чутливої мембрани лізосом призводять до крихкості лізосом та до інших змін, які поступово стають безповоротними. Такі зміни, викликані дією ксенобіотиків, призводять до зменшення поглинання і зв'язування НЧ. Все ж можливо відрізнити життєздатні, пошкоджені або мертві клітини, на чому і засновується цей тест.

Клітини фібробластів лінії Balb/c 3T3 зберігаються в культурному середовищі впродовж 24 годин, для формування моношарів. Для проведення тестування хімічної речовини дві посудини з 96 комірками попередньо інкубуються у 8 різних концентраціях досліджуваної речовини протягом 1 години. Одразу після цього одна з двох посудин піддається дії найвищої не цитотоксичної дози опромінювання, тоді як інша посудина зберігається у темряві. В обох посудинах засіб для обробки потім замінюється культурним середовищем та після проходження ще 24 годин інкубації, життєздатність клітин визначається поглинанням барвника нейтрального червоного. Життєздатність клітин виражається як відсоткове співвідношення контролів необробленого розчинника і обраховується при кожній тестованій концентрації. Для прогнозування фототоксичного потенціалу, порівнюються реакції на концентрацію, отримані у присутності та за відсутності опромінювання; зазвичай при рівні IC , тобто, при концентрації, 50

що  зменшує  життєздатність  клітин   до   50%,   порівнюється   з
необробленими контролями.

1.4. ОПИС МЕТОДУ ТЕСТУВАННЯ

1.4.1. Приготування

1.4.1.1. Клітини

Постійна лінія фібробластових клітин мишей, Balb/c 3T3, клон 31, або з американської колекції Типів культури (АКТП), Менасес, В.А, США, або з Європейської колекції типів культур (ЄКТК), Селісбері, Вільтшир, ОК використовувалась при проведенні аналізу неупередженої вибірки, та була рекомендована для їх отримання з одного високоякісного сховища клітин. Інші клітини або лінії клітин можуть використовуватись для тієї самої процедури тестування, якщо умови для культури пристосовані до потреб клітини, проте, має бути продемонстрована їх рівноцінність.

Клітини слід постійно перевіряти на відсутність зараження мікоплазмою, і використовувати лише тоді, коли його не виявлено (11).

Важливо, щоб УФ чутливість клітин постійно перевірялась, відповідно до процедури контролю якості, яка описана в цьому методі. Оскільки УФА чутливість клітин може зростати з кількістю проходжень, мають бути використані, отримані при найменшій кількості проходжень, переважно менше ніж 100. (Див. розділ 1.4.2.2.2 та Додаток 2).

1.4.1.2. Засіб та умови культури

Відповідне культурне середовище та умови інкубації повинні використовуватись для звичайного проходження клітин та під час процедури тестування, наприклад, для клітин фібробластів лінії Balb/c 3T3, це є клітини ДМСО (Дулбекко Модифіковане Середовище Орла) з додаванням 10% сироватки новонародженого теляти, глютаміну 4 мМ, пеніциліну (100 МО), та стрептоміцину (100 мкг/мл), та вологій інкубації при температурі 37 град.C, 5-7,5% CO в 2

залежності від буферного  розчину  (Див.  Розділ  1.4.1.4,  другий
пункт).  Особливо важливо, щоб умови культури клітин забезпечували
цикл їхнього розвитку в межах  нормального  історичного  діапазону
клітин чи ліній клітин, що використовуються.

1.4.1.3. Приготування культури

Клітини з заморожених культур для зберігання сіють у культурному середовищі за відповідної щільності та інокулюють, принаймні, ще раз перед тим, як їх почнуть використовувати у тесті на фото токсичність 3T3 NRU in vitro.

Клітини, що використовують для тестування на фототоксичність сіють в середовищі культури з відповідною щільністю таким чином, щоб культури не злилися до закінчення проведення дослідження, тобто, коли життєздатність клітин визначається впродовж 48 годин після посіву клітин. Для клітин фібробластів лінії Balb/c 3T3, вирощених у 96-ти пластинках, рекомендована щільність посіву клітин є 1 104 клітин на комірку.

Для кожного досліджуваного хіміката клітини сіють однаково у дві окремі 96-ти коміркові плати, які потім беруть одночасно, впродовж всієї процедури, за однакових культурних умов, крім періоду коли одна плата опромінюється (+Irr), а інша зберігається в темряві (-Irr).

1.4.1.4. Приготування досліджуваної речовини

Досліджувані речовини повинні бути щойно приготованими, безпосередньо перед використанням, якщо дані не демонструють стабільності у зберіганні. Рекомендується, щоб обробка всіх хімічних речовин та початкове застосування клітин проводилось за умов освітлення, що дозволить уникнути фотоактивації чи деградації досліджуваної речовини відносно опромінення.

Досліджувані хімічні речовини повинні бути розчинені в буферних сольових розчинах напр. збалансований сольовий розчин Ерла (EBSS), або інші фізіологічно збалансовані буферні розчини, які не мають містити протеїнових компонентів, компонентів, які поглинають світло (напр. pH-індикаторів кольорів та вітамінів) для того щоб уникнути втручання під час опромінення. З того часу як клітини під час опромінення зберігаються приблизно протягом 50 хвилин ззовні CO інкубатора, слід потурбуватись про те, щоб 2

уникнути алкалізації. Якщо використовуються слабкі буфери такі, як
EBSS, то це можна забезпечити через інкубацію клітин при 7,5% CO .
                                                                2
Якщо клітини інкубують лише при 5%  CO , то слід обирати міцнішого
                                      2
буфера.

Досліджувані хімічні речовини з обмеженою розчинністю у воді повинні бути розчинені у відповідному розчиннику. Якщо розчинник використовується, то він повинен бути наявний в незмінному об'ємі в усіх культурах, тобто в негативних контролях (розчиннику) так само як і у всіх концентраціях досліджуваної хімічної речовини та повинен бути не цитотоксичним у всіх концентраціях. Концентрації досліджуваної хімічної речовини повинні бути обрані для того, щоб уникнути випадіння осаду або мутних розчинів.

Рекомендованими розчинниками є Диметилсульфоксид (ДМСО) та етанол. Можуть використовуватись й інші розчинники з низькою цитотоксичністю. Перед використанням, всі розчинники повинні оцінюватись за особливими властивостями, напр. реакція з досліджуваною хімічною речовиною, подавлення фототоксичного ефекту, основні очисні властивості та/чи хімічна стійкість у розчиннику.

Обробка ультразвуком, та/чи нагрівання до відповідних температур може використовуватись для сприяння розчинення, якщо це не вплине на стійкість досліджуваної хімічної речовини.

1.4.1.5. Умови опромінення

1.4.1.5.1. Джерело світла

Вибір придатного джерела світла та фільтрів є вирішальним фактором у тестуванні на фототоксичність. Світло УФА та видимих ділянок зазвичай асоціюють з фототоксичними реакціями in vivo (3)(12), тоді як загалом УФВ є менш релевантним, але високо цитототоксичним; цитотоксичність зростає в 1000 разів з довжиною хвилі від 313 до 280 нм (13). Критерії вибору потрібного джерела світла мають включати вимоги щодо виділення джерелом світла довжини хвилі, яка поглинається досліджуваною речовиною (спектр поглинання) та дози світла (яка доступна при достатньому періоді піддавання впливу) і вони повинні бути в достатній кількості для виявлення відомих фототоксичних хімікатів. Більше того, довжина хвилі та дози, які використовуються не повинні бути надмірно шкідливими для системи дослідження, напр. виділення теплоти (інфрачервона ділянка).

Симуляція сонячного світла сонячними імітаторами вважається оптимальним штучним джерелом світла. Розподіл сили опромінення сонячного імітатора з фільтром має бути близьким до зовнішнього денного світла (14). Як дуги Ксенона так і (з добавками) дуги ртутно-залізного галогеніду, які використовуються як сонячні імітатори (15). Останній має перевагу, він виділяє менше теплоти і дешевший, але він менше походить на сонячне світло якщо порівнювати з дугами Ксенону. Оскільки всі сонячні імітатори виділяють значну кількість УФВ, їх потрібно фільтрувати належним чином для того, щоб зменшити довжину хвиль високо цитотоксичних УФВ. Оскільки пластичні матеріали культури клітин містять стабілізатори УФ, то спектр повинен вимірюватись через той самий тип 96-ти коміркових плат, і використовуватись для аналізу. Незалежно від проведених вимірювань для того, щоб зменшити частинки спектра шляхом фільтрування, або через неминучі явища фільтрування обладнання, спектр, що записується нижче цих фільтрів не повинен відхилятися від стандартизованого денного світла (14). Приклад спектрального розподілу іррадіації сонячного стимулятора з фільтром, що використовується у затвердженому дослідженні на фототоксичність методом in vitro 3T3 NRU поданий в (8)(16). Див. також Додаток 2 Малюнок 1.

1.4.1.5.2. Дозування

Потужність світла (опромінення) має регулярно перевірятися, перед кожним тестуванням на фототоксичність з використанням належного широкого діапазону вимірювального приладу УФ. Потужність світла повинна вимірюватись з використанням такого ж типу 96-ти коміркових пластинок, які будуть використовуватись в дослідженні. Прилад для вимірювання УФ повинен бути калібрований до джерела.

Експлуатаційні якості приладу для вимірювання УФ слід перевіряти, для цього рекомендується використання другого приладу для вимірювання УФ такого ж типу з ідентичною калібрацією. В ідеалі, при великих інтервалах, слід використовувати спектрорадіометр для вимірювання спектрального опромінення джерела світла з фільтром та для перевірки калібрації приладу широкого діапазону для вимірювання УФ.

Доза 5 Дж/кв.см (як вимірюється величина УФА ) визначена не токсичною для клітин фібробластів лінії Balb/c 3T3 та достатньо сильною, щоб стимулювати хімікати проявляти фототоксичні реакції, (6)(17) напр. щоб досягнути 5 Дж/кв.см впродовж 50 хвилин, встановлене опромінення 1,7 мВт/кв.см. Див. Додаток 2 Малюнок 2. Якщо використовується інша клітинна лінія або інше джерело світла, то може буде необхідним калібрування дози опромінення таким чином, щоб обрати систему дозування, яка є не шкідливою для клітин але достатньою щоб викликати стандартний фототоксин. Період піддавання впливу світла обраховується наступним чином:

доза опромінення (Дж/кв.см) x 1000      (1 Дж = 1 Втсек)
 t(мін) = ----------------------------------
          опромінення (мВт/кв.см) x 60

1.4.2. Умови тестування

1.4.2.1. Концентрація тестових речовин

Величини концентрацій хімічних речовин за наявності (+Irr) і за відсутності (-Irr) світла повинні бути точно визначені під час експериментів, що визначають величину дозування. Це може бути корисним для оцінювання розчинності на початковій стадії та впродовж 60 хвилин (або який би час обробки не використовувався), оскільки розчинність може змінюватись під час перебігу піддавання впливу. Для того щоб уникнути токсичності викликаної невідповідними умовами культури чи високо кислотними та лужними хімічними речовинами, pH культур клітин з доданими досліджуваними хімічними речовинами повинне бути в межах 6,5-7,8.

Найвища концентрація досліджуваної речовини повинна бути в межах фізіологічних умов тесту, напр. потрібно уникати осмотичного та pH тиску. Залежно від досліджуваної хімічної речовини, може бути необхідним і розгляд інших фізико-хімічних властивостей, таких як фактори, що обмежують найвищу тестову концентрацію. Для відносно нерозчинних речовин, які не токсичні при концентраціях до точки поглинання, необхідно досліджувати найвищу концентрацію, якої можна досягнути. Загалом, слід уникати випадання в осад досліджуваної хімічної речовини при будь яких концентраціях дослідження. Максимальна концентрація досліджуваної речовини не повинна перевищувати 1 000 мкг/мл та 10 М. Має бути використаний ряд геометричних розчинень досліджуваної речовини у восьми концентраціях з постійним фактором розчинення. (Див. Розділ 2.1, другий пункт).

Якщо є інформація (з ряду дослідницьких експериментів) про те, що досліджувана хімічна речовина не є цитотоксичною в межах концентрації експерименту, що проводиться в темряві (-Irr), але високо цитотоксичний при опроміненні (+Irr), то межі концентрації, які слід обирати для (+Irr) експерименту, можуть відрізнятися від тих, що обрані для (-Irr) експерименту, з метою виконання вимоги якості точних даних.

1.4.2.2. Групи контролю

1.4.2.2.1. Радіаційна чутливість клітин, встановлення історичних даних:

Клітини слід постійно перевіряти на чутливість до джерела світла через оцінювання їхньої життєздатності після піддавання впливу, для збільшення доз опромінення. Декілька доз опромінення, включаючи набагато більші ступені ніж, ті що використовувались для 3T3 NRU тесту на фототоксичність, мають бути використані у дослідженні. Ці дози найлегше оцінювати через вимірювання частинок УФ джерела світла. Клітини сіють при густоті використаній у in vitro 3T3 NRU тесті на фототоксичність та опромінюються на наступний день. Життєздатність клітин визначається на наступний день шляхом оцінки поглинання нейтрального червоного. Необхідно показати, що отримана найвища не цитотоксична доза (напр. у валідованому дослідженні: 5 Дж/кв.см(UVA)) була достатньою, щоб правильно класифікувати уже згадані хімічні речовини (Таблиця 1).

1.4.2.2.2. Чутливість до радіації, перевірка поточного тесту

Тест відповідає критеріям якості, якщо перевірки опромінювання негативного контролю (розчинника) показують життєздатність більше ніж 80% в порівнянні з негативним контролем (розчинником), який не опромінюється.

1.4.2.2.3. Ефективність перевірок розчинника:

Абсолютна оптична щільність (ОГ540 NRU) барвника нейтрального червоного екстрагованого під час перевірок розчинника показує чи посів 1.104 клітин на комірку зростає з нормальною подвійною швидкістю протягом двох днів аналізів. Тест відповідає затвердженим критеріям, якщо середнє значення OD540 NRU не обробленого контролю >= 0,4 (тобто приблизно у 20 разів основного поглинання розчинника).

1.4.2.2.4. Позитивний контроль

Відома фототоксична хімічна речовина повинна тестуватись одночасно з кожним in vitro 3T3 NRU тестом на фото токсичність. Рекомендується Хлорпромазан (ХПЗ). Для тестованого ХПЗ зі стандартним протоколом in vitro 3T3 NRU тесту на фототоксичність, були визначені наступні критерії: ХПЗ опромінений (+Irr): IC = 0,1 до 2,0 мкг/мл, ХПЗ не опромінений (-Irr): IC = 7,0 to 50 50

90,0 мкг/мл.  фото подразнюючий фактор (PIF),  повинен бути  >  6.
Слід проконтролювати історію здійснення позитивного контролю.

Інші фототоксичні хімічні речовини, що належать до хімічного класу речовин або володіють розчинною властивістю хіміката, який досліджують, можуть використовуватись як конкурентний позитивний контроль замість хлорпромазану.

1.4.3. Процедура дослідження (6)(7)(8)(16)(17):

1.4.3.1. Перший день:

Розподіл 100 мкл культурного середовища у периферійних комірках 96-ти коміркової пластинки мікротитру культури тканини (= контроль). В тих комірках, що залишилися, дозування 100 мкл 5

клітинної суспензії 1 x 105  клітин/мл  в  культурному  середовищі
(= 1.104  клітин/комірку).  Дві пластинки повинні бути приготовані
для  кожної  серії  індивідуальних  тестувань,  та  для   контролю
розчинника та позитивного контролю.

Клітини інкубують на добу (Див. Розділ 1.4.1.2) поки вони не сформують єдиний моношар. Цей інкубаційний період передбачає відновлення клітин, адгезію та експоненціальний ріст.

1.4.3.2. Другий день:

Після інкубації, клітини фільтрують від культурного середовища та ретельно промивають у 150 мкл буферного розчину, який використовується для інкубації. Додають 100 мкл буферу, який містить потрібну концентрацію досліджуваної речовини або розчинника (контроль розчинника). Застосовують вісім різних концентрацій розчину досліджуваної речовини. Клітини інкубують у досліджуваній речовині в темряві впродовж 60 хвилин (Див. Розділ 1.4.1.2 та 1.4.1.4 другий абзац).

З поміж двох пластинок приготованих для кожної серії концентрацій та контролів досліджуваної речовини, обирається одна, як правило, методом випадкового відбору, для визначення цитотоксичності (-Irr) (тобто, контрольна пластинка), і одна (оброблена пластинка) для визначення фототоксичності (+Irr).

Для виконання піддавання дії +Irr, клітини опромінюють при кімнатній температурі впродовж 50 хвилин через кришку 96-ти комірчастої пластинки з найвищою дозою радіації, яка є не токсичною (див. також Додаток 2). Зберігають не опромінені пластинки (-Irr) при кімнатній температурі в темній коробці впродовж 50 хв. (= період піддавання впливу світла).

Досліджуваний розчин фільтрують та ретельно промивають двічі у 150 мкл буферного розчину, який використовувався для інкубації, але не містить досліджуваного матеріалу. Буфер замінюють культурним середовищем та здійснюють інкубацію (Див. Розділ 1.4.1.2.) протягом ночі (18-22 год).

1.4.3.3. Третій день:

1.4.3.3.1. Мікроскопічне оцінювання

Клітини повинні перевірятись на ріст, морфологію та цілісність моношару використовуючи фазово-контрастний мікроскоп. Зміни в морфології клітин та впливи на їхній ріст мають бути записані.

1.4.3.3.2. Тест NRU ( метод на культурах клітин)

Клітини промивають в 150 мкл попередньо нагрітого буферу. Миючий розчин видаляють легким постукуванням. Додають 100 мкл нейтрального червоного 50 мкг/мкл (НЧ) (3-аміно-7-диметиламіно-2-метилфеназин гідрохлорид, N ЄРІКХР 209-035-8; N РСХ 553-24-2; C.I. 50040) в середовище без сироватки(16) та культивують, як описано в абзаці 1.4.1.2., протягом 3 год. Після культивування, видаляють середовище НЧ, та промивають клітини в 150 мкл буфера. Надлишок буферу зціджують та видаляють промоканням або центрифугою.

Додають лише 150 мкл видобутого розчину НЧ (свіжо приготовані 49 частин води + 50 частин етанолу + 1 частина оцтової кислоти).

Мікротитрову пластинку злегка струшують на шейкер мікротитрової пластинки протягом 10 хв. поки НЧ не буде видалений з клітин та не утвориться однорідний розчин.

Вимірюють оптичну щільність екстракту НЧ при 540 нм у спектрофотометрі, використовуючи пусті місця як еталон. Зберігають дані у відповідному форматі електронного файлу для подальшого аналізу.

2. ДАНІ

2.1. КІЛЬКІСТЬ ТА ЯКІСТЬ ДАНИХ

Дані дослідження повинні передбачати ґрунтовний аналіз реакції на концентрацію, отриману за наявності та за відсутності опромінення, та, якщо можливо, концентрацію досліджуваного хімікату, при якій життєздатність клітин зменшується до 50% (IC ). Якщо виявлено цитотоксичність, то як об'єм концентрацій, 50

так і відрізки індивідуальних концентрацій повинні встановлюватись
таким чином щоб криві співпадали з даними дослідження.

Як для чітко позитивного так і чітко негативного результату (Див. Розділ 2.3, перший абзац) може бути достатньо первинного експерименту, що супроводжується ще одним або більше підготовчими експериментом(ами) на визначення величини дозування.

Двозначні чи нечіткі результати слід з'ясувати через проведення подальшого дослідження (див. також в розділі 2.4, другий абзац). В таких випадках, потрібно зважати на зміну умов проведення дослідження. Умови проведення дослідження, які можуть бути змінені включають величину концентрації або розподіл, передінкубаційний період, та період опромінення - піддавання дії. Для коротшого періоду піддавання впливу можуть бути придатні нестійкі до води хімікати.

2.2. ОЦІНКА РЕЗУЛЬТАТІВ

Провести обрахування оцінок даних, фото подразнюючого фактору (PIF) або середнього значення фото ефекту (MPE).

Для обрахування значень фототоксичності (див. нижче) ряд окремих значень реакцій на концентрацію має бути апроксимований через відповідну криву (модель) постійної реакції на концентрацію криву. Відповідність кривої даним здійснюється зазвичай методом не лінійної регресії (18). Для того щоб оцінити вплив варіативності даних придатній кривій рекомендують процедуру застосування бутстрапу.

Фото подразнюючий ефект (PIF) обраховується за наступною формулою:

IC   (-Irr)
                                 50
                        PIF = ------------

IC (+Irr) 50

Якщо за наявності чи відсутності світла не можна обрахувати IC , то не можна визначити ФПФ для тестованого матеріалу. 50

Значення   фото   ефекту   (MPE)   базується   на   дугах   повних
концентраційних-рекцій (19).  Це   визначається  як  середня  вага
відносно представленого ряду значень фотоефектів.

n
                               S  w  PE
                              i=1  i   C
                                        i
                        MPE = -----------
                                 n
                                 S  w
                                i=1  i

S - знак суми.

Фотоефект PEc при будь-якій концентрації C визначається як продукт ефекту реакції REc та ефект дози DEc тобто PEc = REc x DEc. Вплив реакції REc це різниця між реакціями, які спостерігаються за наявності та за відсутності світла, тобто REc = Rc (-Irr) - Rc (+Irr). Вплив дози визначається за формулою:

C/C* - 1
                        DE  = |----------|
                          c     C/C* + 1

де C* означає еквівалентність концентрації, тобто концентрація при якій +Irr реакція дорівнює -Irr реакції при концентрації C. Якщо C* не можна визначити через те, що значення реакції +Irr дуги є систематично вище або нижче ніж RC(-Irr) то ефект дози встановлюється до 1. Фактори зважування w визначають i

при найвищому  значенні  реакції,  тобто  wi  =  MAX  {Ri  (+Irr),
Ri (-Irr)}.  Сітка  концентрацій  C   обирається так,  що однакова
                                   i
кількість точок знижується в  кожному  інтервалі  розсіювання,  що
визначається  за  значеннями концентрацій,  які використовуються в
експерименті.  Обрахунок MPE обмежується до максимального значення
концентрації  при  якому  принаймні  одна  з  двох  кривих  все ще
проявляє значення  реакції  принаймні  10%.  Якщо  ця  максимальна
концентрація вища ніж найвища концентрація,  що використовується в
+Irr  експерименті,  то  для  залишкової   частини   +Irr   кривої
встановлюється величина реакції '0'.  Залежно від того чи величина
МТТ більша    ніж   обране   належним   чином   середнє   значення
(MPEc = 0,15) або ні, хімікат класифікують як фототоксичний.

Пакет програмного забезпечення для обрахування ФПФ та МТТ представлено у посиланні (20).

2.3. ІНТЕРПРЕТАЦІЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

На основі дослідження аналізу неупередженої вибірки(8), досліджувана речовина з ФПФ < 2 або МТТ < 0,1 передбачає: "відсутність фототоксичності". ФПФ > 2 та < 5 чи МТТ > 0,1 та < 0,15 передбачає: "можливу фототоксичність"; та ФПФ> 5 чи МТТ > 0,15 передбачає: "фототоксичність".

Будь-яка лабораторія, яка попередньо запроваджує це дослідження, має перевірити еталонні матеріали, перелічені у Таблиці 1 до початку проведення оцінки тестування досліджуваних речовин на фототоксичність. Показники ФПФ та МТТ мають бути наближеними до показників, вказаних у Таблиці 1.

Таблиця 1

-----------------------------------------------------------------------------
|    Назва    |     N     |    NPCX    |  ФПФ  | МТТ | Найвища  |Розчинник N|
|   хімічної  |   ЄРІКХР  |            |       |     |  точка   |           |
|   речовини  |           |            |       |     |поглинання|           |
|-------------+-----------+------------+-------+-----+----------+-----------|
|Аміодарон    |243-293-2  |(19774-82-4)|> 3,25 |0,2- |242 нм    |етанол     |
|HCL          |           |            |       |0,54 |300 нм    |           |
|             |           |            |       |     |(плече)   |           |
|-------------+-----------+------------+-------+-----+----------+-----------|
|Хлоропромазан|200-701-3  |(69-09-0)   |> 14,4 |0,33-|309 нм    |етанол     |
|HCL          |           |            |       |0,63 |          |           |
|-------------+-----------+------------+-------+-----+----------+-----------|
|Норфлоксацин |274-614-4  |(70458-96-7)|> 71,6 |0,34-|316 нм    |ацетонітрил|
|             |           |            |       |0,90 |          |           |
|-------------+-----------+------------+-------+-----+----------+-----------|
|Антрацен     |204-371-1  |(120-12-7)  |> 18,5 |0,19-|356 нм    |ацетонітрил|
|             |           |            |       |0,81 |          |           |
|-------------+-----------+------------+-------+-----+----------+-----------|
|Протопорфирін|256-815-9  |(50865-01-5)|> 45,3 |0,54-|402 нм    |етанол     |
|IX,          |           |            |       |0,74 |          |           |
|Двонатрієвий |           |            |       |     |          |           |
|-------------+-----------+------------+-------+-----+----------+-----------|
|L-Гістідин   |           |(7006-35-1) |no PIF |0,05-|211 нм    |вода       |
|             |           |            |       |0,10 |          |           |
|-------------+-----------+------------+-------+-----+----------+-----------|
|Гексахлорофен|200-733-8  |(70-30-4)   |1,1-1,7|0,00-|299 нм    |етанол     |
|             |           |            |       |0,05 |317 нм    |           |
|             |           |            |       |     |(плече)   |           |
|-------------+-----------+------------+-------+-----+----------+-----------|
|Лаурилсульфат|205-788-1  |(151-21-3)  |1,0-1,9|0,00-|поглинання|вода       |
|Натрію       |           |            |       |0,05 |відсутнє  |           |
|---------------------------------------------------------------------------|
|(N) Розчинник, який використовувався для вимірювання поглинання            |
-----------------------------------------------------------------------------

2.4. ІНТЕРПРЕТАЦІЯ ДАНИХ

Якщо фототоксичні впливи спостерігаються лише при найвищій досліджуваній концентрації, (особливо для досліджуваних хімічних речовин, що розчиняються у воді), то тоді може виникнути необхідність у проведенні подальшої оцінки ризику. Це може включати дані про поглинання та накопичення хімічної речовини в шкірі та/чи дані інших досліджень, наприклад, тестування хімічної речовини методом in vitro на шкірі тварин чи людей, або на моделях шкіри.

Якщо токсичність не проявляється (+Irr та -Irr), або якщо слабка розчинність обмежує величину концентрацій, які могли б тестуватись, то відповідність тестованої речовини дослідженню може бути під питанням, і має бути розглянута можливість застосування підтверджувального дослідження із використанням, наприклад, іншої моделі.

3. ЗВІТУВАННЯ

ЗВІТ ПРО ПРОВЕДЕННЯ ТЕСТУ

Звіт про проведення тесту має містити, у будь-якому випадку, наступну інформацію:

Досліджувана речовина:

- ідентифікаційні дані, загальні назви та реєстраційний номер ЄРІКХР і РСХ, якщо вони відомі,

- фізичні властивості та чистоту,

- фізико-хімічні властивості, що важливі для проведення дослідження,

- УФ/vis спектр поглинання,

- стабільність та фото стабільність, якщо вони відомі.

Розчинник:

- обґрунтування вибору розчинника,

- розчинність досліджуваної хімічної речовини у розчиннику,

- кількість розчинника, наявного у обробленому середовищі, у відсотках.

Клітини:

- вид та джерело клітин,

- відсутність мікоплазми,

- кількість проходжень клітин, якщо відомо,

- чутливість клітин до випромінювання, що визначається з використанням опромінюючого обладнання, яке застосовується у тесті на фототоксичність 3T3 NRU in vitro.

Умови проведення дослідження (1); інкубація перед та після обробкою:

- тип та склад культурного середовища,

- умови культивування (CO концентрація; температура; 2

вологість),

- тривалість культивування (попередня обробка, кінцева обробка).

Умови проведення дослідження (2); обробка хімічною речовиною:

- логічне пояснення вибору концентрацій тестової речовини, яка використовується за наявності та за відсутності опромінення,

- у випадку обмеженої розчинності досліджуваної хімічної речовини та відсутності цитотоксичності: логічне пояснення для найвищої концентрації, що використовується,

- тип та склад середовища для обробки (буферний сольовий розчин),

- тривалість застосування хімікату.

Умови проведення дослідження (3); опромінення:

- обґрунтування вибору джерела світла, що використовується,

- товаровиробник та тип джерела світла та радіометра,

- особливості спектрального опромінення джерела світла,

- властивості трансмісії та поглинання фільтру, що використовується,

- характеристики радіометру та деталі щодо його калібрації,

- відстань джерела світла від системи дослідження,

- УФА опромінення при цій відстані, виражене у мВт/кв.см,

- тривалість УФ/віз експозиції світла,

- доза УФА (опромінення x час), виражена у Дж/кв.см,

- температура клітинних культур під час опромінення та супутньо клітинних культур, які зберігають в темряві.

Умови проведення дослідження (4); тест на життєздатність барвникомнейтральним червоним:

- склад середовища, обробного нейтральним червоним,

- тривалість інкубації нейтрального червоного,

- умови тесту (CO концентрації; температура; вологість), 2

- умови екстрагування нейтрального червоного (екстрагант; тривалість),

- довжина хвилі, що використовується для спектрофотометричного зняття показників оптичної щільності барвника нейтрального червоного,

- друга довжина хвилі (посилання), якщо використовується,

- вміст бланку спектрофотометру, якщо використовується.

Результати:

- життєздатність клітин отримана при кожній концентрації хімікату, який досліджується, виражена у відсотках життєздатність засобу, супутні контролі розчинника,

- дуги реакцій концентрацій (концентрація досліджуваного хіміката відносно релятивної життєздатності клітин), отримана під час +Irr та -Irr екпериментів,

- аналіз концентраційно-реакційних дуг, якщо можливо розрахунок /обчислення IC (+Irr) та IC (-Irr), 50 50

- порівняння двох концентраційно-реакційних дуг отриманих за наявності та відсутності опромінення, чи обрахунком фото подразнюючого фактору (ФПФ), чи методом обрахунку значення фото ефекту (МТТ),

- критерії прийняття дослідження; одночасний контроль розчинника:

- цілковита життєздатність (оптична щільність екстракту барвника нейтрального червоного) опромінених чи неопромінених клітин,

- історичні дані негативного контролю та контролю розчинника, засоби та стандартні відхилення,

- критерії прийняття дослідження; супутній позитивний контроль,

- IC (+Irr) та IC (-Irr) та ФПФ/МТТ хімікату з позитивним 50 50

контролем,

- дані позитивного контролю хімікату: IC (+Irr) та 50

IC  (-Irr) та ФПФ/МТТ; значення та відхилення від стандарту
  50

Обговорення результатів.

Висновки.

4. Посилання

(1) Lovell W.W., (1993) A scheme for in vitro screening of substances for photoallergenic potential. Toxicology In Vitro 7, p. 95-102.

(2) Santamaria, L. and Prino, G., (1972) List of the photodynamic substances. In "Research Progress in Organic, Biological and Medicinal Chemistry" Vol. 3 part 1. North Holland Publishing Co. Amsterdam. p. XI-XXXV.

(3) Spielmann, H., Lovell, W.W., Holzle, E., Johnson, B.E., Maurer, T., Miranda, M.A., Pape, W.J.W., Sapora, O., and Sladowski, D., (1994) In vitro phototoxicity testing: The report and recommendations of ECVAM Workshop 2. ATLA, 22, p. 314-348.

(4) Spikes, J.D., (1989) Photosensitisation. In "The science of Photobiology" Edited by K.C. Smith. Plenum Press, New York. 2nd edition, p. 79-110.

(5) OECD, (1997) Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No 7 "Guidance Document On Direct Phototransformation Of Chemicals In Water" Environment Directorate, OECD, Paris.

(6) Spielmann, H., Balls, M., Doring, B., Holzhutter, H.G., Kalweit, S., Klecak, G., L'Eplattenier, H., Liebsch, M., Lovell, W.W., Maurer, T., Moldenhauer. F. Moore. L., Pape, W., Pfannbecker, U., Potthast, J., De Silva, O., Steiling, W., and Willshaw, A., (1994) EEC/COLIPA project on in vitro phototoxicity testing: First results obtained with a Balb/c 3T3 cell phototoxicity assay. Toxic. In Vitro 8, p. 793-796.

(7) Anon, (1998) Statement on the scientific validity of the 3T3 NRU PT test (an in vitro test for phototoxicity), European Commission, Joint Research Centre: ECVAM and DGXI/E/2, 3 November 1997, ATLA, 26, p. 7-8.

(8) Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W.J.W., Pechovitch, G. De Silva, O., Holzhutter, H.G., Clothier, R., Desolle, P., Gerberick, F., Liebsch, M., Lovell, W.W., Maurer, T., Pfannenbecker, U., Potthast, J. M., Csato, M., Sladowski, D., Steiling, W., and Brantom, P., (1998) The international EU/COLIPA In vitro phototoxicity validation study: results of phase II (blind trial), part 1: the 3T3 NRU phototoxicity test. Toxicology In Vitro 12, p. 305-327.

(9) OECD, (2002) Extended Expert Consultation Meeting on The In Vitro 3T3 NRU Phototoxicity Test Guideline Proposal, Berlin, 30th-31th October 2001, Secretariat's Final Summary Report, 15th March 2002, OECD ENV/EHS, available upon request from the Secretariat.

(10) Borenfreund, E., and Puerner, J.A., (1985) Toxicity determination in vitro by morphological alterations and neutral red absorption. Toxicology Lett., 24, p. 119-124.

(11) Hay, R.J., (1988) The seed stock concept and quality control for cell lines. Analytical Biochemistry 171, p. 225-237.

(12) Lambert L.A, Warner W.G., and Kornhauser A., (1996) Animal models for phototoxicity testing. In "Dermatotoxicology", edited by F.N.Marzulli and H.I.Maibach. Taylor & Francis, Washington DC. 5th Edition, p. 515-530.

(13) Tyrrell R.M., Pidoux M., (1987) Action spectra for human skin cells: estimates of the relative cytotoxicity of the middle ultraviolet, near ultraviolet and violet regions of sunlight on epidermal keratinocytes. Cancer Res., 47, p. 1825-1829.

(14) ISO 10977., (1993) Photography - Processed photographic colour films and paper prints - Methods for measuring image stability.

(15) Sunscreen Testing (UV.B) TECHNICALREPORT, CIE, International Commission on Illumnation, Publication No 90, Vienna, 1993, ISBN 3 900 734 275

(16) ZEBET/ECVAM/COLIPA - Standard Operating Procedure: In Vitro 3T3 NRU Phototoxicity Test. Final Version, 7 September, 1998. p. 18.

(17) Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W.J.W., De Silva, O., Holzhutter, H.G., Gerberick, F., Liebsch, M., Lovell, W.W., and Pfannenbecker, U., (1998) A study on UV filter chemicals from Annex VII of the European Union Directive 76/768/EEC, in the in vitro 3T3 NRU phototoxicity test. ATLA 26, p. 679-708. (18) Holzhutter, H.G., and Quedenau, J., (1995) Mathematical modeling of cellular responses to external signals. J. Biol. Systems 3, p. 127-138.

(18) Holzhutter, H.G., (1997) A general measure of in vitro phototoxicity derived from pairs of dose-response curves and its use for predicting the in vivo phototoxicity of chemicals. ATLA, 25, p. 445-462.

(19) htt://www.oecd.org/document/55/ 0,2340,en_2649_34377_2349687_1_1_1_1,00.html

Додаток 1

Роль 3T3 NRU PT у логічному підході до тестування хімікатів на фото токсичність

-----------------------------------------------------------------
 |   Початкове оцінювання фізичних, хімічних та                  |
 |   токсилогічних властивостей тестованої речовини              |
 |       * Фізико-хімічні властивості                            |
 |       * Хімічна структура, структурні сигнали тривоги         |
 |       * UV/vis - поглинання                                   |
 |       * QSAR - фотохімія                                      |
 |       * Загальна токсичність (включаючи кінетику та           |
 |         метаболізм                                            |
 -----------------------------------------------------------------
                  |
                  |
                  |
                  \/
     ---------------------------               -------------------
     |       UV/vis            |               | Тестування на   |
     | Спектр поглинання у     |               | Фототоксичність |
     | відповідному розчиннику |-------------> | не вважається   |
     |                         |               | за необхідне    |
     | Напр. ОЕСР TG 101       |               |                 |
     ---------------------------               -------------------
                  |
                  |
                  | Поглинання
                  |
                  \/
 -----------------------------------------------------------------
 | In Vitro 3T3 NRU тест на фототоксичність та/чи інші методи    |
 | якщо необхідно                                                |
 -----------------------------------------------------------------

Додаток 2

Малюнок 1

Спектральний розподіл потужності оснащеного фільтром імітатору сонячного світла ( 994_b14 )

Малюнок 2

Чутливість до опромінення клітин фібробластів лінії Balb/c 3T3 (виміряна в діапазоні УФА) ( 994_b14 )

B.42. ЧУТЛИВІСТЬ ШКІРИ: АНАЛІЗ РЕАКЦІЇ ІЗОЛЬОВАНИХ ВУЗЛІВ

1. МЕТОД

Цей метод еквівалентний методу, описаному у TI OECP 429 (2002)

1.1. ВСТУП

Аналіз реакції ізольованих лімфовузлів (АРІЛ) є достатньо затвердженим та прийнятним для підтвердження його прийняття в якості нового методу (1)(2)(3). Це другий метод оцінювання потенціалу чутливості шкіри тварин до хімічних речовин. Інший метод (B.6) використовує тести на морських свинках, особливо тест на максимізацію на морських свинках та тест Бюхлера (4).

АРІЛ є альтернативним методом для визначення хімічних речовин, які викликають чутливість шкіри та підтверджує те, що хімічні речовини не мають значного потенціалу для спричинення алергічних реакцій шкіри. Це не обов'язково означає, що у всіх випадках необхідно використовувати аналіз реакції ізольованих лімфовузлів замість тесту на морських свинках, але, скоріше за все, цей аналіз є еквівалентним та може застосовуватись в якості альтернативи, коли позитивні та негативні результати вже не потребуватимуть подальшого підтвердження.

АРІЛ має певні переваги у відношенні як технічного прогресу, так і добробуту тварин. Він досліджує індуктивну фазу сенсибілізації шкіри та надає кількісні дані, необхідні для проведення оцінки реакції на дозу. Детальна інформація про затвердження АРІЛ та огляд праці, опублікованої у співавторстві, представлено у посиланнях (5)(6)(7)(8). Окрім того, слід зауважити, що слабкі/помірні сенсибілізатори, які були рекомендовані в якості речовин для позитивного контролю для проведення тесту на морських свинках, можуть також використовуватись під час проведення АРІЛ (6)(8)(9).

АРІЛ - це метод in vivo, а отже, він не виключає використання тварин для оцінювання алергічної реакції (активності чутливості) під час контактування із досліджуваною речовиною. Проте, він має потенціал для зменшення кількості тварин, які потребуються для цього. Більш того, АРІЛ пропонує істотне вдосконалення способу використання тварин для тестування на виникнення алергічних реакцій при контактуванні з досліджуваною речовиною і засновується на розгляді реакцій імунної системи, які стимулюються хімічними речовинами під час фази індукування чутливості. На відміну від тестів на морських свинках, АРІЛ не потребує виявлення викликаних індукованих реакцій чутливості шкіри. До того ж, АРІЛ не потребує використання допоміжних засобів, як у випадку з тестом на максимізацію на морських свинках. Незважаючи на переваги АРІЛ над традиційними тестами на морських свинках, слід визнати, що існують певні обмеження, що потребують використання традиційних тестів на морських свинках (наприклад, неправильні негативні дані АРІЛ з певними металами, неправильні позитивні дані з окремими подразниками шкіри) (10).

Див. також Вступ частину B.

1.2. ПРИНЦИП МЕТОДУ ТЕСТУВАННЯ

Основний принцип, в якому полягає аналіз реакції ізольованих лімфовузлів, те полягає в тому, що хімічні речовини які викликають алергічну реакцію шкіри, викликають початкову проліферацію лімфоцитів у лімфатичному вузлі, який дренує ділянку шкіри, на яку наноситься речовина. Ця проліферація є пропорційною застосованій дозі (та потенціалу алергену) та забезпечує прості способи отримання об'єктивного та кількісного вимірювання чутливості. Аналіз реакції ізольованих лімфовузлів оцінює цю проліферацію, як співвідношення реакції та дози, де проліферація в експериментальних групах порівнюється з контролями застосування розчинника. Відношення проліферації в експериментальних групах, які використовують та у групах для контролів розчинника визначається показником, який позначають як індекс стимуляції, який визначається і повинен бути принаймні три, до подальшого оцінювання речовини, яку тестують в якості потенціального алергену шкіри. Методи, які описані в цьому пункті, засновуються на використанні радіоактивного мічення для визначення клітинної проліферації. Однак, можна використовувати інші основні положення для оцінки проліферації, за умови наявності обґрунтування та відповідного наукового обґрунтування, включаючи повні посилання та опис методології.

1.3. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

1.3.1. Підготовка

1.3.1.1. Умови утримування та харчування

Тварини мають утримуватись окремо одна від одної. Температура в приміщенні, де утримуються піддослідні тварини, має становити 22 град.C (+- 3 град.C). Незважаючи на те, що відносна вологість повинна становити принаймні 30% та не перевищувати 70%, крім часу прибирання приміщення, оптимальним значенням є 50-60%. Освітлення має бути штучним, у наступній послідовності 12 год. світла, 12 год. темряви. Стосовно годування, можливе використання узгоджених лабораторних дієт з безперервним постачанням питної води.

1.3.1.2. Підготовка тварин

Тварин обирають навмання, позначають для індивідуальної ідентифікації (але в жодному разі не маркують на вухах) та утримують в клітках щонайменше протягом п'яти днів до початку введення дози, що дозволяє їм пристосуватися до лабораторних умов. Перед початком дослідження всіх тварин перевіряють, щоб забезпечити відсутність помітних пошкоджень шкіри.

1.3.2. Умови проведення тесту

1.3.2.1. Піддослідні тварини

Миша є біологічним видом тварин, який використовують для цього тесту. Використовують молодих дорослих самок мишей породи CBA/Ca або CBA/J, які не народжували та не чекають приплоду. На початку дослідження тварини вік тварини має становити від 8 до 12 тижнів, а коливання ваги має бути мінімальним та не перевищувати 20% від середнього показника. Інші породи та самці можуть використовуватись коли отримана достатня кількість даних, для того щоб показати, що не існує істотних родових/чи особливих гендерних відмінностей у реакції при проведенні аналізу ізольованих лімфовузлів.

1.3.2.2. Перевірка надійності:

Позитивні контролі використовуються для того, щоб показати відповідне проведення аналізу та здатність лабораторії успішно здійснити аналіз. Позитивний контроль має викликати позитивну реакцію ізольованих лімфовузлів при рівні експозиції, який передбачає збільшення стимуляційного індексу (СІ) > 3 порівняно з групою негативного контролю. Потрібно обирати таку дозу позитивного контролю, щоб індукція була чіткою, але не надлишковою. Речовинами, яким надають перевагу, є гексил коричний альдегід (N РСХ 101-86-0, N ЄРІКХР 202-983-3) та меркаптобензотіазол (N РСХ 149-30-4, N ЄРІКХР 205-736-8). Можливими є і умови використання інших речовин, за наявності обґрунтування та відповідності вище наведеним критеріям. Оскільки, зазвичай, при проведенні кожного аналізу може потребуватися група позитивного контролю, то можуть бути випадки, коли лабораторії для проведення тестів будуть мати наявні історичні дані позитивного контролю, щоб показати послідовність задовільних реакцій протягом 6-ти місяців або і довшого періоду. В таких випадках, буде доцільним менш часте тестування з позитивним контролем та з інтервалами, що не перевищують шість місяців. Хоча речовина позитивного контролю має тестуватись у відомому розчиннику, для того щоб досягнути постійної реакції (наприклад, ацетон, оливкова олія), можуть виникати ситуації, коли виникає необхідність у проведенні тестування у нестандартному розчиннику (клінічно/хімічно релевантний склад). У такому разі потрібно перевіряти можливу взаємодію позитивного контролю з цим нетрадиційним розчинником.

1.3.2.3. Кількість тварин, рівні дозування, вибір середовища

Мінімум по чотири тварини використовують на одну групу введення дози, та мінімум три концентрації досліджуваної речовини, додатково використовують групу негативного контролю лише з середовищем для досліджуваної речовини та, за необхідності, групу позитивного контролю. В тих випадках, коли потрібно зібрати індивідуальні дані тварин, використовують мінімум п'ять тварин. За виключенням відсутності обробки досліджуваною речовиною, з тваринами в контрольних групах слід поводитись так само, як з тваринами, що входять до групи, яка розглядається.

Вибір дози та середовища має засновуватись на рекомендаціях, поданих у посиланні (1). Дози обирають з діапазону концентрацій 100%, 50%, 25%, 10%, 5%, 2,5%, 1%, 0,5% та ін. За наявності, дані про існуючу гостру токсичність та подразнення шкіри мають бути розглянуті при виборі трьох послідовних концентрацій таким чином, щоб було досягнуто максимальної експозиції найвищій концентрації і при цьому уникалась систематична токсичність та гостре місцеве подразнення шкіри (2)(11).

Середовище слід обирати на основі збільшення тестованих концентрацій до максимального рівня і приготуванні розчину/суспензії, що підходить для застосування тестованої речовини. Перевага надається рекомендованим середовищам - ацетону/оливковій олії (4:1 v/v), диметилформаміду, метилетилкетону, пропілен гліколю та диметил сульфоксиду (2)(10), але й інші розчинники можуть використовуватись за наявності достатнього наукового обґрунтування. У деяких ситуаціях може виникнути необхідність використання клінічно доцільного розчинника або купленого формулювання, у якому досліджувана речовина продається в якості додаткового контролю. Особливу увагу слід звернути на те, щоб забезпечити включення гідрофільних матеріалів у систему розчинника, які зволожують шкіру і які не витікають одразу. Таким чином, слід уникати повністю водних розчинників.

1.3.3. Умови процедури

1.3.3.1. Розклад проведення експерименту:

Розклад проведення експерименту є наступним:

День 1

Індивідуально визначити та записати вагу кожної тварини. Нанести 25 мл до тильної поверхні кожного вуха відповідного розчину досліджуваної речовини або позитивний контроль (за необхідністю).

День 2 та 3:

Повторити процедуру нанесення, здійснену у перший день.

День 4 та 5:

Нічого не застосовується.

День 6:

Записати вагу кожної тварини. Ввести 250 мл соляного буферу фосфату (PBS) що містить 20 мю Ci (7,4e + 8Bq) 3H-метил тимідину всім мишам з піддослідної та контрольної груп через хвостову вену. В якості альтернативи ввести 250 мл PBS, який містить 125 -5

2 мCi   (7,4e   +   7Bq)    I-іододеоксириудина   та    10       M
флуородеоксиуридину всім мишам через хвостову вену.

Через п'ять годин тварин знищують. Дренуючі вушні лімфовузли з кожного вуха вирізають та об'єднують у PBS для кожної піддослідної групи (підхід до об'єднаної групи, яку використовують); в якості альтернативи може бути вирізані та об'єднані у PBS пари лімфатичних вузлів окремих тварин. Детальна інформація та діаграми ідентифікації вузлів та розтину можна знайти у Додатку 1 посилання 10.

1.3.3.2. Приготування клітинних суспензій

Одноразова клітинна суспензія клітин лімфоузлів (LNC) або з об'єднаних груп обробки, або подвійна з окремих тварин, готується шляхом легкої механічної дезагрегації через 200 мю м-нитки сітки з нержавіючої сталі. Клітини лімфовузлів двічі промивають з надлишком PBS та занурюють у 5% розчин трихлорацетонової кислоти (TCA) при температурі 4 град.C протягом 18 год. (2). Осад або повторно зважують у 1 мл TCA та переміщують в сцинтиляційні пробірки, які містять 10 мл сцинтиляційної рідини для обрахунку 3 H, або переміщують безпосередньо до трубок, що вимірюють гамму, 125

для    I-обрахунку.

1.3.3.3. Визначення розмноження клітин (включена радіоактивність)

Включення 3H-метил тимідину вимірюється обрахунком бета-сцинтиляції, як дезінтеграція за хвилину (ДЗХ). 125 125

Включення    I-іододеоксиридину  вимірюються  обрахунком     I,  а
також виражаються  як  ДЗХ.  Залежно  від  використаного  підходу,
включення  буде  виражатись  як  ДЗХ/піддослідна група (об'єднаний
підхід) або ДЗХ/тварина (індивідуальний підхід).

1.3.3.4. Результати наукових спостережень

1.3.3.4.1. Клінічні спостереження

Тварин слід ретельно оглядати раз на день на клінічні ознаки, або місцеве подразнення шкіри на ділянці, на яку наносився розчин або на ознаки системної токсичності. Всі досліди систематично реєструють з індивідуальними записами, отриманими для кожної тварини.

1.3.3.4.2. Маси тіла

Як визначено у розділі 1.3.3.1, індивідуальна вага тіла тварин повинна вимірюватись на початку дослідження та під час запланованого знищення тварин.

1.3.4. Обрахування результатів

Результати виражаються як Стимуляційний індекс (СІ). Якщо використовують загальний підхід, то СІ отримують шляхом ділення об'єднаних радіоактивних включень для кожної групи, яку використовують, шляхом включення групи об'єднаного контролю розчинника, то це подає середнє значення СІ. Коли використовують індивідуальний підхід, то СІ виводиться діленням середнього значення ДЗХ/на тварину в межах кожної групи, яку тестують, та групи позитивного контролю на середнє значення ДЗХ/на тварину для групи контролю розчинника. Середнє СІ для розчинника, який застосовують для контролю, становить тоді 1.

Використання індивідуального підходу для обчислення СІ робить можливим здійснення статистичного аналізу даних. При виборі підходящого методу статистичного аналізу, дослідник повинен знати про можливі відмінності у різних точках зору та інші пов'язані з цим проблеми, що можуть призвести до перетворення даних або статистичного аналізу, що не відповідає певним параметрам. Відповідний підхід до обробки даних - це оцінювання всіх індивідуальних даних, застосованих контролів та контролів розчинника та встановлення найбільш відповідної кривої реакції на дозу, враховуючи діапазон довіри (8)(12)(13). Проте, дослідник має бути попереджений про виникнення можливих "побічних" реакцій у окремих тварин в межах групи, що може викликати потребу у використанні альтернативного вимірювання реакції (наприклад, медіанного, а не середнього значення) або усунення побічного ефекту.

Вибір процесу, беручи до уваги позитивну реакцію, включає стимуляційний індекс >= 3 разом із врахуванням реакції на дозу та, за необхідності, значення статистичних даних (3)(6)(8)(12)(14).

Якщо необхідно пояснити отримані результати, слід звернути увагу на різноманітні властивості досліджуваної речовини із врахуванням того, чи вона має структурні взаємовідношення із відомими сенсибілізаторами шкіри, та те, чи це викликає надмірне подразнення шкіри і видимий характер реакції на дозу. Ці та інші точки зору детально обговорюються в іншому місці документу (7).

2. ДАНІ

Дані мають підсумовуватись у формі таблиць і показувати середнє та індивідуальне значення ДЗХ та стимуляційні індекси щодо кожної дози (включаючи контроль розчинника).

3. ЗВІТУВАННЯ

3.1. ЗВІТ ПРО ПРОВЕДЕННЯ ДОСЛІДЖЕННЯ

Звіт про проведення дослідження має містити наступну інформацію:

Тестована речовина:

- ідентифікаційні дані (напр. N РСХЮ за наявності джерело, чистоту, відомі домішки та номер партії),

- фізичну природу та фізико-хімічні властивості (напр. леткість, стабільність, розчинність),

- у випадку суміші склад та співвідношення компонентів у відсотках.

Розчинник:

- ідентифікаційні дані (чистота, концентрація (де необхідно); об'єм, що використовується),

- обґрунтування вибору розчинника.

Піддослідні тварини:

- порода мишей, які використовуються,

- мікробіологічний статус тварин, якщо відомо,

- число, вік та стать тварин,

- походження тварин, умови утримування, харчування та ін.

Умови проведення тесту:

- докладна інформація про приготування та застосування досліджуваної речовини,

- обґрунтування вибору доз, включаючи результати дослідження щодо визначення діапазону, якщо воно проводилось, середовища та концентрацій досліджуваної речовини, які використовувались та загальна кількість застосованої речовини,

- докладна інформація щодо якості їжі та води (включаючи джерело/тип харчування, джерело води).

Перевірка достовірності даних:

- короткий виклад результатів останньої перевірки, включаючи інформацію про речовину, концентрацію та розчинник, що використовується,

- дані одночасного та/чи історичного позитивного та негативного контролю для лабораторії, що проводить тестування.

Результати:

- індивідуальні маси тіла тварин на початку дозування та при запланованому знищенні тварин,

- таблиця середніх (об'єднаний підхід) та індивідуальних (індивідуальний підхід) значень ДЗХ, так само як і діапазон значень для обох підходів та індекси стимуляції для кожної дози (включаючи контроль розчинника),

- статистичний аналіз, де можливо,

- часовий перебіг початку та появи ознак токсичності, включаючи подразнення шкіри у місцях застосування, якщо вони є, для кожної тварини.

Обговорення результатів:

- короткий коментар про результати, аналіз реакції на дозу та статистичні аналізи, де потрібно, з висновком щодо того чи слід вважати тестову речовину сенсибілізатором (алергеном) для шкіри.

4. ПОСИЛАННЯ

(1) Kimber, I. and Basketter, D.A., (1992) The murine local lymph node assay; collaborative studies and new directions: A commentary. Food and Chemical Toxicology 30, p. 165-169.

(2) Kimber, I, Derman, R.J., Scholes E.W, and Basketter, D.A. (1994). The local lymph node assay: developments and applications. Toxicology, 93, p. 13-31.

(3) Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Basketter, D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E., Hastings, K.L., (1998) Assessment of the skin sensitisation potential of topical medicaments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise. Journal of Toxicology and Environmental Health, 53, p. 563-79.

(4) Testing Method B.6.

(5) Chamberlain, M. and Basketter, D.A., (1996) The local lymph node assay: status of validation. Food and Chemical Toxicology, 34, p. 999-1002.

(6) Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E., (1996) The local lymph node assay-A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests. Food and Chemical Toxicology, 34, p. 985-997.

(7) Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I., (1998) Strategies for identifying false positive responses in predictive sensitisation tests. Food and Chemical Toxicology. 36, p. 327-33.

(8) Van Och, F.M.M, Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J., Van Loveren, H., (2000) A quantitative method for assessing the sensitising potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employement of a regression method that includes determination of uncertainty margins. Toxicology, 146, p. 49-59.

(9) Dearman, R.J., Hilton, J., Evans, P., Harvey, P., Basketter, D.A. and Kimber, I., (1998) Temporal stability of local lymph node assay responses to hexyl cinnamic aldehyde. Journal of Applied Toxicology, 18, p. 281-4.

(10) National Institute of Environmental Health Sciences, (1999) The Murine Local Lymph Node Assay: A Test Method for Assessing the Allergic Contact Dermatitis Potential of Chemicals/Compounds: The Results of an Independent Peer Review Evaluation Coordinated by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICETAM). NIH Publication No: 99-4494, Research Triangle Park, N.C. (http://iccvam.niehs.nih.gov).

(11) Testing method B.4.

(12) Basketter, D.A., Selbie, E., Scholes, E.W. Lees, D. Kimber, I. and Botham, P.A., (1993) Results with OECD recommended positive control sensitisers in the maximisation, Buehler and local lymph node assays. Food and Chemical Toxicology, 31, p. 63-67.

(13) Basketter D.A., Lea L.J., Dickens A., Briggs D., Pate I., Dearman R.J., Kimber I., (1999) A comparison of statistical approaches to the derivation of EC3 values from local lymph node assay dose responses. J.Appl. Toxicology, 19, p. 261-266.

(14) Basketter D.A., Blaikie L., Derman R.J., Kimber I., Ryan C.A., Gerberick G.F., Harvey P., Evans P., White I.R. and Rycroft R.T.G., (2000) Use of local lymph node assay for the estimation of relative contact allergenic potency. Contact Dermatitis 42, p. 344-48.

B.43. ДОСЛІДЖЕННЯ НЕЙРОТОКСИЧНОСТІ НА ГРИЗУНАХ

1. МЕТОД

Цей метод еквівалентний методу, описаному у TI OECP 424 (1997).

Цей метод тестування був створений для отримання інформації, яка необхідна для підтвердження або подальшого визначення потенціалу нейротоксичності хімічних речовин на дорослих тваринах. Він може бути об'єднаний з існуючими методами тестування для повторного дослідження токсичності, або здійснюватись як окреме дослідження. Рекомендується ознайомитись з інструкцією OECP щодо стратегій та методів тестувань нейротоксичності (1), щоб допомагати у моделюванні дослідження, що розроблене на основі цього методу тестування. Це особливо важливо, якщо спостерігаються модифікації у спостереженнях та тестових процедурах, які рекомендуються для звичайного використання цього методу. Інструкція була підготовлена з метою полегшення вибору інших процедур тестування для використання за особливих умов.

Оцінювання нейротоксичності, що розвивається, не є об'єктом цього методу.

1.1. ВСТУП

При дослідженні та оцінці токсичних характеристик хімічних речовин важливо розглянути потенціал нейротоксичних впливів. Метод тестування системної токсичності після введення повторних доз включає спостереження, які демонструють потенціал нейротоксичності. Цей метод тестування може використовуватись з метою розробки дослідження для отримання подальшої інформації, або підтвердження нейротоксичних впливів, що спостерігались у дослідженні системної токсичності після введення повторних доз. Однак, розгляд потенційної нейротоксичності певних класів хімічних речовин може висунути припущення про те, що вони можуть бути визначені більш належним чином, використовуючи цей метод без урахування попередніх показників потенціалу нейротоксичності, отриманих з дослідження системної токсичності після введення повторних доз. Такі судження включають, наприклад:

- спостереження неврологічних показників або невропатологічних пошкоджень під час досліджень токсичності, окрім досліджень системної токсичності введення повторних доз, або

- структурні відносини чи іншу інформація, пов'язану з визначенням нейротоксикантів.

Окрім цього, можуть бути інші випадки, коли використання цього методу тестування може застосовуватись для подальшої інформації див. (1).

Цей метод був розроблений таким чином, щоб він міг бути пристосований, для того щоб відповідати особливим потребам для підтвердження особливої гістопатологічної та поведінкової нейротоксичності хімічної речовини, а також надати характеристику та кількісний підрахунок нейротоксичних реакцій.

В минулому, нейротоксичність прирівнювалась до невропатії, яка включає, невропатологічні розлади, такі як припадок, параліч та тремтіння. Хоча невропатія є важливим проявом нейротоксичності, на даний час вже виявлено, що існує багато інших ознак токсичності нервової системи (наприклад, втрата моторної координації, перцептивні дефіцити, розлади навчання та пам'яті), які можуть не бути відображені у невропатії або в інших видах досліджень.

Цей метод тестування нейротоксичності розроблений для виявлення основних впливів на нервову поведінку та невропатологічних впливів у дорослих гризунів. Тоді як вплив на поведінку, навіть за відсутності морфологічних змін, може мати шкідливий вплив на весь організм, не всі зміни у поведінці є характерними для нервової системи. Отже, будь-які зміни, які спостерігаються, мають оцінюватись разом з корелятивними гістопатологічними, гематологічними чи біохімічними даними, так само як і разом з даними про інші види системної токсичності. Призначенням тестування в цьому методі є надання характеристики та кількісної оцінки нейротоксичних реакцій, включаючи специфічні процедури з гістопатології та вивчення поведінки, які надалі можуть бути доведеними електрофізичними та/чи біохімічними дослідженнями (1)(2)(3)(4).

Нейротоксиканти можуть діяти на декілька мішеней в межах нервової системи та за допомогою різних механізмів. Оскільки не існує єдиного порядку проведення тестів, які могли б надати остаточну оцінку нейротоксичного потенціалу всіх речовин, може вникнути необхідність у використанні інших in vivo чи in vitro тестів, специфічних для типу нейротоксичності, яка спостерігається або передбачається.

Цей метод тестування може також використовуватись разом з інструкціями, встановленими в методичних вказівках OECP щодо стратегій та методів тестувань нейротоксичності (1) для розробки досліджень, що призначаються для подальшого опису або збільшення кількісних характеристик чутливості в залежності реакції на дози, для того, щоб краще оцінити невидимий рівень шкідливого впливу чи підтвердити відомі дані або дані, що припускаються, щодо небезпеки хімічної речовини. Наприклад, дослідження може бути розроблене для ідентифікації та визначення нейротоксичного механізму(ів) або доповнювати вже існуючі дані, які вже були отримані на основі спостереження за процедурами в невропатології та вивченні поведінки. Такі дослідження не потребують повторних даних, які були отримані під час використання стандартних процедур, які рекомендуються в цьому методі, за умови, що такі дані вже є наявними та не вважаються необхідними для обробки результатів дослідження.

Це дослідження нейротоксичності, якщо воно використане само по собі або у поєднанні з іншими методами, надає інформацію, яка може:

- визначити чи нервова система вражається постійно чи реверсивно досліджуваною хімічною речовиною;

- зробити внесок до характеристики змін в нервовій системі, які пов'язано з експозицією до хімічної речовини та розуміння основного механізму;

- визначити залежність реакції від дози та часу для того, щоб оцінити невидимий рівень шкідливого впливу (який можна використати для того, щоб встановити критерії безпеки для хімічної речовини).

Цей тестовий метод використовує пероральне застосування тестованої речовини. Інші шляхи застосування (наприклад, через шкіру чи інгаляцію) теж можуть використовуватись та можуть потребувати зміни у рекомендованих процедурах. Підстави для вибору шляху застосування залежать від результатів людської експозиції та наявної токсикологічної чи кінетичної інформації.

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ

Шкідливий вплив: це будь-яка зміна, пов'язана із застосуванням речовини від основного значення, яка зменшує здатність організму до виживання, відтворення та пристосування до навколишнього середовища.

Доза: це кількість застосованої речовини, яку тестують. Доза виражається як маса (г, мг) або як маса тестованої речовини на одиницю ваги піддослідної тварини (напр. мг/кг), або як постійні дієтичні концентрації (ppm).

Дозування: це загальний термін, що включає дозу, її частоту та тривалість прийому дози.

Нейротоксичність: це шкідлива зміна в структурі або функції нервової системи, яка є наслідком експозиції до хімічної речовини, біологічного чи фізичного агенту.

Нейротоксикант: це будь-який хімічний, біологічний чи фізичний агент, який має потенціал викликання нейротоксичності.

NOAEL: це абревіатура для відсутнього рівня шкідливого впливу, та є найвищим рівнем дози, за якої не спостерігаються явища, пов'язані із застосуванням речовини.

1.3. ПРИНЦИП МЕТОДУ ТЕСТУВАННЯ

Досліджувану хімічну речовину вводять перорально у різних дозах семи групам піддослідних гризунів. Зазвичай, повторні дози є необхідними, а період введення дози може тривати 28 днів, підхронічний (90 днів), чи хронічний (1 рік або довше). Процедури, встановлені в цьому тестовому методі, можуть також використовуватись для дослідження гострої нейротоксичності. Тварин тестують з метою виявлення та характеристики аномалій у поведінці та/чи неврології. Вияви поведінки, на які можуть вплинути нейротоксиканти, оцінюються під час періоду спостереження. По закінченню тесту, підгрупа тварин кожної статі та кожної групи оббризкується in situ, далі готуються та досліджуються ділянки головного мозку, спинного мозку та периферійні нерви.

Коли дослід проведено в якості стандартного одиночного дослідження в галузі нейротоксикології чи з метою характеристики нейротоксичних впливів, тварини в кожній групі, які не використовувались для оббризкування та подальшої гістопатології (див. Таблицю 1), можуть бути використані для окремих процедур у галузі вивчення поведінки, невропатології, нейрохімії та електрофізіології, що може доповнити дані, отримані зі стандартних досліджень, проведення яких вимагає цей метод (1). Ці додаткові процедури можуть бути особливо корисними, якщо емпіричні спостереження, або прогнозовані впливи вказують на особливий тип або мішень нейротоксичності хімічної речовини. В якості альтернативи, тварин, які залишилися, можна використати для оцінювань, таких як досліджень токсичності повторної дози у гризунів.

Коли процедури цього методу тестування поєднуються з процедурами інших методів, то необхідна достатня кількість тварин, щоб задовольнити вимоги, висунуті до спостережень в обох дослідженнях.

1.4. ОПИС МЕТОДУ ТЕСТУВАННЯ

1.4.1. Вибір виду тварин

Біологічний вид гризунів, якому надається перевага, це щур, хоча інші види гризунів, за умови обґрунтування, теж можуть використовуватись. Слід використовувати піддослідні породи молодих дорослих здорових тварин, які зазвичай використовуються. Особини жіночої статі мають бути невагітними та такими, що ще не народжували. Введення дози має відбуватися якнайшвидше після відривання від грудей, коли тваринам виповнилося шість тижнів, та, в будь-якому випадку, до того як тваринам виповниться дев'ять тижнів. Однак, коли це дослідження поєднується з іншими дослідженнями, то ці вікові вимоги можуть потребувати погодження. На початку дослідження коливання маси тіла тварин, які використовуються, не мають перевищувати +- 20% середньої маси тіла кожної статі. Коли проводиться короткотривале дослідження повторної дози в якості попереднього до довготривалого дослідження, мають використовуватись тварини однієї породи та з одного джерела в обох дослідженнях.

1.4.2. Умови утримування та годування тварин

Температура у кімнаті, де знаходяться піддослідні тварини, має становити 22 град.C (+- 3 град.C). Хоча відносна вологість повинна бути принаймні 30% та бажано не перевищувати 70%, крім прибирання приміщення, оптимальним значенням є 50-60%. Освітлення має бути штучним, в послідовності - 12 год. світла, 12 год. темряви. Голосний переривчастий шум повинен утримуватись на мінімумі. Для годування, можуть використовуватись стандартна лабораторна їжа із необмеженою кількістю води. На вибір їжі може впливати потреба забезпечити відповідну домішку речовини, яка тестується цим методом. Тварини можуть утримуватись в клітках окремо, або невеликими групами однієї статі.

1.4.3. Підготовка тварин

Здорових молодих тварин навмання обирають до піддослідних та контрольних груп. Клітки повинні бути розташовані таким чином, щоб мінімізувати можливі впливи їх розташування. Тварини ідентифікуються індивідуально та утримуються у своїх клітках щонайменше протягом (5) п'яти днів до початку дослідження з метою надання їм можливості пристосуватися до лабораторних умов.

1.4.4. Спосіб застосування та приготування доз

Цей метод тестування зокрема передбачає пероральне застосування досліджуваної речовини. Пероральне введення може проводитись через шлунковий зонд, шляхом додавання до їжі, до питної води або через капсули. Інші способи введення (напр., через шкіру або шляхом інгаляції) можуть використовуватись, але можуть потребувати змін рекомендованих процедур. Підстави для вибору способу введення залежать від графічного зображення результатів людської експозиції та наявної інформації в галузі токсикології чи кінетики. Обґрунтування вибору способу введення речовини, так само як і зміни до процедур у результаті цього методу тестування, повинні також вказуватись.

За необхідністю, речовина, яка тестується, може бути розчинена або суспендована у відповідному середовищі. Рекомендується, щоб використання водного розчину/суспензії аналізувалось спочатку та супроводжувалось аналізом розчину/суспензії в маслі (наприклад, у кукурудзяному маслі), а потім можливим розчином/суспензією в іншому розчиннику. Токсичні характеристики розчинника повинні бути відомими. Окрім того, аналіз повинен надаватись щодо наступних характеристик розчинника: впливи розчинника на поглинання, розподіл, метаболізм або утримання досліджуваної речовини, які можуть змінити свої токсичні характеристики; та впливати на споживання їжі або води, або стан харчування тварин.

1.5. ПРОЦЕДУРИ

1.5.1. Кількість та стать тварин

Коли дослідження проведено в якості окремого дослідження, щонайменше 20 тварин (10 особин жіночої статі та 10 особин чоловічої статі) мають використовуватися у кожній групі з приймання дози та кожній контрольній групі з метою оцінювання детальних клінічних та функціональних спостережень. Щонайменше п'ять особин чоловічої статі та п'ять особин жіночої статі повинні обприскуватись in situ та використовуватись для проведення детальної нейрогістопатології наприкінці дослідження. В тих випадках, коли обстежується на ознаки нейротоксичних впливів лише обмежена кількість тварин у даній групі дозування, включення цих тварин до тих, що були обрані для обприскування, має обмірковуватися. Коли дослідження проводиться у поєднанні з дослідженням токсичності після прийому повторної дози, відповідна кількість тварин має використовуватись з метою виконання цілей обох досліджень. Мінімальна кількість тварин у групі для різноманітних поєднань досліджень представлена у Таблиці 1. Якщо плануються попередні знищення тварин або формування відновлюючих груп для спостереження оборотності, стійкості або появи з затримкою токсичних впливів та планується подальша обробка, або коли враховуються додаткові спостереження, кількість тварин потрібно збільшити з метою забезпечення наявної кількості тварин, яке необхідне для дослідження та гістопатології.

1.5.2. Група обробки та контролю

Щонайменше три групи дозування та одна контрольна група мають, як правило, використовуватись, але якщо в оцінюванні інших даних не очікується жодних впливів при повторній дозі 1 000 мг/кг маси тіла/на день, то може проводитись тестування на визначення граничного вмісту.

Якщо відповідні дані відсутні, то може проводитись дослідження на визначення діапазону вимірювання, щоб допомогти у визначенні доз, які потрібно використовувати. За виключенням випадків, коли використовують тестовану речовину, тварин у контрольній групі потрібно використовувати в однаковий спосіб по відношенню до особин піддослідної групи. Якщо ж розчинник використовується у застосуванні досліджуваної речовини, то контрольна група повинна отримувати розчинник у найвищому використовуваному об'ємі.

1.5.3. Перевірка надійності отриманих результатів

Лабораторія, яка проводить дослідження, повинна представити дані, які показують її спроможність провести дослідження та показати чутливість використаних процедур. Такі дані мають надавати підтвердження здатності виявити та визначити кількість, де необхідно, змін в різних кінцевих точках, які рекомендуються для спостереження, таких як автономні показники, сенсорна реактивність, міцність хватки кінцівок та моторна активність. Інформацію про хімічні речовини, які спричиняють різні види нейротоксичних реакцій та можуть використовуватись, як речовини для позитивного контролю, можна знайти в посиланнях від 2 до 9. Історичні дані можуть використовуватись, якщо основні аспекти експериментальних процедур залишаються незмінними. Рекомендується періодичне оновлення історичних даних. Потрібно розробляти нові дані, що показують тривалу чутливість процедур, коли якусь основну складову проведення тесту або процедур було змінено лабораторією, яка його здійснює.

1.5.4. Вибір дози

Рівні дозувань потрібно обирати із врахуванням будь-яких токсичних та кінетичних даних, які спостерігались раніше, та є наявними для складового компоненту тесту або пов'язаних з ним матеріалів. Потрібно обирати найвищий рівень дози з метою стимулювання нейротоксичних впливів або усунення системних токсичних впливів. Після того, потрібно обрати спадну послідовність рівнів дозувань для того, щоб показати будь-які реакції, пов'язані з дозуванням та відсутністю шкідливого впливу (NOAEL) при найнижчому рівні дозування. В принципі, рівні дозувань потрібно встановлювати таким чином, щоб початкові токсичні впливи на нервову систему можна було відрізнити від впливів, пов'язаних із системною токсичністю. Від двох до трьох інтервалів, зазвичай, є оптимальним, а додаванню четвертої піддослідної групи зазвичай надається перевага при використанні дуже великих інтервалів (наприклад, більше ніж фактор 10) між дозами. У випадку прогнозування експозиції людини, цей факт також слід враховувати.

1.5.5. Тест на визначення граничної межі

Якщо при дослідженні на одному рівні дозування щонайменше 1 000 мг/кг маси тіла/на день, з використанням вищеописаних процедур, не було виявлено помітних нейротоксичних впливів, та якщо токсичність не очікується на основі даних структурно пов'язаних компонентів, тоді проведення розгорнутого дослідження з використанням трьох рівнів доз може не вважатися необхідним. Очікувана людська експозиція може вказувати на потребу у використанні вищого рівня пероральної дози при проведенні тесту на визначення граничної межі. Що стосується інших видів застосування, таких як інгаляція або нанесення на шкіру, фізико-хімічні властивості досліджуваної речовини, часто можуть вказувати на максимально досяжний рівень експозиції. Для проведення дослідження на гостру реакцію внаслідок перорального прийому доза для тесту на визначення граничної межі має становити щонайменше 2 000 мг/кг.

1.5.6. Застосування доз

Тваринам вводять дозами речовину, яку тестують, щоденно, сім днів на тиждень, протягом періоду щонайменше 28 днів; використання п'ятиденного режиму застосування або коротшої експозиції потребує підтвердження. Коли речовина, яку тестують, вводиться через шлунковий зонд, це потрібно робити однією дозою, використовуючи шлункову трубку або відповідний інкубаційний катетер. Максимальний об'єм рідини, який можна вводити за один раз, залежить від розмірів піддослідних тварин. Об'єм не повинен перевищувати 1 мл/100 г маси тіла. Однак, у випадку водних розчинів, можна розглянути використання до 2 мл/100 г маси тіла. За виключенням подразнюючих чи роз'їдаючих речовин, які зазвичай виявляють загострені впливи за високих концентрацій, варіативність об'ємів слід максимально зменшити шляхом регулювання концентрацій з метою забезпечення постійного об'єму на всіх рівнях дозувань.

Для речовин, введених з їжею або питною водою, важливо забезпечити, щоб кількості досліджуваної речовини не впливали на нормальне харчування чи водний баланс. Коли тестована речовина вводиться з їжею, може використовуватись або постійна концентрація їжі (ppm), або постійний рівень дози в залежності від маси тіла тварин; має бути вказана використана альтернатива. Для речовини, введеної через шлунковий зонд, дози повинні вводитись в один і той же час, та регулюватись, оскільки необхідно підтримувати постійний рівень дози в залежності від маси тіла. У випадках, коли дослідження введення повторної дози проводиться в якості попереднього дослідження до довготривалого дослідження, то слід використовувати однаковий режим харчування в обох дослідженнях. Для дослідження гострих впливів, якщо використання одноразової дози є неможливим, дозу вводити меншими порціями протягом періоду, що не перевищує 24 години.

1.6. ДАНІ СПОСТЕРЕЖЕНЬ

1.6.1. Частота спостережень та тестів

В дослідженнях повторних доз, період спостереження повинен охоплювати період дозування. В дослідженні на виявлення гострих впливів, потрібно дотримуватись 14-ти денного періоду після обробки. Для тварин у супутніх групах, які утримуються без експозиції під час періоду після обробки, спостереження мають так само охоплювати цей період.

Спостереження мають виконуватись з достатньою частотою, щоб максимізувати можливість виявлення будь-яких неврологічних аномалій та/чи відхилень у поведінці. Спостереження повинні здійснюватись бажано в один і той же час кожного дня, враховуючи період піку передбачених явищ після введення дози. Частота клінічних спостережень та функціональних тестів коротко викладені у Таблиці 2. Якщо кінетичні або інші дані, узагальнені з попередніх досліджень, вказують на потребу використання різних відрізків часу для спостереження, періодів проведення тестів, та спостережень після проведення тестів, потрібно слід затвердити альтернативний графік для того, щоб отримати максимум інформації. Також мають наводитись обґрунтування для зміни графіку проведення досліджень.

1.6.1.1. Спостереження за загальним станом здоров'я та смертністю

Всіх тварин потрібно ретельно оглядати принаймні один раз щоденно для виявлення їхнього стану здоров'я, так само як і двічі щоденно з метою виявлення захворювань та смертності.

1.6.1.2. Деталізовані клінічні спостереження

Деталізовані клінічні спостереження мають проводитись на всіх тваринах, обраних з цією метою (див. Таблицю 1) один раз перед першою експозицією (щоб надати можливість порівняння в межах предмету дослідження) та відтак при різних інтервалах, залежно від тривалості дослідження (див. Таблицю 2). Деталізовані клінічні спостереження супутніх груп, що відновлюються, мають здійснюватись наприкінці відновлювального періоду. Деталізовані клінічні огляди повинні проводитись за межами клітки, де утримуються тварини, на стандартній площині. Їх потрібно уважно записувати, використовуючи системи оцінки та шкали оцінок для кожного вимірювання під час огляду. Використані критерії або шкали повинні бути чітко визначені лабораторією, яка проводить дослідження. Слід докладати зусиль для забезпечення того, щоб варіювання умов тестування було мінімальним (не обов'язково систематично пов'язане з дослідженням), та щоб спостереження проводились кваліфікованими дослідниками, які не були ознайомлені з результатами цього дослідження.

Рекомендується проводити огляди у структурованій формі, у якій точно визначені критерії (включаючи визначення звичайного "діапазону") застосовуються систематично до кожної тварини під час кожного періоду огляду. "Звичайний діапазон" повинен мати відповідне документальне підтвердження. Всі потрібно записувати ознаки, які спостерігались. За можливістю, потрібно записувати діапазон показників, які спостерігаються. Клінічні спостереження але включати, але не обмежуватися, змінами шкіри, хутра, очей, слизистої оболонки, появою секреції та екскреції та активності вегетативної нервової системи (напр., сльозоточивість, пілоерекція, розміри зіниці, незвичний характер дихання та/чи дихання ротом, будь-які незвичні явища сечовипускання та випорожнення та знебарвлена сеча).

Будь-які незвичні реакції відповідно до положення тіла, рівня активності (наприклад, зменшення або збільшення дослідження звичайної площі) та координації рухів, мають також записуватись. Зміни ходи (наприклад, хода перевальцем, атаксія (розлад координаційних рухів), стан (наприклад, горбань) та реактивність маніпулювання, розміщення, або інші стимули навколишнього середовища, так само як і присутність клонічних або тонізуючих рухів, судом або тремтіння, стереотипи (наприклад, надмірне чищення, незвичні рухи головою, повторний рух по колу) або дивна поведінка (кусання або надлишкове облизування, завдання ушкоджень особинам того самого виду, рух у зворотному напрямку, подавання звуків) або агресія повинні записуватись.

1.6.1.3. Функціональні тести

Подібно до деталізованих клінічних спостережень, функціональні тести повинні проводитись один раз перед експозицією та часто стосовно всіх тварин, обраних з цією метою (див. Таблицю 1). Частота функціонального тестування також залежить від тривалості дослідження (див. Таблиця 2). Окрім періодів дослідження, як встановлено у Таблиці 2, функціональні спостереження за супутніми відновлювальними групами також мають здійснюватись наскільки це можливо до остаточного знищення. Функціональні тести повинні включати сенсорну реактивність до стимулів різних видів (наприклад, слухових, візуальних, пропріоцептивних стимулів (5)(6)(7)), оцінку сили хватки (8) та оцінювання моторної активності (9). Моторна активність має вимірюватись автоматичним приладом, який здатний виявити як зменшення, так і збільшення активності. Якщо використовується інша визначена система, вона має бути кількісною, та має бути продемонстровано її чутливість та надійність. Кожен прилад слід протестувати, щоб забезпечити достовірність у часі та послідовності з'єднання між приладами. Подальша інформація щодо процедур, яких можна дотримуватися, наведена у відповідних посиланнях. Якщо дані відсутні (наприклад, дані щодо структурна-активності, епідеміологічні дані та інші токсикологічні дослідження), з метою визначення потенціалу нейротоксичних впливів, слід проаналізувати включення більш спеціалізованих тестів на сенсорну та моторну функцію або на процеси навчання та пам'яті, з метою проведення більш деталізованого дослідження можливих впливів. Більше інформації про більш спеціалізовані тести та їхнє застосування наведені у (1).

Виключно ті тварини, які проявляють ознаки токсичності, які завдають значного впливу на перебіг функціонального тесту, можуть бути виключені з цього тесту. Слід навести обґрунтування для виключення тварин з функціонального тесту.

1.6.2. Маса тіла та споживання води/їжі

Для досліджень, які тривають до 90 днів, всіх тварин слід зважувати принаймні раз на тиждень та слід вимірювати кількість спожитої їжі (споживання води, коли досліджувана речовина вводиться через цей спосіб) принаймні щотижня.

Для довгострокових досліджень, всіх тварин потрібно зважувати принаймні один раз на тиждень протягом перших 13 тижнів та з інтервалом щонайменше кожні чотири тижня після цього. Потрібно вимірювати споживання їжі (споживання води, коли тестована речовина вводиться у цей спосіб) щонайменше щотижнево протягом перших 13 тижнів і потім з інтервалом приблизно три місяці, якщо зміни стану здоров'я чи маси тіла не вмагатимуть іншого.

1.6.3. Офтальмологія

Для досліджень з тривалістю, що перевищує 28 днів, офтальмологічне дослідження з використанням офтальмоскопа або рівноцінного підходящого інструменту має проводитися перед застосуванням досліджуваної речовини, та по закінченні дослідження, бажано на всіх тваринах, але принаймні на тваринах з груп з високими дозами та контрольними групами. Якщо виявлено зміни в очах або, якщо клінічні ознаки вказують на потребу, то всіх тварин потрібно обстежити. Для довготривалих досліджень, офтальмологічна перевірка має також проводитись протягом 13 тижнів. Офтальмологічні дослідження не потрібно проводити, якщо ці дані вже наявні з інших досліджень такою ж тривалістю та рівнями застосування доз.

1.6.4. Гематологія і клінічна біохімія

Коли проводиться дослідження нейротоксичності в поєднанні з дослідженням системної токсичності повторних доз, гематологічні випробовування та клінічні біохімічні визначення повинні проводитися так як визначено у відповідному методі дослідження системної токсичності. Забір зразків має здійснюватись таким чином, щоб мінімізувати будь-які потенціальні впливи на нервову поведінку.

1.6.5. Гістопатологія

Нейропатологічне дослідження має бути розроблене таким чином, щоб доповнювати та розширювати спостереження, зроблені під час фази дослідження in vivo. Тканини щонайменше п'яти тварин/статей/груп (див. Таблицю 1 та наступний пункт) повинні фіксуватись in situ, використовуючи загальновизнані техніки оббризкування та фіксації (див. посилання 3, розділ 5 та посилання 4, розділ 50). Потрібно записувати будь-які помітні значні зміни. Коли дослідження проводиться як незалежне дослідження, перевірка на нейротоксичність або характеристика нейротоксичних впливів, решта тварин можє використовуватись або для окремих процедур досліджень поведінки (10)(11), для окремих нейропатологічних досліджень (10)(11)(12)(13) та для окремих нейрохімічних досліджень (10)(11)(14)(15) або електрофізичних досліджень (10)(11)(16)(17), які можуть доповнити процедури та дослідження, описані у цьому пункті, або збільшити кількість суб'єктів перевірених на гістопатологію. Ці додаткові процедури мають окреме застосування, коли емпіричні спостереження або передбачені ефекти вказують на особливий тип чи мішень нейротоксичності (2)(3). В якості альтернативи, решта тварин можуть також використовуватись для звичайних патологічних оцінювань, як описано в методі дослідження при застосуванні повторних доз.

Загальна процедура фарбування, така як гематоксилін та еозін (H & E), повинна проводитись на всіх зразках тканин, покритих парафіном та повинно бути проведене здійснюватись мікроскопічне дослідження. Якщо спостерігаються, або очікуються, то повинні досліджуватись пластикові зразки периферійної нервової тканини. Клінічні ознаки можуть теж надавати додаткові питання для дослідження використання спеціальних процедур фарбування. Інструкція по дослідженню додаткових питань наведена у (3)(4). Відповідні специфічні барвники, що представляють особливі види патологічних змін, можуть також стати в нагоді (18).

Зразки частин центральної та периферійної нервової системи повинні перевірятись шляхом проведення гістологічних досліджень (див. посилання 3, розділ 5 та посилання 4, розділ 50). Ділянки, які досліджуються, мають, як правило, включати: передній мозочок, центр головного мозку, в тому числі ділянку амонового рогу, середній мозочок, мозочок, варолієві мости, кістковий мозок, око з оптичним нервом та сітчаткою, спинний мозок на шийних та крижних випуклостях, нервові ганглії дорсального кореня та черевні волокна, найближчий сідничний нерв, найближчий тибіальний нерв (на коліні) та тибіальний нерв відгалужень м'язів. Спинний мозок та периферійні ділянки нервів повинні включати як перехресні або поперечні, так і ділянки довготи. Слід звернути увагу на судини нервової системи. Зразок скелетної мускулатури, особливо м'язи теляти, потрібно також дослідити. Особливу увагу також слід звернути на боки з клітинною та волокнистою структурою та зразок у CNS та PNS, відомий як той, що особливо вразливий до нейротоксикантів.

Інструкція щодо нейропатологічних змін які, зазвичай, є результатом піддавання впливу токсиканта можна знайти у посиланнях (3)(4). Покрокове дослідження зразків тканин рекомендується для тих ділянок, де частини груп з високою дозою порівнюються спочатку зі зразками з інших груп, послідовний аналіз не вимагається. Якщо невропатологічні зміни спостерігаються у групах з високою дозою, то зразок кожної потенційно ураженої тканини з груп з середньою та низькою дозою повинні бути закодовані та досліджені в подальшому.

Якщо виявлено будь-які докази невропатологічних змін у кількісному дослідженні, слід провести друге дослідження на всіх ділянках нервової системи із демонстрацією цих змін. Зрізи для аналізу з кожної групи дозування з потенційно вражених ділянок мають кодуватись та досліджуватись навмання, не беручи до уваги інформацію про код. Частота та тяжкість кожного пошкодження мають записуватись. Після проведення оцінки на всіх ділянках груп дозування, код може бути зламано, і здійснено статистичний аналіз з метою визначення співвідношення реакції та дози. Приклади різних ступенів тяжкості пошкодження потрібно описувати.

Невропатологічні дані мають бути оцінені у контексті спостережень за змінами у поведінці та вимірювань, так само як і інші дані з попередніх та супутніх досліджень системної токсичності тестованої речовини.

2. ДАНІ

2.1. ОБРОБКА РЕЗУЛЬТАТІВ

Індивідуальні дані повинні надаватись. Додатково, всі дані повинні підсумовуватись у формі таблиці і показувати для кожного тесту чи контрольної групи, кількість тварин на початку досліду, кількість тварин, які померли під час тесту або були вбиті з гуманістичних міркувань, кількість ознак токсичності, опис ознак токсичності, які спостерігались, включаючи початок, тривалість, вид та тяжкість пошкодження(нь).

2.2. ОЦІНКА ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

Результати дослідження мають оцінюватись з точки зору сфери впливу, тяжкості та співвідношення явищ, що спостерігаються у нервовій поведінці та невропатологічних явищ (нейрохімічні чи електрофізіологічні явища, а також додаткові дослідження мають враховуватись) та будь-які інші шкідливі впливи, які спостерігались. Якщо можливо, то результати, виражені у цифровій формі, повинні оцінюватись належним чином та, як правило, із використанням прийнятного статистичного методу. Статистичні методи слід обирати під час розробки дослідження.

3. ЗВІТУВАННЯ

3.1. ЗВІТ ПРО ПРОВЕДЕННЯ ДОСЛІДЖЕННЯ

Звіт про проведення дослідження має містити наступну інформацію:

Досліджувана речовина:

- фізичні властивості (включаючи ізомерію, чистоту та фізико-хімічні властивості),

- ідентифікаційні дані.

Розчинник (у випадку використання):

- підтвердження вибору розчинника.

Піддослідні тварини:

- вид/порода, яку використовують,

- кількість, вік та стать тварин,

- джерело, умови утримування, акліматизація та ін.,

- індивідуальна вага тварин на початку тесту.

- Умови тесту: детальна інформація щодо приготування їжі та складу досліджуваної речовини, отримана концентрація, стабільність та гомогенність приготування,

- детальний опис дозувань, які застосовуються, включаючи детальну інформацію про розчинник, об'єм та фізичну форму матеріалу, який використовують,

- деталі застосування досліджуваної речовини

- обґрунтування обраних рівнів дозувань,

- обґрунтування напряму та тривалості піддавання дії,

- перехід від концентрації дієтичної/питної води в досліджуваній речовині (ppm) до фактичної дози (мг/кг маси тіла/день), якщо застосовується,

- деталі якості їжі та води.

Спостереження та процедури дослідження:

- докладна інформація про розподіл тварин в кожній групі на підгрупи перфузії,

- деталі систем категоризації, включаючи критерії та шкали балів для кожного вимірювання у детальних клінічних спостереженнях,

- деталі функціональних тестів на сенсорну реакційну спроможність щодо стимулів різних видів (наприклад, слухових, візуальних, та пропріоцептивних) для оцінки міцності хватки, моторної активності (включаючи деталі автоматичних приладів які виявляють їх активність), та інші процедури, які використовуються,

- деталі офтальмологічних дослідів та, якщо застосовуються, гематологічних досліджень і клінічних біохімічних тестів з релевантними базовими значеннями,

- деталі конкретних нейробіхевіоральних, невропатологічних, нейрохімічних або електрофізичних процедур.

Результати:

- маса тіла/зміна ваги, включаючи масу тіла при знищенні,

- споживання їжі та води, відповідно,

- дані токсичної реакції за статтю та рівнем дози, включаючи ознаки токсичності або смертності,

- природа, суворість, тривалість (час початку та подальший перебіг) клінічних спостережень (оборотний чи ні),

- детальний опис всіх результатів функціональних тестів,

- результати автопсії,

- детальний опис всіх нейробіхевіоральних, невропатологічних або електрофізичних даних, якщо вони доступні,

- дані про поглинання та метаболізм, якщо наявні,

- статистична обробка результатів, де необхідно.

Обговорення результатів:

- інформація про реакцію на дозування;

- відношення будь-яких інших токсичних явищ до висновку щодо нейротоксичного потенціалу хімікату, який тестують.

- рівень, за якого шкідливого впливу не спостерігається.

Висновки:

- конкретна заява про загальну нейротоксичність речовини, яку тестують, заохочується.

4. ПОСИЛАННЯ

(1) OECD Giudance Document on Neurotoxicity Testing Strategies and Test Methods. OECD, Paris, In Preparation.

(2) Test Guideline for a Developmental Neurotoxicity Study, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. In preparation.

(3) World Health Organisation (WHO) (1986) Environmental Health Criteria document 60: Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity associated with Exposure to Chemicals.

(4) Spencer, P.S. and Schaumburg, H.H. (1980) Experimental and Clinical Neurotoxicology. Eds. Spencer, P.S. and Schaumburg, H.H. eds. Williams and Wilkins, Baltimore/London.

(5) Tupper, D.E. and Wallace, R.B., (1980) Utility of the Neurological Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp., 40, p. 999-1003.

(6) Gad, S.C., (1982) A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J. Toxicol. Environ. Health, 9, p. 691-704.

(7) Moser, V.C., McDaniel, K.M. and Phillips, P.M., (1991) Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of amitraz. Toxic. Appl. Pharmacol., 108, p. 267-283.

(8) Meyer, O.A., Tilson, H.A., Byrd, W.C. and Riley, M.T., (1979) A Method for the Routine Assessment of Fore- and Hind- limb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol., 1, p. 233-236.

(9) Crofton, K.M., Haward, J.L., Moser, V.C., Gill, M.W., Reirer, L.W., Tilson, H.A. and MacPhail, R.C. (1991) Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13, p. 599-609.

(10) Tilson, H.A., and Mitchell, C.L. eds., (1992) Neurotoxicology Target Organ Toxicology Series. Raven Press, New York.

(11) Chang, L.W., ed., (1995) Principles of Neurotoxicology. Marcel Dekker, New York.

(12) Broxup, B., (1991) Neuopathology as a screen for Neurotoxicity Assessment. J. Amer. Coll. Toxicol., 10, p. 689-695.

(13) Moser, V.C., Anthony, D.C., Sette, W.F. and MacPhail, R.C., (1992) Comparison of Subchronic Neurotoxicity of 2-Hydroxyethyl Acrylate and Acrylamide in Rats. Fund. Appl.Toxicol., 18, p. 343-352.

(14) O'Callaghan, J.P. (1988). Neurotypic and Gliotypic Proteins as Biochemical Markers of Neurotoxicity. Eurotoxicol. Teratol., 10, p. 445-452.

(15) O'Callaghan J.P. and Miller, D.B., (1988) Acute Exposure of the Neonatal Rat to Triethyltin Results in Persistent Changes in Neurotypic and Gliotypic Proteins. J. Pharmacol. Exp. Ther., 244, p. 368-378.

(16) Fox D.A., Lowndes, H.E. and Birkamper, G.G., (1982) Electrophysiological Techniques in Neurotoxicology. In: Nervous System Toxicology. Mitchell, C.L. ed. Raven Press, New York, p. 299-335.

(17) Johnson, B.L., (1980) Electrophysiological Methods in neurotoxicity Testing. In: Experimental and Clinical Neurotoxicology. Spencer, P.S. and Schaumburg, H.H. eds., Williams and Wilkins Co., Baltimore/ London, p. 726-742.

(18) Bancroft, J.D. and Steven A., (1990) Theory and Pratice of Histological Techniques. Chapter 17, Neuropathological Techniques. Lowe, James and Cox, Gordon eds. Churchill Livingstone.

Таблиця 1

Мінімальні кількості тварин на групу, коли дослідження на нейротоксичність проводиться окремо, або в поєднанні з іншими дослідженнями

-------------------------------------------------------------------------------
|                          |   ДОСЛІДЖЕННЯ НЕЙРОТОКСИЧНОСТІ ПРОВОДИТЬСЯ ЯК:   |
|                          |--------------------------------------------------|
|                          |Окреме     |Комбіноване |Комбіноване |Комбіноване |
|                          |дослідження|дослідження |дослідження |дослідження |
|                          |           |з 28-ми     |з 90-денним |з           |
|                          |           |денним      |дослідженням|дослідженням|
|                          |           |дослідженням|            |на хронічну |
|                          |           |            |            |токсичність |
|--------------------------+-----------+------------+------------+------------|
|Загальна кількість тварин |10 самців  |10 самців та|15 самців   |25 самців та|
|на групу                  |та 10 самок|10 самок    |15 самок    |25 самок    |
|--------------------------+-----------+------------+------------+------------|
|Кількість тварин обраних  |10 самців  |10 самців та|10 самців та|10 самців та|
|для функціонального       |та 10 самок|10 самок    |10 самок    |10 самок    |
|тестування включаючи      |           |            |            |            |
|клінічні спостереження    |           |            |            |            |
|--------------------------+-----------+------------+------------+------------|
|Кількість тварин обраних  |5 самців та|5 самців та |5 самців та |5 самців та |
|для оббризкування in situ |5 самок    |5 самок     |5 самок     |5 самок     |
|та нейрогістопатології    |           |            |            |            |
|--------------------------+-----------+------------+------------+------------|
|Кількість тварин для      |           |5 самців та |10 самців * |20 самців * |
|спостережень повторних    |           |5 самок     |та          |та          |
|доз/субхронічної/хронічної|           |            |10 самок *  |20 самок *  |
|токсичності, гематології, |           |            |            |            |
|клінічної біохімії,       |           |            |            |            |
|гістопатології та ін. як  |           |            |            |            |
|визначено у відповідних   |           |            |            |            |
|Інструкціях               |           |            |            |            |
|--------------------------+-----------+------------+------------+------------|
|Додаткові спостереження,  |5 самців та|            |            |            |
|якщо використовуються     |5 самок    |            |            |            |
|-----------------------------------------------------------------------------|
|* Включає 5 тварин обраних для функціонального тестування та детальних       |
|клінічних спостережень як частина дослідження нейротоксичності.              |
-------------------------------------------------------------------------------

Таблиця 2

Частота клінічних спостережень та функціональних тестів

---------------------------------------------------------------------------------------------
|            Вид спостережень             |              Тривалість дослідження             |
|                                         |-------------------------------------------------|
|                                         |    Гостре   |  28 днів  |  90 днів  |  Хронічне |
|-----------------------------------------+-------------+-----------+-----------+-----------|
|У всіх тварин  |Загальний стан здоров'я  |щоденно      |щоденно    |щоденно    |щоденно    |
|               |-------------------------+-------------+-----------+-----------+-----------|
|               |Смертність/захворюваність|двічі щоденно|двічі      |двічі      |двічі      |
|               |                         |             |щоденно    |щоденно    |щоденно    |
|---------------+-------------------------+-------------+-----------+-----------+-----------|
|У тварин       |Детальні клінічні        |- перед      |- перед    |- перед    |- перед    |
|обраних для    |спостереження            |першим       |першим     |першим     |першим     |
|функціонального|                         |піддаванням  |піддаванням|піддаванням|піддаванням|
|спостереження  |                         |дії          |дії        |дії        |дії        |
|               |                         |- протягом   |- 1 раз в  |- один раз |- один раз |
|               |                         |8 годин      |тиждень    |протягом   |в кінці    |
|               |                         |дозування при|після того |першого чи |першого    |
|               |                         |оціненому    |           |другого    |місяця     |
|               |                         |часі         |           |тижня      |піддавання |
|               |                         |максимального|           |піддавання |дії        |
|               |                         |ефекту       |           |дії        |- кожні    |
|               |                         |- на 7-мий та|           |- щомісячно|3 місяці   |
|               |                         |14-тий день  |           |після того |післі того |
|               |                         |після        |           |           |           |
|               |                         |дозування    |           |           |           |
|               |-------------------------+-------------+-----------+-----------+-----------|
|               |Функціональні тести      |- перед      |- перед    |- перед    |- перед    |
|               |                         |першим       |першим     |першим     |першим     |
|               |                         |піддаванням  |піддаванням|піддаванням|піддаванням|
|               |                         |дії          |дії        |дії        |дії        |
|               |                         |- протягом   |- протягом |- один раз |- один раз |
|               |                         |8 годин      |4-го тижня |протягом   |наприкінці |
|               |                         |дозування при|обробки    |першого чи |першого    |
|               |                         |оцінці часу  |якомога    |другого    |місяця     |
|               |                         |максимального|ближче до  |тижня      |піддавання |
|               |                         |ефекту       |кінця      |піддавання |дії        |
|               |                         |- на 7-мий та|періоду    |дії        |- кожні три|
|               |                         |14-тий день  |піддавання |- щомісячно|місяця     |
|               |                         |після        |дії        |після того |після того |
|               |                         |дозування    |           |           |           |
---------------------------------------------------------------------------------------------

B.44. АБСОРБЦІЯ ЧЕРЕЗ ШКІРУ: МЕТОД IN VIVO

1. МЕТОД

Цей метод тестування еквівалентний TI OECP 427 (2004).

1.1. ВСТУП

Піддавання дії багатьох хімікатів спостерігається головним чином через шкіру, тоді як більшість токсикологічних досліджень, що проводяться на піддослідних тваринах використовують пероральний метод введення. Дослідження поглинання через шкіру методом in vivo, встановлене в цій інструкції, забезпечує зв'язок необхідний, щоб перейти в іншу область від пероральних досліджень під час оцінювання безпеки наступного піддавання дії через шкіру.

Речовина повинна пройти через багато шарів клітин шкіри до того, як вона потрапить у кровообіг. Шар, який визначає показники для більшості речовин є роговим та складається з мертвих клітин. Проникність шкіри залежить як від ліпофільності хімікату та товщини зовнішнього шару епідермісу, так і від таких факторів як молекулярна вага та концентрація речовини. Загалом, шкіра щурів та кроликів є більш проникною ніж шкіра людини, тоді як проникність шкіри морських свинок та мавп є більш близькою до шкіри людини.

Методи для вимірювання абсорбції через шкіру можна розділити на дві категорії, in vivo та in vitro. Метод in vivo може надати вичерпну інформацію, про поглинання шкірою різними піддослідними видами тварин. Нещодавно були розроблені методи in vitro. Вони використовують переміщення через повну або часткову товщину шкіри тварин чи людей до резервуару рідини. Метод in vitro описується в окремому методі тестування в (1). Рекомендується консультуватись з методичними вказівками з дослідження шкірної абсорбції ОЕСР в (2) для того, щоб сприяти у виборі найбільш придатного методу в даній ситуації, оскільки він надає більше деталей про придатність як методів in vivo, так і in vitro.

Метод in vivo, описаний у цьому методі, дозволяє визначити проникність досліджуваної речовини через шкіру у систематичне відділення. Ця техніка використовувалась протягом багатьох років в (3)(4)(5)(6)(7). Хоча дослідження абсорбції через шкіру in vitro може в багатьох випадках бути придатним, можуть виникати ситуації коли лише дослідження in vivo може забезпечити необхідні дані.

Переваги методу in vivo в тому, що він використовує фізіологічно і метаболічно непошкоджену систему, використовує вид використовуваний для багатьох досліджень токсичності. Недоліки - це використання живих тварин, потреба у міченому радіоактивним ізотопом матеріалі для того, щоб сприяти достовірним результатам, труднощі у визначенні ранньої стадії поглинання та різниця у проникності видів, яким надано перевагу (щур), та людської шкіри. Шкіра тварин загалом є більш проникною, а отже можна переоцінити підшкірне поглинання у людини (6)(8)(9). Каустичні/корозійні речовини не повинні тестуватись на живих тваринах.

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ

Доза, яка не поглинулась: це та доза, що була змита з поверхні шкіри після піддавання дії та будь яке неокклюзивне покриття, включаючи будь яку дозу того вказану, як така, що випаровується зі шкіри під час піддавання дії.

Поглинута доза (in vivo): включає в себе дозу, наявну в сечовині, після миття клітки, фекаліях, повітрі, яке видихається (якщо воно вимірюється), крові, тканинах (якщо їх збирають) та туші, яка залишилася після видалення ділянки шкіри, на яку наносили препарат.

Доза, що поглинається: це доза, присутня на або в шкірі після змивання.

1.3. ПРИНЦИП МЕТОДУ ТЕСТУВАННЯ

Досліджувана речовина, бажано мічена радіоактивним ізотопом, наноситься на виокремлену шкіру тварин на одному або більше рівнях дозування у формі зразка використаного для приготування. Досліджуваний препарат може залишатись в контакті зі шкірою на фіксований період часу за придатного покриття (неокклюзивний, напівокклюзивний, чи окклюзивний) щоб запобігти всмоктуванню досліджуваного препарату. Наприкінці періоду піддавання впливу покриття усувається, а шкіра очищується за допомогою відповідного очищувального агента, покриття та очисні матеріали зберігаються для аналізу та застосовується свіже покриття. Тварин поміщають до, під час та після періоду піддавання впливу в індивідуальних клітках для метаболізму, а випорожнення та повітря, яке видихається під час цих періодів збирається для аналізу.

Збір використаного повітря може бути опущений, якщо є достатньо інформації про те, що леткий радіоактивний метаболіт не утворюється, або його утворюється не багато. Кожне дослідження зазвичай включатиме декілька груп тварин, які будуть піддаватись дії досліджуваного препарату. Одну групу знищують в кінці періоду піддавання впливу. Інші групи знищують у заплановані часові інтервали після того (2). В кінці дослідження тварин, які залишилися знищують, а кров беруть на аналіз, ділянка аплікації видаляється для аналізу, а туша аналізується на наявність будь-якого не виділеного матеріалу. Зразки піддають хімічному аналізу відповідними засобами та оцінюють ступінь підшкірної абсорбції в (6)(8)(9).

1.4. ОПИС МЕТОДУ

1.4.1. Вибір виду тварин

Щур є видом тварин, який як правило найбільш використовують, але безшерстні породи та види мають показники шкірної абсорбції більш схожі з людськими (3)(6)(7)(8)(9). Молоді дорослі здорові тварини однієї статті (з ссавцями як стать по умовчанню) та видів, які зазвичай використовуються в лабораторіях, повинні застосовуватись. На початку дослідження, коливання ваги тварин не повинно перевищувати +- 20% середнього значення. Для прикладу щури самці вагою 200 г - 250 г є придатними, особливо у вищій половині цього ряду.

1.4.2. Кількість та стать тварин

Група з щонайменше чотирьох тварин однієї статі повинна використовуватись для кожного приготування тесту та кожного запланованого терміну його закінчення. Кожну групу тварин знищують під час різних часових інтервалів, наприклад в кінці періоду піддавання дії (як правило 6 чи 24 год) та наступних подій (наприклад, 48 та 72 год). Якщо є доступні дані, які можуть проказати вагомі відмінності в термальній токсичності самців та самок, то обирається та стать, яка є більш чутливою. Якщо таких даних немає, тоді може використовуватись будь-яка стать.

1.4.3. Умови утримування та годування тварин

Температура в експериментальній кімнаті тварин повинна становити 22 град.C (+- 3 град.C). Незважаючи на те що відносна вологість повинна бути щонайменше 30% та бажано не перевищувати 70% за виключенням коли кімнату прибирають, цільовим рівнем є 50-60%. Освітлення повинно бути штучним, в послідовності 12 годин світла, 12 годин темряви. Стосовно годування, можливе використання узгоджених лабораторних дієт з безперервним постачанням питної води. Під час дослідження, а також бажано під час акліматизації, особин тварин потрібно утримувати в камерах для дослідження метаболізму окремо одне від одного. Оскільки їжа та вода можуть викривляти результати, то потрібно мінімізувати можливість таких випадків.

1.4.4. Підготовка тварин

Тварин маркують, щоб забезпечити індивідуальну ідентифікацію та тримають в клітках принаймні п'ять днів перед початком дослідження, щоб зробити можливою акліматизацію до лабораторних умов.

Після акліматизаційного періоду, та приблизно за 24 год перед дозуванням, кожній тварині виокремлюють ділянку шкіри на плечах та на спині. Властивості проникнення пошкодженої шкіри відрізняються від цілісної шкіри, тому потрібно потурбуватись щоб уникнути здирання шкіри. Після виокремлення та приблизно за добу до того як речовину нанесуть на шкіру, (див. Пункт 1.4.7) поверхню шкіри потрібно протерти ацетоном, щоб усунути шкірний жир. Додаткове миття милом та водою не рекомендується, тому що будь-яке мило може сприяти абсорбції досліджуваної речовини. Ділянка повинна бути достатньо великою, щоб забезпечити надійний обрахунок кількості поглинутої досліджуваної речовини на кв.см шкіри, бажано був 10 кв.см. Такий розмір ділянки застосовується для щурів вагою 200-250 г. Після підготовки, тварин повертають в камери.

1.4.5. Досліджувана речовина

Досліджувана речовина це суб'єкт, проникні властивості якого потрібно дослідити. В ідеалі, досліджувана речовина повинна бути мічена радіо ізотопом.

1.4.6. Підготовка до тесту

Підготовка досліджуваної речовини (наприклад, нерозведений, розбавлений, або приготований матеріал, що містить хімікат, який тестують та який наносять на шкіру) повинен бути такий самий (або реальний замінник) як той, дії якого будуть піддаватись люди чи потенціальні цільові види. Будь-які варіації препарату "у використанні" повинні бути обґрунтовані. Якщо необхідно, то тестову речовину розчиняють або опускають у відповідний розчинник. Для розчинників окрім води характеристики абсорбції та потенціал взаємодії з тестовою речовиною повинен бути відомий.

1.4.7. Нанесення на шкіру

Місце нанесення певної ділянки поверхні визначається на поверхні шкіри. Відома кількість препарату рівномірно наноситься на ділянку. Ця кількість повинна як правило імітувати потенціал піддавання дії людини, зазвичай 1-5 мг/кв.см для твердих речовин чи до 10 мю l/кв.см для рідин. Будь-які інші кількості повинні бути обґрунтовані очікуваними умовами використання, об'єктами дослідження чи фізичними характеристиками підготовки тесту. При подальшому нанесенні, оброблена ділянка повинна бути захищена від чистки. Приклад типового приладу наведений на Малюнку 1. Зазвичай, ділянка нанесення захищена неокклюзивним покриттям (наприклад, проникне нейлонове марлеве покриття). Однак, для необмежених нанесень ділянка нанесення повинна бути закритою. У випадку випаровування напівлетючої тестової речовини, коефіцієнт відновлення речовини, яку тестують зменшується до неприйнятної величини (див. також параграф 1.4.10, перший абзац), тому необхідно затримати випаровування речовини у фільтрі з деревного вугілля, який накриває прилад аплікації (див. Рисунок 1). Важливо, щоб будь-який прилад як не пошкоджував шкіри, так і не поглинав або не вступав в реакцію з тестовою речовиною. Тварин повертають до одиночних камер для метаболізму для того, щоб зібрати випорожнення.

1.4.8. Тривалість піддавання дії та відбору проб

Тривалість піддавання дії - це інтервал часу між нанесенням та видаленням досліджуваного препарату, через миття шкіри. Потрібно використовувати відповідний період піддавання впливу (зазвичай 6 або 24 години), який засновується на очікуваній тривалості піддавання дії людини. При подальшому періоді піддавання дії, тварин утримують в метаболічних камерах до запланованого закінчення терміну. Тварин потрібно зважати на ознаки токсичності/аномальні реакції при однакових інтервалах протягом всього дослідження. В кінці дослідження оброблена шкіра повинна оглядатись на наявність видимих ознак подразнення.

Метаболічні камери повинні забезпечувати окремий збір сечовини та фекалій протягом всього дослідження. Вони повинні дозволяти збір 4C-карбон діоксину та летких складових 14C-карбону, які повинні аналізуватись, коли продукуються в кількості (> 5%). Сечовина, фекалії та поглинаючі рідини (наприклад, 14C-карбон діоксин та леткі складові 14C) повинні збиратись окремо з кожної групи при кожному разі відбору проб. Якщо наявна інформація, що утворюється мало або не утворюється радіоактивний метаболіт, то можуть використовуватись відкриті клітки.

Екскременти збирають під час періоду піддавання дії, до 24 годин після першого контакту зі шкірою, а потім щоденно після проведення експерименту. Хоча буде достатньо трьох інтервалів збору екскрементів, передбачена мета підготовки тесту або існуючі кінетичні дані можуть надавати більш придатні або додаткові часові переваги для дослідження.

В кінці періоду піддавання дії захисний механізм видаляється з кожної тварини та зберігається окремо для аналізу. Шкіра тварин, яка була оброблена, повинна промиватись принаймні тричі очисною речовиною з використанням відповідних тампонів. Потрібно потурбуватись, щоб інші частини тіла не забруднилися. Очисна речовина повинна бути відповідати вимогам практичної гігієни, наприклад, водний мильний розчин. Наприкінці шкіру необхідно висушити. Всі тампони та миючі засоби можна зберегти для аналізу. Потрібно застосувати свіже покриття, щоб захистити оброблену ділянку тих тварин, які формують групу для пізнішого дослідження перед поверненням до індивідуальних кліток.

1.4.9. Заключні процедури

В кожній групі, потрібно знищити окремих тварин в запланований час та зібрати кров на аналіз. Захисний механізм або покриття повинно видалятись для аналізу. Шкіра з обробленої ділянки та схожа ділянка не дозованої, виокремлено шкіри повинно видалятись з кожної тварини для окремого аналізу. Оброблена ділянка може бути поділена на частини, щоб відділити роговий шар від епідермісу, який лежить в основі, для того щоб надати більше інформації про характер хімікату, який тестується. Визначення цього характеру протягом часового періоду після періоду піддавання дії повинні забезпечувати визначення долі будь-якого хімікату, який тестується, в роговому шарі. Щоб спростити поділ шкіри на частини (вслід за кінцевим миттям тканини та знищенням тварин) кожне захисне покриття видаляється. Оброблену ділянку шкіри, з кільцеподібним обідком оточуючої шкіри виокремлюють з тіла щура та прикріпляють до дошки. Смужка клейкої стрічки наноситься на поверхню шкіри за допомогою легкого тиску і стрічка видаляється разом з роговим шаром шкіри. Наступні смужки стрічки застосовують поки стрічка вже більше не прилипає до шкіри, коли весь роговий шар видалений. Для кожної тварини, всі смужки стрічки можуть комбінуватись в окремому контейнері до якого додається засіб, який стимулює травлення тканини для того, щоб розчинити роговий шар. Будь-які цільові тканини можуть видалятися для окремого вимірювання перед аналізом залишків туш тварин на дозу абсорбції тушей. Туші окремих тварин повинні зберігатись для аналізу. Зазвичай достатньо аналізу загального вмісту. Цільові органи можуть видалятись для окремого аналізу (якщо визначено іншими дослідженнями). Сечовина, наявна у сечовому міхурі при знищенні, повинна додаватись до попереднього збору сечовини. Після збору екскрементів з метаболічних кліток під час планового вбивства, клітки та пастки потрібно промити відповідним розчинником. Інше потенційно забруднене обладнання повинно також аналізуватись.

1.4.10. Аналіз

У всіх дослідженнях потрібно досягнути відповідного відновлення (тобто середнє значення 100 +- 10% радіоактивності). Відновлення за межами цих значень потрібно обґрунтовувати. Кількість застосованих доз в кожному зразку повинна аналізуватись через відповідні обґрунтовані процедури.

Статистичні аналізи повинні включати величину коливань для повторних експериментів для кожного застосування.

2. ДАНІ

Наступні вимірювання потрібно проводити для кожної тварини, при кожному відборі проб хіміката, який тестують та/або метаболітів. На додаток до індивідуальних даних, вони групуються за періодами вибірки та повинні звітуватись як середні значення.

- кількість, що пов'язана з захисними пристроями,

- кількість, яку можна отримати зі шкіри,

- кількість в/на шкірі, яку не можна з неї змити,

- кількість у пробах шкіри,

- кількість в екскрементах та повітрі, що видихається (якщо застосовується),

- кількість, що залишилася у туші та будь-яких органах, видалених для окремого аналізу.

Кількість досліджуваної речовини та/чи метаболітів у екскрементах, у повітрі, що видихається, крові та в туші дозволяє визначити загальну кількість, яка поглинається на кожний окремий момент часу. Також можна отримати обрахунок кількості хімікату, який тестується, абсорбованого на кв.см шкіри та підданого дії досліджуваної речовини протягом періоду піддавання дії.

3. ЗВІТУВАННЯ

3.1. ЗВІТ ПРО ПРОВЕДЕННЯ ДОСЛІДЖЕННЯ

Звіт про проведення дослідження має включати вимоги, обумовлені в протоколі, включаючи обґрунтування тестової системи, яка використовувалась, та повинен охоплювати наступне:

Досліджувана речовина:

- ідентифікаційні дані (наприклад, номер РСХ, якщо він наявний), джерело, чистоту (радіохімічну чистоту), відомі домішки, номер партії),

- фізичну природу, фізико-хімічні властивості (наприклад, pH, леткість, розчинність, стабільність, молекулярну масу та коефіцієнт розподілу).

Підготування тесту:

- формулювання та обґрунтування використання,

- докладна інформація про підготування дослідження, кількість речовини, яка застосовується, отримана концентрація, розчинник, стабільність та гомогенність.

Піддослідна тварина:

- біологічні види/породи, які були використані,

- кількість, вік та стать тварин,

- місце походження тварин, умови утримування, корм та ін.,

- вага окремих тварини на початку тесту.

Умови проведення дослідження:

- докладна інформація про введення досліджуваного препарату (ділянка нанесення, методи аналізу, окклюзія/неокклюзія, об'єм, видалення та виявлення),

- докладна інформація про якість води та їжі.

Результати:

- будь-які ознаки токсичності,

- табличні дані абсорбції (виражені в діапазоні, кількості та відсотках),

- загальні характеристики відновлювання експерименту,

- інтерпретація результатів, порівняння з будь-якими доступними даними про підшкірну абсорбцію досліджуваного складового компоненту.

Обговорення результатів.

Висновки.

4. ПОСИЛАННЯ

(1) Testing Method B.45. Skin Absorption: In vitro Method.

(2) OECD (2002). Guidance Document for the Conduct of Skin Absorption Studies. OECD, Paris.

(3) ECETOC, (1993) Percutaneous Absorption. European Centre for Ecotoxicology and Toxicology of Chemicals, Monograph No 20.

(4) Zendzian R.P. (1989) Skin Penetration Method suggested for Environmental Protection Agency Requirements. J.Am.Coll. Toxicol. 8(5), p. 829-835.

(5) Kemppainen, B.W., Reifenrath WG (1990) Methods for skin absorption. CRC Press Boca Raton, FL, USA.

(6) EPA, (1992) Dermal Exposure Assessment: Principles and Applications. Exposure Assessment Group, Office of Health and Environmental Assessment.

(7) EPA, (1998) Health Effects Test Guidelines, OPPTS 870-7600, Dermal Penetration. Office of Prevention, Pedsticides and Toxic Substances.

(8) Bronaugh, R.L., Wester, R.C., Bucks, D., Maibach H.I. and Sarason, R., (1990) In vivo percutaneous absorption of fragrance ingredients in reshus monkeys and humans. Fd. Chem. Toxic. 28, p. 369-373.

(9) Feldman, R.J. and Maibach, H.I., (1970) Absorption of some organic compounds through the skin in man. J. Invest Dermatol. 54, p. 399-404.

Малюнок 1

Зразок конструкції типового приладу, який використовується для визначення та захисту ділянки нанесення на дерму під час дослідження підшкірної абсорбції in vivo ( 994_b14 )

B.45. АБСОРБЦІЯ ЧЕРЕЗ ШКІРУ: МЕТОД IN VITRO

1. МЕТОД

Цей метод тестування еквівалентний TI OECP 428 (2004).

1.1. ВСТУП

Цей метод був розроблений щоб отримати інформацію про абсорбцію досліджуваної речовини, яка наноситься на виокремлену шкіру. Він може, як поєднуватись з методом дослідження абсорбції шкіри: методом in vivo в (1), так і проводитись окремо. Рекомендується дотримуватись методичних вказівок з дослідження шкірної абсорбції OECD в (2) щоб сприяти розробці дослідження, яке базується на цьому методі. Методичні вказівки були підготовані для того, щоб полегшити вибір придатних процедур in vitro для використання в конкретних обставинах, щоб забезпечити надійність результатів отриманих цим методом.

Методи для вимірювання абсорбції через шкіру та транспортування препарату через шкіру можна поділити на дві категорії: in vivo та in vitro. Методи абсорбції шкіри in vivo є міцно закріпленими та надають фармакокінетичну інформацію про ряд видів тварин. Метод in vivo окремо описаний в іншому тестовому методі (1). Методи in vitro також використовуються вже багато років, для вимірювання абсорбції через шкіру. Незважаючи на те, що формальний аналіз неупередженої вибірки методів in vitro включене до цього тестового методу, не проводиться, експерти OECP погодились в 1999 р., що повинна бути достатня кількість даних, щоб підтримувати метод in vitro в (3). Решта деталей, які підтверджують цю підтримку, включають значну кількість прямих порівнянь методів in vitro та in vivo, наведені в методичних вказівках (2). Існує ряд монографій, які оглядають цю тему та надають детальну основу використання методу in vitro в (4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12). Методи In vitro вимірюють дифузію хімікатів в/та через шкіру до рідинного резервуару та можуть використовувати не життєздатну шкіру лише для вимірювання дифузії, або свіжої, метаболічно активної шкіри до одночасного вимірювання дифузії та метаболізму. Такі методи особливо застосовуються як скринінг для порівняння подачі хімікату в/та через шкіру з різних формулювань, а також можуть надавати корисні моделі для оцінки підшкірної абсорбції у людини.

Метод in vitro може не підходити для всіх ситуацій та хімічних класів. Використання методу in vitro є можливим для початкового кількісного оцінювання проникності шкіри. В деяких випадках, може бути необхідним завершення даними методу in vivo. Потрібно звертатись до методичних вказівок (2) для подальшої розробки ситуацій, в яких метод in vitro не придатний. Додаткова детальна інформація на підтримку цього рішення наведена у (3).

Цей метод представляє загальні принципи вимірювання абсорбції дерми та подачу тестової речовини з використанням виокремленої шкіри. Можна використовувати шкіру багатьох видів ссавців, включаючи людей. Проникні властивості шкіри зберігаються після її виокремлення з тіла тому що, основним бар'єром для проникнення є нежиттєздатний роговий шар шкіри, активне переміщення хімікатів через шкіру не визначається. Шкіра показує здатність засвоювати деякі хімікати під час підшкірної абсорбції (6), але цей процес не є обмеженням діапазону в межах фактично поглинутої дози, хоча це може вплинути на матеріал, який входить до кровообігу.

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ

Доза, яка не поглинулась: це та доза, що була змита з поверхні шкіри після піддавання дії та будь-яке неокклюзивне покриття, включаючи будь яку дозу того вказану, як така, що випаровується зі шкіри під час піддавання дії.

Поглинута доза (in vitro): маса досліджуваної речовини, яка досягає рідини рецептора або системної циркуляції протягом визначеного періоду часу.

Доза, що поглинається (in vitro): це доза, присутня на/або в шкірі після змивання.

1.3. ПРИНЦИП ТЕСТОВОГО МЕТОДУ

Тестова речовина, яка може бути мічена радіо ізотопом, застосовується до поверхні зразка шкіри, який розділяє дифузор на дві камери. Хімікати залишаються на шкірі на визначений період часу за визначених умов, перед видаленням через відповідну процедуру очищення. Рідина рецептора береться на пробу протягом експерименту та аналізується на тестовий хімікат та/чи метаболіти.

Коли використовуються метаболічно активні системи, то метаболіти тестового хімікату можуть аналізуватись відповідними методами. В кінці експерименту вимірюється розподіл тестового хімікату та його метаболітів, якщо застосовно.

При використанні відповідних умов, описаних в цьому методі та методичних вказівках в (2), поглинання досліджуваної речовини вимірюється протягом даного часового періоду за допомогою аналізу рідини рецептора та обробленої шкіри. Досліджувану речовину, яка залишилася в шкірі, потрібно розглядати як абсорбовану, крім випадків коли абсорбцію можна визначити з самої рідини рецептора. Аналіз інших компонентів (матеріалу, який змили зі шкіри, та який залишився в шарах шкіри) дозволяє подальшу оцінку даних, включаючи загальний розподіл досліджуваної речовини та відсоток відновлення.

Для того, щоб продемонструвати дію та надійність тестової системи в лабораторії, яка проводить дослід, повинні бути доступні результати для відповідних хімікатів, які узгоджуються з опублікованою літературою про метод, який використовується. Щоб відповідати цій вимозі, потрібно тестувати відповідну еталонну речовину (бажано із ліпофільністю близькою до досліджуваної речовини) одночасно з еталонною речовиною або через забезпечення відповідних історичних даних для певних еталонних речовин з різною ліпофільністю (наприклад, кофеїн, бензольну кислоту та тестостерон).

1.4. ОПИСАННЯ ТЕСТОВОГО МЕТОДУ

1.4.1. Дифузор

Дифузор складається з донорської камери та камери рецептора між якими розміщується шкіра (приклад типової конструкції наведений в Малюнку 1). Камера повинна забезпечувати належну ізоляцію навколо шкіри, дати можливість легкого відбору проб та достатнього перемішування розчину рецептора в контакті з нижньою частиною шкіри та достатній контроль температури клітини та її компонентів. Як статичні так і проточні дифузори є прийнятними. Зазвичай, донорські камери залишаються не закритими під час піддавання дії кінцевої дози тестової речовини. Однак, для початкових аплікацій та певних сценаріїв для кінцевих доз, донорські камери можуть бути закриті.

1.4.2. Рідина рецептора

Надається перевага використанню фізіологічно сприятливої рідини рецептора, хоча інші можуть теж використовуватись, за умови, що їх використання є обґрунтованим. Потрібно наводити точний склад рідини рецептора. Необхідно демонструвати достатню розчинність тестового хімікату в рідині рецептора, таким чином, щоб вона не виступала в якості бар'єру для поглинання. До того ж, рідина рецептора не повинна впливати на цілісність препарату шкіри. В поточній системі, величина потоку не повинна перешкоджати проникненню тестової речовини до рідини рецептора. У статичній системі камери, потрібно безперервно розмішувати рідину та регулярно брати її проби. Якщо досліджується метаболізм, то рідина рецептора повинна підтримувати життєздатність шкіри протягом експерименту.

1.4.3. Підготовка шкіри

Можна використовувати шкіру джерелом якої є тварина чи людина. Визнано, що використання людської шкіри є предметом національних та міжнародних етичних аналізів та умов. Хоча перевага надається життєздатній шкірі, не життєздатна шкіра теж може використовуватись, за умови, що можна продемонструвати цілісність шкіри. Або мембрани епідерми (розділені ензимно, нагріванням або хімічним способом), або розділена товщина шкіри (зазвичай 200-400 мю m товщиною) приготована з допомогою дерматому, є прийнятною. Може використовуватись повна товщина шкіри, але слід уникати надмірної товщини (приблизно > 1 мм) крім випадків коли це особливо необхідно для визначення досліджуваного хімікату в шарах шкіри. Вибір видів, анатомічна ділянка та техніки препарування повинні бути обґрунтованими. Вимагаються дані як мінімум чотирьох повторів на один тестовий препарат.

1.4.4. Цілісність препарату шкіри

Важливо, щоб шкіра була підготовлена належним чином. Невідповідна обробка може спричинити пошкодження рогового шару, тому потрібно перевіряти цілісність шкіри. Коли досліджується метаболізм шкіри, то повинна використовуватись свіжо виокремлена шкіра настільки швидко наскільки це можливо, та за умов, які підтримують метаболічну активність. Для загальних вказівок, свіжо виокремлена шкіра повинна використовуватись протягом доби, але прийнятний період зберігання може коливатись залежно від ензимної системи, яка залучена у метаболізації та температурах зберігання (13). Якщо препарати шкіри зберігаються перед використанням, то повинні представлятись дані, які показують, що функція бар'єру виконується.

1.4.5. Досліджувана речовина

Досліджувана речовина - це речовина, характеристики проникності якої, повинні досліджуватись. В ідеалі, тестова речовина повинна бути мічена радіоізотопом.

1.4.6. Підготовка тесту

Підготування тестової речовини (наприклад, чистий, нерозбавлений, складений матеріал, який містить тестову речовину, яка наноситься на шкіру) повинні бути такі ж (або реальний замінник) як ті, дії яких будуть піддаватись люди чи потенціальні цільові види. Будь-які варіації препарату "у використанні" повинні бути обґрунтовані.

1.4.7. Концентрації та склад досліджуваної речовини

Зазвичай використовується більше ніж одна концентрація тестової речовини вимірюючи найвищий потенціал піддавання людини дії препарату. Так само необхідно аналізувати тестування ряду типових рецептур.

1.4.8. Нанесення на шкіру

За нормальних умов піддавання людини дії хімікату, зазвичай зустрічаються кінцеві дози. Тому, повинна наноситись аплікація, яка імітує перше піддаванням людини дії, як правило 1-5 мг/кв.см шкіри для твердого тіла та до 10 мкл/кв.см для рідин. Кількість повинна бути обґрунтованою згідно очікуваних умов, об'єктів дослідження чи фізичних характеристик. Наприклад, нанесення на поверхню шкіри може бути необжеменим, де наносяться великі об'єми на одиницю площі.

1.4.9. Температура

На пасивне проникнення хімікатів (а отже і їх шкірної абсорбції) впливає температура. Дифузорна камера та шкіра повинні зберігатись при постійній температурі близькій до нормальної температури шкіри 32 +- 1 град.C. Різні моделі клітин потребують різний водний розчин або блокові температури підігріву, щоб гарантувати, що рецептор/шкіра перебуває у фізіологічній нормі. Бажана вологість повинна бути між 30 та 70%.

1.4.10. Тривалість піддавання дії та вибірка

Піддавання шкіри дії досліджуваного препарату може тривати протягом всього експерименту або протягом коротших періодів (наприклад, для того, щоб імітувати особливий тип піддавання людини дії препарату). Шкіру потрібно промити від надлишку тестового препарату відповідною очисною речовиною, речовина після промивання збирається для аналізу. Процедура підготовки тесту залежить від очікуваних умов використання та повинна бути обґрунтованою. Як правило вимагається цілодобовий відбір зразків, щоб надати можливість для відповідної характеристики профілю абсорбції. Оскільки цілісність шкіри може пошкоджуватись через добу, то тривалість відбору зразків не повинна перевищувати одну добу. Це може бути не потрібним для тестових речовин, які швидко проникають через шкіру, але для тестових речовин, які проникають повільно можуть бути необхідні довші періоди. Частота збору зразків рідини рецептора повинна надати можливість для графічного представлення профілю абсорбції тестової речовини.

1.4.11. Кінцеві процедури

Всі компоненти тестової системи потрібно аналізувати та визначати їхню відновлюваність. Це включає донорську камеру, промивання поверхні шкіри, підготовка шкіри та рідину/камеру рецептора. В деяких випадках, шкіра може бути поділена на фракції в ділянці шкіри, яка піддавалася дії препарату, та ділянці під фланцем клітини та в роговому шарі, у фракціях епідерми та дерми, для окремого аналізу.

1.4.12. Аналіз

У всіх дослідженнях потрібно досягнути адекватного відновлення (за мету встановлюється 100 +- 10% радіоактивності, а будь-які відхилення потрібно обґрунтувати). Потрібно проаналізувати кількість тестової речовини в рідині рецептора, препараті шкіри, обмивальних засобах для поверхні шкіри та апараті для промивання, використовуючи відповідну техніку.

2. ДАНІ

Потрібно представити аналіз рідини рецептора, розподіл речовини досліджуваного хімікату в тестовій системі та профіль абсорбції із визначенням часу. Коли використовуються умови кінцевого дозування піддавання дії, то необхідно обрахувати кількість речовини, яку змивають зі шкіри, кількість речовини пов'язаної зі шкірою (та проаналізувати шари шкіри) та кількість, наявну в рідині рецептора (об'єм, кількість або відсоток застосованої дози). Інколи абсорбція шкіри може виражатись через використання лише даних рідини рецептора. Однак, якщо досліджувана речовина залишається в шкірі в кінці дослідження, то її потрібно включити до загальної поглинутої кількості (див. параграф 66 в посиланні (3)). Якщо, використовуються початкові умови дозування піддавання дії, то ці дані можуть дозволити обрахувати константу проникності (Kp). За останніх умов, відсоток абсорбції є не релевантним.

3. ЗВІТУВАННЯ

3.1. ЗВІТ ПРО ПРОВЕДЕННЯ ДОСЛІДЖЕННЯ

Звіт про проведення дослідження має включати вимоги, обумовлені в протоколі, включаючи обґрунтування тестової системи, яка використовувалась, та повинен включати наступне:

Досліджувана речовина:

- фізична природа, фізико-хімічні властивості (ринаймні молекулярна вага та коефіцієнт розподілу), та чистота (радіохімічна чистота),

- ідентифікаційна інформація (наприклад, номер партії),

- розчинність в рідині рецептора.

Підготовка тесту:

- формулювання та обґрунтування використання,

- гомогенність.

Умови проведення дослідження:

- джерела та ділянки шкіри, метод препарування, умови зберігання перед використанням, будь-яка попередня обробка (очищення, застосування антибіотиків, та ін.), вимірювання цілісності шкіри, метаболічний статус, обґрунтування використання,

- моделювання камери, склад рідини рецептора, об'єм потоку рідини рецептора або час вибірки та процедури,

- докладна інформація про нанесення досліджуваного препарату та кількість дози, яка застосовується,

- тривалість піддавання дії,

- докладна інформація про видалення досліджуваного препарату зі шкіри, наприклад, промивання шкіри,

- докладна інформація аналізу шкіри та будь-яких технік поділу на фракції, які застосовуються, щоб продемонструвати розподіл шкіри,

- процедури промивання камер та обладнання,

- методи аналізу, техніки екстрагування, обмеження виявлення та аналітичні методи затвердження.

Результати:

- повний вихід експерименту (Застосована доза = Промивання шкіри + Шкіра + Рідина рецептора + промивання клітин),

- складання таблиць індивідуального відновлення клітин в кожному відсіку,

- профіль абсорбції,

- дані абсорбції у формі таблиць (виражені в діапазоні, кількості та відсотках),

Обговорення результатів.

Висновки.

4. ПОСИЛАННЯ

(1) Testing Method B.44. Skin Absorption: In Vivo Method.

(2) OECD, (2002) Guidance Document for the Conduct of Skin Absorption Studies. OECD, Paris.

(3) OECD, (2000) Report of the Meeting of the OECD Extended Steering Committee for Percutaneous Absorption Testing, Annex 1 to ENV/JM/TG(2000)5. OECD, Paris.

(4) Kemppainen B.W. and Reifenrath W.G., (1990) Methods for skin absorption. CRC Press, Boca Raton.

(5) Bronaugh R.L. and Collier, S.W., (1991) Protocol for In vitro Percutaneous Absorption Studies, in In vitro Percutaneous Absorption: Principles, Fundamentals and Applications, RL Bronaugh and HI Maibach, Eds., CRC Press, Boca Raton, p. 237-241.

(6) Bronaugh R.L. and Maibach H.I., (1991) In vitro Percutaneous Absorption: Principles, Fundamentals and Applications. CRC Press, Boca Raton.

(7) European Centre for Ecotoxicology and Toxicology of Chemicals, (1993) Monograph No 20, Percutaneous Absorption, ECETOC, Brussels.

(8) Diembeck W., Beck H., Benech-Kieffer F., Courtellemont P., Dupuis J., Lovell W., Paye M., Spengler J., Steiling W., (1999) Test Guidelines for In Vitro Assessment of Dermal Absorption and Percutaneous Penetration of Cosmetic Ingredients, Fd Chem Tox, 37, p. 191-205.

(9) Recommended Protocol for In vitro Percutaneous Absorption Rate Studies (1996). US Federal Register, Vol. 61, No 65.

(10) Howes, D., Guy, R., Hadgraft, J., Heylings, J.R.et al.(1996). Methods for assessing Percutaneous absorption. ECVAM Workshop Report ATLA 24, 81 R10.

(11) Schaefer, H. and Redelmeier, T.E., (1996). Skin barrier: principles of percutaneous absorption. Karger, Basel.

(12) Roberts, M.S. and Walters, K.A., (1998). Dermal absorption and toxicity assessment. Marcel Dekker, New York.

(13) Jewell, C., Heylings, J.R., Clowes, H.M. and Williams, F.M. (2000). Percutaneous absorption and metabolism of dinitrochlorobenzene in vitro. Arch Toxicol 74, p. 356-365.

Малюнок 1

Приклад типової конструкції статичного дифузора для досліджень підшкірної абсорбції in vitro ( 994_b14 )

Серія C: МЕТОДИ ДЛЯ ВИЗНАЧЕННЯ ЕКОТОКСИЧНОСТІ

ЗМІСТ

C.1. ГОСТРА ТОКСИЧНІСТЬ ДЛЯ РИБ.

C.2. DAPHNIA SP. ДОСЛІДЖЕННЯ ВИСОКОЇ ІММОБІЛІЗАЦІЇ

C.3. ДОСЛІДЖЕННЯ ІНГІБІЦІЇ ВОДОРОСТЕЙ

C.4. ВИЗНАЧЕННЯ "ПОВНОЇ" БІОРОЗКЛАДНОСТІ

PART I. ЗАГАЛЬНІ ПОЛОЖЕННЯ

PART II. ДОСЛІДЖЕННЯ ЗА МЕТОДОМ РОЗКЛАДАННЯ РОВ (Метод C.4-A).

PART III. ДОСЛІДЖЕННЯ ЗА МЕТОДОМ МОДИФІКОВАНОГО РОЗКЛАДАННЯ ОЕСР (Метод C.4-B)

PART IV. ДОСЛІДЖЕННЯ ЗА МЕТОДОМ ВИДІЛЕННЯ CO (Метод C.4-C). 2

PART V. ДОСЛІДЖЕННЯ ЗА МЕТОДОМ МАНОМЕТРИЧНОЇ СПІРОМЕТРІЇ (Метод C.4-D)

PART VI. ДОСЛІДЖЕННЯ ЗА МЕТОДОМ ЗАКРИТОЇ ПЛЯШКИ (Метод C.4-E)

PART VII. ДОСЛІДЖЕННЯ ЗА МЕТОДОМ ММТП (Метод C.4-F)

C.5. ДЕГРАДАЦІЯ (РОЗКЛАДАННЯ) - БІОХІМІЧНА ПОТРЕБА В КИСНІ

C.6. ДЕГРАДАЦІЯ - ХІМІЧНА ПОТРЕБА В КИСНІ

C.7. ДЕГРАДАЦІЯ - АБІОТИЧНА ДЕГРАДАЦІЯ: ГІДРОЛІЗ ЯК ФУНКЦІОНУВАННЯ PH МЕТОДУ

C.8. ТОКСИЧНІСТЬ ДЛЯ ДОЩОВИХ ЧЕРВ'ЯКІВ

C.9. БІОЛОГІЧНА ДЕСТРУКЦІЯ - ТЕСТ ЗАН-ВЕЛЛЕНСА

C.10. БІОЛОГІЧНА ДЕСТРУКЦІЯ - ДОСЛІДЖЕННЯ МОДЕЛЮВАННЯ АКТИВНОГО МУЛУ

C.11. БІОЛОГІЧНА ДЕСТРУКЦІЯ - ДОСЛІДЖЕННЯ ЗАТРИМКИ ІНТЕНСИВНОСТІ ДИХАННЯ АКТИВОВАНОГО МУЛУ

C.12. БІОЛОГІЧНИЙ РОЗПАД - МОДИФІКОВАНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ НБАМ

C.13. БІОЛОГІЧНЕ НАКОПИЧЕННЯ: ДОСЛІДЖЕННЯ НА РИБІ У ПРОТОЧНОМУ РЕЖИМІ

C.14. ДОСЛІДЖЕННЯ РОСТУ МАЛЬКА

C.15. РИБА, ЕКСПРЕС-ДОСЛІДЖЕННЯ НА ТОКСИЧНІСТЬ ДЛЯ РІЗНИХ СТАДІЙ РОЗВИТКУ ЕМБРІОНІВ ТА ПЕРЕДЛИЧИНОК

C.16. МЕДОНОСНІ БДЖОЛИ - ДОСЛІДЖЕННЯ НА ГОСТРУ ПЕРОРАЛЬНУ ТОКСИЧНІСТЬ

C.17. МЕДОНОСНІ БДЖОЛИ - ДОСЛІДЖЕННЯ НА ГОСТРУ КОНТАКТНУ ТОКСИЧНІСТЬ

C.18. АДСОРБЦІЯ/ДЕСОРБЦІЯ З ВИКОРИСТАННЯМ МЕТОДУ РІВНОВАГИ

C.19. ВИЗНАЧЕННЯ КОЕФІЦІЄНТА АДСОРБЦІЇ (К ) НА ҐРУНТІ ТА НА ОС ОСАДІ СТІЧНИХ ВОД З ВИКОРИСТАННЯМ ВИСОКОЕФЕКТИВНОЇ РІДИННОЇ ХРОМАТОГРАФІЇ (ВЕРХ)

C.20. ТЕСТУВАННЯ РЕПРОДУКТИВНОЇ ФУНКЦІЇ ДАФНІЇ МАГНА (DAPHNIA MAGNA)

C.21. ҐРУНТОВІ МІКРООРГАНІЗМИ: ДОСЛІДЖЕННЯ ТРАНСФОРМАЦІЇ АЗОТУ

C.22. ҐРУНТОВІ МІКРООРГАНІЗМИ: ДОСЛІДЖЕННЯ ТРАНСФОРМАЦІЇ ВУГЛЕЦЮ

C.23. АЕРОБНЕ ТА АНАЕРОБНЕ ПЕРЕТВОРЕННЯ В ГРУНТІ

C.24. АЕРОБНІ І АНАЕРОБНІ ТРАНСФОРМАЦІЇ В СИСТЕМІ ВОДНИХ ОСАДІВ

C.1. ГОСТРА ТОКСИЧНІСТЬ ДЛЯ РИБ

1. МЕТОД

1.1. ВСТУП

Мета цього тесту визначити гостру летальну токсичність речовини для риб у прісній воді. Бажано мати, по мірі можливості, інформацію про розчинність у воді, тиск пари, хімічну стабільність, константи дисоціації та здатності речовини до біологічного розпаду, щоб допомогти у виборі найбільш придатного тестового методу (статичного, напівстатичного чи поточного) для забезпечення задовільно сталих концентрацій досліджуваної речовини протягом періоду тестування.

Додаткова інформація (наприклад структурна формула, ступінь чистоти, природа та відсоток важливих домішок, наявність та кількість хімічних додатків, коефіцієнт розподілу n-октанолу/води) необхідно взяти до уваги як при плануванні тесту, так і при інтерпретації результатів.

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ ТА ОДИНИЦІ

Гостра токсичність це видимий шкідливий ефект, що виникає в організмі протягом короткого періоду (днів) піддавання дії речовини в даному тесті, гостра токсичність виражається як середня летальна концентрація (LC ) тобто, така концентрація у воді, що 50

вбиває   50%   тестової   групи  риб  протягом  тривалого  періоду
піддавання дії, що повинно встановлюватись.

Всі концентрації тестової речовини подаються у масі на об'єм (міліграм на літр). Вони також можуть виражатися як маса на масу

-1

(мг/кг ).

1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ

Еталонна речовина може тестуватись, як засіб, що показує, що за умов лабораторного тесту реакція видів, які тестують, значно не змінюється.

Для цього тесту еталонні речовини не визначаються.

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

Контроль по діапазону значень здійснюється при 100 мг на літр для того, щоб показати, що LC більший ніж ця концентрація. 50

Рибу до піддають дії досліджуваної речовини, що додається до води у вигляді певного спектру концентрацій за період 96 год.

Випадки смертності записуються принаймні з інтервалом в добу, та обраховують, якщо можливо, концентрації, які знищують 50% риб (LC ) при кожному періоді спостереження. 50

1.5. КРИТЕРІЇ ЯКОСТІ

Критерії якості повинні застосовуватись як до контролю по діапазону значень так і до повного методу дослідження.

Смертність в контрольних групах не повинна перевищувати 10% (або однієї риби, якщо використовується менше 10) на кінець дослідження.

Концентрація розчиненого кисню повинна становити більше ніж 60% величини насиченості повітря протягом всього періоду дослідження.

Концентрації досліджуваної речовини повинні підтримуватись в межах 80% початкових концентрацій протягом всього періоду дослідження.

Стосовно речовин, які легко розчиняються в досліджуваному середовищі та утворюють стабільні розчини, тобто ті, які не будуть значною мірою випаровуватись, розкладатись, піддаватись гідролізу або поглинатись, початкову концентрацію можна вважати еквівалентною номінальній концентрації. Докази мають показувати, що концентрації зберігались протягом всього дослідження та відповідали критеріям якості.

Для речовин які:

(i) погано розчиняються в досліджуваному середовищі, або

(ii) здатні утворювати стабільні емульсії чи дисперсії,

(iii) нестабільні у водних розчинах,

За початкову концентрацію потрібно брати концентрацію виміряну в розчині (або, якщо технічно не можливо, то виміряну у водомірній колонці) на початку дослідження. Концентрацію необхідно визначати після періоду врівноважування, але до початку дослідження риб.

В будь-якому з цих випадків, подальші вимірювання потрібно здійснювати під час дослідження, щоб підтвердити дійсні концентрації піддавання дії або відповідність критеріям якості.

Рівень pH не повинен змінюватись більше ніж на 1 одиницю.

1.6. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

Три види процедур можуть використовуватись:

Статичне дослідження.

Дослідження токсичності, в якому не відбувається витік досліджуваних речовин. (Розчини залишаються незмінними протягом всього дослідження.)

Напівстатичне дослідження:

Дослідження без витоку досліджуваної речовини, але з регулярним періодичним відновленням досліджуваної речовини після тривалих періодів. (наприклад, 24 год).

Проточний метод дослідження:

Дослідження токсичності, в якому вода постійно відновлюється в досліджуваних відсіках, хімікат, який під час дослідження транспортується з водою, використовується для відновлення досліджуваного середовища.

1.6.1. Реагенти

1.6.1.1. Розчини досліджуваних речовин

Вихідні розчини необхідної концентрації готують за допомогою розчинення речовини в деіонізованій воді або воді згідно пункту 1.6.1.2.

Обрані концентрації для дослідження готують через розчинення вихідного розчину. Якщо досліджуються високі концентрації, то речовину можуть розчиняти безпосередньо в розбавленій воді.

Речовини зазвичай досліджують лише до ліміту розчинності. Стосовно деяких речовин (наприклад, речовин, які мають низьку розчинність у воді, або високу величину P , або ті, які утворюють ow

радше стабільні дисперсії аніж чистий розчин у воді), допускається
використовувати досліджувану концентрацію,  яка є вищою  за  ліміт
розчинності   речовини,   для   того,   щоб  отримати  максимально
розчинну/стабільну   концентрацію.   Важливо,   однак,   щоб    ця
концентрація   не   порушувала  іншим  чином  систему  дослідження
(наприклад, плівка речовини на поверхні води перешкоджає насиченню
води киснем та ін.).

Ультразвукова дисперсія, органічні розчинники, емульгатори або дисперсанти можуть використовуватись, як допоміжні для приготування вихідних розчинів речовин з низькою розчинністю у воді, або ж для того щоб допомогти диспергувати ці речовини в досліджуваному середовищі. Якщо використовуються такі допоміжні речовини, то всі досліджувані концентрації повинні містити однакову кількість допоміжної речовини, риба для додаткового контролю повинна піддаватися впливу такої ж концентрації допоміжної речовини, яка використовується в серії досліджень. Концентрація таких допоміжних речовин повинна бути мінімальною, але ні в якому разі не перевищувати 100 мг на літр в досліджуваному середовищі.

Дослідження має здійснюватись без регулювання рівня pH. Якщо є ознаки змін в рівні pH, то рекомендується повторити дослідження з регулюванням рівня pH та відзвітувати про результати. В цьому випадку, значення pH вихідного розчину потрібно погодити зі значенням pH розчиненої води, за винятком якщо є особливі причини не робити цього. Для цієї мети віддають перевагу HCl та NaOH. Це регулювання рівня pH повинно виконуватись таким чином, щоб концентрація досліджуваної речовини у вихідному розчині не змінювалася значною мірою. Якщо трапиться так, що будь-яка хімічна реакція або фізичний осад складового компоненту дослідження буде викликаний регулюванням, то про це слід звітувати.

1.6.1.2. Вода утримування та розчинення

Може використовуватись запас питної води (не заражена потенційно шкідливими концентраціями хлору, важких металів чи інших речовин) природна вода належної якості або відновлена вода. Надається перевага воді з загальною жорсткістю від 10 до 250 мг на літр (як CaCO ) та pH від 6,0 до 8,5. 3

1.6.2. Прилади

Всі прилади повинні бути виготовлені з неінертного матеріалу:

- автоматична система розчинення (для проточного тесту),

- апарат для вимірювання кисню,

- обладнання для визначення жорсткості води,

- відповідний прилад для контролю температури,

- прилад для вимірювання рівня pH.

1.6.3. Піддослідна риба

Риба повинна бути здоровою та не мати жодних очевидних дефектів.

Біологічні види необхідно обирати на основі практичних критеріїв, таких як наявність протягом року, легкість в утримуванні, зручність для досліджень, відносна чутливість до хімікатів, та будь-які економічні, біологічні чи екологічні фактори, які до них відносяться. Потрібно звертати увагу на потребі порівняння отриманих даних та існуючих міжнародних узгоджень (посилання 1), коли обираються біологічні види.

Список видів риб, які рекомендовані для здійснення цього дослідження надається в Додатку 2, перевага надається; Смугастій перцині та Райдужній форелі.

1.6.3.1. Утримування

Піддослідна риба повинна бути з одного запасу, однакової довжини та віку. Риба повинна утримуватись щонайменше 12 днів в наступних умовах:

завантаження:

відповідно до системи (рециркуляція або проточність) та біологічних видів риб,

вода:

див. пункт 1.6.1.2,

освітлення:

12-16 годин освітлення щоденно,

Концентрації розчиненого кисню:

принаймні 80% значення насиченості повітря,

Годування:

Тричі на тиждень або щоденно, годування припиняється за 24 години до початку дослідження.

1.6.3.2. Смертність

Після 48-ми годинного періоду заселення, випадки смертності записують та використовують наступні критерії:

- більше ніж 10% популяції за 7 днів:

відхилення всієї групи,

- між 5 та 10% популяції:

період утримування подовжується на сім додаткових днів.

Якщо подальших випадків смертності не трапляється, то група є прийнятною, в іншому випадку групу потрібно відхилити.

- менше ніж 5% популяції:

Прийняття партії.

1.6.4. Адаптація

Всіх риб потрібно піддати впливу води такої якості та температури, яка має використовуватись в дослідженні, принаймні протягом семи днів до того, як їх будуть використовувати.

1.6.5. Процедура дослідження

Дослідження на визначення діапазону значень може передувати кінцевому дослідженню, для того щоб отримати інформацію про діапазон концентрацій, які використовуються в основному дослідженні.

Проводиться один контроль без досліджуваної речовини та, якщо необхідно, один контроль, який містить допоміжну речовину, на додаток до ряду досліджень.

Залежно від фізичних та хімічних властивостей складового компоненту, що досліджується, статичне, напівстатичне та проточне дослідження обирається відповідно, щоб задовольнити критерії якості.

Рибу піддають дії речовини, як описано нижче:

- тривалість 96 годин,

- кількість тварин: щонайменше 7 на одну концентрацію,

- резервуари: відповідної ємності відносно рекомендованого завантаження,

- завантаження: рекомендується максимальне завантаження 1 г на літр для статичного та напівстатичного дослідження, для проточних систем може використовуватись більше завантаження,

- досліджувана концентрація: Щонайменше 5 концентрацій, що відрізняються на незмінний коефіцієнт, який не перевищує 2,2, та настільки, наскільки можливо охоплює область значень від 0 до 100% смертності,

- вода: див. пункт 1.6.1.2,

- світло: 12-16 годин освітлення на день,

- температура: та що підходить для біологічних видів (Додаток 2) але в межах +- 1 град.C в межах будь-якого конкретного тесту,

- концентрація розчиненого кисню: не менше ніж 60% значення насиченості повітря при обраній температурі,

- годування: відсутнє.

Риб оглядають після перших 2-4 годин та з інтервалами щонайменше в добу. Риба вважається мертвою, якщо відсутня реакція на дотик до хвостового стебла та відсутні видимі дихальні рухи. Якщо помічають мертву рибу, то її видаляють та записують смертність. Ведуться записи видимих аномалій (наприклад, втрата рівноваги, зміна плавальної поведінки, дихальної функції, пігментації та ін.).

Вимірювання pH, розчиненого кисню та температури повинно здійснюватись щоденно.

Дослідження на граничний вміст

Використовуючи процедури, описані в цьому методі, дослідження на граничний вміст може здійснюватись при 100 мг на літр для того, щоб продемонструвати, що LC більше ніж ця концентрація. 50

Якщо природа цієї речовини така, що не можливо отримати концентрацію 100 мг на літр, то дослідження на граничний вміст повинно здійснюватись при концентрації, що дорівнює розчинності речовини (або при максимальній концентрації, що утворює стабільну дисперсію) в середовищі, яке використовується (див. також пункт 1.6.1.1).

Дослідження на граничний вміст повинно проводитись з використанням 10 риб, з таким же числом в контрольному зразку (зразках). (Біноміальна теорія проголошує, що коли використовується 10 риб з нульовою смертністю, то можна бути впевненим на 99,9%, що LC більше ніж концентрація, яка 50

використовувалась в дослідженні на граничний вміст).

Якщо трапляються випадки смертності, то слід проводити повне дослідження. Якщо спостерігається сублетальні впливи, то це потрібно записувати.

2. ДАНІ ТА ОЦІНЮВАННЯ

Для кожного періоду, для якого записувались спостереження (24, 48, 72 та 96 годин), наноситься на графік відсоток смертності в залежності від концентрації на папері для ймовірного логарифмічно нормального розподілу.

Якщо можливо та для кожного періоду спостереження, LC та 50

границі   достовірності   (p   =   0,05)   повинно  оцінюватись  з
використанням  стандартних  процедур;  ці  значення  повинні  бути
округлені  до  одиниці,  або  при двох найбільш значних показниках
(приклади округлення до двох цифр:  170 для 173,5; 0,13 для 0,127;
1,2 для 1,21).

В тих випадках де нахил кривої співвідношення концентрація/процент занадто крутий для того, щоб надати можливість обрахувати кривої реакції LC , достатньо графічної 50

оцінки значення.

Коли дві послідовні концентрації, з коефіцієнтом 2,2 дають лише 0 та 100% смертності, то ці два значення є достатніми для того щоб визначити діапазон в межах якого LC спадає. 50

Якщо спостерігається той факт, що стабільність або гомогенність досліджуваної речовини не може бути збережена, то про це слід відзвітувати та потурбуватись про інтерпретацію результатів.

3. ЗВІТУВАННЯ

Звіт про дослідження повинен, якщо це можливо, включати наступну інформацію:

- інформацію про піддослідну рибу (наукову назву, вид, постачальника, будь-яку попередню обробку, розмір та кількість, використані для кожної досліджуваної концентрації),

- джерело води для розчинення та основні хімічні характеристики (рівень pH, жорсткість, температура),

- якщо речовина має низьку розчинність у воді, то метод приготування вихідного та досліджуваного розчину,

- концентрацію будь-яких допоміжних речовин,

- перелік концентрацій, які використовуються та будь-яку доступну інформацію про стабільність при цих концентраціях досліджуваного хімікату в досліджуваному розчині,

- якщо проводяться хімічні аналізи, то методи, які використовувались, та отримані результати,

- результати дослідження граничного вмісту, якщо воно проводилось,

- обґрунтування вибору та деталі процедури дослідження, яка використовувалась (наприклад, статична, напівстатична, норма дозування, норма протікання, чи газоване, завантаження рибою, та ін.),

- опис обладнання для досліду,

- режим освітлення,

- концентрації розчиненого кисню, значення pH та температури досліджуваних розчинів кожні 24 години,

- докази того, що були виконані критерії якості,

- таблиця, яка показує сукупну смертність при кожній концентрації та контроль (та контроль з допоміжними речовинами, якщо необхідно) при кожному рекомендованому періоді спостереження,

- графік кривої співвідношення концентрація/процент реакції в кінці тестування,

- якщо можливо, значення LC у кожному рекомендованому 50

періоді спостереження (з 95% границею довірчого інтервалу),

- статистичні процедури, що використовуються для визначення значень LC , 50

- якщо використовується еталонна речовина, вказати отримані результати,

- найвища досліджувана концентрація, яка не викликає смертності протягом всього періоду дослідження,

- найнижча досліджувана концентрація, яка викликає 100% смертність протягом всього періоду дослідження.

4. ПОСИЛАННЯ

(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 203, Decision of the Council C(81) 30 final and updates.

(2) AFNOR - Determination of the acute toxicity of a substance to Brachydanio rerio- Static and Flow Through methods - NFT 90-303 June 1985.

(3) AFNOR - Determination of the acute toxicity of a substance toSalmo gairdneri- Static and Flow - Through methods - NFT 90-305 June 1985.

(4) ISO 7346/1,/2 and/3 - Water Quality - Determination of the acute lethal toxicity of substances to a fresh water fish (Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan-Teleostei, Cyprinidae). Part 1: Static method. Part 2: Semi-static method. Part 3: Flow-through method.

(5) Eidgenossisches Department des Innern, Schweiz: Richtlinien fur Probenahme und Normung von Wasseruntersuchungsmethoden - Part II 1974.

(6) DIN Testverfahren mit Wasserorganismen, 38 412 (11) und 1 (15).

(7) JIS K 0102, Acute toxicity test for fish.

(8) NEN 6506-Water-Bepaling van de akute toxiciteit met behulp van Poecilia reticulata, 1980.

(9) Environmental Protection Agency, Methods for the acute toxicity tests with fish, macroinvertebrates and amphibians. The Committee on Methods for Toxicity Tests with Aquatic Organisms, Ecological Research Series EPA-660-75-009, 1975.

(10) Environmental Protection Agency, Environmental monitoring and support laboratory, Office of Research and Development, EPA-600/4-78-012, January 1978.

(11) Environmental Protection Agency, Toxic Substance Control, Part IV, 16 March 1979.

(12) Standard methods for the examination of water and wastewater, fourteen edition, APHA-AWWAWPCF, 1975.

(13) Commission of the European Communities, Inter-laboratory test programme concerning the study of the ecotoxicityof a chemical substance with respect to the fish. EEC Study D.8368, 22 March 1979.

(14) Verfahrensvorschlag des Umweltbundesamtes zum akuten Fisch-Test. Rudolph, P. und Boje, R. Okotoxikologie, Grundlagen fur die okotoxikologische Bewertung von Umweltchemikalien nach dem Chemikaliengesetz, ecomed 1986.

(15) Litchfield, J. T.and Wilcoxon, F., A simplified method for evaluating dose effects experiments, J. Pharm, tExp. Therap., 1949, vol. 96, 99.

(16) Finney, D.J. Statistical Methods in Biological Assay. Griffin, Weycombe, U.K., 1978.

(17) Sprague, J.B. Measurement of pollutant toxicity to fish. Bioassay methods for acute toxicity. Water Res., 1969, vol. 3, 793-821.

(18) Sprague, J.B. Measurement of pollutant toxicity to fish. II Utilising and applying bioassay results. Water Res. 1970, vol. 4, 3-32.

(19) Stephan, C.E. Methods for calculating an LC . In 50

Aquatic  Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F.I.Mayer and
J.L.Hamelink).  American Society for Testing and  Materials,  ASTM
STP 634, 1977, 65-84.

(20) Stephan, C.E., Busch, K.A., Smith, R., Burke, J. and Andrews, R.W. A computer program for calculating an LC . US EPA. 50

Додаток 1

Відновлена вода

Приклад придатного розчину води

Всі хімікати повинні бути аналітичної якості.

Вода повинна бути належної якості та дистильована, або -1

деіонізована з провідністю менше ніж 5 мю Scm  .

Апаратне забезпечення для дистиляції води не повинне містити жодних частин, які виготовлені з міді.

Вихідні речовини

CaCl . 2H O (кальцій хлорид дигідрат): 11,76 г 2 2

Розчинити в, та утворити до 1 л з водою

MgSO . 7H O (магній сульфат гептагідрат): 4,93 г 4 2

Розчинити в, та утворити до 1 л з водою

NaHCO (гідроксид карбонату натрію): 2,59 г 3

Розчинити в, та утворити до 1 л з водою

KCl (хлорид калію):                                    0,23 г

Розчинити в, та утворити до 1 л з водою

Відновлена вода для розчину

Змішати 25 мл кожного з чотирьох розчинів та утворити до 1 л з водою.

Насичувати киснем до рівня, коли концентрація розчиненого кисню не буде дорівнювати значенню насиченості повітрям.

Рівень pH повинен становити 7,8 +- 0,2.

Якщо необхідно, врегулювати рівень pH за допомогою NaOH (гідроксидом натрію) або HCl (соляною кислотою).

Розчинена вода, виготовлена таким чином, відставляється в сторону на 12 годин та не повинна надалі насичуватись повітрям.

Кількість іонів Ca та Mg в цьому розчині становить 2,5 моль на літр. Співвідношення іонів Ca:Mg становить 4:1 та іонів Na:K становить 10:1. Загальна лужність цього розчину становить 0,8 моль на літр.

Будь-які відхилення в приготуванні водного розчину не повинні змінювати співвідношення властивостей води.

Додаток 2

Види риб, рекомендовані для дослідження

--------------------------------------------------------------------------------------------
|                     Рекомендовані види                      |Рекомендований|Рекомендована|
|                                                             |ряд температур|   загальна  |
|                                                             | дослідження  |   довжина   |
|                                                             |   (град.C)   | тварин (см) |
|-------------------------------------------------------------+--------------+-------------|
|Brachydanio rerio (Teleostei, Cyprinidae) (Hamilton-Buchanan)|    20-24     | 3,0 +- 0,5  |
|Смугаста перцина                                             |              |             |
|                                                             |              |             |
|Pimephales promelas (Teleostei, Cyprinidae) (Rafinesque)     |    20-24     | 5,0 +- 2,5  |
|Товстоголовий гольян                                         |              |             |
|                                                             |              |             |
|Cyprinus carpio (Teleostei, Cyprinidae) (Linneaus 1758)      |    20-24     | 6,0 +- 2,0  |
|Карп звичайний                                               |              |             |
|                                                             |              |             |
|Oryzias latipes (Teleostei, Poeciliidae) Cyprinodontidae     |    20-24     | 3,0 +- 1,0  |
|(Tomminck and Schlege 1850) Червоний фундулюс                |              |             |
|                                                             |              |             |
|Poecilia reticulata (Teleostei, Poeciliidae) (Peters 1859)   |    20-24     | 3,0 +- 1,0  |
|Гуппі                                                        |              |             |
|                                                             |              |             |
|Lepomis macrochirus (Teleostei, Centrarchidae)               |    20-24     | 5,0 +- 2,0  |
|(Rafinesque Linneaus 1758) Синьозяберний сонячник            |              |             |
|                                                             |              |             |
|Onchorhynchus mykiss (Teleostei, Salmonidae) (Walbaum 1988)  |    12-17     | 6,0 +- 2,0  |
|Райдужна форель                                              |              |             |
|                                                             |              |             |
|Leuciscus idus (Teleostei, Cyprinidae) (Linneaus 1758)       |    20-24     | 6,0 +- 2,0  |
|Орфей золотий                                                |              |             |
--------------------------------------------------------------------------------------------

Збір

Види риб, перелічені, вище легко розводяться та/чи широко доступні протягом всього року. Їх можна розводити та культивувати на рибних фермах або в лабораторіях, за умов контролю хвороб та паразитів, так щоб піддослідні тварини були здорові та з відомим походженням. Ці види тварин доступні у багатьох частинах світу.

Додаток 3

Приклад концентрації: процентне співвідношення випадків смертності

Приклад визначення LC з використанням графіку 50 для запису одиниць вірогідності (лог-пробіт) ( 994_b14 )

C.2. DAPHNIA SP. ДОСЛІДЖЕННЯ ГОСТРОЇ ІММОБІЛІЗАЦІЇ

1. МЕТОД

Цей метод дослідження високої іммобілізації еквівалентний TI OECP 202 (2004).

1.1. ВСТУП

Цей метод описує дослідження гострої токсичності, щоб оцінити вплив хімікатів на дафній. Існуючі методи дослідження були використані можливою мірою в (1)(2)(3).

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ

В контексті цього методу, використовувались наступні визначення:

EC : це концентрація, визначена як така, за якої 50

відбувається   іммобілізація  50%  дафній  протягом  встановленого
періоду піддавання дії.  Якщо використовуються інші визначення, то
про це слід звітувати, разом з відповідними посиланнями.

Іммобілізація: ті тварини, які не можуть плавати протягом 15 секунд після легкого збовтування посудини вважаються нерухомими. (навіть якщо вони все ж рухають своїми вусиками).

1.3. ПРИНЦИП ТЕСТОВОГО МЕТОДУ

Молоді дафнії, віком менше доби на початку дослідження, піддаються дії досліджуваної речовини в певному діапазоні концентрацій на період 48 годин. Іммобілізація записується після 24 годин та 48 годин та порівнюється з контрольними значеннями. Результати аналізуються для того, щоб вирахувати EC після 50

48 годин  (визначення  наведені  у Розділі 1.2.).  Визначення EC
                                                                50
після 24 годин не є обов'язковим.

1.4. ІНФОРМАЦІЯ ПРО ДОСЛІДЖУВАНУ РЕЧОВИНУ

Розчинність води та тиск пари досліджуваної речовини повинен бути відомий та повинен бути доступний надійний аналітичний метод для кількісного вимірювання речовини в досліджуваних розчинах із заявленою відновлювальною ефективністю та лімітом визначення. Корисна інформація включає структурну формулу, відсутність домішок в речовині, стабільність у воді чи світлі, P та результати ow

дослідження на готову біодеградацію (див. метод C.4).

Примітка: методичні вказівки для дослідження речовин з фізико-хімічними властивостями, які ускладнюють їхнє дослідження, наведені в (4).

1.5. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ

Еталонна речовина може досліджуватись на EC як засіб 50

підтвердження надійності умов дослідження.  Токсичні речовини, які
використовуються  в  міжнародних  кільцевих  дослідженнях в (1)(5)
рекомендуються  з  цієї   метою(1).   Дослідження   з   еталонними
речовинами повинні проводитись щомісячно та щонайменше два рази на
рік.

----------------

(1) Результати цих міжлабораторних досліджень та Технічних поправок до ISO 6341 надають EC - 24 години біхромату калію 50

(K Cr O ) в межах 0,6 мг/л до 1,7 мг/л. 2 2 7

1.6. КРИТЕРІЇ ЯКОСТІ

Для того щоб дослідження вважалось підтвердженим, застосовуються наступні критерії проведення:

- в контролях, включаючи контроль, який містить розчинну речовину, не більше ніж 10% дафній повинні бути нерухомими;

- концентрація розчиненого кисню в кінці дослідження повинна становити >= 3 мг/л в контрольних та досліджуваних ємностях.

Примітка: Для першого критерію, не більше ніж 10% дафній контролю повинні бути нерухомими або проявляти інші ознаки хвороби чи стресу, наприклад, знебарвлювання, незвичну поведінку, таку як затримка на поверхні води.

1.7. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

1.7.1. Прилади

Посудини для дослідження та інші прилади, які вступатимуть у контакт з досліджуваним розчином, повинні бути виготовлені виключно зі скла або іншого хімічно інертного матеріалу. У якості посудин для дослідження зазвичай використовуються дослідні пробірки або колби; вони повинні бути очищені перед кожним використанням у відповідності до стандартних лабораторних процедур. Посудини для дослідів повинні бути нещільно накриті, щоб зменшити втрату води через випаровування та уникнути попадання пилу в розчини. Леткі речовини потрібно досліджувати у повністю закритих посудинах, достатньо великих, щоб запобігти обмеженню або низькому зниженню рівня кисню (див. в розділ 1.6 та перший абзац в розділі 1.8.3).

Окрім того, буде використовуватись деяке або все з наведеного далі обладнання: прилад для вимірювання кисню (з мікроелектродом або іншим необхідним обладнанням для вимірювання розчиненого кисню в зразках з низьким об'ємом); вимірювач рівня pH; відповідний апарат для контролю температури, обладнання для визначення загальної концентрації органічного вуглецю (ЗОВ), обладнання для визначення хімічної потреби у кисні (ХПК), обладнання для визначення жорсткості), та ін.

1.7.2. Піддослідний організм

Daphnia magna Straus є біологічним видом, якому надається перевага, хоча можна використовувати і інші біологічні види (наприклад, Daphnia pulex). На початку дослідження, тварини повинні бути віком принаймні добу та зменшувати варіативність, строго рекомендується, щоб вони не були першими виведеними потомками. Вони повинні походити зі здорової породи (тобто не мати жодних ознак стресу, таких як висока смертність, наявність чоловічих особин та ефіпій, затримка у розмноженні та продукуванні першого потомства, знебарвлення тварин та ін.). Всі організми, що використовуються для певного дослідження, повинні походити з культур встановлених з того ж роду дафній. Тварини, яких утримують, повинні утримуватись в культурних умовах (освітлення, температура, середовище) схожих до тих, які використовуються в дослідженні. Якщо культурне середовище дафній, яке повинно використовуватись в дослідженні, відрізняється від звичайного середовища дафній, то хорошою практикою є виділення акліматизаційного періоду перед дослідженням. З цією метою, виводок дафній повинен зберігатись у розчинній воді при температурі дослідження, щонайменше 48 годин до початку дослідження.

1.7.3. Вода утримування та розчинення

Природна вода (поверхнева або ґрунтова вода), відновлена вода або дехлорована водопровідна вода підходить як вода для утримування та розчинення, якщо дафнії виживуть в ній протягом культивування, акліматизації та дослідження без наявних ознак стресу. Будь-яка вода, яка відповідає хімічними властивостями прийнятного водного розчину, як перераховано у Додатку 1, є прийнятною водою для дослідження. Вона повинна мати стабільну якість протягом всього періоду дослідження. Відновлена вода може готуватись з додаванням конкретної кількості реагентів аналітичної якості. Приклади відновленої води подані у (1) (6) та в Додатку 2. Зверніть увагу, що слід уникати середовищ з хелатоутворюючими агентами, такими як M4 та M7 в Додатку 2 для досліджуваних речовин, які містять метали. Рівень pH повинен бути в межах від 6 до 9. Жорсткість між 140 та 250 мг/л (як CaCO ) рекомендований для 3

Daphnia    magna   та   при   нижчій   жорсткості   можуть   також
використовуватись і інші біологічні види дафній. Вода для розчинів
може  насичуватись  повітрям  перед  використанням для дослідження
таким   чином,   що   концентрація   розчиненого   кисню   досягає
насиченості.

Якщо використовується природна вода, то параметри якості повинні вимірюватись принаймні двічі на рік, та будь-коли, якщо є підозри відносно того, що характеристики могли значно змінитись. (див. попередній параграф та Додаток 1). Вимірювання важких металів (наприклад, Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni) повинно також здійснюватись. Якщо дехлорована водопровідна вода використовується, то необхідний щоденний аналіз хлору. Якщо розчинена вода є поверхневою чи ґрунтовою, то потрібно вимірювати провідність, загальний органічний вуглець (ЗОВ) та хімічну потребу в кисні (ХПК).

1.7.4. Досліджувані розчини

Досліджувані речовини обраних концентрацій зазвичай готують через розбавлення вихідного розчину. Вихідні речовини повинні бути підготовані через розчинення у воді для розчинів. По можливості, слід уникати використання розчинників, емульгаторів або дисперсантів. Однак, такі складові можуть бути необхідними в деяких випадках для того, щоб виробляти вихідний розчин з придатною концентрацією. Керівництво по необхідним розчинникам, емульгаторах та дисперсантах надається в посиланні (4). У випадку, якщо досліджувана речовина в досліджуваних розчинах не перевищує обмеження розчинності у воді.

Дослідження повинне здійснюватись без регулювання pH. Якщо pH не залишається в межах 6-9, тоді потрібно провести друге дослідження, з регулюванням pH вихідного розчину до того яке було в розбавленій воді до додавання досліджуваної речовини. Регулювання pH потрібно робити таким чином щоб концентрація вихідної речовини не змінювалась значною мірою та не спричиняла жодної хімічної реакції або випадіння речовини в осад. Перевага надається HCl та NaOH.

1.8. ПРОЦЕДУРА

1.8.1. Умови піддавання дії

1.8.1.1. Піддослідні групи та контрольні зразки

Посудини для дослідження наповнюють відповідним об'ємом розбавленої води та розчинами досліджуваного розчину. Коефіцієнт об'єму повітря/води в посудині повинен бути такий самий як групі дослідження та контролю. Потім дафнії поміщають в посудини для досліду. Принаймні 20 тварин, які переважно ділять на чотири групи по п'ять тварин кожна, повинні використовуватись при кожній досліджуваній концентрації та контрольні зразки. Щонайменше 2 мл досліджуваного розчину повинно надаватись для кожної тварини (тобто об'єм 10 мл для п'яти дафній на посудину для досліду). Дослідження може здійснюватись з використанням напівстатичної або проточної системи, якщо концентрація досліджуваної речовини є не стабільною.

Один ряд контролю розбавленої води а також, якщо застосовно, один ряд контролю з вмістом розчинного реагенту повинен проводитись додатково до ряду обробок.

1.8.1.2. Досліджувані концентрації

Дослідження визначення показників може проводитись, для того, щоб визначити спектр концентрацій для певного дослідження, крім випадків, коли інформація про токсичність досліджуваної речовини є доступною. З цією метою, дафнії піддають впливу послідовності широко рознесених між собою концентрацій досліджуваної речовини. П'ять дафній потрібно піддати впливу при кожній досліджуваній концентрації для 48 годин або менше, а повторні дослідження не є необхідними. Період піддавання дії може бути скорочений (наприклад, до 24 годин і менше) якщо дані відповідають меті дослідження визначення показників та можуть бути отримані за коротший період.

Необхідно використовувати принаймні п'ять досліджуваних концентрацій. Вони повинні бути розташовані у геометричній прогресії з коефіцієнтом розподілу, який бажано не перевищує 2,2. Потрібно надавати обґрунтування, якщо використовується менше п'яти концентрацій. Найвищі досліджувані концентрації повинні закінчуватись 100% іммобілізацією, а найнижчі досліджувані концентрації не повинні проявляти видимого впливу.

1.8.1.3. Умови інкубації

Температура повинна бути в межах від 18 град.C до 22 град.C, і для кожного дослідження вона повинна бути константою постійною в межах +- 1 град.C. Рекомендується така послідовність освітлення: 16 годин світла, 8 годин темряви. Повна темрява можливою також є прийнятною, особливо для досліджуваних речовин, нестійких на світлі.

Посудини для дослідження не повинні насичуватись повітрям під час дослідження. Дослідження здійснюється без регулювання pH. Дафній не потрібно годувати під час дослідження.

1.8.1.4. Тривалість

Дослідження триває 48 годин.

1.8.2. Спостереження

Кожна посудина для досліду повинна перевірятись на наявність нерухомих дафній при 24 та 48 год. після початку дослідження (визначення наведені в Розділі 1.2). На додаток до нерухомості, будь-які аномалії поведінки або зовнішнього вигляду повинні подаватись у формі звіту.

1.8.3. Аналітичні вимірювання

Розчинений кисень та pH вимірюються на початку дослідження у контрольному зразку (зразках) і у найвищій концентрації досліджуваної речовини. Концентрація розчиненого кисню у контролях повинна відповідати критерію затвердження. (див. Розділ 1.6). Рівень pH як правило, не повинен коливатися більше ніж на 1,5 одиниці в будь-якому окремому дослідженні. Температура зазвичай вимірюється в контрольних посудинах або у навколишньому повітрі і вона повинна записуватись безперервно протягом усього дослідження, як мінімум, на початку та в кінці дослідження.

Концентрація досліджуваної речовини повинна вимірюватись, як мінімум, при найвищій та найнижчій концентрації, на початку та в кінці дослідження (4). Рекомендується щоб результати базувались на виміряних концентраціях. Однак, якщо наявні докази, що досліджувана речовина була задовільно збережена в межах +- 20% номінальної чи виміряної початкової концентрації протягом дослідження, то результати можуть базуватися на номінальних та виміряних початкових значеннях.

1.9. ДОСЛІДЖЕННЯ НА ГРАНИЧНИЙ ВМІСТ

Використовуючи процедури описані в цьому методі, дослідження на граничний вміст може здійснюватись при 100 мг/л досліджуваної речовини або до її ліміту розчинності досліджуваному середовищі (в залежності від того, яке значення нижче) для того, щоб показати, що EC є більшим ніж ця концентрація. Дослідження на граничний

вміст повинне проводитись з використанням 20 дафній (які необхідно
поділити на 4  групи  по  п'ять  тварин),  з  таким  же  числом  в
контрольному    зразку    (зразках).    Якщо    виникає   будь-яка
іммобілізація,  то потрібно проводити повне дослідження.  Будь-які
аномалії поведінки, які спостерігаються, потрібно записувати.

2. ДАНІ

Дані потрібно підсумовувати у формі таблиці та вказувати для кожної групи, яку застосовують і для контролю, число дафній, яке використовувалось, іммобілізацію при кожному спостереженні. Процентне співвідношення нерухомих тварин після 24 та 48 годин наноситься на графік по відношенню до досліджуваних концентрацій. Дані аналізують за допомогою відповідних статистичних методів (наприклад, пробіт-аналіз, та ін.) щоб обрахувати нахил кривих та EC з 95% границею довірчого інтервалу (p = 0,05) (7)(8). 50

Якщо стандартні методи обрахунку EC неможна застосувати до 50

отриманих   даних,   то  найвища  концентрація,  яка  не  викликає
нерухомість,  та  найнижча  концентрація,  що   викликає   100%-ву
нерухомість  повинна  використовуватись  як приблизне значення для
EC    (це  вважають  геометричним  середнім  значенням  цих   двох
  50
концентрацій).

3. ЗВІТУВАННЯ

3.1. ЗВІТ ПРО ДОСЛІДЖЕННЯ

Звіт про дослідження повинен містити наступну інформацію:

Досліджувана речовина:

- фізична природа та відповідні фізико-хімічні властивості,

- хімічні ідентифікаційні дані, включаючи чистоту.

Піддослідні біологічні види:

- джерело та види дафній, постачальник джерела (якщо відомо) та умови культури, які використовуються (включаючи джерело, вид та кількість їжі, частоту годування).

Умови дослідження:

- опис посудин для досліду, об'єм розчину, число дафній на досліджувану посудину, число посудин (реплікатів) на концентрацію,

- спосіб приготування вихідних та досліджуваних розчинів включаючи використання будь-якого розчинника чи дисперсанта, концентрації, які використовуються,

- деталі води для розчину: джерело та характеристики якості води (pH, жорсткість, коефіцієнт Ca/Mg, коефіцієнт лужності Na/K, провідність та ін.); склад відновленої води, якщо вона використовується,

- умови інкубації: температура, інтенсивність освітлення та періодичність, розчинений кисень, pH, та ін.

Результати:

- кількість та процентне співвідношення дафній, які були іммобілізовані або не виявляли побічного впливу (включаючи аномалії поведінки) в групах контролю та групах обробки, при кожному періоді спостереження, та опис природи впливів, які спостерігаються,

- результати та дані дослідження проведеного з еталонною речовиною, якщо доступні,

- номінальні досліджувані концентрації та результат всіх аналізів, щоб визначити концентрацію досліджуваної речовини в посудинах для досліду; дієвість відновлення методу та визначення ліміту повинні також подаватись у звіті,

- всі фізико-хімічні вимірювання температури, pH та розчиненого кисню, отриманий під час дослідження,

- EC після 48 годин для іммобілізації з довірчим інтервалом 50

та  графіками  необхідної  моделі,  яку  використовують   для   їх
розрахунку,  нахили  кривих  реакцій  на  дозу  та  їх  стандартна
похибка,   статистичні   процедури,   які   використовуються   для
визначення EC  ; (ці пункти даних для іммобілізації після 24 годин
             50
повинні теж подаватись в звіті, якщо вони вимірюються),

- пояснення будь-якого відхилення від методу дослідження та чи вплинули ці відхилення на результати дослідження.

4. ПОСИЛАННЯ

(1) ISO 6341. (1996). Water quality - Determination of the inhibition of the mobility of Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) - Acute toxicity test. Third edition, 1996.

(2) EPA OPPTS 850.1010. (1996). Ecological Effects Test Guidelines - Aquatic Invertebrate Acute Toxicity Test, Freshwater Daphnids.

(3) Environment Canada. (1996) Biological test method. Acute Lethality Test Using Daphnia spp. EPS 1/RM/ 11. Environment Canada, Ottawa, Ontario, Canada.

(4) Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environmental Health and Safety Publication. Series on Testing and Assessment. No 23. Paris 2000.

(5) Commission of the European Communities. Study D8369. (1979). Inter-laboratory Test Programme concerning the study of the ecotoxicity of a chemical substance with respect to Daphnia.

(6) OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. Guideline 211: Daphnia magna Reproduction Test, adopted September 1998.

(7) Stephan C.E. (1977). Methods for calculating an LC50. In Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F.I.Mayer and J.L.Hamelink). ASTM STP 634 - American Society for Testing and Materials. p. 65-84

(8) Finney D.J. (1978). Statistical Methods in Biological Assay. 3rd ed. London. Griffin, Weycombe, UK.

Додаток 1

ДЕЯКІ ХІМІЧНІ ХАРАКТЕРИСТИКИ ПРИЙНЯТНОЇ ВОДИ ДЛЯ РОЗЧИНІВ

------------------------------------------------------------------
|                      Речовина                     |Концентрація|
|---------------------------------------------------+------------|
|Тверді частки                                      |  < 20 мг/л |
|---------------------------------------------------+------------|
|Загальний органічний вуглець                       |  < 2 мг/л  |
|---------------------------------------------------+------------|
|Неіонізований аміак                                | < 1 мю g/l |
|---------------------------------------------------+------------|
|Залишковий хлор                                    |< 10 мю g/л |
|---------------------------------------------------+------------|
|Загальні фосфорорганічні пестициди                 |  < 50 нг/л |
|---------------------------------------------------+------------|
|Загальні органохоринові пестициди плюс             |  < 50 нг/л |
|поліхлоровані біфеніли                             |            |
|---------------------------------------------------+------------|
|Загальний органічний хлор                          |  < 25 нг/л |
------------------------------------------------------------------

Додаток 2

ПРИКЛАДИ ПРИДАТНОЇ ВІДНОВЛЕНОЇ ДОСЛІДЖУВАНОЇ ВОДИ ISO Досліджувана вода(1)

------------------------------------------------------------------
|             Вихідні речовини             |     Приготувати     |
|             (єдина речовина)             |   відновлену воду,  |
|------------------------------------------|   додати наступні   |
|      Речовина      |    Кількість,яка    |   об'єми вихідних   |
|                    | додається до 1 літр | речовин до 1 л води |
|                    |       води(*)       |         (*)         |
|--------------------+---------------------+---------------------|
|Хлорид кальцію      |       11,76 г       |        25 мл        |
|CaCl , 2H O         |                     |                     |
|    2    2          |                     |                     |
|--------------------+---------------------+---------------------|
|Сульфат магнію      |        4,93 г       |        25 мл        |
|MgSO , 7H O         |                     |                     |
|    4    2          |                     |                     |
|--------------------+---------------------+---------------------|
|Гідрокарбонат натрію|        2,59 г       |        25 мл        |
|NaHCO               |                     |                     |
|     3              |                     |                     |
|--------------------+---------------------+---------------------|
|Хлористий калій     |        0,23 г       |        25 мл        |
|KCl                 |                     |                     |
|----------------------------------------------------------------|
|(*) Вода відповідної чистоти, наприклад, деіонізована,          |
|дистильована або зі зворотнім осмосом з електропровідністю, яка |
|                       -1                                       |
|не перевищує 10 мю S.см  .                                      |
------------------------------------------------------------------

Середовище Елендт M7 та M4

Акліматизація до середовища Елендт M4 та M7

У деяких лабораторіях виникали труднощі у прямому переносі Дафнії до середовища M4 та M7. Однак, було досягнуто певного успіху в поступовій акліматизації, тобто переміщенні з власного середовища до 30% Елендту, потім до 60% Елендту та потім до 100% Елендту. Акліматизаційні періоди можуть тривати впродовж одного місяця.

Підготовка

Мікроелемент

Окремі вихідні розчини (I) окремих мікроелементів спочатку готують у воді відповідної чистоти, наприклад, деіонізованій, дистильованій або з оборотним осмосом. З цих різних вихідних розчинів (I) другий єдиний вихідний розчин (комбінований розчин), тобто:

------------------------------------------------------------------------
|Вихідний розчин(и)| Кількість додана |   Концентрація  |     Для      |
|     I (єдина     |  до води (мг/л)  |   (відносно до  | приготування |
|    речовина)     |                  |  середовища M4) |комбінованого |
|                  |                  |                 |  вихідного   |
|                  |                  |                 | розчину II,  |
|                  |                  |                 |  додається   |
|                  |                  |                 |   наступна   |
|                  |                  |                 |  кількість   |
|                  |                  |                 |  вихідного   |
|                  |                  |                 | розчину I до |
|                  |                  |                 | води (мл/л)  |
|                  |                  |                 |--------------|
|                  |                  |                 |  M4  |  M7   |
|------------------+------------------+-----------------+------+-------|
|H BO              |      57 190      |  20 000-кратна  |  1,0 |  0,25 |
| 3  3             |                  |                 |      |       |
|MnCl .4H O        |      7 210       |  20 000-кратна  |  1,0 |  0,25 |
|    2   2         |                  |                 |      |       |
|LiCl              |      6 120       |  20 000-кратна  |  1,0 |  0,25 |
|RbCl              |      1 420       |  20 000-кратна  |  1,0 |  0,25 |
|SrCl .6H O        |      3 040       |  20 000-кратна  |  1,0 |  0,25 |
|    2   2         |                  |                 |      |       |
|NaBr              |        320       |  20 000-кратна  |  1,0 |  0,25 |
|Na  MoO .2H O     |      1 230       |  20 000-кратна  |  1,0 |  0,25 |
|  2    4   2      |                  |                 |      |       |
|CuCl2.2H O        |        335       |  20 000-кратна  |  1,0 |  0,25 |
|    2   2         |                  |                 |      |       |
|ZnCl              |        260       |  20 000-кратна  |  1,0 |  1,0  |
|    2             |                  |                 |      |       |
|CoCl .6H O        |        200       |  20 000-кратна  |  1,0 |  1,0  |
|    2   2         |                  |                 |      |       |
|KI                |        65        |  20 000-кратна  |  1,0 |  1,0  |
|Na  SeO           |       43,8       |  20 000-кратна  |  1,0 |  1,0  |
|  2    3          |                  |                 |      |       |
|NH  VO            |       11,5       |  20 000-кратна  |  1,0 |  1,0  |
|  4   3           |                  |                 |      |       |
|Na  EDTA.2H O     |      5 000       |   2 000-кратна  |  -   |  -    |
|  2        2      |                  |                 |      |       |
|FeSO .7H O        |      1 991       |   2 000-кратна  |  -   |  -    |
|    4   2         |                  |                 |      |       |
------------------------------------------------------------------------

Обидва розчини Na 2 EDTA та FeSO готуються окремо, 4

зливаються в один та одразу стерилізуються в автоклаві.

Це надає:

------------------------------------------------------------------------
|Розчин 2 l Fe-EDTA|                  |  1 000-кратна   | 20,0 |  5,0  |
------------------------------------------------------------------------

M4 та M7 середовище

Середовища M4 та M7 готуються з використанням вихідного розчину II, макронутріентів та вітамінів, а саме:

---------------------------------------------------------------------------
|                      |Кількість |Концентрація (відносно до|  Кількість  |
|                      |додана до |      середовища M4)     |  вихідного  |
|                      |   води   |                         |  розчину II |
|                      |  (мг/л)  |                         |додається для|
|                      |          |                         | приготування|
|                      |          |                         |  середовища |
|                      |          |                         |    (мл/л)   |
|                      |          |                         |-------------|
|                      |          |                         |  M4  |  M7  |
|----------------------+----------+-------------------------+------+------|
|Вихідний розчин II    |          |        20-кратна        |  50  |  50  |
|(комбіновані          |          |                         |      |      |
|мікроелементи)        |          |                         |      |      |
|Вихідні розчини       |          |                         |      |      |
|макронутріентів (єдина|          |                         |      |      |
|речовина)             |          |                         |      |      |
|CaCl  · 2H 0          |  293 800 |      1 000-кратна       |  1,0 |  1,0 |
|    2     2           |          |                         |      |      |
|MgSO  · 7H O          |  246 600 |      2 000-кратна       |  0,5 |  0,5 |
|    4     2           |          |                         |      |      |
|KCl                   |  58 000  |      10 000-кратна      |  0,1 |  0,1 |
|NaHCO                 |  64 800  |      1 000-кратна       |  1,0 |  1,0 |
|     3                |          |                         |      |      |
|Na  SiO  · 9H O       |  50 000  |      5 000-кратна       |  0,2 |  0,2 |
|  2    3     2        |          |                         |      |      |
|NaNO                  |  2 740   |      10 000-кратна      |  0,1 |  0,1 |
|    3                 |          |                         |      |      |
|KH  PO                |  1 430   |      10 000-кратна      |  0,1 |  0,1 |
|  2   4               |          |                         |      |      |
|K HPO                 |  1 840   |      10 000-кратна      |  0,1 |  0,1 |
| 2   4                |          |                         |      |      |
|Комбінований запас    |    -     |      10 000-кратна      |  0,1 |  0,1 |
|вітамінів             |          |                         |      |      |
|-------------------------------------------------------------------------|
|Комбінований вітамінний вихідний розчин готується через додавання 3-х    |
|вітамінів до 1 л води, які наведено нижче:                               |
|-------------------------------------------------------------------------|
|Тиамін гідрохлорид    |  750     |      10 000-кратна      |      |      |
|Цианокобаломін (B  )  |  10      |      10 000-кратна      |      |      |
|                 12   |          |                         |      |      |
|Біотин                |  7,5     |      10 000-кратна      |      |      |
---------------------------------------------------------------------------

Запас сукупності вітамінів зберігається заморожений в маленьких аліквотах. Вітаміни додають до середовища незадовго до використання.

N.B: Щоб уникнути осаду солей, коли готуються остаточні середовища, додають аліквоти вихідних розчинів до 500-800 мл деіонізованої води, а потім доводять об'єм до 1 л.

N.B: перша публікація середовища M4 знаходиться в Elendt, B.P. (1990). Selenium deficiency in crustacea; anultrastructual approach to antennal damage in Daphnia magna Straus. Protoplasma, 154, 25-33.

C.3. ДОСЛІДЖЕННЯ ІНГІБІЦІЇ ВОДОРОСТЕЙ

1. МЕТОД

1.1. ВСТУП

Мета цього дослідження визначити впливи речовини на ріст одноклітинних зелених видів водоростей. Відносно короткі (72 години) дослідження можуть оцінити впливи на декілька поколінь. Цей метод може бути адаптований для використання для декількох видів одноклітинних видів водоростей, у випадку якого має надаватись опис методу, який використовується зі звітом про дослідження.

Цей метод найлегше застосовувати до речовин, які розчинні у воді, та які за умов дослідження зазвичай залишаються у воді.

Цей метод може використовуватись для речовин, які прямо не впливають на вимірювання росту водоростей.

Перед початком дослідження необхідно мати, по можливості, інформацію про розчинність у воді, тиск насиченого пару, хімічну стабільність, константи розпаду та здатність речовини до біологічного розпаду.

Додаткова інформація (наприклад структурна формула, ступінь чистоти, природа та процентне співвідношення важливих домішок, кількість добавок, та коефіцієнт розподілу n-октанолу/води) повинні бути взяті до уваги як в плануванні дослідження, так і в інтерпретації результатів.

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ ТА ОДИНИЦІ ВИМІРЮВАННЯ

Щільність клітин: кількість клітин на мілілітр.

Ріст: зростання щільності клітин протягом періоду дослідження.

Темп росту: зростання щільності клітин на одиницю часу.

EC : в цьому методі, концентрація досліджуваної речовини, 50

результатом якої є зменшення на 50%  або в  рості  (E C  )  або  в
                                                     b 50
темпі росту (E C  ) відносно контрольного зразка.
              r 50

КНВ (Концентрація невидимого впливу): в цьому методі, найвища досліджувана концентрація при якій не спостерігається значного гальмування росту відносно контрольного зразка.

Всі концентрації досліджуваної речовини подаються в масі на об'єм (міліграм на літр). Вони також можуть виражатись як маса на -1

масу (мг/кг  ).

1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ

Еталонна речовина може досліджуватись як засіб щоб продемонструвати, що за лабораторних умов дослідження чутливість біологічних видів значно не змінюється.

Якщо використовується еталонна речовина, то результати потрібно подавати у звіті про дослідження. Біхромат калію може використовуватись, як еталонна речовина, але його колір може вплинути на якість та інтенсивність освітлення доступного для клітин, а також на спектрофотометричні дослідження, якщо вони використовуються. Біхромат калію використовується в міжнародному міжлабораторному дослідженні (див. посилання (3) та Додаток 2).

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

Дослідження на граничний вміст може проводитись при 100 мг на літр, для того, щоб продемонструвати, що EC більше ніж ця 50

концентрація.  Культури  обраних  зелених водоростей,  які ростуть
експоненціально,  піддаються дії різних концентрацій досліджуваної
речовини протягом декількох поколінь за визначених умов.

Досліджуваний розчин інкубують протягом періоду 72 годин, під час якого щільність клітин в кожному розчині вимірюється принаймні кожну добу. Гальмування росту визначається відносно контрольної культури.

1.5. КРИТЕРІЇ ЯКОСТІ

Критерії якості повинні застосовуватись як до дослідження граничного вмісту так і до методу повного дослідження.

Щільність клітин в культурах контролю повинна збільшуватись на коефіцієнт щонайменше 16 протягом трьох днів.

Концентрації досліджуваної речовини повинні підтримуватись в межах 80% від початкових концентрацій/протягом періоду, що відповідає тривалості перебігу дослідження.

Для речовин, які легко розчиняються в досліджуваному середовищі, утворюють стабільні розчини тобто ті, які не будуть значною мірою випаровуватись, деградувати, піддаватись гідролізу чи адсорбувати, початкова концентрація може розглядатись як еквівалент номінальній концентрації. Потрібно надавати свідчення того, що концентрація була збережена протягом дослідження та критерії якості були дотримані.

Для речовин які мають наступні властивості:

(i) погано розчиняються в досліджуваному середовищі, або

(ii) можуть утворювати стабільні емульсії чи дисперсії, або

(iii) нестабільні у водних розчинах,

Початковою концентрацією слід вважати концентрацію, яка була виміряна на початку дослідження. Концентрація повинна визначатись після періоду врівноваження.

В будь-якому з цих випадків подальші вимірювання потрібно виконувати протягом дослідження, щоб підтвердити те, що дійсні концентрації піддавання дії чи критерії якості були дотримані.

Визнають, що значні кількості досліджуваної речовини можуть включатися в біомасу водоростей протягом періоду дослідження. Отже, для того, щоб продемонструвати відповідність вищеназваним критеріям якості, як кількість речовини включеної в біомасу водорості так і речовину у розчині (або якщо це технічно не можливо, то виміряну у водомірній колонці) слід взяти до уваги. Однак, оскільки визначення концентрації речовини в біомасі водорості може викликати значні технічні проблеми, відповідність критеріям якості може бути продемонстрована через використання посудини для дослідження при найвищій концентрації, але без водоростей та вимірювання концентрацій в розчині (або, якщо технічно неможливо, у водомірній колонці) на початку та в кінці періоду дослідження.

1.6. ОПИС ПРОЦЕДУРИ ДОСЛІДЖЕННЯ

1.6.1. Реагенти

1.6.1.1. Розчини досліджуваних речовин

Вихідні розчини з необхідною міцністю готують шляхом розчинення речовини в деіонізованій воді або воді згідно пункту 1.6.1.2.

Обрані для дослідження концентрації готують додаючи відповідні аліквоти до попередніх культур водоростей (див. Додаток 1).

Речовини потрібно, як правило, досліджувати лише до границі розчинності. Для деяких речовин (наприклад, речовин, які мають низьку розчинність у воді, або високий показник P , або ті які ow

утворюють скоріше  стабільні  дисперсії,  ніж  істинний  розчин  у
воді),  дозволяється  використовувати тестову концентрацію вищу за
границю   розчинності   речовини,   щоб   забезпечити    отримання
максимально розчинної стабільної концентрації. Важливо, однак, щоб
ця концентрація не  порушувала  іншим  чином  систему  дослідження
(наприклад, плівка речовини на поверхні води перешкоджає насиченню
води киснем, та ін.).

Ультразвукова дисперсія, органічні розчинники, емульгатори чи дисперсанти можуть використовуватись як допоміжні засоби для приготування вихідних розчинів з низькою розчинністю у воді або щоб допомогти диспергувати ці речовини в досліджуваному середовищі. Коли використовуються такі допоміжні речовини, всі досліджувані концентрації повинні вміщувати однакову кількість таких допоміжних речовин, та додаткові контрольні зразки повинні піддаватися дії однакової концентрації допоміжних речовин, як ті, які використовувались в серії досліджень. Концентрація таких допоміжних речовин повинна бути мінімальною, але ні в якому разі не перевищувати 100 мг на л в досліджуваному середовищі.

Дослідження повинно проводитись без регулювання pH. Якщо є свідчення відміченої зміни pH, то рекомендується повторне дослідження з регулюванням pH та записом результатів. В такому випадку, значення pH вихідного розчину повинно узгоджуватись зі значенням pH водного розчину, окрім випадків наявності особливих причин щоб цього не виконувати. З цією метою надається перевага HCl та NaOH. Це регулювання pH повинно бути здійснене таким чином, щоб концентрація досліджуваної речовини у вихідному розчині значно не змінювалась. Якщо трапиться так, що хімічна реакція або фізичний випад осаду досліджуваного компоненту буде викликаний регулюванням, то це потрібно вказати у звіті.

1.6.1.2. Досліджуване середовище

Вода повинна бути дистильованою, належної якості, або -1

деіонізованою з  провідністю  менш  ніж 5 мю S.см  .  Прилади  для
дистиляції води не повинні містити будь-яких частин,  виготовлених
з міді.

Рекомендується наступне середовище.

Готують чотири вихідні розчини згідно наступної таблиці. Вихідні розчини стерилізують фільтрацією через мікропористу мембрану або автоклавну обробку та зберігають в темряві при температурі 4 град.C. Вихідний розчин N 4 потрібно стерилізувати лише фільтруванням через мікропористу мембрану. Ці вихідні розчини розбавляють для того, щоб досягнути кінцевих концентрацій нутрієнта в досліджуваних розчинах.

------------------------------------------------------------------
|  Нутрієнт  |Концентрація у вихідному |  Кінцева концентрація у |
|            |         розчині         |  досліджуваному розчині |
|----------------------------------------------------------------|
|Вихідний розчин 1: макронутрієнти                               |
|----------------------------------------------------------------|
|NH Cl       |         1,5 г/л         |         15 мг/л         |
|  4         |                         |                         |
|MgCl .6H O  |         1,2 г/л         |         12 мг/л         |
|    2   2   |                         |                         |
|CaCl .2H O  |         1,8 г/л         |         18 мг/л         |
|    2   2   |                         |                         |
|MgSO .7H O  |         1,5 г/л         |         15 мг/л         |
|    4   2   |                         |                         |
|KH PO       |        0,16 г/л         |        1,6 мг/л         |
|  2  4      |                         |                         |
|----------------------------------------------------------------|
|Вихідний розчин 2: Fe-ЕДТА                                      |
|----------------------------------------------------------------|
|FeCl .6H O  |         80 мг/л         |        0,08 мг/л        |
|    3   2   |                         |                         |
|Na EDTA.2H O|        100 мг/л         |        0,1 мг/л         |
|  2       2 |                         |                         |
|----------------------------------------------------------------|
|Вихідний розчин 3: мікроелементи                                |
|----------------------------------------------------------------|
|H BO        |        185 мг/л         |        0,185 мг/л       |
| 3  3       |                         |                         |
|MnCl .4H O  |        415 мг/л         |        0,415 мг/л       |
|    2   2   |                         |            -3           |
|ZnCl        |          3 mg/l         |      3 х 10   мг/л      |
|    2       |                         |             -3          |
|CoCl .6H O  |        1,5 мг/л         |     1,5 х 10   мг/л     |
|    2   2   |                         |          -5             |
|CuCl .2H O  |        0,01 мг/л        |        10   мг/л        |
|    2   2   |                         |            -3           |
|Na MoO .2H O|          7 мг/л         |      7 х 10   мг/л      |
|  2   4   2 |                         |                         |
|----------------------------------------------------------------|
|Вихідний розчин 4: NaHCO3                                       |
|----------------------------------------------------------------|
|NaHCO       |          50 г/л         |         50 мг/л         |
|     3      |                         |                         |
------------------------------------------------------------------

Рівень pH середовища після врівноважування з повітрям становить приблизно 8.

1.6.2. Прилади

- Стандартне лабораторне обладнання.

- Пробірки для дослідження відповідного об'єму (наприклад, конусні пробірки ємністю 250 мл придатні, якщо об'єм досліджуваної речовини становить 100 мл). Всі пробірки для дослідження повинні бути однакові в плані матеріалу та розмірів,

- прилади для культивування: кабіна або камера в якій температура в межах від 21 град.C до 25 град.C може підтримуватись на рівні +- 2 град.C, та забезпечувати безперервне однакове освітлення в спектральному діапазоні 400-700 нм. Якщо водорість у культурах контролю досягає рекомендованого темпу росту, то можна припустити, що умови росту, включаючи інтенсивність освітлення є адекватними.

При середньому рівні досліджуваних розчинів рекомендується використовувати, інтенсивність освітлення в межах -2 -1 -2 -1

60 - 120 мю E.м  .s   (35 - 70 x 1018 фотонів.м  .s  ),       якщо
вимірюється  в  межах  значенням   400-700  нм   з   використанням
відповідного рецептора. Для інструментів, що вимірюють освітлення,
каліброваних в люксах, еквівалентним та прийнятним є значення  від
6000 до 10000 лк.

Інтенсивність освітлення можна отримати використовуючи від чотирьох до семи 30 W флуоресцентних ламп універсального білого типу (з кольоровою температурою приблизно 4300 K), на відстані 0,35 м від культури водорості.

- Вимірювання щільності клітин повинні здійснюватись з використанням прямого методу обрахунку живих клітин, наприклад, мікроскопом з камерами для рахування. Однак, інші процедури (фотометрія, нефелометрія, ...) можуть використовуватись, якщо вони достатньо чутливі, та якщо показано, що вони у достатній мірі пов'язані зі щільністю клітин.

1.6.3. Піддослідні організми

Рекомендується, щоб біологічні види зелених водоростей, які використовуються, були видами, які швидко ростуть, що є зручним для культивування та дослідження. Перевага надається наступним видам:

- Selenastrum capricornutum, наприклад, АКТК 22662 or ЦКВН 278/4,

- Scenedesmus subspicatus, наприклад, 86.81 ККВ,

Примітка:

АКТК = Американська колекція типових культур мікроорганізмів (США)

ЦКВН = Центр культур водоростей та найпростіших (Сполучене Королівство Великобританії)

ККВ = Колекція культур водоростей (Геттінген, ФРН)

Якщо використовуються інші біологічні види, то у звіті потрібно зазначити сорт.

1.6.4. Процедура дослідження

Діапазон концентрації, в якому можуть з'являтись впливи, визначається на основі результатів досліджень на визначення діапазону.

Дві одиниці виміру росту (біомаса та темп росту) можуть давати результати із широко не зіставними одиницями значень затримки росту, обидві повинні використовуватись в дослідженні на визначення показників, для того, щоб забезпечити, щоб геометрична прогресія концентрацій надала можливість оцінити як E C , так і b 50

E C  .
 r 50

Початкова щільність клітин

Рекомендується, щоб початкова щільність клітин становила 4

приблизно  10   клітин/мл   для   Selenastrum   capricornutum   та
Scenedesmus  subspicatus.  Якщо  використовуються  інші біологічні
види, то біомаса повинна бути зіставною.

Концентрації досліджуваної речовини

Для дослідження готують щонайменше п'ять концентрацій в геометричній серії відповідно до коефіцієнта концентрації, який не перевищує 2,2. Найнижча досліджувана концентрація не повинна мати помітного впливу на ріст водоростей. Найвища концентрація повинна перешкоджати росту щонайменше на 50% відносно контрольного зразка та, бажано, повністю зупиняти ріст.

Повтори та контролі

План дослідження повинен включати три повтори при кожній досліджуваній концентрації. Проводяться три контролі без досліджуваної речовини, якщо це суттєво, проводяться три контролі з допоміжними речовинами. Якщо це виправдано, то план дослідження може змінюватись для того, щоб збільшити число концентрацій та зменшити число повторів при кожній концентрації.

Проведення дослідження

Досліджувані культури, які містять бажані концентрації досліджуваної речовини та бажану кількість інокулянту водоростей, готуються методом додавання аліквот вихідних розчинів досліджуваної речовини до відповідних кількостей попередніх культур водоростей (див. Додаток 1).

Пробірки з культурами струшують та поміщають у апарат для культивування. Клітини водоростей зберігають в суспензії через струшування, збовтування та барботування повітрям, для того, щоб покращити обмін газами та зменшити варіювання pH в досліджуваних розчинах. Культури повинні зберігатись при температурі в межах від 21 до 25 град.C, контрольованих при +- 2 град.C.

Щільність клітин в кожній пробірці визначається принаймні після 24, 48 та 72 годин після початку дослідження. Відфільтроване середовище водоростей, що містить відповідну концентрацію досліджуваного хімікату, використовується для визначення основи, під час використання вимірювань щільності клітин за непрямих методів обрахунку.

Рівень pH вимірюється на початку дослідження та після 72 годин. Рівень pH в контрольних зразках не повинен, як правило, відхилятись більш ніж на 1,5 одиниці під час дослідження.

Дослідження летких речовин

На даний момент не існує загально прийнятого способу дослідження летких речовин. Якщо відомо, що речовина має схильність до випаровування, то можуть використовуватись закриті тестові пробірки зі збільшеним вільним простором над поверхнею рідини. Можливість дефіциту CO потрібно взяти до уваги під час 2

підрахунку вільного  простору  над  поверхнею  рідини  в  закритих
пробірках.  Варіанти  цього  методу  були  запропоновані  (див.  в
посиланні (4)).

Потрібно робити спроби визначити кількість речовини, яка залишається у розчині, та рекомендується бути надзвичайно обережним під час інтерпретації результатів досліджень летких хімікатів з використанням закритих систем.

Дослідження на граничний вміст

Використовуючи процедури, описані в цьому методі, дослідження на граничний вміст може здійснюватись при 100 мг на літр для того, щоб показати, що EC є більшим ніж ця концентрація. 50

Якщо природа речовини така, що не можливо досягнути концентрації 100 мг на літр у воді для дослідження, то дослідження граничного вмісту повинно здійснюватись при концентрації, яка дорівнює розчинності речовини (або максимальній концентрації, яка утворює стабільні дисперсії) в середовищі, яке використовується (див. також в пункті 1.6.1.1).

Дослідження на граничний вміст повинно здійснюватись принаймні в трьох екземплярах, з таким же числом контрольних зразків. Для дослідження на граничний вміст повинні використовуватись дві одиниці вимірювання росту (біомаса та темп росту).

Якщо у досліджені на граничний вміст зменшення середнього значення різниці між дослідженням на граничний вміст та контрольним зразком досягає 25% або більше у біомасі або темпі росту, то необхідно проводити повне дослідження.

2. ДАНІ ТА ОЦІНЮВАННЯ

Виміряна щільність клітин в досліджуваних культурах та контрольних зразках подаються у формі таблиці разом з концентраціями досліджуваної речовини та часом вимірювань. Середнє значення щільності клітин для кожної концентрації досліджуваної речовини та для контрольних зразків наноситься на графік відповідно до часу (0-72 години), щоб побудувати криві росту.

Для того щоб визначити співвідношення концентрації/впливу, потрібно використовувати два наступних підходи. Деякі речовини можуть стимулювати ріст при низьких концентраціях. Потрібно брати до уваги лише базові точки, що вказують на затримку між 0 та 100%.

2.1. ПОРІВНЯННЯ ДІЛЯНОК ПІД КРИВИМИ РОСТУ

Ділянка між кривими росту та горизонтальною лінією N = N 0 може бути обрахована за формулою:

N  - N         N  + N  - 2N                      N    + N  - 2N
      1    0         1    2     0                      n-1    n     0
 A = ------- x t  + ------------- x (t  - t ) + ... + --------------- x (t  - t   )
        2       1         2           2    1                 2            n    n-1

Де:

A = ділянка

N = число клітин/мл при часі t (початок дослідження),

0                             0

N = виміряне число клітин/мл при t

1                                 1

N = виміряне число клітин/мл на момент часу

t = час першого вимірювання після початку дослідження

t = час вимірювання n після початку дослідження

n                    th

n = кількість проведених вимірювань після початку дослідження.

Відсоток затримки росту клітин при кожній концентрації досліджуваної речовини (I ) обраховується за формулою: A

A  - A
                             c    t
                      I  = --------- x 100
                       A       A
                                c

Де:

A = ділянка між кривою контролю росту та горизонтальною

лінією N = N .
            0

A = ділянка між кривою росту при концентрації t та

горизонтальній лінії N = N .
                          0

I = значення наносяться на графік на напівлогарифмічний

папір,  або  на  напівлогарифмічний  пробіт-папір в залежності від
відповідних концентрацій. Якщо вони наносяться на пробіт-папір, то
всі  одиниці  розміщують на одній прямій лінії,  або візуально або
через комп'ютерну регресію.

EC оцінюється з лінії регресії через зчитування 50

концентрацій,  які еквівалентні  50%  затримки  (I   =  50%).  Щоб
                                                  A
визначити  це значення однозначно відносно цього методу обрахунку,
пропонують  використовувати  символ  E C  .  Важливо,  щоб   E C
                                      b 50                    b 50
вказувався  з  посиланям  на  відповідний  період  піддавання  дії
(наприклад, E C   (0-72 години).
             b 50

2.2. ПОРІВНЯННЯ ТЕМПІВ РОСТУ

Середній питомий темп росту (мю) для культур з експоненціальним ростом може обраховуватись за формулою

ln N  - ln N
                                 n       0
                        мю = -------------

t - t n 0

де t час на початку дослідження. 0

В якості альтернативи, середній питомий темп росту може бути визначений з нахилу лінії регресії на графіку ln N відносно часу.

Відсоток затримки значень питомого темпу росту при кожній концентрації (I ) обраховується за формулою мю t

мю  - мю
                                  c     t
                       I      = ----------
                        мю t       мю
                                     c

Де:

мю = середнє значення контролю питомого темпу росту c

мю = середнє значення питомого темпу росту для досліджуваної t

концентрації t

Зменшення відсотку середнього питомого темпу росту при кожній досліджуваній концентрації в порівнянні зі значенням контролю наноситься на графік відносно логарифму концентрації. EC можна 50

прочитати  з  отриманого  графіку.  Щоб  визначити однозначно EC
                                                                50
отримане цим методом пропонується  використовувати  символ  E C  .
                                                             r 50
Періоди   вимірювань  слід  вказувати,  наприклад,  якщо  значення
відноситься з періодом часу 0 та 72 годин,  то символ  стає  E C
                                                              r 50
(0-72 години).

Примітка: питомий темп росту є логарифмічним терміном, а невеликі зміни темпу росту можуть призвести до великих змін в біомасі. Отже, значення E C та E C не можна чисельно порівнювати. b r

2.3. ОБРАХУНОК ВВВК

Відсутність Видимого Впливу Концентрації визначається через відповідну статичну процедуру для вибіркового порівняння багатьох вибірок (наприклад, аналіз варіативності та тест Дуннетта), з використанням значень ділянок кривої росту А окремих реплікантів (див. в пункт 2.1.) або питомий темп росту (див. в пункт 2.2.).

3. ЗВІТУВАННЯ

Звіт про дослідження, якщо можливо, повинен містити наступну інформацію:

- досліджувана речовина: дані хімічної ідентифікації,

- піддослідні організми: походження, лабораторна культура, номер породи, метод культивування,

- умови дослідження:

- дати початку та кінця дослідження та його тривалість,

- температура,

- склад середовища,

- прилади для культивування,

- pH розчинів на початку та в кінці дослідження (a якщо спостерігаються відхилення від норми pH більше ніж на 1,5 одиниці, то повинно надаватися пояснення),

- розчинник та метод, який використовується для розчинення досліджуваної речовини та концентрація розчинника в досліджуваних розчинах,

- інтенсивність та якість освітлення,

- концентрації, що досліджуються (виміряні або номінальні).

- результати:

- щільність клітин для кожної пробірки, на кожній точці вимірювання та метод вимірювання щільності клітин,

- середнє значення щільності клітин,

- криві росту,

- графічне представлення співвідношення концентраційного ефекту,

- значення EC та метод обрахунку,

- ВВВК,

- інші ефекти, які спостерігаються.

4. ПОСИЛАННЯ

(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 201, Decision of the Council C(81) 30 Final.

(2) Umweltbundesamt, Berlin, 1984, Verfahrensvorschlag 'Hemmung der Zellvermehrung bei der Grunalge Scenedesmus subspicatus', in: Rudolph/Boje: bkotoxikologie, ecomed, Landsberg, 1986.

(3) ISO 8692 - Water quality - Fresh water algal growth inhibition test with Scenedesmus subspicatusand Selenastrum capricornutum.

(4) S.Galassi and M.Vighi - Chemosphere, 1981, vol. 10, 1123-1126.

Додаток 1

Зразок процедури вирощування водоростей

Загальні спостереження

Метою вирощування, на основі попередньої процедури, є отримання культур водоростей для проведення токсикологічних випробувань.

Необхідно застосовувати відповідні методи для попередження зараження водоростевих культур бактеріями (ISO 4833). Аксенічні культури є бажаними, проте необхідною умовою є наявність альголічно чистих культур.

Всі операції повинні проводитися в умовах стерильності з метою уникнення зараження бактеріями та іншими видами водоростей. Заражені культури мають вибраковуватися.

Процедури, необхідні для отримання водоростевих культур

Підготовка поживних розчинів (середовищ):

Необхідне середовище можливо підготувати шляхом розведення основного концентрованого розчину поживних речовин. Для отримання твердого середовища додають 0,8% агару. Використовуване середовище повинне бути стерильним. Стерилізація в автоклаві може призвести до втрати NH . 3

Вихідна культура:

Вихідні культури - це дрібні водоростеві культури, що регулярно переносяться у свіже середовище у якості матеріалу для попередніх досліджень. Якщо ці культури не використовуються регулярно, їх сіють штрихом у пробірках зі скошеним поживним агарним середовищем. Такі культури переносять у свіже середовище щонайменше раз на два місяці.

Вихідні культури сіються у конічних колбах, що містять необхідне середовище (об'ємом близько 100 мл). Якщо водорості вирощуються за температури 20 град.C при постійному освітленні, необхідно переносити їх щотижня.

В процесі перенесення відбирається певна кількість "старої" культури та переноситься у колбу зі свіжим середовищем за допомогою стерильних піпеток таким чином, що для швидкоростучих видів початкова концентрація є приблизно у 100 разів меншою, ніж у старій культурі.

Швидкість росту для того чи іншого виду можна визначити за допомогою кривої росту. За наявності таких відомостей можливо розрахувати щільність, за якої певну культуру слід переносити у нове середовище. Це необхідно зробити, перш ніж культура досягне фази деградації.

Прекультура:

Прекультура має давати необхідну для посіву тест-культур кількість водоростей. Прекультура вирощується за умов дослідження та використовується, доки ще продовжується її експоненційне зростання, як правило, після спливання приблизно трьох днів інкубаційного періоду. У разі, якщо водоростеві культури містять деформовані або аномальні клітини, такі культури мають вибраковуватися.

Додаток 2

Стандарт якості води ІСО 8692 - Міжлабораторна перевірка на затримку росту водоростей у свіжій воді для видів Scenedesmus subspicatus та Selenastrum capricornutum, проведена в 16 лабораторіях із використанням дихромату калію, дала наступні результати:

------------------------------------------------------------------
|                   | Середні значення (мг/л) |  Діапазон (мг/л) |
|-------------------+-------------------------+------------------|
|E C   (0-72 год)   |        0,84 0,53        | від 0,60 до 1,03 |
| r 50              |                         |                  |
|E C   (0-72 год)   |                         | від 0,20 до 0,75 |
| b 50              |                         |                  |
------------------------------------------------------------------

C.4. ВИЗНАЧЕННЯ "ПОВНОЇ" БІОРОЗКЛАДНОСТІ

ЧАСТИНА I. ЗАГАЛЬНІ ПОЛОЖЕННЯ

I.1. ВСТУП

Описано шість методів дослідження, що дозволяють перевірку хімічної речовини на предмет повної біорозкладності в аеробному водному середовищі:

(a) Розкладання розчиненого органічного вуглецю (РОВ) (Метод C.4-A)

(b) Модифікована перевірка ОЕСР - Розкладання РОВ (Метод C.4-B)

Штурма) (Метод C.4-C)

(d) Манометрична спірометрія (Метод C.4-D)

(e) Закрита посудина (Метод C.4-E)

(f) ММТП (Міністерство міжнародної торгівлі та промисловості - Японія) (Метод C.4-F)

Загальні та спільні міркування стосовно всіх шести методів наведено у Частині I кожного методу. Особливості кожного конкретного методу наведено в Частинах II-VII. У додатках містяться визначення, формули та інструктивна документація.

Міжлабораторний зіставний аналіз ОЕСР, проведений 1988 року, продемонстрував, що всі ці методи дають надійні результати. Однак залежно від фізичних характеристик речовини, що підлягає дослідженню, може бути надано перевагу тому чи іншому методу.

I.2. ВИБІР НАЛЕЖНОГО МЕТОДУ

Для вибору найбільш доречного методу необхідна інформація про розчинність, тиск пари та адсорбційні характеристики. Необхідно також знати хімічну структуру формули для підрахунку теоретичних та/або отриманих у результаті контрольного вимірювання значень параметрів, наприклад, ТПК, ТВГ, РОВ, ЗОВ, ХПК (див. Додатки 1 та 2).

Досліджувані хімічні речовини, що розчиняються у воді принаймні до 100 мг/л, можуть підлягати оцінюванню за допомогою будь-якого з методів за умови, що вони не є леткими або адсорбуючими. Методи, що підходять для хімічних речовин, які погано розчиняються у воді, є леткими або адсорбуючими, вказано у Таблиці 1. Спосіб роботи зі слабко водорозчинними та леткими хімічними речовинами описано в Додатку 3. Помірно леткі хімічні речовини можуть підлягати дослідженню за допомогою методу розкладання РОВ за умови, що у дослідних посудинах (закоркованих належним чином) достатній об'єм для газу. В такому разі необхідне встановлення абіотичного регулювання з урахуванням будь-яких фізичних втрат.

Таблиця 1: Застосовність методів дослідження

------------------------------------------------------------------
|  Дослідження |Метод аналізу |   Підходить для речовин, що є:   |
|              |              |----------------------------------|
|              |              |    слабко   |леткими|адсорбуючими|
|              |              |  розчинними |       |            |
|--------------+--------------+-------------+-------+------------|
|Розкладання   |Розчинений    |      -      |   -   |    +/-     |
|РОВ           |органічний    |             |       |            |
|              |вуглець       |             |       |            |
|--------------+--------------+-------------+-------+------------|
|Мод.          |Розчинений    |      -      |   -   |    +/-     |
|розкладання   |органічний    |             |       |            |
|ОЕСР          |вуглець       |             |       |            |
|--------------+--------------+-------------+-------+------------|
|Виділення CO  |Спірометрія:  |      +      |   -   |      +     |
|            2 |виділення CO  |             |       |            |
|              |            2 |             |       |            |
|--------------+--------------+-------------+-------+------------|
|Манометрична  |Манометрична  |      +      |  +/-  |      +     |
|спірометрія   |спірометрія:  |             |       |            |
|              |поглинання    |             |       |            |
|              |кисню         |             |       |            |
|--------------+--------------+-------------+-------+------------|
|Закрита       |Спірометрія:  |     +/-     |   +   |      +     |
|посудина      |розчинений    |             |       |            |
|              |кисень        |             |       |            |
|--------------+--------------+-------------+-------+------------|
|ММТП          |Спірометрія:  |      +      |  +/-  |      +     |
|              |поглинання    |             |       |            |
|              |кисню         |             |       |            |
------------------------------------------------------------------

Для інтерпретації отриманих результатів необхідна інформація про чистоту або відносні пропорції основних компонентів матеріалу для дослідження, особливо якщо ці результати є низькими або граничними.

Інформація про токсичність досліджуваної хімічної речовини відносно бактерій (Додаток 4) може бути надзвичайно корисною при виборі необхідної для дослідження концентрації, а також важливою для правильної інтерпретації низьких значень біорозкладності.

I.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ

З метою перевірки процедури еталонні хімічні речовини, що відповідають критеріям повної біорозкладності, досліджують шляхом встановлення відповідної колби одночасно із серією звичайних дослідів.

Для цього підходять такі хімічні речовини, як анілін (свіжоперегнаний), ацетат натрію та бензоат натрію. Всі ці еталонні хімічні речовини розкладаються при використанні цих методів навіть без спеціального додавання посівного матеріалу.

Було внесено пропозицію стосовно пошуку еталонної хімічної речовини, повністю біорозкладної, але водночас такої, що потребувала б додавання посівного матеріалу. З цією метою було запропоновано гідрофталат калію, однак необхідно отримати більше даних стосовно цієї речовини перед визнанням її прийнятною еталонною речовиною.

Під час проведення спірометричних досліджень сполуки, що містять азот, можуть вплинути на поглинання кисню через нітрифікацію (див. Додатки 2 та 5).

I.4. ПРИНЦИП МЕТОДІВ ДОСЛІДЖЕННЯ

Розчин або суспензія досліджуваної речовини у мінеральному середовищі засівається та інкубується в аеробних умовах у темряві або при розсіяному освітленні. Кількість РОВ у розчині для аналізу, пов'язана з посівним матеріалом, має підтримуватися на якомога нижчому рівні порівняно з кількістю РОВ, пов'язаною з досліджуваною речовиною. Враховується також ендогенна активність посівного матеріалу, для чого паралельно проводяться "сліпі" досліди із використанням посівного матеріалу, але без досліджуваної речовини, хоча ендогенна активність клітин за наявності такої речовини не буде точно відповідати активності при ендогенному контролі. Паралельно аналізується еталонна речовина з метою перевірки дії процедур.

В цілому, після розкладання відбувається визначення таких параметрів, як РОВ, виділення CO поглинання кисню; при цьому 2

через  достатньо  невеликі  проміжки  часу  робляться  заміри  для
визначення  початку та кінця процесу біорозкладання.  За допомогою
автоматичних респірометрів постійно проводиться вимірювання. Іноді
РОВ  вимірюється  на  доповнення до іншого параметру,  але це,  як
правило,  робиться лише на початку та  наприкінці  дослідження.  З
метою  оцінювання первинного розкладання досліджуваної речовини та
визначення  концентрації  будь-яких  утворених  проміжних  речовин
також    можливе   проведення   спеціального   хімічного   аналізу
(обов'язково для дослідження ММТП).

Як правило, дослідження триває 28 днів. Однак дослідження можуть завершитися і швидше, ніж за 28 днів, щойно крива біорозкладання сягне плато щонайменше для трьох замірів. Дослідження можуть також продовжуватися і по закінченні 28 днів, якщо крива демонструє, що процес біорозкладання почався, але станом на 28-й день плато досягнуто не було.

I.5. КРИТЕРІЇ ЯКОСТІ

I.5.1. Відтворюваність

З урахуванням природи біорозкладання та змішаних популяцій бактерій, що використовуються як посівний матеріал, заміри мають проводитися щонайменше по два рази.

Досвід підтверджує, що чим більша концентрація мікроорганізмів, початково доданих у досліджуване середовище, тим менше буде розбіжність між репліками. Кільцеві дослідження також продемонстрували, що можливі суттєві розбіжності між результатами, отриманими в різних лабораторіях, але для сполук, що легко біорозкладаються, як, правило, рівень узгодженості доволі високий.

I.5.2. Достовірність дослідження

Дослідження вважається достовірним, якщо різниця між крайніми повторюваними відщеплення досліджуваної хімічної речовини на стадії плато наприкінці дослідження або наприкінці 10-денного проміжку часу, відповідно, менша за 20%, а також якщо процент розкладання еталонної речовини сягнув рівня повної біорозкладності на 14-й день. Якщо не виконується будь-яка з цих умов, дослідження необхідно повторити. З огляду на високу точність вищезгаданих методів низькі значення не обов'язково означають, що досліджувана речовина не є біорозкладною в умовах навколишнього середовища; вони можуть вказувати на те, що необхідно провести додаткові дослідження для встановлення біорозкладності.

Якщо при проведенні токсикологічного дослідження, що включало в себе як досліджувану речовину, так і еталонну хімічну речовину, рівень розкладання протягом 14 днів склав менш ніж 35% (за ознакою РОВ) або менш ніж 25% (за ознакою ТПК або ТВГ), можна припустити, що досліджувані хімічні речовини є інгібуючими (див. також Додаток 4). В такому разі необхідно повторити серію дослідів, за можливості зменшивши концентрацію досліджуваної хімічної речовини та/або підвищивши концентрацію посівного матеріалу, але не більше, ніж до 30 мг сухих речовин на літр.

I.6. ЗАГАЛЬНІ ПРОЦЕДУРИ ТА ПІДГОТОВКА

Загальні умови дослідження підсумовані у Таблиці 2. Матеріали для дослідів та інші умови експериментів, що стосуються безпосередньо конкретних дослідів, описані нижче під заголовками відповідних дослідів.

Таблиця 2 Умови дослідження

-----------------------------------------------------------------------------------
| Дослідження |Розкладання|Виділення| Манометрична|Модифікована| Закрита| ММТП (I)|
|             |    РОВ    |   CO    |респірометрія|  перевірка |посудина|         |
|             |           |     2   |             |    ОЕСР    |        |         |
|-------------+-----------+---------+-------------+------------+--------+---------|
|Концентрація |           |         |             |            |        |         |
|досліджуваної|           |         |             |            |        |         |
|речовини     |           |         |             |            |        |         |
|-------------+-----------+---------+-------------+------------+--------+---------|
|у мг/л       |           |         |     100     |            |  2-10  |   100   |
|-------------+-----------+---------+-------------+------------+--------+---------|
|мг РОВ/л     |   10-40   |  10-20  |             |    10-40   |        |         |
|-------------+-----------+---------+-------------+------------+--------+---------|
|мг ТПК/л     |           |         |    50-100   |            |  5-10  |         |
|-------------+-----------------------------------+------------+--------+---------|
|Концентрація |           <= 30 мг/л ТЗ           |   0,5 мл   |<= 5 мл | 30 мг/л |
|посівного    |      або <= 100 мг витоку/л       | вторинного |витоку/л|ТЗ       |
|матеріалу (у |                7   8              |  витоку/л  |   4    |   7   8 |
|клітинах/л,  |             (10 -10 )             |       5    |(10 -   |(10 -10 )|
|приблизно)   |                                   |    (10 )   |  6     |         |
|приблизно)   |                                   |            |10 )    |         |
|-------------+------------------------------------------------+--------+---------|
|Концентрація |                                                |        |         |
|елементів у  |                                                |        |         |
|мінеральному |                                                |        |         |
|середовищі (у|                                                |        |         |
|мг/л):       |                                                |        |         |
|-------------+------------------------------------------------+--------+---------|
|P            |116                                             |11,6    |    29   |
|-------------+------------------------------------------------+--------+---------|
|N            |1,3                                             |0,13    |   1,3   |
|-------------+------------------------------------------------+--------+---------|
|Na           |86                                              |8,6     |  17,2   |
|-------------+------------------------------------------------+--------+---------|
|K            |122                                             |12,2    |  36,5   |
|-------------+------------------------------------------------+--------+---------|
|Mg           |2,2                                             |2,2     |   6,6   |
|-------------+------------------------------------------------+--------+---------|
|Ca           |9,9                                             |9,9     |  29,7   |
|-------------+------------------------------------------------+--------+---------|
|Fe           |0,05-0,1                                        |0,05-   |  0,15   |
|             |                                                |0,1     |         |
|-------------+---------------------------------------------------------+---------|
|pH           |                        7,4 +- 0,2                       |переважно|
|             |                                                         |   7,0   |
|-------------+---------------------------------------------------------+---------|
|Температура  |                       22 +- 2 град.C                    |25 +-    |
|             |                                                         |1 град.C |
-----------------------------------------------------------------------------------

РОВ = Розчинений органічний   ТПК = Теоретична потреба   ТЗ = Твердий завис
       вуглець                       в кисн

I.6.1. Вода для розведення

Для розведення використовується деіонізована або дистильована вода, вільна від інгібуючих концентрацій токсичних речовин ++

(наприклад, іонів Cu ). Вміст органічного вуглецю у ній має становити не більш ніж 10% від матеріалу дослідження. Для виключення високих порожніх значень необхідний високий рівень чистоти води для дослідження. Забруднення може бути спричинене як невіддільними домішками, так і іонообмінними смолами та продуктами лізису бактерій і водоростей. У кожній серії дослідів має використовуватися лише одна порція води, попередньо перевірена шляхом аналізу РОВ. Подібна перевірка не є обов'язковою для методу закритої посудини, однак рівень поглинання кисню для води має бути низьким.

I.6.2.Основні розчини мінеральних компонентів

Для приготування досліджуваних розчинів готуються основні розчини мінеральних компонентів відповідної концентрації. Нижчезазначені розчини (із різними коефіцієнтами розведення) можуть використовуватися при застосуванні методів розкладання РОВ, модифікованої перевірки ОЕСР, виділення CO , манометричної 2

спірометрівї та закритої посудини.

Коефіцієнти розведення, а також особливості приготування мінерального середовища (для дослідження ММТП) наведено під заголовками конкретних дослідів.

Основні розчини:

Наступні основні розчини має бути приготовано із використанням хімічно чистих речовин.

(a) Монофосфат калію, KH PO 8,50 g 2 4

Гідрофосфат калію, K HPO 21,75 g 2 4

Двозаміщений фосфорнокислий натрій Na HPO . 2 H O 33,40 g 2 4 2

Хлорид аммонію, NH Cl 0,50 g 4

Розчинити у воді і довести до об'єму 1 л. Водневий показник розчину має становити 7,4.

(b) Хлорид кальцію, безводний, CaCl 27,50 g 2

або Дигідрат хлориду кальцію, CaCl . 2 H O 36,40 g 2 2

Розчинити у воді і довести до об'єму 1 л

(d) Гексагідрат хлориду заліза (III), FeCl . 6H O 0,25 g 3 2

Розчинити у воді і довести до об'єму 1 л

Примітка: щоб уникнути необхідності готувати цей розчин безпосередньо перед використанням, додайте одну краплину концентрованого HCl або 0,4 г двонатрієвої солі етилендіамінтетраоцтової кислоти (ЕДТО) на літр.

I.6.3. Основні розчини хімічних речовин

Розчиніть, наприклад, 1-10 г, відповідно, досліджуваної або еталонної хімічної речовини в деіонізованій воді та доведіть до об'єму 1 л, коли розчинність перевищує 1 г/л. В іншому разі приготуйте основні розчини у мінеральному середовищі або ж додайте хімічну речовину безпосередньо в мінеральне середовище. Стосовно роботи з менш розчинними хімічними речовинами див. Додаток 3; слід зауважити, однак, що при досліджуванні ММПТ (Метод C.4-F) не повинні використовуватися ані розчинники, ані емульгатори.

I.6.4. Посівні матеріали

Посівний матеріал може бути взято з цілого ряду джерел, серед яких активований мул, очищені стічні води (нехлоровані), поверхневі води та ґрунти або ж їх суміш. Якщо при дослідженнях за методами розкладання РОВ, виділення CO та манометричної 2

спірометрії використовуються активований мул,  він має бути взятий
із  очисної станції або лабораторної установки,  до яких надходять
переважно комунально-побутові стічні  води.  Посівні  матеріали  з
інших  джерел,  згідно  зі  спостереженнями,  дають більший розкид
результатів.  Для дослідження за методами модифікованої  перевірки
ОЕСР  та  закритої  посудини  необхідний більш розведений посівний
матеріал без пластівців мулу; найбільш бажаним джерелом є вторинні
стічні води із водоочисної станції або лабораторної установки,  що
переробляють комунально-побутові стічні води. Для дослідження ММТП
посівний матеріал має бути взято із декількох джерел; він описаний
під заголовком цього конкретного дослідження.

I.6.4.1. Посівний матеріал із активованого мулу

Візьміть свіжий зразок активованого мулу з аераційного резервуару станції очищення стічних вод або лабораторної установки, що переробляють переважно комунально-побутові стічні води. За необхідності відфільтруйте крупні частинки через сито з дрібними отворами, після чого утримуйте мул в аеробному стані.

У якості альтернативи можливе відстоювання або центрифугування (наприклад, 100 г на 10 хв.) після усунення всіх крупних частинок. Слід усунути надосадову рідину. Мул можна промити у мінеральному середовищі. Підвісьте концентрований мул у мінеральному середовищі, щоб досягти концентрації у 3-5 г твердої зависі на літр та аеруйте по мірі необхідності.

Мул має бути взято із працюючої станції звичайного типу. Якщо мул береться із високошвидкісної очисної установки або може містити інгібітори, його слід промити. Необхідно відстояти або центрифугувати повторно підвішений мул після ретельного перемішування, усунути надосадову рідину та знову підвісити промитий мул у наступній порції мінерального середовища. Цю процедуру слід повторювати, поки мул не можна буде вважати вільним від надмірного субстрату або інгібіторів.

Після завершення повторного підвішування або при наявності необробленого мулу слід узяти зразок безпосередньо перед використанням з метою визначення сухої ваги твердої зависі.

Ще однією альтернативою є гомогенізація активованого мулу (3-5 г твердої зависі на літр). Для цього необхідна обробка мулу у механічному змішувачі на середній швидкості протягом двох хвилин. Перемішаний мул слід відстояти 30 хв. або довше за необхідності та декантувати рідину для використання у якості посівного матеріалу у розмірі 10 мілль мінерального середовища.

I.6.4.2. Інші джерела посівного матеріалу

Посівний матеріал може бути отримано із вторинних стічних вод водоочисної станції або лабораторної установки, що переробляють переважно комунально-побутові стічні води. Необхідно взяти свіжий зразок і транспортувати його в аеробних умовах. Після цього слід дозволити йому відстоятися протягом години або ж просіяти через фільтрувальний папір грубого очищення та зберігати зціджені стічні води або аеробний фільтрат до виникнення потреби. Подібний вид посівного матеріалу може використовуватися у співвідношенні 100 мл на літр середовища.

Ще одним джерелом посівного матеріалу можуть бути поверхневі води. В такому випадку слід взяти зразок придатних стічних вод (наприклад, ріки, озера тощо) та зберігати в аеробних умовах до виникнення потреби. За необхідності посівний матеріал може бути сконцентровано шляхом фільтрування або центрифугування.

I.6.5. Попередня обробка посівних матеріалів

Посівні матеріали можуть бути попередньо підготовлені до умов експерименту, однак не преадаптовані до досліджуваної хімічної речовини. Попередня підготовка полягає в аерації активованого мулу у мінеральному середовищі або вторинних стічних водах протягом 5-7 днів за температури дослідження. Іноді попередня підготовка підвищує точність методів дослідження шляхом зменшення порожніх значень. Попередня підготовка посівних матеріалів ММТП не вважається необхідною.

I.6.6. Абіотичне регулювання

За необхідності слід перевірити можливість абіотичного розкладання досліджуваної речовини шляхом визначення відщеплення РОВ, поглинання кисню або виділення вуглекислого газу в стерильних контролях без посівного матеріалу. Необхідна стерилізація шляхом фільтрації через мембрану (0,2-0,45 мкм) або додавання придатної токсичної речовини у відповідній концентрації. При фільтруванні через мембрану необхідно брати зразки в асептичних умовах для збереження стерильності. У разі, якщо попередньо не було виключено адсорбцію досліджуваної хімічної речовини, дослідження, до яких входить вимірювання біорозкладання через відщеплення РОВ, особливо з посівними матеріалами із активованого мулу, мають також включати абіотичне регулювання із засіванням та отруєнням.

I.6.7. Кількість колб

Кількість колб у типовому циклі описана під заголовком кожного з дослідів.

Можуть бути використані наступні види колб:

- пробна суспензія: містить досліджувану речовину та посівний матеріал

- холоста проба посівного матеріалу: містить лише посівний матеріал

- процедурний контроль: містить еталону речовину та посівний матеріал

- абіотичний стерильний контроль: стерильний, містить досліджувану речовину (див. 1.6.6)

- адсорбційний контроль: містить досліджувану речовину, посівний матеріал та стерилізуючий засіб

- контроль токсичності: містить досліджувану речовину, еталонну речовину та посівний матеріал

Обов'язковою вимогою є паралельне проведення замірів пробної суспензії та холостого посівного матеріалу. Рекомендується також паралельне проведення замірів у інших колбах.

Однак така можливість може існувати не завжди. Слід пересвідчитися, що взята достатня кількість зразків або показників для оцінки процентного значення відщеплення протягом 10-денного інтервалу.

I.7. ДАНІ ТА ОЦІНЮВАННЯ

При розрахунку D , процентного значення розкладання, t

використовуються   середні  значення  при  повторному  вимірюванні
параметрів в  обох  дослідних  посудинах  та  холостому  посівному
матеріалі.  Відповідні  формули  наведені  нижче  у  розділах,  що
стосуються  конкретних  дослідів.  Хід  розкладання   відображений
графічно із зазначенням 10-денного інтервалу. Необхідно вирахувати
та зафіксувати процентне значення відщеплення, отримане наприкінці
10-денного  інтервалу,  та  значення  стадії  плато або наприкінці
дослідження за необхідністю.

При спірометричному дослідженні азотовмісні сполуки можуть вплинути на поглинання кисню через нітрифікацію (див. Додатки 2 та 5).

I.7.1. Вимірювання розкладання шляхом визначення РОВ

Процентне значення розкладання D при кожному взятті зразка t

має підраховуватися окремо для колб із досліджуваною речовиною  із
використанням  середніх  значень  повторних  замірів  РОВ  з метою
оцінювання  достовірності  дослідження  (див.  1.5.2).  Для   його
підрахування застосовується наступне рівняння:

C  - C
                               t    bt
                    D  = (1 - ---------) x 100

t C - C o bo

D = % розкладання за час t

C = середнє значення початкової концентрації РОВ у посівному

культуральному середовищі,   що   містить   досліджувану  речовину
(мг РОВ/л)

C = середнє значення концентрації РОВ у посівному

культуральному  середовищі,  що містить досліджувану речовину,  за
час t (мг РОВ/л)

C = середнє значення початкової концентрації РОВ у холостій

пробі посівного мінерального середовища (мг РОВ/л)

C = середнє значення концентрації РОВ у холостій пробі

посівного мінерального середовища за час t (мг РОВ/л).

Всі значення концентрації вимірюються експериментальним шляхом.

I.7.2. Вимірювання розкладання шляхом окремого аналізу

За наявності конкретних даних аналізу значення первинного біорозкладання підраховується за наступною формулою:

S  - S
                                 b    a
                          D  = --------- x 100
                           t       S
                                    b

де:

D = % розкладання за час t, як правило, 28 днів;

S = залишкова кількість досліджуваної речовини у посівному

середовище наприкінці дослідження (мг);

S = залишкова кількість досліджуваної речовини при сліпому

дослідженні з використанням води/середовища,  до якого було додано
лише досліджувану речовину (мг).

1.7.3. Абіотичне розкладання

При використанні абіотичного стерильного контролю процентне значення абіотичного розкладання вираховується за формулою:

C     - C
                                  s(o)    s(t)
     % абіотичного розкладання = ------------- x 100
                                      C
                                       s(o)

де:

C = концентрація РОВ при стерильному контролі у день 0

s(o)

C = концентрація РОВ при стерильному контролі у день t.

s(t)

I.8. ЗВІТУВАННЯ

Звіт про дослідження за можливості має включати інформацію про:

- досліджувану й еталонну речовини та їхню чистоту;

- умови дослідження;

- посівний матеріал: природу та місце відбору проб, концентрацію та будь-які процедури з попередньої підготовки;

- частку та природу промислових відходів, наявних у стічних водах, якщо вона відома;

- тривалість та температура дослідження;

- у разі використання слабкорозчинних досліджуваних хімічних речовин - проведену обробку;

- для будь-якої зміни процедури має бути наведено застосований метод дослідження, наукове обґрунтування та пояснення;

- лист даних;

- будь-які спостережені явища інгібування;

- будь-яке спостережене абіотичне розкладання;

- конкретні дані хімічних аналізів (за наявності);

- дані аналізів проміжних продуктів (за наявності);

- графік відношення процентного значення розкладання до часу для досліджуваних та еталонних речовин; мають бути чітко вказані латентна фаза, фаза розкладання, 10-денний інтервал та кутовий коефіцієнт (Додаток 1). За умови відповідності дослідження критеріям застосовності середнє процентне значення розкладання в колбах із досліджуваною речовиною може бути використано для побудови графіка;

- процентне значення відщеплення після 10-денного інтервалу, а також на стадії плато або наприкінці дослідження.

ЧАСТИНА II. ДОСЛІДЖЕННЯ ЗА МЕТОДОМ РОЗКЛАДАННЯ РОВ (Метод C.4-A)

II.1. ПРИНЦИП МЕТОДУ

Виміряний об'єм посівного мінерального середовища, що містить відому концентрацію досліджуваної речовини (10-40 мг РОВ/л) як номінального єдиного джерела органічного вуглецю, аерується в темряві або при розсіяному світлі за температури 22 +- 2 град.C.

Розкладання супроводжується аналізом РОВ через короткі проміжки часу протягом 28-денного періоду. Ступінь біорозкладання вираховується шляхом вираження концентрації відщепленого РОВ (із поправкою на це при контролі холостої проби посівного матеріалу) через відсоток від початкової концентрації. Ступінь первинного біорозкладання також може бути вирахувано за допомогою додаткового хімічного аналізу, що проводиться на початку та наприкінці інкубації.

II.2. ОПИС МЕТОДУ

II.2.1. Обладнання

(a) конічні колби, напр., від 250 мл до 2 л, залежно від об'єму, необхідного для аналізу РОВ;

(b) апарат для струшування, в якому мають бути розміщені конічні колби, з автоматичним регулюванням температури або ж такий, що використовується в приміщенні з постійною температурою; його потужність має бути достатньою, щоб підтримувати аеробні умови в усіх колбах;

(d) аналізатор РОВ;

(e) прилад для визначення розчиненого кисню;

(f) центрифуга.

II.2.2. Приготування мінерального середовища

Щодо приготування основних розчинів див. I.6.2.

Необхідно змішати 10 мл розчину (a) та 800 мл води для розчинення, додати 1 мл розчинів (b) до (d) та довести до 1 л за допомогою води для розчинення.

II.2.3. Приготування та попередня підготовка посівного матеріалу

Посівний матеріал може бути взято з ряду джерел, серед яких активований мул, очищені стічні води, поверхневі води, ґрунти або їх суміш.

Див. I.6.4., I.6.4.1., I.6.4.2. та I.6.5.

II.2.4. Підготовка колб

Як приклад, можна помістити по 80-мілілітровій порції мінерального середовища у 21 конічну колбу та додати достатню кількість основних розчинів досліджуваних та еталонних речовин в окремі колби, щоб досягти концентрації хімічного еквіваленту 1-40 мг РОВ/л. Слід перевірити значення водневого показника та за необхідності привести його до 7,4. Після цього необхідно засіяти в колби активований мул або інше джерело посівного матеріалу (див. I.6.4.); при цьому остаточна концентрація не має перевищувати 30 мг твердої зависі на літр. Також слід підготувати контроль посівного матеріалу в мінеральному середовищі, однак без використання досліджуваної або еталонної хімічної речовини.

За необхідності слід використати одну посудину з метою перевірки можливої інгібуючої дії досліджуваної хімічної речовини шляхом посіву в мінеральному середовищі розчинів порівнянної концентрації як досліджуваної, так і еталонної хімічної речовини.

Окрім цього, якщо є підозра, що досліджувана хімічна речовина активно адсорбується на склі, мулі тощо, необхідно провести попереднє оцінювання з метою визначення ймовірного ступеня адсорбування і, отже, придатність такого дослідження для цієї хімічної речовини (див. Таблицю 1). Необхідно встановити колбу із досліджуваною речовиною, посівним матеріалом та стерилізуючим засобом.

Додаванням мінерального середовища слід довести об'єм у всіх колбах до 1 л і після змішування взяти з кожної колби зразок із метою визначення первинної концентрації РОВ (див. Додаток 2.4). Слід закрити отвори в колбах, наприклад, алюмінієвою фольгою, таким чином, щоб лишалась можливість вільного повітрообміну між колбою та оточуючим середовищем. Після цього слід помістити посудини в апарат для струшування та розпочати дослід.

II.2.5. Кількість колб у типовому циклі

Колби 1 та 2: Пробна суспензія

Колби 3 та 4: Холоста проба посівного матеріалу

Колба 5: Процедурний контроль

Бажано та за необхідності:

Колба 6: Абіотичний стерильний контроль

Колба 7: Адсорбційний контроль

Колба 8: Контроль токсичності

Див. також I.6.7.

II.2.6. Проведення досліду

Під час проведення досліду необхідно визначити концентрацію РОВ у кожній колбі двічі через визначені проміжки часу, достатньо часто, щоб була можливість визначити початок 10-денного інтервалу та процентне значення відщеплення наприкінці 10-денного інтервалу. Кожного разу слід брати мінімальний об'єм досліджуваної зависі, необхідний для визначення.

Перед відбором зразків слід надійно забезпечити втрати на випаровування з колб шляхом додавання води для розчинення (I.6.1) у необхідному об'ємі. Слід ретельно перемішати культуральне середовище перед забором зразка та пересвідчитися, що матеріал, який пристав до стінок посудин, розчинено або суспендовано перед відбором зразків. Зразок необхідно відфільтрувати через мембрану або центрифугувати (див. Додаток 2.4) відразу ж після забору. Відфільтровані або центрифуговані зразки слід аналізувати того ж дня або ж зберігати за температури 2-4 град.C не більш ніж 48 годин, або ж довше за температури - 18 град.C.

II.3. ДАНІ ТА ЗВІТУВАННЯ

II.3.1. Обробка результатів

Необхідно вирахувати процентне значення розкладання за час t згідно з I.7.1 (визначення РОВ) або ж, факультативно, згідно I.7.2 (спеціальний аналіз).

Необхідно занести всі результати в надані листи даних.

II.3.2. Достовірність результатів

Див. I.5.2.

II.3.3. Звітування

Див. I.8.

II.4. ЛИСТ ДАНИХ

Нижче наведено зразок листа даних.

ДОСЛІДЖЕННЯ РОЗКЛАДАННЯ РОВ

1. ЛАБОРАТОРІЯ

2. ДАТА ПОЧАТКУ ДОСЛІДЖЕННЯ

3. ДОСЛІДЖУВАНА РЕЧОВИНА

Назва:

Концентрація основного розчину: ... мг/л як хімічна речовина

Початкова концентрація в середовищі, до: ... мг/л як хімічна речовина

4. ПОСІВНИЙ МАТЕРІАЛ

Джерело:

Проведена обробка:

Попередня підготовка (за наявності):

Концентрація твердої зависі у реакційній суміші: мг/л

5. ВИЗНАЧЕННЯ ВУГЛЕЦЮ

Карбоаналізатор:

------------------------------------------------------------------
|                      | N колби |            |РОВ після n днів  |
|                      |         |            |(мг/л)            |
|                      |         |            |------------------|
|                      |         |            |0 |n  |n  |n  |n  |
|                      |         |            |  | 1 | 2 | 3 | x |
|----------------------+---------+------------+--+---+---+---+---|
|Досліджувана хімічна  |    1    |     a      |  |   |   |   |   |
|речовина та посівний  |         |      1     |  |   |   |   |   |
|матеріал              |---------+------------+--+---+---+---+---|
|                      |         |     a      |  |   |   |   |   |
|                      |         |      2     |  |   |   |   |   |
|                      |---------+------------+--+---+---+---+---|
|                      |         | a, середнє |  |   |   |   |   |
|                      |         |    C       |  |   |   |   |   |
|                      |         |     a(t)   |  |   |   |   |   |
|                      |---------+------------+--+---+---+---+---|
|                      |    2    |     b      |  |   |   |   |   |
|                      |         |      1     |  |   |   |   |   |
|                      |---------+------------+--+---+---+---+---|
|                      |         |     b      |  |   |   |   |   |
|                      |         |      2     |  |   |   |   |   |
|                      |---------+------------+--+---+---+---+---|
|                      |         | b, середнє |  |   |   |   |   |
|                      |         |    C       |  |   |   |   |   |
|                      |         |     b(t)   |  |   |   |   |   |
|----------------------+---------+------------+--+---+---+---+---|
|Холоста проба         |    3    |     c      |  |   |   |   |   |
|посівного матеріалу   |         |      1     |  |   |   |   |   |
|без досліджуваної     |         |------------+--+---+---+---+---|
|хімічної речовини     |         |     c      |  |   |   |   |   |
|                      |         |      2     |  |   |   |   |   |
|                      |         |------------+--+---+---+---+---|
|                      |         |C, середнє  |  |   |   |   |   |
|                      |         |   C        |  |   |   |   |   |
|                      |         |    c(t)    |  |   |   |   |   |
|                      |---------+------------+--+---+---+---+---|
|                      |    4    |     d      |  |   |   |   |   |
|                      |         |      1     |  |   |   |   |   |
|                      |         |------------+--+---+---+---+---|
|                      |         |     d      |  |   |   |   |   |
|                      |         |      2     |  |   |   |   |   |
|                      |         |------------+--+---+---+---+---|
|                      |         |d, середнє  |  |   |   |   |   |
|                      |         |   C        |  |   |   |   |   |
|                      |         |    d(t)    |  |   |   |   |   |
|                      |----------------------+--+---+---+---+---|
|                      |         C     - C    |  |   |   |   |   |
|                      |          c(t)    d(t)|  |   |   |   |   |
|                      |C      = -------------|  |   |   |   |   |
|                      | bl(t)        2       |  |   |   |   |   |
------------------------------------------------------------------

6. ОЦІНЮВАННЯ ПОПЕРЕДНІХ ДАНИХ

--------------------------------------------------------------------
|     N колби     |                                |% розкладання  |
|                 |                                |після n днів   |
|                 |                                |---------------|
|                 |                                | 0 |n |n |n |n |
|                 |                                |   | 1| 2| 3| x|
|-----------------+--------------------------------+---+--+--+--+--|
|1                |          C     - C             | 0 |  |  |  |  |
|                 |           a(t)     bl(t)       |   |  |  |  |  |
|                 |D  = (1 - ---------------) x 100|   |  |  |  |  |
|                 | 1        C     - C             |   |  |  |  |  |
|                 |           a(o)    bl(o)        |   |  |  |  |  |
|-----------------+--------------------------------+---+--+--+--+--|
|2                |          C     - C             | 0 |  |  |  |  |
|                 |           b(t)     bl(t)       |   |  |  |  |  |
|                 |D  = (1 - ---------------) x 100|   |  |  |  |  |
|                 | 2        C     - C             |   |  |  |  |  |
|                 |           b(o)    bl(o)        |   |  |  |  |  |
|-----------------+--------------------------------+---+--+--+--+--|
|Середнє(*)       |    D  - D                      | 0 |  |  |  |  |
|                 |     1    2                     |   |  |  |  |  |
|                 |D = -------                     |   |  |  |  |  |
|                 |       2                        |   |  |  |  |  |
|------------------------------------------------------------------|
|(*) D1 та D2 не повинні усереднюватися, якщо між ними є значна    |
|різниця.                                                          |
--------------------------------------------------------------------

Примітка: аналогічні формати можуть використовуватися для еталонної хімічної речовини та контролю токсичності.

------------------------------------------------------------------
|                                             |       Час        |
|                                             | (кількість днів) |
|---------------------------------------------+------------------|
|                                             |    0    |   t    |
|---------------------------------------------+---------+--------|
|Конц. РОВ (мг/л) при стерильному контролі    |  C      |  C     |
|                                             |   s(o)  |   s(t) |
------------------------------------------------------------------

7. АБІОТИЧНИЙ КОНТРОЛЬ (необов'язковий)

C     - C
                                  s(o)    s(t)
    % абіотичного розкладання =  ------------- x 100
                                      C
                                       s(o)

8. СПЕЦІАЛЬНИЙ ХІМІЧНИЙ АНАЛІЗ (необов'язковий)

------------------------------------------------------------------
|                    | залишкова кількість |    % первинного     |
|                    |    досліджуваної    |     розкладання     |
|                    |  хімічної речовини  |                     |
|                    |      наприкінці     |                     |
|                    |  дослідження (мг/л) |                     |
|--------------------+---------------------+---------------------|
|Стерильний контроль |          S          |                     |
|                    |           b         |                     |
|--------------------+---------------------+---------------------|
|Засіяне досліджуване|          S          | S  - S              |
|середовище          |           a         |  b    a             |
|                    |                     |--------- x 100      |
|                    |                     |    S                |
|                    |                     |     b               |
------------------------------------------------------------------

ЧАСТИНА III. ДОСЛІДЖЕННЯ ЗА МЕТОДОМ МОДИФІКОВАНОГО РОЗКЛАДАННЯ ОЕСР (Метод C.4-B)

III.1. ПРИНЦИП МЕТОДУ

Виміряний об'єм мінерального середовища, що містить відому концентрацію досліджуваної речовини (10-40 мг РОВ/л) як номінального єдиного джерела органічного вуглецю, засіюється 0,5 мл стічних вод на літр середовища. Отримана суміш аерується в темряві або при розсіяному світлі за температури 22 +- 2 град.C.

III.2. ОПИС МЕТОДУ

III.2.1. Обладнання

(a) конічні колби, напр., від 250 мл до 2 л, залежно від об'єму, необхідного для аналізу РОВ;

(d) аналізатор РОВ;

(e) прилад для визначення розчиненого кисню;

(f) центрифуга.

III.2.2. Приготування мінерального середовища

Стосовно приготування основних розчинів див. I.6.2.

Необхідно змішати 10 мл розчину (a) з 80 мл води для розчинення, додати 1 мл розчинів від (b) до (d) та довести до об'єму 1 л шляхом додавання води для розчинення.

В цьому методі для посівного матеріалу використовується лише 0,5 мл стічних вод на літр, тому може існувати необхідність підвищення концентрації середовища за допомогою мікроелементів та факторів росту. Цього можна досягти шляхом додавання 1 мл кожного з наступних розчинів на літр кінцевого середовища:

Розчин мікроелементів:

Тетрагідрат сульфату мангану, MnSO . 4H O 39,9 мг 4 2

Борна кислота, H BO 57,2 мг 3 3

Гептагідрат сульфату цинку, ZnSO . 7H O 42,8 мг 4 2

Гептамолібдат аммонію (NH4)6 Mo O 34,7 мг 7 24

Хелат феруму                                         100,0 мг

(FeCl етилендіамінтетраоцтової кислоти) 3

Розчинити та довести до об'єму 1 000 мл за допомогою води для розчинення

Вітамінний розчин:

Дріжджовий екстракт                                   15,0 мг

Необхідно розчинити дріжджовий екстракт у 100 мл води, після чого стерилізувати розчин шляхом фільтрації через 0,2-мікронну мембрану або заново розвести.

III.2.3. Приготування та попередня підготовка посівного матеріалу

Посівний матеріал може бути взято з очищених стічних вод з очисної станції або лабораторної установки, що переробляють переважно комунально-побутові стічні води... Див. I.6.4.2. та I.6.5.

Слід використовувати 0,5 мл на літр мінерального середовища.

III.2.4. Підготовка колб

Як приклад, можна помістити по 800-мілілітровій порції мінерального середовища у 2-літрові конічні колби та додати достатню кількість основних розчинів досліджуваних та еталонних речовин в окремі колби, щоб досягти концентрації хімічного еквіваленту 10-40 мг РОВ/л. Слід перевірити значення водневого показника та за необхідності привести його до 7,4. Після цього необхідно засіяти в колби стічні води з розрахунку 0,5 мл на літр (див. I.6.4.2). Також слід підготувати контроль посівного матеріалу в мінеральному середовищі, однак без використання досліджуваної або еталонної хімічної речовини.

III.2.5. Кількість колб у типовому циклі

Колби 1 та 2: Пробна суспензія

Колби 3 та 4: Холоста проба посівного матеріалу

Колба 5: Процедурний контроль

Бажано та за необхідності:

Колба 6: Абіотичний стерильний контроль

Колба 7: Адсорбційний контроль

Колба 8: Контроль токсичності

Див. також I.6.7.

III.2.6. Проведення досліду

III.3. ДАНІ ТА ЗВІТУВАННЯ

III.3.1. Обробка результатів

Необхідно занести всі результати в надані листи даних.

III.3.2. Достовірність результатів

Див. I.5.2.

III.3.3. Звітування

Див. I.8.

III.4. ЛИСТ ДАНИХ

Нижче наведено зразок листа даних.

МОДИФІКОВАНЕ РОЗКЛАДАННЯ ОЕСР

1. ЛАБОРАТОРІЯ

2. ДАТА ПОЧАТКУ ДОСЛІДЖЕННЯ

3. ДОСЛІДЖУВАНА РЕЧОВИНА

Назва:

Концентрація основного розчину: ... мг/л як хімічна речовина

Початкова концентрація в середовищі, до: ... мг/л як хімічна речовина

4. ПОСІВНИЙ МАТЕРІАЛ

Джерело:

Проведена обробка:

Попередня підготовка (за наявності):

Концентрація твердої зависі у реакційній суміші: мг/л

5. ВИЗНАЧЕННЯ ВУГЛЕЦЮ

Карбоаналізатор:

------------------------------------------------------------------
|                     |N колби |                 |РОВ після n    |
|                     |        |                 |днів (мг/л)    |
|                     |        |                 |---------------|
|                     |        |                 |0 |n  |n |n |n |
|                     |        |                 |  | 1 | 2| 3| x|
|---------------------+--------+-----------------+--+---+--+--+--|
|Досліджувана хімічна |    1   |        a        |  |   |  |  |  |
|речовина та посівний |        |         1       |  |   |  |  |  |
|матеріал             |--------+-----------------+--+---+--+--+--|
|                     |        |        a        |  |   |  |  |  |
|                     |        |         2       |  |   |  |  |  |
|                     |--------+-----------------+--+---+--+--+--|
|                     |        |    a, середнє   |  |   |  |  |  |
|                     |        |      C          |  |   |  |  |  |
|                     |        |       a(t)      |  |   |  |  |  |
|                     |--------+-----------------+--+---+--+--+--|
|                     |    2   |        b        |  |   |  |  |  |
|                     |        |         1       |  |   |  |  |  |
|                     |--------+-----------------+--+---+--+--+--|
|                     |        |        b        |  |   |  |  |  |
|                     |        |         2       |  |   |  |  |  |
|                     |--------+-----------------+--+---+--+--+--|
|                     |        |    b, середнє   |  |   |  |  |  |
|                     |        |      C          |  |   |  |  |  |
|                     |        |       b(t)      |  |   |  |  |  |
|---------------------+--------+-----------------+--+---+--+--+--|
|Холоста проба        |    3   |        c        |  |   |  |  |  |
|посівного матеріалу  |        |         1       |  |   |  |  |  |
|без досліджуваної    |        |                 |  |   |  |  |  |
|хімічної речовини    |        |                 |  |   |  |  |  |
|                     |--------+-----------------+--+---+--+--+--|
|                     |        |        c        |  |   |  |  |  |
|                     |        |         2       |  |   |  |  |  |
|                     |--------+-----------------+--+---+--+--+--|
|                     |        |C, середнє C     |  |   |  |  |  |
|                     |        |            c(t) |  |   |  |  |  |
|                     |--------+-----------------+--+---+--+--+--|
|                     |    4   |        d        |  |   |  |  |  |
|                     |        |         1       |  |   |  |  |  |
|                     |--------+-----------------+--+---+--+--+--|
|                     |        |        d        |  |   |  |  |  |
|                     |        |         2       |  |   |  |  |  |
|                     |--------+-----------------+--+---+--+--+--|
|                     |        |    d, середнє   |  |   |  |  |  |
|                     |        |      C          |  |   |  |  |  |
|                     |        |       d(t)      |  |   |  |  |  |
|                     |--------------------------+--+---+--+--+--|
|                     |         C     - C        |  |   |  |  |  |
|                     |          c(t)    d(t)    |  |   |  |  |  |
|                     |C      = -------------    |  |   |  |  |  |
|                     | bl(t)         2          |  |   |  |  |  |
------------------------------------------------------------------

6. ОЦІНЮВАННЯ ПОПЕРЕДНІХ ДАНИХ

-------------------------------------------------------------------------
|     N колби     |                                 |% розкладання після|
|                 |                                 |n днів             |
|                 |                                 |-------------------|
|                 |                                 | 0 |n  |n  |n  |n  |
|                 |                                 |   | 1 | 2 | 3 | x |
|-----------------+---------------------------------+---+---+---+---+---|
|1                |          C     - C              | 0 |   |   |   |   |
|                 |           a(t)     bl(t)        |   |   |   |   |   |
|                 |D  = (1 - ---------------) x 100 |   |   |   |   |   |
|                 | 1        C     - C              |   |   |   |   |   |
|                 |           a(o)    bl(o)         |   |   |   |   |   |
|-----------------+---------------------------------+---+---+---+---+---|
|2                |          C     - C              | 0 |   |   |   |   |
|                 |           b(t)     bl(t)        |   |   |   |   |   |
|                 |D  = (1 - ---------------) x 100 |   |   |   |   |   |
|                 | 2        C     - C              |   |   |   |   |   |
|                 |           b(o)    bl(o)         |   |   |   |   |   |
|-----------------+---------------------------------+---+---+---+---+---|
|Середнє(*)       |    D  - D                       | 0 |   |   |   |   |
|                 |     1    2                      |   |   |   |   |   |
|                 |D = -------                      |   |   |   |   |   |
|                 |       2                         |   |   |   |   |   |
|-----------------------------------------------------------------------|
|(*) D1 та D2 не повинні усереднюватися, якщо між ними є значна різниця.|
-------------------------------------------------------------------------

7. АБІОТИЧНИЙ КОНТРОЛЬ (необов'язковий)

------------------------------------------------------------------
|                                             |       Час        |
|                                             | (кількість днів) |
|---------------------------------------------+------------------|
|                                             |    0    |   t    |
|---------------------------------------------+---------+--------|
|Конц. РОВ (мг/л) при стерильному контролі    |  C      |  C     |
|                                             |   s(o)  |   s(t) |
------------------------------------------------------------------

C     - C
                                   s(o)    s(t)
     % абіотичного розкладання =  ------------- x 100
                                       C
                                        s(o)

8. СПЕЦІАЛЬНИЙ ХІМІЧНИЙ АНАЛІЗ (необов'язковий)

------------------------------------------------------------------
|                     | залишкова кількість |    % первинного    |
|                     |    досліджуваної    |    розкладання     |
|                     |  хімічної речовини  |                    |
|                     |      наприкінці     |                    |
|                     |  дослідження (мг/л) |                    |
|---------------------+---------------------+--------------------|
|Стерильний контроль  |          S          |                    |
|                     |           b         |                    |
|---------------------+---------------------+--------------------|
|Засіяне досліджуване |          S          | S  - S             |
|середовище           |           a         |  b    a            |
|                     |                     |--------- x 100     |
|                     |                     |    S               |
|                     |                     |     b              |
------------------------------------------------------------------

ЧАСТИНА IV. ДОСЛІДЖЕННЯ ЗА МЕТОДОМ ВИДІЛЕННЯ CO (Метод 2

C.4-C)

IV.1. ПРИНЦИП МЕТОДУ

Виміряний об'єм засіяного мінерального середовища, що містить відому концентрацію досліджуваної речовини (10-20 мг РОВ або ЗОВ/л) як номінального єдиного джерела органічного вуглецю, аерується в темряві або при розсіяному світлі шляхом пропускання через нього повітря, вільного від вуглекислого газу, за регульованої швидкості. Відбувається спостереження за розкладанням протягом 28 днів шляхом визначення утвореного вуглекислого газу, захопленого гідроокисом барію або натрію, що вимірюється за допомогою титрування залишкового гідроокису або як неорганічний вуглець. Об'єм вуглекислого газу, що виділяється досліджуваною речовиною (з поправкою на утворення з холостої проби посівного матеріалу), виражається через відсоткове значення ТВГ. Ступінь біорозкладання також може бути вирахувано за допомогою додаткового аналізу РОВ, що проводиться на початку та наприкінці інкубації.

IV.2. ОПИС МЕТОДУ

IV.2.1. Обладнання

(a) колби, 2-5 літрів, обладнані аераційною трубкою, що доходить майже до дна посудини, та отвором;

(b) магнітні мішалки для оцінювання слабкорозчинних хімічних речовин;

(d) прилад для регулювання та вимірювання повітряного потоку;

(e) обладнання для очищення вуглекислого газу, для підготовки повітря, вільного від вуглекислого газу; як варіант, може бути використано суміш кисню, вільного від CO , та азоту, вільного від 2

CO ,  взятих  із газових балонів у правильних пропорціях (20%  O :
  2                                                             2
80% N );

(f) прилад для визначення вуглекислого газу шляхом титриметрії або ж іншим видом неорганічного карбоаналізатора;

(g) мембранний фільтр (необов'язково);

(h) аналізатор РОВ (необов'язково).

IV.2.2. Приготування мінерального середовища

Стосовно приготування основних розчинів див. I.6.2.

Необхідно змішати 10 мл розчину (a) з 800 мл води для розчинення, додати 1 мл розчинів від (b) до (d) та довести до об'єму 1 л шляхом додавання води для розчинення.

IV.2.3. Приготування та попередня підготовка посівного матеріалу

Див. I.6.4., I.6.4.1., I.6.4.2. та I.6.5.

IV.2.4. Підготовка колб

Як приклад, наступні об'єми та маси вказують значення для 5-літрових колб, що містять 3 л суспензії. При використанні менших об'ємів слід відповідним чином змінити значення, однак пересвідчитися, що при цьому можливе точне вимірювання утвореного вуглекислого газу.

Слід помістити по 2400-мілілітровій порції мінерального середовища у кожну 5-літрову колбу. Після цього необхідно засіяти в колби відповідний об'єм підготовленого активованого мулу (див. I.6.4.1 та I.6.5); при цьому остаточна концентрація 3 л засіяної суміші не має перевищувати 30 мг твердої зависі на літр. Як варіант, можливо спочатку розвести активований мул до утворення 500-1000 мг/л суспензії в мінеральному середовищі, після чого додати аліквоту до вмісту 5-літрової колби з метою отримання концентрації 30 мг/л - таким чином забезпечується підвищення точності. Також можливе використання інших джерел посівного матеріалу (див. I.6.4.2.).

Ці засіяні суміші необхідно протягом ночі аерувати за допомогою повітря, вільного від CO , з метою очищення системи від 2

вуглекислого газу.

Слід окремо додати матеріал дослідження та еталонну речовину, як відомий об'єм основних розчинів, у репліки колб з метою отримання концентрації 10-20 мг РОВ або ЗОВ/л за допомогою додавання хімічних речовин. Кілька колб, у які хімічні речовини не додаються, мають слугувати для контролю посівного матеріалу. Слабкорозчинні досліджувані речовини слід додати безпосередньо в колби за вагою або об'ємом, або ж працювати з ними, як описано в Додатку 3.

За необхідності слід використати одну посудину з метою перевірки можливої інгібуючої дії досліджуваної хімічної речовини шляхом посіву в мінеральному середовищі розчинів як досліджуваної, так і еталонної хімічної речовини, такої ж концентрації, як і в інших колбах.

Також за необхідності слід встановити ще одну стерильну колбу, щоб перевірити, чи зазнає досліджувана хімічна речовина абіотичного розкладання при використанні незасіяного розчину хімічної речовини (див. I.6.6). Необхідно провести стерилізацію шляхом додавання токсичної речовини у відповідній концентрації.

Слід довести об'єм суспензій у всіх колбах до 3 л шляхом додавання мінерального середовища, попередньо керованого за допомогою повітря, вільного від CO . Як варіант, можливе взяття 2

зразків на аналіз  РОВ  (див.  додаток  2.4.)  та/або  спеціальний
аналіз.  Необхідно  під'єднати  поглинальні  сулії  од отворів для
випуску повітря з колб.

При використанні гідроокису барію необхідно з'єднати по три поглинальні сулії, кожна з яких містить 100 мл 0,0125-молярного розчину гідроокису барію, із кожною 5-літровою колбою. Розчин має бути вільний від осадів сульфату та карбонату, а його міцність має бути визначена безпосередньо перед використанням. При використанні гідроокису натрію слід з'єднати дві пастки, друга з яких призначена для контролю, щоб пересвідчитися, що весь вуглекислий газ поглинутий першою. Для цього підходять поглинальні сулії для сироватки з кришками. Слід додати 200 мл 0,05-молярного розчину гідроокису натрію в кожну колбу; цього має бути достатньо для поглинання загального об'єму вуглекислого газу, що виділиться при повному розкладанні досліджуваної речовини. Розчин гідроокису натрію, навіть одразу після приготування. міститиме сліди карбонатів; з огляду на це слід вилучити карбонат із холостої проби.

IV.2.5. Кількість колб у типовому циклі

Колби 1 та 2: Пробна суспензія

Колби 3 та 4: Холоста проба посівного матеріалу

Колба 5: Процедурний контроль

Бажано та за необхідності:

Колба 6: Абіотичний стерильний контроль

Колба 7: Контроль токсичності

Див. також I.6.7.

IV.2.6. Проведення досліду

На початку досліду необхідно розпочати барботування суспензій за допомогою повітря, вільного від CO , зі швидкістю 30-100 мл/хв. 2

Періодично необхідно брати зразки абсорбенту вуглекислого газу для
аналізу вмісту CO .  Протягом перших  десяти  днів  рекомендується
                 2
робити  аналізи  раз на два чи три дні,  а надалі й до 28-го дня -
раз на п'ять днів, таким чином, щоб можна було визначити 10-денний
інтервал.

28-го дня необхідно взяти зразки (на вибір) для аналізу РОВ та/або спеціального аналізу, виміряти водневий показник суспензій та додати 1 мл концентрованої хлористоводневої кислоти в кожну з колб; слід аерувати колби протягом ночі з метою ліквідації вуглекислого газу, присутнього у пробних суспензіях. 29-го дня необхідно зробити останній аналіз виділеного вуглекислого газу.

У дні вимірювання CO необхідно від'єднати найближчий до 2

колби  абсорбер гідроокису барію та титрувати розчин гідроокису за
допомогою 0,05-молярного  розчину  HCl,  використовуючи  в  якості
індикатору фенолфталеїн.  Решту абсорберів слід пересунути на одну
позицію ближче до колби та додати в кінець ряду новий абсорбер, що
містить  100 мл свіжого 0,0125-молярного розчину гідроокису барію.
Титрування слід проводити по мірі необхідності,  наприклад, коли в
першій  пастці спостерігається значна кількість осаду,  що поки не
з'явився в другій,  або ж принаймні щотижня.  Як варіант,  коли  в
якості  абсорбенту  використовується NaOH,  необхідно за допомогою
шприца  взяти  маленький   зразок   (залежно   від   характеристик
використовуваного  карбоаналізатора)  розчину  гідроокису натрію з
абсорбера,  що знаходиться ближче до  колби.  Після  цього  зразок
необхідно  ввести  в  модуль  карбоаналізатора,  що  відповідає за
неорганічний вуглець,  з метою безпосереднього аналізу  виділеного
вуглекислого газу.

Вміст другої пастки необхідно проаналізувати лише наприкінці досліду з тим, щоб внести поправку на будь-які домішки вуглекислого газу.

IV.3. ДАНІ ТА ЗВІТУВАННЯ

IV.3.1. Обробка результатів

Об'єм CO , захоплений абсорбером при титруванні, задається 2

наступним рівнянням:

mgCO = (100 · C - 0,5 · V · C ) x 44 2 B A

де:

V = об'єм HCl, використаний при титруванні 100 мл у абсорбері (мл)

C = концентрація розчину гідроокису барію (моль)

C = концентрація розчину хлористоводневої кислоти (моль)

якщо C дорівнює 0,0125 моль, а C - 0,05 моль, титр для B A

100 мл  гідроокису  барію  дорівнює  50  мл,  а вага CO  задається
                                                       2
рівнянням:

- x 44 x мл титрованого HCl = 1,1 x мл HCl

Отже, в такому випадку, при переведенні об'єму титрованого HCl в мг виділеного CO коефіцієнт дорівнює 1,1. 2

Необхідно обчислити об'єм CO , виділений лише з посівного 2

матеріалу та з посівного матеріалу разом із досліджуваною хімічною
речовиною,  використовуючи відповідні значення титрування; різниця
між  ними дорівнюватиме вазі CO ,  виділеного лише з досліджуваної
                               2
хімічної речовини.

Наприклад, якщо значення титрування лише для посівного матеріалу складає 48 мл, а для посівного матеріалу та досліджуваної хімічної речовини - 45 мл,

CO з посівного матеріалу = 1,1 x (50-48) = 2,2 мг 2

CO з посівного матеріалу та досліджуваної хімічної речовини 2

= 1,1 x (50-45) = 5,5 мг

Отже, вага CO , утвореного з хімічної речовини, дорівнює 2

3,3 мг.

Процентне значення біорозкладання вираховується наступним чином:

мг утвореного CO  x 100
                                          2
 % розкладання = -------------------------------------------------
                  ТВГ xмг доданої досліджуваної хімічної речовини

або

мг утвореного CO  x 100
                                         2
 % розкладання =  ----------------------------------------
                   мг TO, доданого під час досліду x 3,67

де 3,67 - коефіцієнт перерахунку (44/12) вуглецю у вуглекислий газ.

Процентне значення розкладання отримується після будь-якого часового проміжку шляхом додавання процентних значень ТВГ, підрахованих для кожного із днів до моменту вимірювання цього значення.

Для абсорберів гідроокису натрію необхідно підрахувати об'єм виділеного вуглекислого газу, виражений у вигляді неорганічного вуглецю (мг), шляхом множення концентрації неорганічного вуглецю в абсорбенті на об'єм абсорбенту.

Процентне значення розкладання вираховується наступним чином:

мг у колбі з неорганічним вуглецем - мг холостої
                   проби неорганічного вуглецю
 % ТВГ = ------------------------------------------------- x 100 %
         МГ ЗОВ, доданого як досліджувана хімічна речовина

Значення відщеплення РОВ підраховується згідно з пунктом I.7. Всі результати слід вказати у наданих листах даних.

IV.3.2.Достовірність результатів

Вміст неорганічного вуглецю в суспензії досліджуваної хімічної речовини на початку досліду не має перевищувати 5% загального вмісту вуглецю, а загальний об'єм виділеного CO в 2 холостій пробі посівного матеріалу в нормі не має перевищувати 40 мг/л середовища. При отриманні значень, що перевищують 70 мг CO /літр, необхідний критичний перегляд даних та методики 2

експерименту.

Див. також I.5.2.

IV.3.3. Звітування

Див. I.8.

IV.4. ЛИСТ ДАНИХ

Нижче наведено зразок листа даних.

ДОСЛІДЖЕННЯ ВИДІЛЕННЯ ВУГЛЕКИСЛОГО ГАЗУ

1. ЛАБОРАТОРІЯ

2. ДАТА ПОЧАТКУ ДОСЛІДЖЕННЯ

3. ДОСЛІДЖУВАНА РЕЧОВИНА

Назва:

Концентрація основного розчину: ... мг/л як хімічна речовина

Початкова концентрація в середовищі, до: ... мг/л як хімічна речовина

Загальний об'єм вуглецю, доданий у колбу: ... мг C

ТВГ: мг

Джерело:

Проведена обробка:

Попередня підготовка (за наявності):

Концентрація твердої зависі

CO 2

4. ПОСІВНИЙ МАТЕРІАЛ

у реакційній суміші: мг/л

---------------------------------------------------------------------------
| Час  |    Об'єм    |   Об'єм    |   Сукупний  |       ТВГ               |
|(день)|  виділеного | виділеного |    об'єм    |Сукупний об'єм CO        |
|      |     CO      |    CO      |  виділеного |                 2       |
|      |       2     |      2     |   CO  (мг)  |               ---- x 100|
|      | Дослідження |  холостої  |     2       |                ТВГ      |
|      |     (мг)    |   проби    |   (середнє  |                         |
|      |             |    (мг)    |   значення  |                         |
|      |             |            | дослідження |                         |
|      |             |            |мінус холоста|                         |
|      |             |            |    проба)   |                         |
|------+-------------+------------+-------------+-------------------------|
|      |1 /  |середнє|3 / |середнє|  1   |  2   |  1   |   2   | середнє  |
|      | / 2 |       | / 4|       |      |      |      |       |          |
|------+-----+-------+----+-------+------+------+------+-------+----------|
|0     |     |       |    |       |      |      |      |       |          |
|------+-----+-------+----+-------+------+------+------+-------+----------|
|n     |     |       |    |       |      |      |      |       |          |
| 1    |     |       |    |       |      |      |      |       |          |
|------+-----+-------+----+-------+------+------+------+-------+----------|
|n     |     |       |    |       |      |      |      |       |          |
| 2    |     |       |    |       |      |      |      |       |          |
|------+-----+-------+----+-------+------+------+------+-------+----------|
|n     |     |       |    |       |      |      |      |       |          |
| 3    |     |       |    |       |      |      |      |       |          |
|------+-----+-------+----+-------+------+------+------+-------+----------|
|      |     |       |    |       |      |      |      |       |          |
|------+-----+-------+----+-------+------+------+------+-------+----------|
|      |     |       |    |       |      |      |      |       |          |
|------+-----+-------+----+-------+------+------+------+-------+----------|
|28    |     |       |    |       |      |      |      |       |          |
---------------------------------------------------------------------------

6. АНАЛІЗ ВУГЛЕЦЮ (необов'язковий)

Карбоаналізатор:

------------------------------------------------------------------
|Час (день) |Холоста проба мгл|Досліджувана хімічна речовина мг/л|
|-----------+-----------------+----------------------------------|
|     0     |      C          |                C                 |
|           |       b(o)      |                 o                |
|-----------+-----------------+----------------------------------|
|  28(*)    |      C          |                C                 |
|           |       b(t)      |                 t                |
------------------------------------------------------------------

----------------

(*) Або наприкінці інкубації.

C  - C
                                t    b(t)
     % відщеплення РОВ =  (1 - ----------- x 100

C - C o b(o)

7. АБІОТИЧНЕ РОЗКЛАДАННЯ (необов'язкове)

утворення CO  у стерильній колбі після 28 дня (мг)
                                         2
 % абіотичного розкладання = -------------------------------------------------- x 100

ТВГ (мг)

ЧАСТИНА V. ДОСЛІДЖЕННЯ ЗА МЕТОДОМ МАНОМЕТРИЧНОЇ СПІРОМЕТРІЇ (Метод C.4-D)

V.1. ПРИНЦИП МЕТОДУ

Виміряний об'єм засіяного мінерального середовища, що містить відому концентрацію досліджуваної хімічної речовини (100 мг/л досліджуваної речовини, що дає як мінімум 50-100 мг ТПК/л) як номінального єдиного джерела органічного вуглецю, перемішується за постійної температури (+- 1 град.C або менше) в закритій колбі за постійної температури до 28 днів. Поглинання кисню визначається вимірюванням кількості кисню (отриманого шляхом електролізу), необхідної для підтримання постійного об'єму газу в колбі спірометра або ж за зміною об'єму чи тиску (або того й іншого) в апараті. Виділений вуглекислий газ абсорбується розчином гідроокису калію або іншого придатного для цієї мети абсорбенту. Кількість кисню, поглинутого досліджуваною речовиною (із урахуванням поправки на паралельне поглинання холостою пробою посівного матеріалу) виражається через відсоток ТПК або ХПК. Як варіант, значення первинного біорозкладання може бути вирахувано за допомогою додаткового спеціального аналізу, проведеного на початку та наприкінці інкубації, а кінцевого біорозкладання - за допомогою аналізу РОВ.

V.2. ОПИС МЕТОДУ

V.2.1. Обладнання

(a) придатний спірометр;

(b) терморегулятор, що підтримує температуру принаймні на рівні +- 1 град.C;

(d) карбоаналізатор (необов'язково).

V.2.2. Приготування мінерального середовища

Стосовно приготування основних розчинів див. I.6.2.

Необхідно змішати 10 мл розчину (a) та 800 мл води для розчинення, додати 1 мл розчинів від (b) до (d) та довести до об'єму 1 л за допомогою води для розчинення.

V.2.3. Приготування та попередня підготовка посівного матеріалу

Див. I.6.4., I.6.4.1., I.6.4.2. та I.6.5.

V.2.4. Підготовка колб

Необхідно приготувати розчини досліджуваної та еталонної хімічних речовин в окремих партіях, у мінеральному середовищі із концентрацією, в нормі, 100 мг хімічної речовини на літр (що дає як мінімум 50-100 мг ТПК/л), із використанням основних розчинів.

Значення ТПК обчислюється на основі утворення солей амонію; в разі, якщо очікується нітрифікація, обчислення має ґрунтуватися на утворенні нітратів (див. Додаток 2.2)

Слід визначити значення водневого показника та за необхідності привести його до 7,4 +- 0,2.

Слабкорозчинні речовини слід додавати пізніше (див. нижче).

Якщо необхідно визначити токсичність досліджуваної хімічної речовини, слід приготувати ще один розчин у мінеральному середовищі, що містить як досліджувану, так і еталонну хімічну речовину у такій самій концентрації, як у окремих розчинах.

За необхідності вимірювання фізико-хімічного поглинання кисню слід приготувати розчин досліджуваної хімічної речовини із концентрацією, в нормі, 100 мг ТПК/л, попередньо стерилізований щляхом додавання відповідної токсичної речовини (див. I.6.6).

Слід ввести необхідний об'єм розчинів досліджуваної та еталонної хімічних речовин, відповідно, щонайменше у дві колби. В решту колб слід додати лише мінеральне середовище (для контролю посівного матеріалу) та, за необхідності, змішаний розчин досліджуваної та еталонної хімічної речовин і стерильний розчин.

Якщо досліджувана хімічна речовина є слабко розчинною, необхідно додати її безпосередньо на цьому етапі за вагою або об'ємом, або ж працювати з нею згідно Додатку 3. У відділи абсорбера CO слід додати гідроокис калію, гранули натрового вапна 2

або інший абсорбент.

V.2.5. Кількість колб у типовому циклі

Колби 1 та 2: Пробна суспензія

Колби 3 та 4: Холоста проба посівного матеріалу

Колба 5: Процедурний контроль

Бажано та за необхідності:

Колба 6: Стерильний контроль

Колба 7: Контроль токсичності

Див. також I.6.7.

V.2.6. Проведення досліду

Слід зачекати, поки температура посудин не сягне необхідної температури, після чого засіяти у відповідні посудини підготовлений активований мул або інше джерело посівного матеріалу, щоб отримати концентрацію твердої зависі не більш ніж 30 мг/л. Після цього необхідно зібрати обладнання, запустити змішувач, провести перевірку на предмет герметичності та почати вимірювання поглинання кисню. Як правило, подальше спостереження обмежується зняттям необхідних показників та щоденними перевірками на предмет підтримання потрібної температури та правильності роботи змішувача.

Необхідно вирахувати поглинання кисню на основі даних, що регулярно знімаються через короткі проміжки часу, із використанням методів, запропонованих виробником обладнання. Наприкінці інкубації, в нормі - через 28 днів, необхідно виміряти водневий показник вмісту колб, особливо якщо рівень поглинання кисню нижчий або вищий за ТПК NH (для азотовмісних сполук). 4

За необхідності слід взяти зразки із колб спірометра, на початку та наприкінці, для аналізу РОВ або конкретної хімічної речовини (див. Додаток 2.4). При початковому заборі необхідно перевірити рівень пробної суспензії, що лишилася в колбі. При поглинанні кисню азотовмісною досліджуваною речовиною необхідно визначити підвищення концентрації нітриту та нітрату протягом 28 днів та обчислити поправку на поглинання кисню при нітрифікації (Додаток 5).

V.3. ДАНІ ТА ЗВІТУВАННЯ

V.3.1. Обробка результатів

Необхідно розділити значення поглинання кисню (мг) досліджуваної речовини після певного проміжку часу (із поправкою на контроль холостої проби посівного матеріалу за той самий час) на вагу використаної досліджуваної хімічної речовини. Результатом є значення БПК, виражене у мг кисню/мг досліджуваної хімічної речовини, тобто:

(мг поглинання O досліджуваною хімічною речовиною - 2 мг поглинання O холостою пробою) 2 БПК = -------------------------------------------------------

(мг досліджуваної хімічної речовини в колбі)

= мг O на мг досліджуваної хімічної речовини 2

Відсоткове значення біорозкладання обчислюється за допомогою формули:

БПК (мг O /мг хімічної речовини)
                                         2
     % біорозкладання = % ТПК = ---------------------------------- x 100

ТПК (мг O хімічної речовини) 2 або

БПК (мг O /мг хімічної речовини)
                     2
    % ХПК = -------------------------------- x 100
              ХПК (мг O  хімічної речовини)
                       2

Слід зазначити, що ці два методи не обов'язково дають однакове значення; краще використовувати перший метод.

Для досліджуваних речовин, що містять азот, необхідно використовувати відповідне значення ТПК (NH або NO ) відповідно 4 3

до   відомої  або  очікуваної  нітрифікації  (Додаток  2.2).  Якщо
відбувається неповна нітрифікація, необхідно обчислити поправку на
поглинання  кисню під час нітрифікації внаслідок змін концентрації
нітриту та нітрату (Додаток 5).

При додатковому визначенні органічного вуглецю та/або конкретної хімічної речовини необхідно обчислити процентне значення біорозкладання згідно I.7.

Всі результати слід занести в надані листи даних.

V.3.2. Достовірність результатів

Рівень поглинання кисню холостою пробою посівного матеріалу зазвичай складає 20-30 мг O /л та не має перевищувати 60 мг/л за 2

28 днів.  Значення більші за 60 мг/л вимагають критичного вивчення
даних та методики експерименту.  Якщо значення водневого показника
виходить  за рамки 6-8,5 і поглинання кисню досліджуваною хімічною
речовиною менше 60%,  дослід слід повторити з меншою концентрацією
досліджуваної хімічної речовини.

Див. також I.5.2.

V.3.3. Звітування

Див. I.8.

V.4. ЛИСТ ДАНИХ

Нижче наведено зразок листа даних.

ДОСЛІДЖЕННЯ ЗА МЕТОДОМ ММТП (I)

1. ЛАБОРАТОРІЯ

2. ДАТА ПОЧАТКУ ДОСЛІДЖЕННЯ

3. ДОСЛІДЖУВАНА РЕЧОВИНА

Назва:

Концентрація основного розчину: мг/л

Початкова концентрація в середовищі, С : ... мг/л O

Об'єм у дослідній колбі, V: ... мл

ТПК або ХПК: ... мг O /мг досліджуваної речовини (NH або 2 4

NO )
  3

4. ПОСІВНИЙ МАТЕРІАЛ

Джерело:

Проведена обробка:

Попередня підготовка (за наявності):

Концентрація твердої зависі у реакційній суміші: мг/л

5. ПОГЛИНАННЯ КИСНЮ: БІОРОЗКЛАДАННЯ

---------------------------------------------------------------------------
|                 |             |              Час (Дні)                  |
|                 |             |-----------------------------------------|
|                 |             | 0 |   | 7 |  |14 |  |  |21 |  |  |28 |  |
|-----------------+-------------+---+---+---+--+---+--+--+---+--+--+---+--|
|Погл. O  (мг)    |      1      |   |   |   |  |   |  |  |   |  |  |   |  |
|       2         |-------------+---+---+---+--+---+--+--+---+--+--+---+--|
|дослід. речовини |      2      |   |   |   |  |   |  |  |   |  |  |   |  |
|                 |-------------+---+---+---+--+---+--+--+---+--+--+---+--|
|                 |  a, середнє |   |   |   |  |   |  |  |   |  |  |   |  |
|-----------------+-------------+---+---+---+--+---+--+--+---+--+--+---+--|
|Погл. O  (мг)    |      3      |   |   |   |  |   |  |  |   |  |  |   |  |
|       2         |-------------+---+---+---+--+---+--+--+---+--+--+---+--|
|холостої проби   |      4      |   |   |   |  |   |  |  |   |  |  |   |  |
|                 |-------------+---+---+---+--+---+--+--+---+--+--+---+--|
|                 |  b, середнє |   |   |   |  |   |  |  |   |  |  |   |  |
|-----------------+-------------+---+---+---+--+---+--+--+---+--+--+---+--|
|Поправка БПК (мг)|  (a  - b )  |   |   |   |  |   |  |  |   |  |  |   |  |
|                 |    1    m   |   |   |   |  |   |  |  |   |  |  |   |  |
|                 |-------------+---+---+---+--+---+--+--+---+--+--+---+--|
|                 |  (a  - b )  |   |   |   |  |   |  |  |   |  |  |   |  |
|                 |    2    m   |   |   |   |  |   |  |  |   |  |  |   |  |
|-----------------+-------------+---+---+---+--+---+--+--+---+--+--+---+--|
|БПК на мг дослід.|  (a - b)    |   |   |   |  |   |  |  |   |  |  |   |  |
|речовини         |    1        |   |   |   |  |   |  |  |   |  |  |   |  |
|                 |  ---------  |   |   |   |  |   |  |  |   |  |  |   |  |
|                 |    C V      |   |   |   |  |   |  |  |   |  |  |   |  |
|                 |     o       |   |   |   |  |   |  |  |   |  |  |   |  |
|                 |-------------+---+---+---+--+---+--+--+---+--+--+---+--|
|                 |  (a  - b)   |   |   |   |  |   |  |  |   |  |  |   |  |
|                 |     2       |   |   |   |  |   |  |  |   |  |  |   |  |
|                 |  ---------  |   |   |   |  |   |  |  |   |  |  |   |  |
|                 |    C V      |   |   |   |  |   |  |  |   |  |  |   |  |
|                 |     o       |   |   |   |  |   |  |  |   |  |  |   |  |
|-----------------+-------------+---+---+---+--+---+--+--+---+--+--+---+--|
|% розкладання    |   D  (a )   |   |   |   |  |   |  |  |   |  |  |   |  |
|                 |    1   1    |   |   |   |  |   |  |  |   |  |  |   |  |
|                 |-------------+---+---+---+--+---+--+--+---+--+--+---+--|
|БПК ТПК x 100    |   D  (a )   |   |   |   |  |   |  |  |   |  |  |   |  |
|                 |    2   2    |   |   |   |  |   |  |  |   |  |  |   |  |
|                 |-------------+---+---+---+--+---+--+--+---+--+--+---+--|
|                 | Середнє(*)  |   |   |   |  |   |  |  |   |  |  |   |  |
---------------------------------------------------------------------------

V = об'єм середовища в пробній колбі

----------------

(*) D1 та D2 не мають усереднюватися, якщо між ними існує значна різниця.

Примітка: аналогічні формати можуть використовуватися для еталонної сполуки та контролю токсичності.

6. ПОПРАВКА НА НІТРИФІКАЦІЮ (див. Додаток V)

------------------------------------------------------------------
|День                                             | 0 |28|Різниця|
|-------------------------------------------------+---+--+-------|
|(i) Концентрація нітрату (мг N/л)                |   |  |  (N)  |
|-------------------------------------------------+---+--+-------|
|(ii) Кисневий еквівалент (4,57 · N · V) (мг)     | - |- |       |
|-------------------------------------------------+---+--+-------|
|(iii) Концентрація нітриту (мг N/л)              |   |  |  (N)  |
|-------------------------------------------------+---+--+-------|
|(iv) Кисневий еквівалент (3,43 · N · V) (мг)     | - |- |       |
|-------------------------------------------------+---+--+-------|
|(ii + iv) Загальний кисневий еквівалент          | - |- |       |
------------------------------------------------------------------

7. АНАЛІЗ ВУГЛЕЦЮ (необов'язково)

Карбоаналізатор:

------------------------------------------------------------------
|Час (день)|Холоста проба мг/л|Досліджувана хімічна речовина мг/л|
|----------+------------------+----------------------------------|
|    0     |      (C   )      |           (C )                   |
|          |        blo       |             o                    |
|----------+------------------+----------------------------------|
| 28(*)    |      (C   )      |           (C )                   |
|          |        blt       |             t                    |
------------------------------------------------------------------

----------------

(*) Або наприкінці інкубації.

C  - C
                              t    blt
    % розкладання РОВ = (1 - ---------) x 100

C - C o blo

8. СПЕЦІАЛЬНИЙ ХІМІЧНИЙ АНАЛІЗ (необов'язково)

S = концентрація фізико-хімічного (стерильного) контролю за

28 днів

S = концентрація в засіяній колбі за 28 днів,

S  - S
                          b    a
     % біорозкладання = --------- x 100
                            S
                             b

9. АБІОТИЧНЕ РОЗКЛАДАННЯ (необов'язкове)

a = поглинання кисню в стерильних колбах після 28 днів, мг)

a x 100
     поглинання кисню на мг досліджуваної речовини = -------
                                                       C V
                                                        o

(див. Розділи 1 та 3)

a x 100
    % абіотичного розкладання = -----------
                                 C V x ThOD
                                  o

ЧАСТИНА VI. ДОСЛІДЖЕННЯ ЗА МЕТОДОМ ЗАКРИТОЇ ПЛЯШКИ (Метод C.4-E)

VI.1 ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

Розчин досліджуваної речовини у мінеральному середовищі, зазвичай 2-5 мг/літр, заповнюється порівняно невеликою кількістю мікроорганізмів різних популяцій та зберігається в абсолютно повних закритих колбах у темному місці за сталої температури. Відбувається спостереження за розкладанням протягом 28 днів шляхом аналізу розчиненого кисню. Об'єм кисню, що виділяється досліджуваною речовиною (з поправкою на паралельний процес утворення з холостої проби посівного матеріалу), виражається через відсоткове значення ТПК чи ХПК.

VI.2. ОПИС МЕТОДУ

VI.2.1. Технічне оснащення

a) БПК колби зі скляними пробками, напр., 250-300 мл;

b) водяна баня чи інкубатор, щоб зберігати колби за сталої температури (+- 1 град.C чи менше) без доступу світла;

c) великі скляні колби (2-5 літрів) для приготування середовища й наповнення БПК колб;

d) кисневий електрод та лічильник, або обладнання та реагенти для титрування Вінклера.

VI.2.2. Приготування мінерального середовища

Для приготування основного розчину див. I.6.2.

Слід змішати 1 (один) мл розчину (a) і (d) та довести до об'єму 1 л шляхом додавання води для розчинення.

VI.2.3. Приготування посівного матеріалу

Посівний матеріал зазвичай береться зі вторинних очищених стічних вод водоочисної станції чи лабораторної установки, яка очищує переважно комунально-побутові стічні води. Альтернативне джерело посівного матеріалу - поверхневі води. Зазвичай використовують від однієї краплі (0,05 мл) до 5 мл фільтрату на літр середовища; можливо знадобляться тести, щоб визначити оптимальний об'єм очищених стічних вод (Див. I.6.4.2 і I.6.5).

VI.2.4. Підготовка колб

Сильно проаерувати мінеральне середовище протягом щонайменше 20 хв. Для кожної серії досліджень брати проби з того самого мінерального середовища. Загалом середовище придатне для використання через 20 год. зберігання за заданої температури. Визначити концентрацію розчиненого кисню для контрольних вимірів, її значення має бути приблизно 9 мг/літр при температурі 20 град.C. Провести усі операції з переливання та заповнення насиченого киснем середовища без утворення газових бульбашок, наприклад, з використанням сифонів.

Підготувати аналогічні партії БПК колб для визначення досліджуваних та еталонних речовин в одночасних дослідженнях. Зібрати достатню кількість БПК колб, зокрема холостої проби посівного матеріалу, щоб можна було принаймні двічі виміряти витрати кисню через задані часові проміжки, наприклад, через 0, 7, 14, 21 та 28 днів. Щоб точно визначити 10-денний інтервал, може знадобитись більше колб.

Заповнити великі колби повністю аерованим мінеральним середовищем приблизно на одну третину. Після цього додати достатню кількість основного розчину досліджуваної та еталонної речовин, щоб відокремити великі колби так, щоб кінцева концентрація речовин не перевищувала 10 мг/літр. Не додавати хімічні речовини до холостої проби контрольного середовища, яке міститься у додатковій великій колбі.

Щоб не обмежувати активність посівного матеріалу, концентрація розчиненого кисню має бути не нижчою за 0,5 мг/літр у БПК колбах. Це скорочує концентрацію досліджуваної речовини приблизно до 2 мг/літр. Однак для речовин, які погано розкладаються, чи речовин з низьким ТПК, можна використовувати концентрацію 5-10 мг/літр. У деяких випадках бажано проводити аналогічні випробування досліджуваних речовин у різних концентраціях, наприклад, 2 і 5 мг/літр. Зазвичай треба розраховувати ТПК на основі утворення амонієвих солей, але якщо буде нітрифікація, можна розраховувати ТПК на основі утворення нітрату (ТПК : див. Додаток 2.2). Однак, якщо нітрифікація є не NO 3

завершеною,  але  вона  відбувається,  треба  зважати   на   зміну
концентрації нітриту та нітрату,  які визначаються аналізом, (див.
Додаток 5).

Якщо треба визначити токсичність досліджуваної речовини (наприклад, раніше було виявлено низьку здатність до біологічного розкладу), потрібна інша партія колб.

Підготувати іншу велику колбу для аерованого мінерального середовища (приблизно одна третина об'єму) та досліджуваної й еталонної речовин у кінцевих концентраціях, зазвичай таких самих, як і в інших великих колбах.

Заповнити великі колби з розчином вторинними очищеними стічними водами (від однієї краплі чи приблизно 0,05 мл до 5 мл/літр) чи іншою рідиною, наприклад, річковою водою (Див. I.6.4.2.). Зрештою, додати до розчину аероване мінеральне середовище, користуючись шлангом, який дістає до дна колби і забезпечує ретельне змішування.

VI.2.5. Кількість колб у типовому циклі

У типовому циклі використовуються такі колби:

- щонайменше 10 колб з досліджуваною речовиною та посівним матеріалом (досліджувана суспензія),

- щонайменше 10 колб лише з посівним матеріалом (холоста проба посівного матеріалу),

- щонайменше 10 колб з еталонною речовиною та посівним матеріалом (технологічний контроль),

- і, за необхідності, 6 колб з досліджуваною, еталонною речовинами та посівним матеріалом (перевірка на токсичність). Однак, щоб точно визначити 10-денний інтервал, може знадобитись більше колб.

VI.2.6. Проведення досліду

Негайно розлити приготовані розчини у відповідну партію БПК колб за допомогою шлангу з нижньої чверті (не дна) відповідної великої колби, так щоб БПК колби були повністю заповнені. Обережно постукати, щоб видалити усі повітряні бульбашки. Одразу проаналізувати колби на розчинений кисень методом Вінклера або за допомогою електродів. Вміст колб може бути збережений для подальшого аналізу методом Вінклера з додаванням сульфату марганцю (II) чи гідроксиду натрію (для першого реагенту Вінклера). Зберігати обережно закриті колби зі зв'язаним киснем, коричневий гідрооксид марганцю (III), у темному місці при температурі 10-20 град.C не довше ніж добу перед тим, як перейти до наступних етапів методу Вінклера. Закрити інші колби, що залишились, так, щоб туди не потрапили повітряні бульбашки, та зберігати при температурі 20 град.C у темному місці. Для кожної партії колб має бути ще одна партія для визначення холостої проби засіяного середовища. Забрати або принаймі зробити ще раз колби усіх партій для аналізу розчиненого кисню через певні проміжки часу (принаймні щотижня) через 28 днів розведення.

Щотижневі зразки повинні давати можливість оцінювання процентного значення відщеплення протягом 14-денного інтервалу, а зразки, що беруться кожні 3-4 дні - визначення 10-денного інтервалу, на що знадобиться удвічі більше колб.

Для досліджуваних речовин, які містять азот, треба зважати на поглинання кисню під час нітрифікації. Для цього необхідно використовувати метод O -електроду для визначення концентрації 2

розчиненого кисню, а потім узяти зразок з БПК колби для аналізу на
нітрат  та  нітрит.   Вирахувати   використаний   кисень   завдяки
збільшенню концентрації нітриту та нітрату. (див. Додаток V).

VI.3. ДАНІ ТА ЗВІТУВАННЯ

VI.3.1. Обробка результатів

Спочатку порахувати БПК, отримане після кожного часового періоду, віднімаючи зменшення кількості кисню (мг O /літр) у 2

холостій  пробі  посівного  матеріалу.  Розділити  це   виправлене
зменшення  на  концентрацію (мг/літр) досліджуваної речовини,  щоб
отримати питому  БПК,  мг  кисню  на  мг  досліджуваної  речовини.
Порахувати   процентну   можливість   біологічного  розпаду  можна
розділивши питому БПК на питому ТПК (розрахунки згідно з  Додатком
2.2) чи ХПК (визначається за допомогою аналізу, див. Додаток 2.3),
отже:

(мг поглинання O досліджуваною речовиною - 2 мг поглинання O холостою пробою) 2 БПК = -------------------------------------------------

(мг досліджуваної речовини у колбі)

= мг O на мг досліджуваної речовини 2

БПК (мг O /мг досліджуваної речовини)
                               2
     % розкладання = -------------------------------------- x 100
                      ТПК(мг O /мг досліджуваної речовини)
                              2

чи

БПК (мг O /мг досліджуваної речовини)
                               2
     % розкладання = --------------------------------------- x 100
                      ХПК (мг O /мг досліджуваної речовини)
                               2

Необхідно зазначити, що ці два методи не обов'язково дадуть однакові результати, краще використовувати перший метод.

Для азотовмісних досліджуваних речовин слід використовувати відповідний ТПК (NH or NO ), згідно якого очікується процес 4 3

нітрифікації (Додаток 2.2).  Якщо нітрифікація  відбувається,  але
вона не завершена,  можна вирахувати поглинання кисню,  врахувавши
зміни у концентрації нітриту й нітрату (Додаток 5).

VI.3.2. Достовірність результатів

Об'єм скорочення кисню у холостій пробі посівного матеріалу не повинен перевищувати 1,5 мг розчиненого кисню на літр через 28 днів. Вищі показники вказують на необхідність дослідження методик експерименту. Кінцева концентрація кисню у колбах повинна бути постійно не нижче за 0,5 мг/літр. Такий низький рівень кисню є правильним лише тоді, коли за методом, що використовується для визначення розчиненого кисню можна вимірювати точно.

Див. також I.5.2.

VI.3.3. Звітування Див. I.8.

VI.4. Лист даних

Нижче наведено зразок листа даних.

ДОСЛІДЖЕННЯ ЗА МЕТОДОМ ЗАКРИТОЇ ПЛЯШКИ

1. ЛАБОРАТОРІЯ

2. ДАТА ПОЧАТКУ ДОСЛІДЖЕННЯ

3. ДОСЛІДЖУВАНА РЕЧОВИНА

Назва:

Концентрація основного розчину: ... мг/л

Початкова концентрація в колбі, до: ... мг/л

ТПК чи ХПК: ......мг O /мг досліджуваної речовини 2

4. ПОСІВНИЙ МАТЕРІАЛ

Джерело:

Проведена обробка:

Попередня підготовка (за наявності):

Концентрація у реакційній суміші: мг/л

5. СПОСІБ ВИЗНАЧЕННЯ

Метод: Вінклера/електродний

Аналіз колби

------------------------------------------------------------------
|              Час вирощування (d)                |   DO (мг/л)  |
|                                                 |--------------|
|                                                 | 0 | n | n |  |
|                                                 |   |  1|  2|  |
|-------------------------------------------------+---+---+---+--|
|Холоста проба                      |   1   |  C  |   |   |   |  |
|(без хімічних речовин)             |       |   1 |   |   |   |  |
|                                   |-------+-----+---+---+---+--|
|                                   |   2   |  C  |   |   |   |  |
|                                   |       |   2 |   |   |   |  |
|-----------------------------------+-------------+---+---+---+--|
|Значення                           |     C  + C  |   |   |   |  |
|                                   |      1    2 |   |   |   |  |
|                                   |m  = --------|   |   |   |  |
|                                   | b      2    |   |   |   |  |
|-----------------------------------+-------------+---+---+---+--|
|Досліджувана речовина              |   1   |  a  |   |   |   |  |
|                                   |       |   1 |   |   |   |  |
|                                   |-------+-----+---+---+---+--|
|                                   |   2   |  a  |   |   |   |  |
|                                   |       |   2 |   |   |   |  |
|-----------------------------------+-------------+---+---+---+--|
|Значення                           |     a  + a  |   |   |   |  |
|                                   |      1    2 |   |   |   |  |
|                                   |m  = ------- |   |   |   |  |
|                                   | t      2    |   |   |   |  |
------------------------------------------------------------------

Примітка: Такий самий формат може використовуватись також для основного і токсичного контролю.

6. КОРЕКЦІЯ З УРАХУВАННЯМ НІТРИФІКАЦІЇ (див. Додаток V)

------------------------------------------------------------------
|              Час вирощування (d)               | 0 |n  |n  |n  |
|                                                |   | 1 | 2 | 3 |
|------------------------------------------------+---+---+---+---|
|(i) Концентрація нітрату (мг N/літр)            |   |   |   |   |
|------------------------------------------------+---+---+---+---|
|(ii) Зміна концентрації нітрату (мг N/літр)     | - |   |   |   |
|------------------------------------------------+---+---+---+---|
|(iii) Еквівалент кисню (мг/літр)                | - |   |   |   |
|------------------------------------------------+---+---+---+---|
|(iv) Концентрація нітриту (мг N/літр)           |   |   |   |   |
|------------------------------------------------+---+---+---+---|
|(v) Зміна концентрації нітриту (мг N/літр)      | - |   |   |   |
|------------------------------------------------+---+---+---+---|
|(vi) Еквівалент кисню (мг/літр)                 | - |   |   |   |
|------------------------------------------------+---+---+---+---|
|(iii + vi) Загальний еквівалент кисню (мг/літр) | - |   |   |   |
------------------------------------------------------------------

7. СКОРОЧЕННЯ: % РОЗКЛАДАННЯ

------------------------------------------------------------------
|                                       |    Поглинання через    |
|                                       |    n днів (мг/літр)    |
|                                       |------------------------|
|                                       | n   |  n  |  n  |      |
|                                       |  1  |   2 |   3 |      |
|---------------------------------------+-----+-----+-----+------|
|Колба 1: (m   - m  ) - (m   - m        |     |     |     |      |
|           to -  tx      bo    bx)     |     |     |     |      |
|---------------------------------------+-----+-----+-----+------|
|Колба 2: (m   - m  ) - (m  - m  )      |     |     |     |      |
|           to    tx      bo   bx       |     |     |     |      |
|---------------------------------------+-----+-----+-----+------|
|Колба 1:                               |     |     |     |      |
|% D  = ((m  - m  ) - (m  - m  )) x 100 |     |     |     |      |
|   1      to   tx      bo   bx         |     |     |     |      |
|конц. хімречовини x ТПК                |     |     |     |      |
|---------------------------------------+-----+-----+-----+------|
|Колба 2:                               |     |     |     |      |
|% D  = ((m  - m  ) - (m  - m  )) x 100 |     |     |     |      |
|   2      to   tx      bo   bx         |     |     |     |      |
|конц. хімречовини x ТПК                |     |     |     |      |
|---------------------------------------+-----+-----+-----+------|
|                  D  - D               |     |     |     |      |
|                   1    2              |     |     |     |      |
|% D, середнє(*) = ----------           |     |     |     |      |
|                     2                 |     |     |     |      |
------------------------------------------------------------------

----------------

(*) Не можна зважати на значення, якщо є суттєва відмінність між однаковими колбами.

m = значення у колбі у час 0

m = значення у колбі у час Х

m = середнє значення холостої проби за час 0

m = середнє значення холостої проби за час x

Метод корекції з урахуванням нітрифікації можна знайти з iii до vi у частині 6.

8. СКОРОЧЕННЯ ХОЛОСТОЇ ПРОБИ

Поглинання кисню холостою пробою: (m - m ) мг/літр. Це bo b28

поглинання є  важливим  для  достовірності  дослідження.  Показник
поглинання повинен бути менше ніж 1,5 мг/літр.

ЧАСТИНА VII. ДОСЛІДЖЕННЯ ЗА МЕТОДОМ ММТП (Метод C.4-F)

VII.1. ПРИНЦИП МЕТОДУ

Поглинання кисню переміщуваним розчином або суспензією хімічної речовини, що тестується у мінеральному середовищі, засіяному спеціально вирощеними, непристосованими мікроорганізмами, автоматично вимірюється протягом періоду в 28 днів у затемненому, закритому спірометрі при температурі 25 +- 1 град.C. Вуглекислий газ, що виділяється, поглинається натровим вапном. Здатність до біорозкладання виражається у вигляді процентного співвідношення поглиненого кисню (з поправкою на поглинання холостою пробою) відносно теоретичного поглинання (ТПК). Процентне співвідношення первинної здатності до біорозкладання також вираховується за допомогою додаткового специфічного хімічного аналізу, проведеного на початку та в кінці інкубації та, можливо, за допомогою РОВ аналізу.

VII.2. ОПИС МЕТОДУ

VII.2.1. Обладнання

(а) Автоматичний електролітичний БПК вимірювач або спірометр, зазвичай обладнаний шістьма колбами по 300 мл кожна та склянками з абсорбентом CO ; 2

(b) кімната з постійною температурою та/або водяна баня при температурі 25 град.C +- 1 град.C або вище;

(с) мембранний фільтр (необов'язково);

(d) карбоаналізатор (необов'язково);

VII.2.2. Приготування мінерального середовища

Наступні основні розчини має бути приготовано із використанням хімічно чистих речовин та води (Див. I.6.1.):

(а) Монофосфат калію, KH PO 8,50 г 2 4 Гідрофосфат калію, K HPO 21,75 г 2 4 Дванадцятизаміщений фосфорнокислий натрій Na HPO . 12 H O 44,60 г 2 4 2 Хлорид аммонію, NH Cl 1,70 г 4

Розчинити у воді і довести до об'єму 1 л.

Водневий показник розчину має становити 7,2.

(b) Гептагідрат сульфату магнію, MgSO . 7 H O 22, 50 г 4 2

Розчинити у воді і довести до об'єму 1 л.

(с) Ангідрид хлориду кальцію CaCl 27,50 г 2

Розчинити у воді і довести до об'єму 1 л.

(d) Гексагідрат хлориду заліза (III), FeCl . 6H O 0,25 г 3 2

Розчинити у воді і довести до об'єму 1 л.

Взяти по 3 мл кожного розчину (a), (b), (c) та (d) і довести до 1 л.

VII.2.3. Приготування посівного матеріалу

Необхідно взяти свіжі зразки не менш ніж в десяти місцях, переважно у районах, де використовуються та виділяються різноманітні хімікати. В таких місцях, як споруди для очистки промислових стічних вод, ріки, озера, моря, візьміть 11 зразків мулу, поверхневого шару ґрунту, води тощо та ретельно змішати. Після видалення плаваючої речовини та відстоювання слід встановити водневий показник надосадової рідини на рівні 7 +- 1 за допомогою гідроксиду натрію або фосфорної кислоти.

Слід використати підходящий об'єм відфільтрованої надосадової рідини, щоб наповнити посудину для активованого мулу, та аерувати рідину приблизно 23 1/2 год. Через 30 хвилин після припинення аерації необхідно усунути приблизно одну третину загального об'єму надосадової рідини та додати до речовини, що осіла, відповідний об'єм розчину (pH 7), який містить по 0,1% глюкози, пептону та монофосфат калію, та продовжити аерацію. Цю процедуру слід повторювати раз на день. При обробці зразка мулу слід дотримуватися сумлінної практики: стічні води слід очистити, температуру слід тримати на рівні 25 +- 2 град.C, водневий показник повинен бути 7 +- 1, мул має добре осідати та достатньо аеруватися, щоб суміш весь час була аеробною, у суміші має бути присутня протозоа, а також активність мулу слід порівнювати з еталонною речовиною щонайменше раз на три місяці. Не можна використовувати мул як посівний матеріал, поки він не пройде обробки щонайменше протягом місяця, але не більше ніж чотири місяці. Відтак, слід брати зразки з 10 місць через відповідні інтервали, один раз на три місяці.

Щоб підтримувати у свіжому та старому мулі однакову активність, необхідно перемішати відфільтровану надосадову рідину активованого мулу з відповідним об'ємом відфільтрованої надосадової рідини свіжезібраної суміші мулу з 10 джерел та культивувати комбінований розчин як описано вище. Мул має використовуватися як посівний матеріал через 18-24 години після підгодовування зразка.

VII.2.4. Підготовка колб

Необхідно підготувати наступні шість колб:

N 1: досліджувана хімічна речовина у воді для розведення при 100 мг/л

N 2, 3 та 4: досліджувана хімічна речовина у мінеральному середовищі при 100 мг/л

N 5: еталонна хімічна речовина (напр., анілін) у мінеральному середовищі при 100 мг/л

N 6: чисте мінеральне середовище

Слід додати слабкорозчинні пробні хімічні елементи безпосередньо в колби за вагою або об'ємом, або працювати з ними, як описано в Додатку 3, за винятком того, що не слід використовувати жодних розчинників або емульгаторів. Необхідно додати абсорбент CO в спеціальних склянках до всіх колб. Слід 2

встановити водневий показник у колбах N 2, 3 та 4 на рівні 7,0.

VII.2.5. Проведення досліду

Необхідно засіяти колби N 2, 3 та 4 (пробні суспензії), N 5 (контроль активності) та N 6 (холоста проба посівного матеріалу) малим об'ємом посівного матеріалу, щоб концентрація складала 30 мг/л твердої зависі. До колби N 3, яка відіграє роль абіотичного контролю, посівний матеріал не додається. Слід зібрати обладнання, перевірити на герметичність, розпочати змішування та вимірювання поглинання кисню в темряві. Необхідно щоденно перевіряти температури, мішалку та кулонометричний реєстратор поглинання кисню, а також відмічати будь-яку зміну кольору вмісту колб. Слід вивчати поглинання кисню в шести колбах безпосередньо за допомогою відповідного методу, наприклад, за допомогою шеститочкового діаграмного самописця, який створює криву БПК. В кінці інкубації, зазвичай через 28 днів, слід виміряти водневий показник вмісту колб та визначити концентрацію залишкової досліджуваної хімічної речовини і будь-якої проміжної сполуки та, у випадку водорозчинної речовини, концентрацію РОВ (Додаток 2.4). Слід бути особливо уважними у випадку летких хімічних речовин. Якщо має відбутися нітрифікація, слід за можливості визначи ти концентрацію нітрату та нітриту.

VII.3. ДАНІ ТА ЗВІТУВАННЯ

VII.3.1. Обробка результатів

Необхідно розділити поглинання кисню (мг) досліджуваною хімічною речовиною після певного часу із поправкою на кисень, поглинутий при контролі холостої проби посівного матеріалу після рівного проміжку часу, на вагу використаної досліджуваної хімічної речовини. Це дасть БПК, виражене в мг кисню/мг досліджуваної хімічної речовини, тобто:

(мг поглиненого досліджуваною хімічною речовиною O 2 - мг поглиненого холостою пробою посівного матеріалу O ) 2 БПК = -----------------------------------------------------------

(мг досліджуваної хімічної речовини в колбі)

= мг O на мг досліджуваної хімічної речовини 2

Процентне співвідношення  біорозкладання потім можна отримати
з:
                            БПК (мг O /мг хімічної речовини)
                                     2
 % біорозкладання = % ТПК = -------------------------------- x 100
                            ТПК (мг O /мг хімічної речовини)
                                     2

Для сумішей ТПК визначається за допомогою елементного аналізу, як і для простих сполук. Слід використовувати ТПК (ТПК NH 4 або ТПК ), враховуючи, чи відбулася нітрифікація, чи вона NO 3

відсутня (Додаток 2.2). Однак, якщо нітрифікація відбувається, але
ще   не   закінчилась,   необхідно  зробити  поправку  на  кисень,
поглинений нітрифікацією,  який вираховується із змін концентрації
нітриту та нітрату (Додаток 5).

Процентне співвідношення первинного біорозкладання визначається із втрати конкретної (початкової) хімічної речовини (див. 1.7.2).

S  - S
                             b    a
                      D  = ---------- x 100
                       t       S
                                b

Якщо відбулася втрата досліджуваної хімічної речовини з колби N 1, при вимірюванні фізико-хімічного відщеплення слід відмітити це та використати концентрацію досліджуваної хімічної речовини (S ) у цій колбі після 28 днів, щоб визначити процентне b

співвідношення біорозкладання.

Під час визначення РОВ (необов'язково) процентне співвідношення кінцевого біорозкладання визначається за наступною формулою:

C  - C
                               t    bt
                    D  = (1 - --------) x 100

t C - C o bo

як описується в пункті I.7.1. Якщо відбулася втрата РОВ в колбі N 1, при вимірюванні фізико-хімічного відщеплення слід використати концентрацію РОВ у колбі, щоб визначити процентне співвідношення біорозкладання.

Всі результати слід занести в надані листи даних.

VII.3.2. Достовірність результатів

28  днів.  Поглинання  кисню  холостою  пробою посівного матеріалу
звичайно дорівнює 20-30 мг O /л і не повинно перевищувати 60  мг/л
                            2
за  28  днів.  Значення  більші  за  60  мг/л вимагають критичного
вивчення даних та методики експерименту.  Якщо значення  водневого
показника виходить за рамки 6-8,5 і поглинання кисню досліджуваною
хімічною речовиною менше  60%,  дослід  слід  повторити  з  меншою
концентрацією досліджуваної хімічної речовини.

Див. також I.5.2.

Якщо процентне співвідношення розкладання аніліну, визначене з поглинання кисню, не перевищує 40% після семи днів та 65% після 14 днів, дослід вважається недійсним.

VII.3.3. Звітування

Див. I.8.

VII.4. ЛИСТ ДАНИХ

Нижче наведено зразок листа даних.

ДОСЛІДЖЕННЯ ЗА МЕТОДОМ ММТП (I)

1. ЛАБОРАТОРІЯ

2. ДАТА ПОЧАТКУ ДОСЛІДЖЕННЯ

3. ДОСЛІДЖУВАНА РЕЧОВИНА

Назва:

Концентрація основного розчину: мг/л як хімічна речовина

Початкова концентрація в середовищі, СО: ... мг/л як хімічна речовина

Об'єм реакційної суміші, V: ... мл

ТПК: ... мг O /л 2

4. ПОСІВНИЙ МАТЕРІАЛ

Місця збору зразків мулу:

(1) .... (6) ....

(2) .... (7) ....

(3) .... (8) ....

(4) .... (9) ....

(5) .... (10) ....

Концентрація твердої зависі в активованому мулі після акліматизації в синтетичних стічних водах = ... мг/л

Об'єм активованого мулу на літр кінцевого середовища = ... мл

Концентрація мулу у кінцевому середовищі = ... мг/л

5. ПОГЛИНАННЯ КИСНЮ: БІОРОЗКЛАДАННЯ

Тип використаного спірометра:

------------------------------------------------------------------
|                                            |     Час (Дні)     |
|                                            |-------------------|
|                                            | 0 | 7 |14 |21 |28 |
|--------------------------------------------+---+---+---+---+---|
|Поглинання (мг) O         |        а        |   |   |   |   |   |
|                 2        |         1       |   |   |   |   |   |
|хімічною речовиною        |-----------------+---+---+---+---+---|
|                          |        а        |   |   |   |   |   |
|                          |         2       |   |   |   |   |   |
|                          |-----------------+---+---+---+---+---|
|                          |        а        |   |   |   |   |   |
|                          |         3       |   |   |   |   |   |
|--------------------------+-----------------+---+---+---+---+---|
|Поглинання (мг) O         |        b        |   |   |   |   |   |
|                 2        |                 |   |   |   |   |   |
|холостою пробою посівного |                 |   |   |   |   |   |
|матеріалу                 |                 |   |   |   |   |   |
|--------------------------+-----------------+---+---+---+---+---|
|З поправкою на БПК (мг)   |    (а  - b )    |   |   |   |   |   |
|                          |      1    1     |   |   |   |   |   |
|                          |    (а  - b )    |   |   |   |   |   |
|                          |      1    1     |   |   |   |   |   |
|                          |    (а  - b )    |   |   |   |   |   |
|                          |      1    1     |   |   |   |   |   |
|--------------------------+-----------------+---+---+---+---+---|
|БПК на мг досліджуваної   |(a - b)| Колба 1 |   |   |   |   |   |
|хімічної речовини         |-------|---------+---+---+---+---+---|
|                          | C  V  | Колба 2 |   |   |   |   |   |
|                          |  o    |---------+---+---+---+---+---|
|                          |       | Колба 3 |   |   |   |   |   |
|--------------------------+-------+---------+---+---+---+---+---|
|% розкладання             |       |   1     |   |   |   |   |   |
|БПК                       |       |---------+---+---+---+---+---|
|---- x 100                |       |   2     |   |   |   |   |   |
|ТПК                       |       |---------+---+---+---+---+---|
|                          |       |   3     |   |   |   |   |   |
|                          |       |---------+---+---+---+---+---|
|                          |       |Середній |   |   |   |   |   |
|                          |       |   (*)   |   |   |   |   |   |
|----------------------------------------------------------------|
|(*) Середній показник не враховується при значних розбіжностях  |
|між репліками                                                   |
------------------------------------------------------------------

Примітка: аналогічні формати можуть використовуватися для еталонної сполуки.

6. АНАЛІЗ ВУГЛЕЦЮ (необов'язковий)

Карбоаналізатор:

------------------------------------------------------------------
|      Колба       |        РОВ        |% видаленого|  Середній  |
|                  |-------------------|     РОВ    |  показник  |
|                  |Виміряно|    З     |            |            |
|                  |        |поправкою |            |            |
|------------------+--------+----------+------------+------------|
|  Вода + пробна   | а  |   |      |   |     -      |     -      |
|     речовина     |    |   |      |   |            |            |
|------------------+----+---+------+---+------------+------------|
|   Мул + пробна   | b  |   |b  - с|   |            |            |
|     речовина     |  1 |   | 1    |   |            |            |
|------------------+----+---+------+---+------------+------------|
|   Мул + пробна   | b  |   |b  - с|   |            |            |
|     речовина     |  2 |   | 2    |   |            |            |
|------------------+----+---+------+---+------------+------------|
|   Мул + пробна   | b  |   |b  - с|   |            |            |
|     речовина     |  3 |   | 3    |   |            |            |
|------------------+----+---+------+---+------------+------------|
|Контрольна холоста| с  |   |   -  |   |     -      |     -      |
|      проба       |    |   |      |   |            |            |
------------------------------------------------------------------

a  - (b - c)
                        1
     % видаленого РОВ: ------------ x 100
                            a

7. СПЕЦІАЛЬНИЙ ХІМІЧНИЙ АНАЛІЗ

------------------------------------------------------------------
|                         |  залишкова кількість   |% розкладання|
|                         | досліджуваної хімічної |             |
|                         |  речовини наприкінці   |             |
|                         |      дослідження       |             |
|-------------------------+------------------------+-------------|
|  Тест холостої проби з  |           S            |             |
|          водою          |            b           |             |
|-------------------------+------------------------+-------------|
|    Засіяне середовище   |          S             |             |
|                         |           a            |             |
|                         |            1           |             |
|                         |------------------------+-------------|
|                         |          S             |             |
|                         |           a            |             |
|                         |            2           |             |
|                         |------------------------+-------------|
|                         |          S             |             |
|                         |           a            |             |
|                         |            3           |             |
------------------------------------------------------------------

S  - S
                      b    a
     % розкладання = -------- x 100
                        S
                         b

Відповідно вираховується % розкладання для колб а  та а
                                                      1     3

8. ПРИМІТКИ

Якщо можливо, слід додати криву БПК.

Додаток 1

АБРЕВІАТУРИ ТА ВИЗНАЧЕННЯ

РК: розчинений кисень (мг/л) - концентрація кисню, розчиненого у пробі на основі води.

БПК: біохімічна потреба в кисні (г) - об'єм кисню, який споживається мікроорганізмами під час метаболізації досліджуваної сполуки; може також виражатися у грамах використаного кисню на грам досліджуваної сполуки. (Див. метод С.5).

ХПК: хімічна потреба в кисні (г) - об'єм кисню, який використовується під час окислення досліджуваної сполуки гарячим кислим дихроматом; являє собою міру присутності об'єму речовини, що здатна окислятися; також виражається як 9 кисень спожитого на грам досліджуваної сполуки. (Див. метод С.6).

РОВ: розчинений органічний вуглець - органічний вуглець, наявний у розчині, або такий, що вільно проходить через фільтр 0,45 мкм, чи залишається у надосадовій рідині після -2

центрифугування при 40 000 м.с.   (+/- 4 000 г) протягом 15 хв.

ТПК: теоретична потреба в кисні (мг) - загальний об'єм кисню, потрібний для повного окислення хімічної речовини; обчислюється за молекулярною формулою (Див. Додаток 2.2) і також виражається у міліграмах кисню, потрібного для окислення міліграма досліджуваної сполуки.

ТКВ: теоретична кількість вуглекислоти (мг) - розрахункова кількість вуглекислоти, що утвориться з відомого чи виміряного вмісту вуглецю у досліджуваній сполуці, яку повністю мінералізовано; також виражається у міліграмах вуглекислоти, що виділяється з міліграму досліджуваної сполуки.

ЗОВ: загальна кількість органічного вуглецю у пробі є сумою органічного вуглецю, який міститься у розчині та суспензії.

НВ: неорганічний вуглець.

ЗВ: загальна кількість вуглецю є сумарною кількістю органічного та неорганічного вуглецю, наявного у пробі.

Першочергова біологічна деструкція:

Зміна хімічної структури речовини, спричинена біологічною дією, яка має своїм наслідком втрату особливих властивостей такої речовини.

Повна біологічна деструкція (аеробна):

Рівень деструкції, який досягається, коли досліджувана сполука повністю утилізована мікробами, внаслідок чого утворюється вуглекислота, вода, мінеральні солі та нові мікробні целюлярні елементи (біомаса).

Легко сприйнятливі до біологічної деструкції:

Умовна класифікація хімічних речовин, що пройшли певні визначені відбіркові тести на повну біологічну деструкцію; ці тести є настільки точними, що вважається, що такі речовини швидко та повністю розкладаються у водному середовищі та за аеробних умов.

Відомі як сприйнятливі до біологічної деструкції:

Класифікація хімічних речовин, для яких існують безперечні докази біологічної деструкції (першочергової чи повної) у будь-якому з визнаних тестувань на біологічну деструкцію.

Придатність до обробки

Здатність сполук до видалення під час біологічної очистки стічних вод, що не матиме негативного впливу на нормальний хід процесу очистки. Загалом до цього типу належать усі сполуки, що є сприйнятливими до біологічної деструкції, але не всі сполуки, відомі як сприйнятні до біологічної деструкції. Абіотичні процеси також можуть використовуватися з цією метою.

Період затримки

Відрізок часу від інокуляції, у тесті на відмирання, до моменту, коли рівень розкладу досягнув принаймні 10 відсотків. Період затримки часто може дуже відрізнятися і його важко відтворити.

Час біологічної деструкції

Відрізок часу від закінчення періоду затримки до моменту, коли досягнуто 90 відсотків від максимального рівня розкладу.

10-денне вікно

Період у десять днів, що наступає відразу ж після досягнення рівня 10 відсотків розкладу.

Додаток 2

ОБЧИСЛЕННЯ ТА ВИЗНАЧЕННЯ ВІДПОВІДНИХ СУМАРНИХ ПОКАЗНИКІВ

Залежно від обраного методу, необхідно отримати певні сумарні параметри. Наступний розділ описує виведення формул цих показників. Застосування цих параметрів описано для кожного з методів окремо.

1. Вміст вуглецю

Вміст вуглецю обчислюється з відомого елементарного складу або визначається елементарним аналізом досліджуваної сполуки.

2. Теоретична потреба в кисні (ТПК)

Теоретичну потребу в кисні (ТПК) можна обчислити, якщо елементарний склад відомий або його визначено елементарним аналізом. Для сполуки:

С H Cl N Na O P S

с h cl n na o p s

без нітрифікації

16(2с+1/2(h-сl-3n)+3s+5/2p+1/2na-o)
     ТПК   = ----------------------------------- mg/mg
        NH                   MW
          4

Або з нітрифікацією

16(2с+1/2(h-сl)+5/2n+1/2na-o)
     ТПК    = ------------------------------ mg/mg
        NO                MW
          4

3. Хімічна потреба у кисні (ХПК)

Хімічна потреба в кисні (ХПК) визначається відповідно методу С.6.

4. Розчинений органічний вуглець (РОВ)

Розчинений органічний вуглець (РОВ) є за визначенням органічним вуглецем будь-якої хімічної речовини або суміші у воді, який вільно проходить через фільтр 0,45 мкм.

Зразки із тестових посудин відразу ж виймаються і фільтруються у фільтрувальному пристрої з використанням відповідного мембранного фільтра. Перші 20 мл (цю кількість можна зменшити при використанні малих фільтрів) відбраковуються. Об'єми у 10-20 мл чи менше, якщо такі вводяться (об'єм залежить від кількості, потрібної для роботи вуглецевого аналізатора), зберігаються для вуглецевого аналізу. Концентрація РОВ визначається за допомогою аналізатора органічного вуглецю, що спроможний точно вимірювати концентрацію вуглецю рівну чи нижчу за 10 відсотків початкової концентрації РОВ, використаної під час випробування.

Відфільтровані зразки, що не піддаються аналізу того ж робочого дня, можна зберігати шляхом утримання у холодильній камері при температурі 2-4 градуси за Цельсієм до 48 годин, або при температурі нижче -18 градусів за Цельсієм - зберігати протягом довшого періоду часу.

Примітки:

Мембранні фільтри часто наповнюються поверхнево-активними речовинами для гідрофілізації. Таким чином, у фільтрі може міститися до кількох міліграмів розчинного органічного вуглецю, що створюватиме певні перешкоди у визначенні біологічної деструкції. Поверхнево-активні речовини та інші розчинні органічні сполуки видаляють з фільтрів шляхом кип'ятіння їх у деіонізованій воді тричі по одній годині. Після цього фільтри можна зберігати у воді протягом тижня. При використанні змінних картриджів для фільтрів, кожну їх партію потрібно перевірити на виділення розчинного органічного вуглецю.

Залежно від типу мембранного фільтру досліджувана хімічна речовина може бути утримана шляхом адсорбції. Тому рекомендується переконатися у тому, що фільтр не утримує досліджувану хімічну речовину.

Замість фільтрації для розрізнення ЗОВ та РОВ можна -2

використовувати  центрифугування  при  40  000 м.с.   (+- 4 000 г)
протягом 15  хвилин.  Цей  метод  не  є  надійним  при  початковій
концентрації менш ніж 10 г  РОВ  на  літр,  оскільки  або  не  всі
бактерії  видаляються,  або  ж  вуглець  є  повторно розчиненим як
частина бактеріальної плазми.

БІБЛІОГРАФІЯ

- Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 12th ed, Am. Pub. Hlth. Ass., Am. Wat. Poll. Control Fed., Oxygen Demand, 1965, P 65.

- Wagner, R., Von Wasser, 1976, vol. 46, 139.

- DIN-Entwurf 38409 Teil 41 Deutsche Einheitsverfahren zur Wasser-, Abwasser- und Schlammuntersuchung, Summarische Wirkungs- und StoffkenngroSen (GruppeH). Bestimmung des Chemischen Sauerstoffbedarfs (CSB) (H41), NormenausschuS Wasserwesen (NAW) in DIN Deutsches Institut fur Normung e.V.

- Gerike, P., The biodegradability testing of poorly water soluble compounds. Chemosphere, 1984, vol 13(1), 169.

Додаток 3

ОЦІНКА БІОЛОГІЧНОЇ ДЕСТРУКЦІЇ СЛАБОРОЗЧИННИХ РЕЧОВИН

При проведенні досліджень на ступінь біологічної деструкції слаборозчинних речовин необхідно звернути особливу увагу на наступні аспекти.

Оскільки однорідні рідини рідко створюють проблеми при взятті проб, рекомендовано гомогенізувати тверді матеріали за допомогою прийнятних засобів, щоб уникнути помилок, пов'язаних з неоднорідністю досліджуваного матеріалу. Необхідно виявляти велику обережність у випадках, коли потрібно взяти кілька міліграмів репрезентативної проби із сумішей хімічних речовин чи матеріалів, де присутня чимала частка домішок.

Під час дослідження можна використовувати різноманітні методи перемішування. Проте їх треба застосовувати обачно, лише у тій мірі, щоб підтримувати хімічну речовину у розсіяному (диспергованому) стані, і уникати перегріву, надлишкового піноутворення та надлишкової сили зрізу.

Можна скористатися емульгатором, що створює постійну дисперсію даної речовини. Проте він не повинен бути токсичним для бактерій, а також не повинен піддаватися біологічній деструкції чи утворювати піну в умовах проведення дослідження.

Такі ж критерії застосовуються і для вибору розчинника.

Рекомендовано не використовувати заповнені носії для твердих досліджуваних речовин, але вони можуть бути придатними лише для окремих речовин.

При використанні додаткових речовин, таких як емульгатори, розчинники та носії, потрібно спершу виконати дослідження холостої проби, що містить допоміжну речовину.

Будь-які з трьох спірометричних досліджень СО , БПК, МІТІ 2

можна  використовувати  для  дослідження  біологічної   деструкції
слабкорозчинних сполук.

БІБЛІОГРАФІЯ

- de Morsier, A. et al. Biodegradation tests for poorly soluble compounds. Chemosphere, 1987, vol. 16, 833.

- Gerike, P, The Biodegradability testing of poorly water soluble compounds. Chemosphere, 1984, vol. 13, 169.

Додаток 4

ОЦІНКА БІОЛОГІЧНОЇ ДЕСТРУКЦІЇ ХІМІЧНИХ РЕЧОВИН, ЩО ВВАЖАЮТЬСЯ ТОКСИЧНИМИ ДЛЯ ІНОКУЛЯТУ (ПОСІВНОГО МАТЕРІАЛУ)

Коли хімічну речовину піддають дослідженню на легку сприйнятливість до біологічної деструкції і вона виявиться такою, що не піддається розкладу, рекомендовано застосовувати наступну процедуру для розрізнення між затримкою реакції та інертністю сполуки (Reynoldsetal., 1987).

Для дослідження як на токсичність, так і біологічну деструкцію потрібно використовувати ідентичний або ж схожий інокулят.

Для оцінки токсичності хімічних речовин, досліджуваних на легкість біологічної деструкції, найкращим вважається застосування одного або поєднання методу затримання інтенсивності дихання емульсії (випробування на затримку дихання активованої емульсії - Директива 87/302/ЕЕС), БПК і/або методів затримки росту.

Якщо необхідно уникнути затримки реакції через токсичність, рекомендовано використовувати концентрації досліджуваної речовини, використаної для дослідження на легкість біологічної деструкції, менше ніж 1/10 показника ЕК речовини (або менше ніж показники 50

ЕК  )  від  отриманих  при  дослідженні на токсичність.  Сполуки з
  20
показником ефективної концентрації більшим ніж 300 мг/л не повинні
мати  токсичного  впливу  у  дослідженнях  на легкість біологічної
деструкції.

Показники ЕК менше ніж 20 мг/л скоріш за все створюватимуть 50

серйозні проблеми для подальших досліджень. Потрібно застосовувати
низькі концентрації досліджуваних речовин, що вимагає використання
точного  та  чутливого  тесту із закритою пляшкою або використання
                     14
матеріалу з поміткою    С.  У якості альтернативи, акліматизований
інокулят    може   допускати   використання   вищих   концентрацій
досліджуваної речовини.  Проте,  в останньому випадку  специфічний
критерій   легкої   сприйнятливості   до   біологічної  деструкції
втрачається.

БІБЛІОГРАФІЯ

Reynolds, L. et al., Evaluation of the toxicity of substances to be assessed for biodegradability. Chemosphere, 1987, vol. 16, 2259.

Додаток 5

ПОПРАВКА ПО ЗАСВОЄННЮ КИСНЮ ДЛЯ ВИПАДКІВ ІНТЕРФЕРЕНЦІЇ НІТРИФІКАЦІЇ

Похибки, пов'язані з нітрифікацією, котру не було враховано при оцінці біологічної деструкції досліджуваних речовин за засвоєнням кисню не є суттєвими (не більше 5 відсотків), якщо такі речовини не містять N, навіть коли окислення амонію-N у середовищі відбувається нерівномірно, як між тестовою посудиною, так і посудиною з холостою пробою. Проте, у випадку з речовинами, які містять N, можуть виникати серйозні похибки.

Якщо нітрифікація відбулася, але вона є неповною, зафіксоване засвоєння кисню реагуючою сумішшю можна скоригувати на об'єм кисню, використаний для окислення амонію до нітриту та нітрату, якщо зміни концентрації під час інкубації нітриту та нітрату визначаються розглядом наступних рівнянь:

2 NH Cl + 3 O = 2 HNO + 2 HCl + 2 H O (1) 4 2 2 2

2 HNO + O = 2 HNO (2) 2 2 3

В цілому:

2 NH Cl + 4 O = 2 HNO + 2HCl + 2 H O (3) 4 2 3 2

З рівняння (1), засвоєння кисню 28 грамами нітрогену, що містяться у хлориді амонію (NH Cl), під час його окислення 4

становить 96 грам,  тобто коефіцієнт 3,43 (96/28). Таким же чином,
з рівняння (3) засвоєння кисню 28 грамами нітрогену під  час  його
окислення  до  нітрату  становить  128  грамів,  тобто  коефіцієнт
складає 4,57 (128/28).

Оскільки реакції є послідовними і виконуються різними та несхожими видами бактерій, концентрація нітриту може знижуватися чи підвищуватися; в останньому випадку, утвориться така ж концентрація нітрату. Таким чином, кисень, використаний для утворення нітрату, дорівнює добутку коефіцієнту 4,57 помноженого на ріст концентрації нітрату, в той час як кисень, пов'язаний з утворенням нітриту, дорівнює добутку коефіцієнту 3,43 помноженого на ріст концентрації нітриту, або ж зі зменшенням його концентрації втрата кисню становитиме -3,43 помножене на зменшення концентрації.

Тобто:

О , використаний при утворенні нітрату = 4,57 х ріст

концентрації нітрату                                      (4)

О , використаний при утворенні нітриту = 3,43 х ріст

концентрації нітриту                                      (5)

О , втрачений при зникненні нітриту = -3,43 х зменшення

концентрації нітрату                                      (6)

Отже

Засвоєння О , через нітрифікацію = +/-3,43 х зміни 2

концентрації нітриту + 4,57 х збільшення концентрації

нітрату                                                   (7)

I таким чином

Засвоєння О , пов'язане з окисленням вуглецю = загальне 2

зафіксоване засвоєння, пов'язане з нітрифікацією (8)

Якщо визначається лише загальний окислений N, засвоєння кисню, пов'язане з нітрифікацією, можна прийняти, як у першому наближенні, як рівне 4,57 х збільшення окисленого N.

Скоригований коефіцієнт використання кисню, викликаного окисленням вуглецю, потім порівнюють з теоретичним засвоєнням кисню для NH , як обчислено у Додатку 2. 3

С.5. ДЕГРАДАЦІЯ (РОЗКЛАДАННЯ) - БІОХІМІЧНА ПОТРЕБА В КИСНІ

1. МЕТОД

1.1. ВСТУП

Метою цього методу є вимірювання біохімічної потреби в кисні (БПК) твердих чи рідких органічних речовин.

Дані, отримані за допомогою цього дослідження, стосуються водорозчинних сполук; проте, леткі та малорозчинні у воді сполуки також можна, в принципі, досліджувати таким чином.

Цей метод можна застосовувати лише до тих органічних досліджуваних матеріалів, які не створюють затримок для діяльності бактерій у такій концентрації, яка використана у дослідженні. Якщо піддослідний матеріал не є розчинним у тестовій концентрації, тоді може виникнути потреба у використанні особливих заходів, таких як ультразвукова дисперсія, для досягнення значної дисперсії (розсіювання) досліджуваного матеріалу.

Інформація про токсичність матеріалу може бути корисною для інтерпретації низьких результатів та при виборі відповідних концентрацій речовин для дослідження.

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ ТА ОДИНИЦІ ВИМІРУ

БПК визначають як масу розчиненого кисню, потрібна яка необхідна для конкретного об'єму розчину речовини у процесі біохімічного окислення за вказаних умов.

Результати виражають у грамах БПК на грам досліджуваної речовини.

1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ

Бажано використовувати відповідні еталонні речовини для перевірки діяльності інокуляту.

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

Попередньо визначену кількість речовини, розчинену чи розсіяну у збагаченому киснем середовищі, засівають мікроорганізмами та зберігають на час інкубаційного періоду за постійної визначеної температури оточуючого середовища у темряві.

БПК визначають за різницею у вмісті розчиненого кисню на початку та наприкінці дослідження. Його тривалість повинна становити щонайменше п'ять діб, але не більше ніж 28 діб.

У паралельно розміщеній пробірці, яка не містить досліджуваної речовини, необхідно визначити показники холостої проби.

1.5. КРИТЕРІЇ ЯКОСТІ

Визначення БПК не може вважатися дійсним визначенням сприйнятливості до біологічної деструкції тієї чи іншої речовини. Це дослідження слід розглядати лише як вибірковий (скринінговий) тест.

1.6. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

Для отримання концентрації БПК, сумісної з використовуваним методом, готують попередній розчин або дисперсію потрібної речовини. Після цього БПК визначають згідно будь-якому відповідному національному чи міжнародному стандартному методу.

2. ДАНІ ТА ОЦІНКА

БПК, що міститься у попередньому розчині, обчислюється згідно з обраним стандартизованим методом, і переводиться у грами БПК на грам досліджуваної речовини.

3. СКЛАДАННЯ ЗВІТІВ

Необхідно зазначати використаний метод дослідження.

Біохімічна потреба в кисні має бути середнім арифметичним принаймні трьох дійсних вимірювань.

Вся інформація та зауваження, що стосуються інтерпретації результатів, повинні включатися до звіту, особливо інформація стосовно домішок, фізичного стану, проявів токсичності та специфічного складу досліджуваної речовини, який може вплинути на результати.

Необхідно вказувати у звіті інформацію про використання додаткових речовин для уповільнення біологічної нітрифікації.

4. ПОСИЛАННЯ

Перелік стандартних методів, наприклад:

NF T 90-103: Визначення біохімічної потреби в кисні.

NBN 407: Біохімічна потреба в кисні.

NEN 32355.4: Bepaling van het biochemish zuurstofverbruik (BZV).

Визначення біохімічної потреби у кисні, методи дослідження води та пов'язаних з нею речовин, Королівська державна канцелярія, Лондон.

ISO 5815: Визначення біохімічної потреби у кисні через енну кількість днів.

С.6. ДЕГРАДАЦІЯ (РОЗКЛАДАННЯ) - ХІМІЧНА ПОТРЕБА В КИСНІ

1. МЕТОД

1.1. ВСТУП

Метою цього методу є вимірювання хімічної потреби в кисні (ХПК) твердих чи рідких органічних речовин стандартним, довільно обраним способом, у сталих лабораторних умовах.

Інформація про формулу хімічної речовини буде корисною для проведення цього дослідження та інтерпретації отриманого результату (наприклад, галогенні солі, солі двовалентного заліза в органічних сполуках, хлорорганічні сполуки).

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ ТА ОДИНИЦІ ВИМІРУ

Хімічна потреба в кисні є мірою окислюваності речовини; вона виражається як еквівалентний об'єм у кисні окислюючого реагенту, що використовується речовиною у сталих лабораторних умовах.

Результати виражають у грамах ХПК на грам досліджуваної речовини.

1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ

Немає необхідності застосовувати еталонні речовини у всіх випадках дослідження нової речовини. В першу чергу вони мають слугувати для перевірки методу дослідження час від часу і дозволяти порівняння результатів, коли застосовується ще й інший метод.

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

Попередньо визначену кількість речовини, розчинену чи розсіяну у воді, окислюють дихроматом калію у середовищі концентрованої сірчаної кислоти із сульфатом срібла у якості каталізатора зі зворотним холодильником протягом двох годин. Остаточний дихромат визначається титруванням стандартною сіллю Мора.

У випадку дослідження речовин, що містять хлор, додають сульфат ртуті(1) для зменшення перешкод, спричинених присутностю хлору.

----------------

(1) Після використання розчинів, що містять солі ртуті, потрібно потурбуватися про недопущення її розповсюдження у навколишнє середовище.

1.5. КРИТЕРІЇ ЯКОСТІ

Через довільно обраний спосіб визначення, ХПК є "показником здатності до окислення" і використовується у цій якості як практичний спосіб вимірювання органічної речовини.

Хлор може створювати перешкоди при проведенні дослідження; неорганічні відновлювані або окислюючі агенти також можуть створювати перешкоди для визначення ХПК.

Деякі циклічні сполуки та багато летких речовин (наприклад, нижчі жирні кислоти) не повністю окислюються при цьому дослідженні.

1.6. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

Для отримання БПК між 250 та 600 мг на літр готують попередній розчин або дисперсію потрібної речовини.

Примітки:

У випадку дослідження погано розчинних та нерозсіюваних речовин, можна зважити певну кількість дрібного порошку потрібної речовини чи рідкої речовини, що співвідноситься з 5 мг ХПК, та помістити до дослідного апарату разом з водою.

Хімічна потреба в кисні (ХПК) часто визначається (особливо у випадку з погано розчинними речовинами) переважно за одним з варіантів даного методу, тобто за варіантом, що передбачає застосування закритої системи з вирівнювачем тиску (H.Kelkenberg, 1975). У цій модифікації сполуки, які традиційними методами визначаються з труднощами - наприклад, оцтова кислота, - успішно піддаються обчисленню кількості. Проте, цей метод також може не дати результатів у випадку присутності піридину. Якщо концентрація дихромату калію, як вказано у посиланні (1), підвищується до 0,25 N (0,0416 М), пряме зважування 5-10 мг речовини полегшується, що є суттєво важливим для визначення ХПК для речовин, слабко розчинних у воді (див. посилання 2).

Інакше ж, БПК визначають згідно будь-якому доцільному національному чи міжнародному стандартному методу.

2. ДАНІ ТА ОЦІНКА

ХПК, що міститься у експериментальній колбі, обчислюється згідно з обраним стандартизованим методом, і переводиться у грами ХПК на грам досліджуваної речовини.

3. СКЛАДАННЯ ЗВІТІВ

Необхідно зазначати використаний метод дослідження.

Хімічна потреба в кисні повинна бути середнім арифметичним принаймні трьох дійсних вимірювань. Вся інформація та зауваження, що стосуються інтерпретації результатів, повинні включатися до звіту, особливо інформація стосовно домішок, фізичного стану, проявів токсичності та специфічного складу досліджуваної речовини (якщо вони відомі), які можуть вплинути на результати.

Необхідно вказувати у звіті інформацію про використання сульфату сірки для зменшення перешкод, спричинених наявністю хлору.

4. ПОСИЛАННЯ

(1) Kelkenberg, H.Z. von Wasser und Abwasserforschung, 1975, vol. 8, 146.

(2) Gerike, P. The biodegradability testing of poorly water soluble compounds. Chemosphere, 1984, vol. 13, 169.

Перелік стандартних методів, наприклад:

NBN Т 91-201: Визначення хімічної потреби в кисні.

ISBN О 11 7512494 Хімічна потреба в кисні (коефіцієнт для дихромату) для забруднених та стічних вод.

NFT90-101 Визначення хімічної потреби в кисні.

DS 217 = Аналіз води. Визначення хімічної потреби в кисні.

DIN 38409-H-41 Визначення хімічної потреби в кисні (ХПК) у межах вище 15 мг на літр.

NEN 3235 5.4: Bepaling van het chemish zuurstofverbruik.

ISO6060: Якість води: Визначення хімічної потреби у кисні дихроматичними методами.

С.7. ДЕГРАДАЦІЯ - АБІОТИЧНА ДЕГРАДАЦІЯ: ГІДРОЛІЗ ЯК ФУНКЦІОНУВАННЯ PH МЕТОДУ

1. МЕТОД

Цей метод дослідження еквівалентний методу ОЄСР ТІ 111 (2004).

1.1. ВСТУП

Хімічні речовини можуть потрапляти у поверхневі води такими шляхами, як пряме попадання, знесення при розпилюванні, потрапляння через водостоки, каналізацію, викид відходів, захоронення чи викиди промислових, побутових чи сільськогосподарських відходів, потрапляння їх у атмосферу, та згодом піддаватися певним перетворенням у цих водах шляхом хімічних (наприклад, гідроліз, окислення) та/чи мікробних процесів. Дана методична рекомендація описує лабораторний метод дослідження для оцінки абіотичних гідролізних трансформацій хімічних речовин у водних системах при коефіцієнтах рН, характерних для природного середовища (рН 4-9) і складена на основі існуючих методичних рекомендацій (1)(2)(3)(4)(5)(6)(7).

Експерименти проводять з метою визначення (i) швидкості гідролізу досліджуваної речовини як функції рН і (ii) ідентичності чи природи та швидкості утворення і зникнення продуктів гідролізу, під дію яких можуть потрапляти живі організми. Потреба в таких дослідженнях може виникати для хімічних речовин, які попадають прямо у воду або які імовірно потраплять до навколишнього середовища якимось зі шляхів, описаних вище.

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ ТА ОДИНИЦІ ВИМІРУ

Див. Додаток 2.

1.3. ЗАСТОСОВУВАНІСТЬ МЕТОДУ

Цей метод загалом приданий для дослідження хімічних речовин (мічених чи ні), для яких існують аналітичні методи дослідження достатньої точності та чутливості. Його також застосовують до слабко летких та нелетких сполук, що мають достатню розчинність у воді. Цей тест не слід застосовувати до хімічних речовин, що є надзвичайно леткими у воді (наприклад, фумиганти, органічні розчинники) і, тому відповідно, не можуть утримуватися у формі розчину за умов проведення такого дослідного експерименту. Також це дослідження може бути важко провести з речовинами, що мають мінімальну розчинність у воді (8).

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

Стерильні водні буферні розчини з різним коефіцієнтом рН (рН 4, 7 та 9) оброблюються досліджуваною речовиною та інкубуються у темряві у контрольованих лабораторних умовах (за постійної температури). Через певні проміжки часу, буферні розчини досліджують на наявність досліджуваної речовини та продуктів гідролізу. У випадку з міченими досліджуваними речовинами 14

(наприклад, С), баланс маси речовин буде набагато легше встановити.

Цей метод дослідження побудовано на принципі поетапного дослідження, як вказано та роз'яснено у Додатку 1. Кожен наступний етап запускають відповідно до результатів попереднього етапу.

1.5. ІНФОРМАЦІЯ ПРО ДОСЛІДЖУВАНУ РЕЧОВИНУ

Немічені чи мічені досліджувані речовини можуть використовуватися для вимірювання швидкості гідролізу. Мічені матеріали краще використовувати для вивчення шляху гідролізу та встановлення матеріального балансу речовин; проте, в окремих випадках, встановлення міток не є абсолютно необхідним. 14

Встановлення  міток    С є рекомендованим,  але використання таких
            13   15   3
ізотопів як   C,   N,  H також може бути доцільним. Мітку потрібно
розміщувати  у  найбільш  стабільній  частині (частинах) молекули,
настільки,  наскільки це  можливо.  Наприклад,  якщо  досліджувана
речовина має одне ядро, треба встановити мітку на цьому ядрі; якщо
в досліджуваній речовині міститься два або більше ядер,  тоді може
знадобитися  проведення окремих досліджень для оцінки долі кожного
з мічених ядер та отримання відповідної інформації  про  утворення
продуктів  гідролізу.  Чистота досліджуваної речовини має складати
принаймні 95 відсотків.

Перед виконанням дослідження на гідроліз, потрібно мати наступну інформацію про досліджувану речовину:

(а) розчинність у воді (Метод дослідження А.6);

(b) розчинність в органічних розчинниках;

(d) коефіцієнт розподілу октанол/вода (метод дослідження А.8);

(e) константа дисоціації (рК ) (рекомендація ОЄСР 112) (9); а

(f) швидкість прямої та непрямої фототрансформації у воді, якщо така інформація потрібна.

Також треба мати відповідні аналітичні методи визначення кількості досліджуваної речовини, і, якщо це має значення для дослідження, для ідентифікації та визначення кількості продуктів гідролізу у водних розчинах (див. Розділ 1.7.2).

1.6. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ

По можливості, потрібно використовувати еталонні речовини для ідентифікації та визначення кількості продуктів гідролізу спектроскопічним та хроматографічним способами або ж іншими методами, що мають достатню чутливість.

1.7. КРИТЕРІЇ ЯКОСТІ

1.7.1. Видалення

Аналіз, принаймні подвоєних буферних розчинів або їх екстрактів, зразу ж після додавання досліджуваної речовини показує перші ознаки відтворюваності аналітичного методу та однорідності процесу застосування для досліджуваної речовини. Видалення для пізніших стадій експериментів демонструється відповідними матеріальними балансами (коли використовується мічена речовина). Видалення має становити від 90 до 100 відсотків для мічених та немічених хімічних речовин (7). У випадку виникнення технічних труднощів у досягненні цього спектру значень, видалення 70 відсотків вважається прийнятним для немічених хімічних речовин, але цьому необхідно надати підтвердження.

1.7.2. Відтворюваність та чутливість аналітичного методу

Відтворюваність аналітичного методу/методів, використаних для визначення кількості досліджуваної речовини та продуктів гідролізу на пізніших етапах може бути перевірено дублікатним аналізом тих самих буферних розчинів (або їх екстрактів) після того, як утвориться об'єм продуктів гідролізу, достатній для визначення їх кількості.

Аналітичний метод має бути достатньо чутливим для визначення кількості концентрацій досліджуваної речовини до 10 відсотків або менше від початкової концентрації. Якщо цей момент є відповідним, то аналітичні методи також повинні бути достатньо чутливими для визначення кількості будь-якого продукту гідролізу, що представляє 10 відсотків або більше від застосованого матеріалу (у будь-який час протягом дослідження) і до 25 відсотків чи менше від його найвищої концентрації.

1.7.3. Довірчі інтервали для кінетичних даних гідролізу

Довірчі інтервали слід вирахувати і представити їх значення для всіх коефіцієнтів регресії, констант швидкості, періодів напіврозпаду та будь-яких інших кінетичних параметрів (наприклад, ДТ ). 50

1.8. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

1.8.1. Обладнання та апаратура

За необхідності дослідження слід проводити у скляних контейнерах (наприклад, тестових пробірках, колбах тощо) у темряві та у стерильних умовах, коли попередньо відомі дані (такі як коефіцієнт розподілу октанол/вода) не вказують на те, що досліджувана речовина може прилипати до скла. У таких випадках, можна розглянути можливість використання альтернативних матеріалів, таких як тефлон. Також можна частково усунути цю проблему прилипання до скла шляхом використання одного чи кількох із наступних методів:

- визначити масу досліджуваної речовини та продуктів гідролізу, сорбованих до посуду, що використовується для дослідження;

- використати ультразвукову ванну;

- забезпечити промивання скляного посуду розчинником при кожному інтервалі забору проб;

- використовувати розроблені за хімічною формулою продукти;

- використовувати підвищену кількість допоміжного розчинника для додавання досліджуваної речовини до системи; потрібно використовувати лише такий допоміжний розчинник, який не гідролізує досліджуваної речовини.

Зазвичай також потрібно використовувати терморегульовані струшувальні апарати з водяною банею або термостатні інкубатори для створення різноманітних умов для проведення досліджень.

Стандартне лабораторне обладнання є також необхідним, зокрема, таке:

- вимірювач рН;

- аналітичні інструменти, такі як газовий хроматограф, апарат високоефективної рідинної хроматографії, тонкошаровий хроматограф та інше обладнання, що включає відповідну детекторну систему для аналізу радіоактивно мічених та немічених речовин чи методу зворотного ізотопного розбавлення;

- інструменти для проведення ідентифікації (наприклад, масової спектрометрії, газової хроматографії та масової спектрометрії, високоефективної рідинної хроматографії, ядерного магнітного резонансу тощо);

- рідинний сцинтиляційний лічильник;

- сортувальні воронки для рідинної екстракції;

- інструменти для концентрації розчинів та екстрактів (наприклад, обертовий випарник);

- прилад контролю температури (наприклад, водяна баня);

До переліку хімічних реагентів можуть, зокрема, входити наступні речовини:

- органічні розчинники, хімічно чисті речовини, такі як гексан, дихлорметан тощо;

- сцинтиляційна речовина;

- буферні розчини (див. Розділ 1.8.3).

Весь скляний посуд, очищена реагентами вода і буферні розчини, використані для досліджень гідролізу, мають бути простерилізовані.

1.8.2. Дії з досліджуваною речовиною

Досліджувану речовину слід застосовувати у вигляді водного розчину у різних буферних розчинах (див. Додаток 3). Якщо це необхідно для належного розчинення, дозволено використовувати невелику кількість розчинників, що змішуються з водою (таких як ацетонітрил, ацетон, етанол) для застосування та розповсюдження досліджуваної речовини, але, зазвичай, вона не повинна перевищувати 1 відсотка в об'ємному співвідношенні. У випадку, коли йдеться про вищу концентрацію розчинників (наприклад, при дослідженні погано розчинних речовин), перевищення допустиме, лише якщо можна довести відсутність впливу розчинника на гідроліз досліджуваної речовини.

Не рекомендовано використовувати розроблений за хімічною формулою продукт постійно, оскільки не можна виключати можливості впливу хімічного складу інгредієнтів на процес гідролізу. Проте, використання розробленого за хімічною формулою матеріалу може бути розумною альтернативою у тих випадках, коли досліджують погано розчинні у воді речовини або речовини, що прилипають до скляних поверхонь (див. Розділ 1.8.1).

Слід використовувати однакову концентрацію досліджуваної речовини. Вона не повинна перевищувати 0,01 М або ж половини концентрації насичення (Див. Додаток 1).

1.8.3. Буферні розчини

Дослідження гідролізу слід виконувати при коефіцієнтах рН 4, 7 та 9. Для цієї мети потрібно приготувати буферні розчини, використовуючи очищені реагентами хімічні речовини та воду. Деякі корисні буферні системи вказано у Додатку 3. Слід зазначити, що використовувані буферні системи можуть вплинути на швидкість гідролізу, та у випадку фіксації такого впливу, слід застосовувати іншу буферну систему(1).

----------------

(1) Мейбі та Мілл радять використовувати боратні чи ацетатні буферні системи замість фосфатних.

рН кожного буферного розчину потрібно перевірити відкаліброваним рН-метром до точності, принаймні рівної 0,1 при потрібній температурі.

1.8.4. Умови проведення тесту

1.8.4.1. Температура проведення тесту

Тест на гідроліз слід проводити при постійній температурі. З метою екстраполяції, важливо дотримуватися визначеної температури у межах +/- 0,5 градусів за Цельсієм.

Попереднє тестування (Етап 1) слід проводити при температурі 50 градусів за Цельсієм, якщо гідролітична поведінка досліджуваної речовини невідома. Кінетичні тести вищого етапу потрібно виконувати принаймні при трьох температурах (включаючи тест при температурі 50 градусів), якщо тільки досліджувана речовина не є стабільною до гідролізу за результатами першого етапу тестування. Пропонований спектр температур складає від 10 до 70 градусів за Цельсієм (рекомендовано провести хоча б один тест при температурі нижче 25 градусів), і він включає звітну температуру у 25 градусів та більшість температур, що зазвичай зустрічаються у навколишньому середовищі.

1.8.4.2. Світло та кисень

Всі тести на гідроліз слід проводити, використовуючи будь-який підходящий метод для уникнення фотолітичного ефекту. Необхідно вжити всіх відповідних заходів для виключення присутності кисню (наприклад, барботувати гелієм, нітрогеном чи аргоном протягом п'яти хвилин перед приготуванням розчину).

1.8.4.3. Тривалість тесту

Попереднє тестування слід виконувати протягом 5 днів, в той час як тести вищих етапів необхідно проводити, доки не буде досягнуто 90 відсотків гідролізу, або доки не закінчиться термін у 30 днів, в залежності від того, що станеться раніше.

1.8.5. Виконання тесту

1.8.5.1. Попереднє тестування (Етап 1)

Попереднє тестування виконують при температурі 50 +/- 0,5 градусів за Цельсієм та коефіцієнті рН 4,0, 7,0 та 9,0. Якщо протягом 5 днів спостерігається менш ніж 10 відсотків гідролізу (t * 1 рік), досліджувана речовина вважається 0,5 25 C

стабільною до гідролізу,  і зазвичай не потрібно більше  проводити
жодних   додаткових   досліджень.   Якщо  відомо,  що  речовина  є
нестабільною  до  гідролізу  при  температурах,  характерних   для
навколишнього   середовища(1),  немає  необхідності  у  проведенні
попереднього тесту і.  Аналітичний метод має бути достатньо точним
та чутливим,  щоб виявити  зменшення  початкової  концентрації  на
10 відсотків.

----------------

(1) Така інформація може надходити з інших джерел, таких як дані про гідроліз структурно схожих сполук з літератури чи інших попередніх, напівкількісних тестів гідролізу з досліджуваною речовиною на більш ранній стадії її розвитку.

1.8.5.2. Гідроліз нестабільних речовин (Етап 2)

Вищий (наступний) етап дослідження потрібно виконувати при коефіцієнтах рН, за яких досліджувана речовина виявилася нестабільною за результатами попереднього тестування, згаданого вище. Буферовані розчини досліджуваної речовини потрібно термостатувати при обраних температурах. Для проведення тесту поведінки першого порядку, реакція кожного розчину має бути проаналізована у часових проміжках, які надають мінімум шість розміщених з певним інтервалом точок даних зазвичай між 10 та 90 відсотками гідролізу досліджуваної речовини. Окремі вибірки повторного тестування (мінімум повторних вибірок, що утримуються в окремих реакційних резервуарах) повинні бути видалені, а їх склад проаналізовано при кожному з шести вибіркових періодах часу (для мінімуму у дванадцять повторних точок даних). Використання єдиної сукупної проби, з якої при кожному взятті вибірки видаляються окремі аліквоти досліджуваного розчину, вважається невідповідним, оскільки це не дозволяє здійснити аналіз варіативності даних, і це може призвести до проблем, пов'язаних із забрудненням досліджуваного розчину. Тест на підтвердження стерильності необхідно провести по закінченню вищого етапу тесту (тобто через 30 днів або по досягненні показника гідролізу у 90 відсотків). Проте якщо не спостерігалося ознак розкладу (тобто перетворення), тест стерильності не є необхідними.

1.8.5.3. Ідентифікація продуктів гідролізу (Етап 3)

Будь-які основні продукти гідролізу (принаймні ті, що відображають більше 10 відсотків застосованої дози), потрібно виявити відповідними аналітичними методами.

1.8.5.4. Довільні тести

Довільні тести при коефіцієнтах рН, відмінних від 4, 7 та 9 можуть знадобитися для гідролітично нестабільної досліджуваної речовини. Наприклад, з фізіологічних міркувань може знадобитися тестування в умовах підвищеної кислотності (наприклад, рН 1,2) та з використання єдиної фізіологічно важливої температури (37 градусів за Цельсієм).

2. ДАНІ

Об'єми досліджуваних речовин та продуктів гідролізу, якщо ця інформація є значимою, потрібно виражати у відсотках від застосованої початкової концентрації і, за потреби, у міліграмах на літр для кожного інтервалу між вибірками, та для кожного коефіцієнту рН і температури, використаних у тесті. Крім того, слід виражати баланс маси у відсотках від задіяної початкової концентрації, якщо використано мічену досліджувану речовину.

Графічне відображення даних (після логарифмічного перетворення) про концентрації досліджуваної речовини та її зміни з часом необхідно додати до звіту. Будь-які основні продукти гідролізу, принаймні ті, що складають >= 10 відсотків від застосованої дози, повинні бути ідентифіковані, а їх логарифмічно перетворені концентрації потрібно також відобразити графічно так само, як це зроблено стосовно вихідної речовини, щоб показати їх швидкість утворення та зменшення.

2.1. ОБРОБКА РЕЗУЛЬТАТІВ

Більш точне визначення періодів напіврозпаду або ДТ слід 50

отримувати через застосування відповідних  розрахунків  кінетичних
моделей.  Період  напіврозпаду  та/чи  ДТ    (включно  з довірчими
                                         50
межами) потрібно включати до звіту  для  кожного  значення  рН  та
температури разом з описом кінетичної моделі,  яку використано, та
                         2
коефіцієнту визначення (r ).  При необхідності, продукти гідролізу
також обраховуються.

У випадку тестування швидкості, які проводяться за різних температур, константу псевдо-швидкості гідролізу першого порядку (k ) слід описувати як функцію температури. Обчислювання має obs

ґрунтуватися   як  на  поділі  k     на  константи  швидкості  для
                                obs
каталізованого кислотою,  нейтрального та базового  каталізованого
гідролізу   (відповідно,   k ,   k           ,  k  )  та  рівнянні
                            H     нейтральний    OH
Арреніуса:

-B /T
       k    = k (H+) + k            + k  (OH-) = S A e  i
        obs    H        нейтральний    OH           i

i = H. нейтральний, OH

S - знак суми,

де А та В є константами регресії від точки перетину та i i

похилої,  відповідно, найкращих ліній відповідності, утворених від
лінійно  регресуючої ln k  у співвідношенні зі зворотною величиною
                         i
абсолютної  температури  за  Кельвіном  (Т).  Шляхом  застосування
відношень   Ареніуса  для  кислотного,  нейтрального  та  базового
каталізованого   гідролізу,   псевдо   константи   першого   рівня
швидкості, і таким чином періоди напіврозпаду, можна обчислити для
інших  значень  температур,  для   яких   пряме   експериментальне
визначення констант швидкості є неможливим (10).

2.2. ОЦІНКА ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

Більшість реакцій гідролізу відбуваються зі швидкістю реакції першого порядку, і тому періоди напіврозпаду не залежать від концентрації (див. рівняння 4 у Додатку 2). Це зазвичай дозволяє -2 застосовувати результати, отримані у лабораторії у проміжку 10

-3                                               -6
до 10   М, до умов  навколишнього  середовища   (<= 10   М)  (10).
Кілька прикладів узгодження між швидкостями гідролізу,  виміряними
у чистій та природній воді для чималої кількості хімічних речовин,
повідомляють Мейбі та Мілл (11),  за умови що  рН  та  температура
були попередньо виміряні.

3. ЗВІТНІСТЬ/СКЛАДАННЯ ЗВІТІВ

3.1. ЗВІТ ПРО ДОСЛІДЖЕННЯ

Звіт про дослідження має містити як мінімум наступну інформацію:

Досліджувана речовина:

- звичайна назва, хімічна назва, номер методу очищення стічних вод у аеротенці, структурна формула (що вказує розміщення мітки при застосуванні радіоактивних міток) та відповідні фізико-хімічні властивості (див. Розділ 1.5);

- чистота (наявність домішок) досліджуваної речовини;

- чистота мітки міченої хімічної речовини та молярна активність (за необхідності);

- буферні розчини;

- дата та подробиці приготування;

- буфери та вода, що використовуються;

- полярність та рН буферних розчинів;

Умови проведення тесту:

- дата виконання тестування;

- кількість досліджуваної речовини, що застосовувалася;

- метод та розчинники (тип та кількість), застосовані для використання досліджуваної речовини;

- об'єм інкубованих буферизованих розчинів досліджуваної речовини;

- опис використаної системи інкубації;

- рН та температура протягом періоду тестування;

- час отримання проби;

- метод(и) екстракції;

- методи визначення кількості та ідентифікації досліджуваної речовини та продуктів гідролізу у буферних розчинах;

- число повторних проб.

Результати:

- відтворюваність та чутливість використаних аналітичних методів;

- відновлення (відсоткове значення коефіцієнтів для дійсного дослідження подано у розділі 1.7.1);

- дані про повторні проби та засоби у формі таблиці;

- матеріальний баланс під час та наприкінці дослідження (коли застосовується мічена досліджувана речовина);

- результати попереднього тестування;

- обговорення та інтерпретація результатів;

- всі вихідні дані та числа.

Наступна інформація потрібна лише для визначення швидкості гідролізу:

- графіки концентрацій та їх змін з часом для досліджуваних речовин і, де потрібно, для продуктів гідролізу при кожному значенні рН та температурі;

- таблиці результатів рівняння Арреніуса для температури -1 20/25 градусів за Цельсієм, значення рН, константи швидкості (h -1

або день  ), період напіврозпаду або ДТ  , температури (у градусах
                                       50
за  Цельсієм),  включно  з  довірчими  межами   та   коефіцієнтами
                 2
співвідношення (r ) або аналогічна інформація;

- пропонований хід гідролізу.

4. ПОСИЛАННЯ

(1) OECD, (1981) Hydrolysis as a Function of pH. OECD Guideline for Testing of Chemicals No 111, adopted 12 May 1981.

(2) US-Environmental Protection Agency, (1982) 40 CFR 796.3500, Hydrolysis as a Function of pH at 25 град.C. Pesticide Assessment Guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environmental Fate.

(3) Agriculture Canada, (1987) Environmental Chemistry and Fate Guidelines for registration of pesticides in Canada.

(4) European Union (EU), (1995) Commission Directive 95/36/EC amending Council Directive 91/414/EEC concerning the placing of plant protection products on the market. Annex V: Fate and Behaviour in the Environment.

(5) Dutch Commission for Registration of Pesticides, (1991) Application for registration of a pesticide. Section G: Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air.

(6) BBA, (1980) Merkblatt No 55, Teil I und II: Prufung des Verhaltens von Pflanzenbehandlungsmitteln im Wasser (October 1980).

(7) SETAC, (1995) Procedures for Assessing the Environmental Fate and Ecotoxicity of Pesticides. Mark R.Lynch, Ed.

(8) OECD, (2000) Guidance document on aquatic toxicity testing of difficult substances and mixtures, OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No 23.

(9) OECD, (1993) Guidelines for the Testing of Chemicals. Paris. OECD (1994-2000): Addenda 6-11 to Guidelines for the Testing of Chemicals.

(10) Nelson, H, Laskowski D, Thermes S, and Hendley P., (1997) Recommended changes in pesticide fate study guidelines for improving input to computer models. (Text version of oral presentation at the 14th Annual Meeting of the Society of Environmental Toxicology and Chemistry, Dallas TX, November 1993).

(11) Mabey, W. and Mill, T., (1978) Critical review of hydrolysis of organic compounds in water under environmental conditions. J. Phys. Chem. Ref. Data 7, p. 383-415.

Додаток 1

Схема поетапного дослідження гідролізу ( 994_b14 )

Додаток 2

Визначення та одиниці вимірювання

У всіх випадках необхідно використовувати одиниці СІ (Міжнародної системи одиниць).

Досліджувана речовина: будь-яка речовина, або материнська сполука, або продукт відповідної трансформації.

Продукти трансформації: всі речовини, утворені внаслідок біотичних чи абіотичних реакцій трансформації (перетворення) у досліджуваній речовині.

Продукти гідролізу: всі речовини утворені внаслідок реакцій гідролітичної трансформації досліджуваної речовини.

Поняття гідролізу відноситься до певної реакції досліджуваної речовини RX з водою, з групи X із OH у центрі реакції:

RX + HOH ---> ROH + HX                   (1)

Швидкість, з якою зменшується концентрація RX у цьому спрощеному процесі, отримують наступним:

швидкість = k (H O) (RX) реакція другого порядку 2

або

швидкість = k (RX)                    реакція першого порядку

залежно від швидкості, що визначає інтервал. Через те, що у порівнянні з досліджуваною речовиною тут присутня надмірна кількість води, цей тип реакції зазвичай описують як псевдо-реакцію першого порядку, у якій зафіксовану константу швидкості отримують з відношення:

k    = (H O)                                              (2)
      obs     2

і може бути визначено з виразу(*)

k    = 1 ln C                                             (3)
      obs         o
      t C
         t

де:

t = час

а C , C = концентрації RX на моменти часу 0 і t. o t

-1 Одиниці вимірювання у цій константі мають вимір (час) та період напіврозпаду реакції (час, за який 50 відсотків RX реагують), отримані звідси:

t    = ln                                                 (4)
      0,5
      k
       obs

----------------

(*) Якщо графік даних з журналу тестування не показує лінійної функції (прирівняної до швидкості реакції першого порядку), тоді використання рівняння (3) не буде прийнятним для визначення константи швидкості гідролізу досліджуваної сполуки.

Період напіврозпаду: (t ) є часом, що вимагається для 0,5

50-відсоткового гідролізу  досліджуваної  речовини,  коли  реакція
може  бути описана кінетикою першого порядку;  цей час не залежить
від концентрації.

ДТ (Період зникнення 50): це час, за який концентрація 50

досліджуваної речовини зменшується на  50  відсотків;  цей  період
відрізняється   від   періоду   напіврозпаду,   коли   реакція  не
відбувається з кінетикою першого порядку.

Визначення k при різних температурах

Коли константи швидкості відомі для двох температур, константи швидкості для інших температур можна вирахувати, використовуючи рівняння Арреніуса:

E
              - ------
                R x T                 - E
     k = A x e           або  ln k = ------- + ln A
                                      R x T

Графік ln k по відношенню до 1/T дає пряму лінію з падінням -E/R.

де:

k = константа швидкості, виміряна за різних температур

E = енергія активації (kJ/моль)

T = абсолютна температура (T)

R = константа газу (8,314 J/моль K)

Енергію активації розраховано регресійним аналізом або наступним рівнянням:

ln k  - ln k
                 2       1
     E = R x --------------
                1     1
              (--- - ---)
                T     T
                 1     2

Де: T  > T
          2    1

Додаток 3

Буферні системи

А. КЛАРК І ЛАБС:

Буферні суміші Кларка і Лабса(*)

----------------

(*) Коефіцієнти pH, вказані у даних таблицях, було вирахувано з потенційних вимірювань з використання стандартних рівнянь Соренса (1909). Відповідні значення pH є на 0,04 одиниці вищими ніж значення у таблиці.

------------------------------------------------------------------
|                   Склад                    |        рН         |
|----------------------------------------------------------------|
|               0,2 N Cl i 0,2 N KCl при 20 град.С               |
|----------------------------------------------------------------|
|47,5 мл HCl + 25 мл KCl розведений до 100 мл|        1,0        |
|--------------------------------------------+-------------------|
|32,25 мл HCl + 25 мл KCl розведений до      |        1,2        |
|100 мл                                      |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|20,75 мл HCl + 25 мл KCl розведений до      |        1,4        |
|100 мл                                      |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|13,15 мл HCl + 25 мл KCl розведений до      |        1,6        |
|100 мл                                      |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|8,3 мл HCl + 25 мл KCl розведений до 100 мл |        1,8        |
|--------------------------------------------+-------------------|
|5,3 мл HCl + 25 мл KCl розведений до 100 мл |        2,0        |
|--------------------------------------------+-------------------|
|3,35 мл HCl + 25 мл KCl розведений до 100 мл|        2,2        |
|----------------------------------------------------------------|
|       0,1 M біфталату калію + 0,1 N HCl при 20 град.C          |
|----------------------------------------------------------------|
|46,70 мл 0,1 NHCl + 50 мл біфталату,        |        2,2        |
|розведеного до 100 мл                       |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|39,60 мл 0,1 NHCl + 50 мл біфталату,        |        2,4        |
|розведеного до 100 мл                       |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|32,95 мл 0,1 NHCl + 50 мл біфталату,        |        2,6        |
|розведеного до 100 мл                       |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|26,42 мл 0,1 NHCl + 50 мл біфталату,        |        2,8        |
|розведеного до 100 мл                       |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|20,32 мл 0,1 NHCl + 50 мл біфталату,        |        3,0        |
|розведеного до 100 мл                       |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|14,70 мл 0,1 NHCl + 50 мл біфталату,        |        3,2        |
|розведеного до 100 мл                       |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|9,90 мл 0,1 NHCl + 50 мл біфталату,         |        3,4        |
|розведеного до 100 мл                       |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|5,97 мл 0,1 NHCl + 50 мл біфталату,         |        3,6        |
|розведеного до 100 мл                       |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|2,63 мл 0,1 NHCl + 50 мл біфталату,         |        3,8        |
|розведеного до 100 мл                       |                   |
|----------------------------------------------------------------|
|       0,1 M біфталату калію + 0,1 NNaOH при 20 град.C          |
|----------------------------------------------------------------|
|0,40 мл 0,1 NNaOH + 50 мл біфталату,        |        4,0        |
|розведеного до 100 мл                       |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|3,70 мл 0,1 NNaOH + 50 мл біфталату,        |        4,2        |
|розведеного до 100 мл                       |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|7,50 мл 0,1 NNaOH + 50 мл біфталату,        |        4,4        |
|розведеного до 100 мл                       |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|12,15 мл 0,1 NNaOH + 50 мл біфталату,       |        4,6        |
|розведеного до 100 мл                       |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|17,70 мл 0,1 NNaOH + 50 мл біфталату,       |        4,8        |
|розведеного до 100 мл                       |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|23,85 мл 0,1 NNaOH + 50 мл біфталату,       |        5,0        |
|розведеного до 100 мл                       |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|29,95 мл 0,1 NNaOH + 50 мл біфталату,       |        5,2        |
|розведеного до 100 мл                       |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|35,45 мл 0,1 NNaOH + 50 мл біфталату,       |        5,4        |
|розведеного до 100 мл                       |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|39,85 мл 0,1 NNaOH + 50 мл біфталату,       |        5,6        |
|розведеного до 100 мл                       |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|43,00 мл 0,1 NNaOH + 50 мл біфталату,       |        5,8        |
|розведеного до 100 мл                       |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|45,45 мл 0,1 NNaOH + 50 мл біфталату,       |        6,0        |
|розведеного до 100 мл                       |                   |
------------------------------------------------------------------

Буферні суміші Кларка і Лабса (продовження)

------------------------------------------------------------------
|           0,1 M монокалійортофосфату + NNaOH при 20 C          |
|----------------------------------------------------------------|
|5,70 мл 0,1 NNaOH + 50 мл фосфату,          |        6,0        |
|розведеного до 100 мл                       |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|8,60 мл 0,1 NNaOH + 50 мл фосфату,          |        6,2        |
|розведеного до 100 мл                       |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|12,60 мл 0,1 NNaOH + 50 мл фосфату,         |        6,4        |
|розведеного до 100 мл                       |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|17,80 мл 0,1 NNaOH + 50 мл фосфату,         |        6,6        |
|розведеного до 100 мл                       |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|23,45 мл 0,1 NNaOH + 50 мл фосфату,         |        6,8        |
|розведеного до 100 мл                       |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|29,63 мл 0,1 NNaOH + 50 мл фосфату,         |        7,0        |
|розведеного до 100 мл                       |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|35,00 мл 0,1 NNaOH + 50 мл фосфату,         |        7,2        |
|розведеного до 100 мл                       |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|39,50 мл 0,1 NNaOH + 50 мл фосфату,         |        7,4        |
|розведеного до 100 мл                       |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|42,80 мл 0,1 NNaOH + 50 мл фосфату,         |        7,6        |
|розведеного до 100 мл                       |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|45,20 мл 0,1 NNaOH + 50 мл фосфату,         |        7,8        |
|розведеного до 100 мл                       |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|46,80 мл 0,1 NNaOH + 50 мл фосфату,         |        8,0        |
|розведеного до 100 мл                       |                   |
|----------------------------------------------------------------|
|       0,1 M H BO  y 0,1 M KCl + 0,1 NNaOH при 20 град.C        |
|              3  3                                              |
|----------------------------------------------------------------|
|2,61 мл 0,1 NNaOH + 50 мл борної кислоти,   |        7,8        |
|розведеної до 100 мл                        |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|3,97 мл 0,1 NNaOH + 50 мл борної кислоти,   |        8,0        |
|розведеної до 100 мл                        |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|5,90 мл 0,1 NNaOH + 50 мл борної кислоти,   |        8,2        |
|розведеної до 100 мл                        |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|8,50 мл 0,1 NNaOH + 50 мл борної кислоти,   |        8,4        |
|розведеної до 100 мл                        |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|12,00 мл 0,1 NNaOH + 50 мл борної кислоти,  |        8,6        |
|розведеної до 100 мл                        |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|16,30 мл 0,1 NNaOH + 50 мл борної кислоти,  |        8,8        |
|розведеної до 100 мл                        |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|21,30 мл 0,1 NNaOH + 50 мл борної кислоти,  |        9,0        |
|розведеної до 100 мл                        |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|26,70 мл 0,1 NNaOH + 50 мл борної кислоти,  |        9,2        |
|розведеної до 100 мл                        |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|32,00 мл 0,1 NNaOH + 50 мл борної кислоти,  |        9,4        |
|розведеної до 100 мл                        |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|36,85 мл 0,1 NNaOH + 50 мл борної кислоти,  |        9,6        |
|розведеної до 100 мл                        |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|40,80 мл 0,1 NNaOH + 50 мл борної кислоти,  |        9,8        |
|розведеної до 100 мл                        |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|43,90 мл 0,1 NNaOH + 50 мл борної кислоти,  |       10,0        |
|розведеної до 100 мл                        |                   |
------------------------------------------------------------------

Б. КОЛТХОФ І ВЛЕШХУВЕР

ЦИТРАТНІ БУФЕРНІ РОЗЧИНИ КОЛТХОФА І ВЛЕШХУВЕРА

------------------------------------------------------------------
|                   Склад                    |        рН         |
|----------------------------------------------------------------|
|       0,1 M цитрату монокалію i 0,1 NHCl при 18 град.C(*)      |
|----------------------------------------------------------------|
|49,7 мл 0,1 NHCl + 50 мл цитрату            |        2,2        |
|розведеного до 100 мл                       |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|43,4 мл 0,1 NHCl + 50 мл цитрату            |        2,4        |
|розведеного до 100 мл                       |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|36,8 мл 0,1 NHCl + 50 мл цитрату            |        2,6        |
|розведеного до 100 мл                       |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|30,2 мл 0,1 NHCl + 50 мл цитрату            |        2,8        |
|розведеного до 100 мл                       |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|23,6 мл 0,1 NHCl + 50 мл цитрату            |        3,0        |
|розведеного до 100 мл                       |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|17,2 мл 0,1 NHCl + 50 мл цитрату            |        3,2        |
|розведеного до 100 мл                       |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|10,7 мл 0,1 NHCl + 50 мл цитрату            |        3,4        |
|розведеного до 100 мл                       |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|4,2 мл 0,1 NHCl + 50 мл цитрату розведеного |        3,6        |
|до 100 мл                                   |                   |
|----------------------------------------------------------------|
|     0,1 M цитрату монокалію i 0,1 NNaOH при 18 град.C(*)       |
|----------------------------------------------------------------|
|2,0 мл 0,1 NNaOH + 50 мл цитрату            |        3,8        |
|розведеного до 100 мл                       |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|9,0 мл 0,1 NNaOH + 50 мл цитрату            |        4,0        |
|розведеного до 100 мл                       |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|16,3 мл 0,1 NNaOH + 50 мл цитрату           |        4,2        |
|розведеного до 100 мл                       |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|23,7 мл 0,1 NNaOH + 50 мл цитрату           |        4,4        |
|розведеного до 100 мл                       |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|31,5 мл 0,1 NNaOH + 50 мл цитрату           |        4,6        |
|розведеного до 100 мл                       |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|39,2 мл 0,1 NNaOH + 50 мл цитрату           |        4,8        |
|розведеного до 100 мл                       |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|46,7 мл 0,1 NNaOH + 50 мл цитрату           |        5,0        |
|розведеного до 100 мл                       |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|54,2 мл 0,1 NNaOH + 50 мл цитрату           |        5,2        |
|розведеного до 100 мл                       |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|61,0 мл 0,1 NNaOH + 50 мл цитрату           |        5,4        |
|розведеного до 100 мл                       |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|68,0 мл 0,1 NNaOH + 50 мл цитрату           |        5,6        |
|розведеного до 100 мл                       |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|74,4 мл 0,1 NNaOH + 50 мл цитрату           |        5,8        |
|розведеного до 100 мл                       |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|81,2 мл 0,1 NNaOH + 50 мл цитрату           |        6,0        |
|розведеного до 100 мл                       |                   |
------------------------------------------------------------------

----------------

(*) Додайте невеличкий кристал тимолу чи аналогічної речовини, щоб запобігти росту плісняви.

С. СОРЕНСЕН

Боратні суміші СОРЕНСЕНА

------------------------------------------------------------------
|       Склад         | Соренсен |        Вальбум, рН при        |
|---------------------| 18 град.С|-------------------------------|
| Бура, мл |HCl/NaOH, |          |          |          |         |
|          |   мл     |          |          |          |         |
|----------------------------------------------------------------|
|                     0,05 M бури + 0,1 NHCl                     |
|----------------------------------------------------------------|
|5,25      |4,75      |7,62      |7,64      |7,55      |7,47     |
|5,50      |4,50      |7,94      |7,98      |7,86      |7,76     |
|5,75      |4,25      |8,14      |8,17      |8,06      |7,95     |
|6,00      |4,00      |8,29      |8,32      |8,19      |8,08     |
|6,50      |3,50      |8,51      |8,54      |8,40      |8,28     |
|7,00      |3,00      |8,08      |8,72      |8,56      |8,40     |
|7,50      |2,50      |8,80      |8,84      |8,67      |8,50     |
|8,00      |2,00      |8,91      |8,96      |8,77      |8,59     |
|8,50      |1,50      |9,01      |9,06      |8,86      |8,67     |
|9,00      |1,00      |9,09      |9,14      |8,94      |8,74     |
|9,50      |0,50      |9,17      |9,22      |9,01      |8,80     |
|10,00     |0,00      |9,24      |9,30      |9,08      |8,86     |
|----------------------------------------------------------------|
|                    0,05 M бури + 0,1 NNaOH                     |
|----------------------------------------------------------------|
|10,0      |0,0       |9,24      |9,30      |9,08      |8,86     |
|9,0       |1,0       |9,36      |9,42      |9,18      |8,94     |
|8,0       |2,0       |9,50      |9,57      |9,30      |9,02     |
|7,0       |3,0       |9,68      |9,76      |9,44      |9,12     |
|6,0       |4,0       |9,97      |10,06     |9,67      |9,28     |
------------------------------------------------------------------

Фосфатні суміші СОРЕНСЕНА

------------------------------------------------------------------
|                   Склад                    |        рН         |
|----------------------------------------------------------------|
|   0,0667 M монокалійортофосфату + 0,0667 М динатрійфосфату     |
|                       при 20 град.C                            |
|----------------------------------------------------------------|
|99,2 мл KH PO  + 0,8 мл Na HPO              |        5,0        |
|          2  4            2   4             |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|98,4 мл KH PO  + 1,6 мл Na HPO              |        5,2        |
|          2  4            2   4             |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|97,3 мл KH PO  + 2,7 мл Na HPO              |        5,4        |
|          2  4            2   4             |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|95,5 мл KH PO  + 4,5 мл Na HPO              |        5,6        |
|          2  4            2   4             |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|92,8 мл KH PO  + 7,2 мл Na HPO              |        5,8        |
|          2  4            2   4             |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|88,9 мл KH PO  + 11,1 мл Na HPO             |        6,0        |
|          2  4             2   4            |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|83,0 мл KH PO  + 17,0 мл Na HPO             |        6,2        |
|          2  4             2   4            |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|75,4 мл KH PO  + 24,6 мл Na HPO             |        6,4        |
|          2  4             2   4            |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|65,3 мл KH PO  + 34,7 мл Na HPO             |        6,6        |
|          2  4             2   4            |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|53,4 мл KH PO  + 46,6 мл Na HPO             |        6,8        |
|          2  4             2   4            |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|41,3 мл KH PO  + 58,7 мл Na HPO             |        7,0        |
|          2  4             2   4            |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|29,6 мл KH PO  + 70,4 мл Na HPO             |        7,2        |
|          2  4             2   4            |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|19,7 мл KH PO  + 80,3 мл Na HPO             |        7,4        |
|          2  4             2   4            |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|12,8 мл KH PO  + 87,2 мл Na HPO             |        7,6        |
|          2  4             2   4            |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|7,4 мл KH PO  + 92,6 мл Na HPO              |        7,8        |
|         2  4             2   4             |                   |
|--------------------------------------------+-------------------|
|3,7 мл KH PO  + 96,3 мл Na HPO              |        8,0        |
|         2  4             2   4             |                   |
------------------------------------------------------------------

С.8. ТОКСИЧНІСТЬ ДЛЯ ДОЩОВИХ ЧЕРВ'ЯКІВ

ТЕСТУВАННЯ ШТУЧНОГО ГРУНТУ

1. МЕТОД

1.1. ВСТУП

У цьому лабораторному тесті, досліджувану речовину додають до штучного ґрунту, у який на 14 днів поміщають черв'яків. По закінченню цього періоду (за бажанням через 7 днів) вивчають вбивчий вплив речовини на дощових черв'яків. Тест надає можливість у відносно короткі терміни провести перевірку впливу хімічних речовин, що потрапляють до організму черв'яків через шкіру та з їжею.

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ ТА ОДИНИЦІ ВИМІРЮВАННЯ

ЛК : концентрація речовини, що вбиває 50 відсотків 50

піддослідних тварин під час періоду тестування.

1.3. ЕТАЛОННА РЕЧОВИНА

Еталонну речовину періодично використовують для демонстрації того, що чутливість тестової системи не зазнала суттєвих змін.

Хімічно чистий хлорацетамід рекомендовано до використання в якості еталонної речовини.

1.4. ПРИНЦИП ДОСЛІДЖЕННЯ

Якість різних ґрунтів може відрізнятися, тож для цього дослідження використано ретельно визначений штучний суглинковий ґрунт. Дорослі дощові черв'яки виду Eisenia foetida (див. примітку у Додатку) утримуються у визначеному штучному ґрунті, який обробляють різними концентраціями досліджуваної речовини. Вміст контейнерів розсипають на лотках на 14 днів (за бажанням на 7 днів) після початку тестування, а потім виконують підрахунок черв'яків, що виживають при застосуванні кожної з концентрацій.

1.5. КРИТЕРІЇ ЯКОСТІ

Цей тест сплановано таким чином, щоб він було максимально відтворюваним у тому, що стосується субстрату та організмів, використаних у ньому. Смертність у контрольних групах не повинна перевищувати 10 відсотків, інакше тест вважатиметься недійсним.

1.6. ОПИС МЕТОДУ ТЕСТУВАННЯ

1.6.1. Матеріали

1.6.1.1. Субстрат для проведення тесту

Визначений штучний ґрунт використовують у якості основного субстрату для тестування.

(а) основний субстрат (відсоткове співвідношення, подане для сухої ваги)

- 10 відсотків сфагнумового торфу (із коефіцієнтом рН найбільш наближеним до 5,5-6,0, без видимих решток рослин та сильно подрібнений),

- 20 відсотків каолінітової глини, що містить більш ніж 50 відсотків каолініту,

- близько 69 відсотків промислового кварцового піску (що здебільшого складається з дрібного піску розміром від 0,05 до 0,2 мм). Якщо речовина недостатньо розсіюється у воді, 10 грамів піску на один контейнер слід тримати напоготові для пізнішого змішування з досліджуваною речовиною.

- близько 1 відсотка пилоподібного карбонату кальцію (CaCO ), 3 хімічно чистого, який додають для доведення значення рН до 6,0 +/- 0,5.

(b) Субстрат для проведення тесту

Цей субстрат складається з основного субстрату, досліджуваної речовини та деіонізованої води.

Вміст води становить від 25 до 42 відсотків від сухої ваги основного субстрату. Вміст води у субстраті визначається висушуванням проби до постійної ваги при 105 градусах за Цельсієм. Основним критерієм є те, що штучний ґрунт має бути зволоженим до такого стану, щоб у ньому не було стоячої води. Змішувати потрібно ретельно, щоб досягнути рівномірного розподілу досліджуваної речовини та субстрату. Спосіб, яким досліджувану речовину додавали до субстрату, потрібно вказатиу звіті.

Контрольний субстрат складається з основного субстрату та води. Якщо використовуються які-небудь домішки, додаткова контрольна група має містити ту ж саму кількість домішок.

1.6.1.2. Контейнери

Використовуються скляні контейнери місткістю близько 1 літра (що добре закриваються пластиковими кришками, тарілками, чи пластиковою плівкою з вентиляційними отворами), наповнені об'ємом вологого чи контрольного субстрату, який є еквівалентним 500 грамам сухої ваги субстрату.

1.6.2. Умови тестування

Контейнери утримують у камерах штучного клімату при температурі 20 +/- 2 градуси за Цельсієм з постійним освітленням. Інтенсивність світла має складати від 400 до 800 люкс.

Період тестування становить 14 днів, але смертність можна за бажанням оцінювати вже через 7 днів після початку дослідження.

1.6.3. Процедура проведення тесту

Концентрації

Концентрації досліджуваної речовини визначають як відношення ваги речовини до сухої ваги основного субстрату (мг/кг).

Тест діапазонів

Спектр концентрацій, які спричиняють смертність від 0 до 100 відсотків можна визначити тестом діапазонів, що надасть інформацію про спектр концентрацій для використання у визначальному тесті.

Речовину необхідно протестувати у наступних концентраціях: 1000, 100, 10, 1, та 0,1 мг речовини на кілограм субстрату, використаного для проведення тесту (суха вага).

Якщо потрібно провести повний визначальний тест, то достатньою кількістю для проведення тесту діапазонів буде одна дослідна група на кожну концентрацію речовини та одна контрольна група, не оброблена речовиною, по 10 черв'яків кожна.

Проведення остаточного тесту

Результати проведення тесту діапазонів використовують для вибору принаймні п'яти концентрацій у геометричній прогресії, що покривають собою спектр від 0 до 100 відсотків смертності та відрізняються постійним коефіцієнтом, що не перевищує 1,8.

Тестування з використанням геометричних прогресій концентрації мають дозволити здійснення якомога точнішого визначення ЛК та її довірчих меж. 50

Під час проведення остаточного тестування використовують принаймні 4 дослідних групи на кожну концентрацію та 4 не оброблених речовиною контрольних групи, по 10 черв'яків у кожній групі. Результати цих додаткових партій подаються як середнє значення та стандартне відхилення.

Коли дві послідовні концентрації при коефіцієнті 1,8 дають лише 0 та 100 відсотків смертності, ці два значення відповідатимуть межам діапазону, що визначає величину ЛК . 50

Суміш основного дослідного субстрату та досліджуваної речовини

За можливості, дослідний субстрат не повинен мати у своєму складі жодних домішок, окрім води. Зразу ж після початку тестування, емульсію чи дисперсію досліджуваної речовини у деіонізованій воді чи іншому розчиннику змішують із основним дослідним субстратом, або ж рівним шаром розпилюють на нього у формі дрібного хроматографічного чи іншого спрею.

Якщо досліджувана речовина не розчиняється у воді, тоді її можна розчинити у якомога меншій кількості відповідного органічного розчинника (наприклад, гексану, ацетону чи хлороформу).

Лише домішки, які легко переходять у леткий стан, можна використовувати для розчинення, розсіювання чи емульгації досліджуваної речовини. Піддослідний субстрат слід провентилювати перед використанням. Кількість випаруваної води необхідно замінити. Контрольна група має містити ту ж кількість будь-якої домішки.

Якщо досліджувана речовина не піддається розчиненню, дисперсії чи емульгації органічними розчинниками, 10 грамів суміші дрібного кварцового піску та кількість досліджуваної речовини, що є необхідною для обробки 500 грамів сухої ваги штучного ґрунту, змішують з 490 грамами сухої ваги дослідного субстрату.

Для кожної дослідної групи, певна кількість вологого дослідного субстрату, еквівалентну 500 грамам сухої ваги, кладуть до кожного скляного контейнера, і поміщають на поверхню дослідного субстрату 10 дощових черв'яків, яких перед цим тримали протягом 24 годин в аналогічному вологому основному субстраті, а потім обмили водою, з наступним збором надлишку води фільтрованим папером перед поміщенням їх на дослідний субстрат.

Контейнери покривають перфорованими пластиковими кришками, тарілками чи плівкою, щоб запобігти висиханню субстрату, і витримують за визначених умов дослідження протягом 14 днів.

Оцінку необхідно проводити через 14 днів (по бажанню через 7 днів) після початку тестування. Субстрат розміщують рівномірним шаром на лотку зі скла чи нержавіючої сталі. Потім оглядають дощових черв'яків і визначають кількість живих черв'яків. Черв'яки вважаються мертвими, якщо вони не реагують на легке механічне подразнення передньої частини тіла.

Коли огляд проводять через 7 днів, контейнер знову наповнюють субстратом і дощові черв'яки, що вижили, поміщаються на поверхню того самого дослідного субстрату.

1.6.4. Піддослідні організми

В якості піддослідних організмів використовують дорослих особин Eisenia foetida (див. Примітку у Додатку), принаймні двохмісячного віку з пояском, вологою вагою від 300 до 600 мг (див. Особливості розведення у Додатку).

2. ДАНІ

2.1. ОБРОБКА ТА ОЦІНКА РЕЗУЛЬТАТІВ

Концентрацію речовини, використаної у тесті, вказують у звіті відносно відповідних процентних співвідношень мертвих дощових черв'яків.

Коли дані є адекватними, значення ЛК та довірчі межі 50

(р = 0,05) слід визначати з використанням стандартних методів (див. Літчфілд та Вілкоксон, 1949, для інформації про еквівалентний метод.) ЛК потрібно вказувати у міліграмах 50

досліджуваної речовини  на  кілограм  дослідного  субстрату  (суха
вага).

У тих випадках, коли падіння кривої концентрації занадто круте для обрахунку ЛК , графічної оцінки значення ЛК буде 50

достатньо.

Коли дві послідовні концентрації з коефіцієнтом 1.8 дають лише 0 та 100 відсотків смертності, ці два значення вважають достатніми, для визначення діапазону значень, на які припадає ЛК . 50

3. ЗВІТНІСТЬ

3.1. ЗВІТ ПРО ТЕСТУВАННЯ

Звіт про тестування має, за можливості, містити наступну інформацію:

- підтвердження того, що дослідження проведено у відповідності з вищевказаними критеріями якості,

- виконане дослідження (дослідження діапазонів та остаточне тестування),

- точний опис умов проведення тесту чи підтвердження того, що тест було проведено у відповідності з методом; потрібно вказати на будь-які відхилення, якщо такі мали місце,

- точний опис того, як саме досліджувана речовина змішувалася із основним дослідним субстратом,

- інформація про піддослідні організми (вид, вік, середня, мінімальна та максимальна вага, умови утримання та розведення, постачальник),

- метод, використаний для визначення ЛК , 50

- результати дослідження, усіма включаючи всі дані, що використовувалися,

- опис зафіксованих симптомів чи змін у поведінці піддослідних організмів,

- смертність у контрольних групах,

- ЛК чи найвища концентрація для організмів, що не 50

викликала смертності,  та найнижча досліджувана  концентрація,  що
викликала смертність у 100 відсотків,  за 14  днів  (за  бажанням,
7 днів) після початку дослідження проведення тестування,

- Креслення/графік кривої концентрації/реакції,

- Результати, отримані при використанні еталонної речовини, чи у зв'язку з проведенням даного тесту чи у зв'язку із попередніми заходами контролю якості.

4. ПОСИЛАННЯ

1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 207, Decision of the Council C(81)30 final.

2) Edwards, C.A. and Lofty, J.R., 1977, Biology of Earthworms, Chapman and Hall, London, p. 331.

3) Bouche.M.B., 1972, Lombriciens de France, Ecologie et Systematique, Institut National de la Recherche Agronomique, p. 671.

4) Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F., A simplified method of evaluation dose effect experiments. I. Pharm. Exp. Therap., vol. 96, 1949, p. 99.

5) Commission of the European Communities, Development of a standardised laboratory method forassessing the toxicity of chemical substances to earthworms, Report EUR 8714 EN, 1983.

6) Umweltbundesamt/Biologische Bundesanstalt fur land- und Forstwirtschaft, Berlin, 1984 p., Verfahrens-vorschlag 'Toxizitatstest am Regenwurm Eisenia foetida in kunstlichem Boden', in: Rudolph/Boje, Okotoxikologie, ecomed, Landsberg, 1986.

Додаток

Розведення та утримання черв'яків перед дослідженням

Для розведення тварин, від 30 до 50 дорослих черв'яків поміщають у розплідник зі свіжим субстратом на 14 днів. Ці тварини потім можуть бути використані для розмноження подальших партій. Дощові черв'яки, що виводяться з коконів, використовують для дослідів, коли вони досягають дорослого віку (при описаних умовах через два або три місяці).

Умови утримання та розведення.

Камера штучного клімату: температура 20 +/- градусів за Цельсієм, бажано з постійним освітленням (інтенсивністю від 400 до 800 люкс).

Розплідники: підходящі неглибокі контейнери об'ємом від 10 до 20 літрів.

Субстрат: Eisenia foetida можна розводити у екскрементах різноманітних тварин. Рекомендовано використовувати у якості середовища для розведення суміш з 50 відсотків об'єму торфу та 50 відсотків коров'ячого чи кінського гною. Середовище повинно мати коефіцієнт рН від 6 до 7 (його регулюють карбонатом кальцію) та невисоку іонну провідність (менш ніж 6 мкСм чи 0,5 відсотка концентрації солі).

Субстрат повинен бути вологим, але не занадто зволоженим.

Також можна використовувати інші успішні процедури, окрім вищевказаних.

Примітка: Eisenia foetida існує у двох різновидах, які деякі таксономісти підрозділяють у два види (Буше, 1972). Морфологічно вони схожі, але один з них, Eisenia foetida foetida, зазвичай має поперечні полоси чи лінії на сегментах тіла, а інший, Eisenia foetida andrei, таких ліній не має і також відрізняється різноманітними відтінками червонястого кольору тіла. По можливості, слід завжди намагатися використовувати вид Eisenia foetida Andrei. Можна також використовувати інші види, за наявності необхідної розробленої методології досліджень.

С.9. БІОЛОГІЧНА ДЕСТРУКЦІЯ

ТЕСТ ЗАН-ВЕЛЛЕНСА

1. МЕТОД

1.1. ВСТУП

Метою цього методу є оцінка потенційної повної біологічної деструкції водорозчинних, нелетких органічних речовин під дією відносно високих концентрацій мікроорганізмів у статичному тесті.

Може відбуватися фізико-хімічне всмоктування твердих речовин у суспензії, і це необхідно враховувати при інтерпретації результатів (3.2).

Досліджувані речовини використовуються у концентраціях, що співвідносяться зі значеннями коефіцієнту РОВ у діапазоні від 50 до 400 мг/літр або зі значеннями коефіцієнту ХПК у діапазоні від 100 до 1000 мг/літр (РОВ = розчинений органічний вуглець; ХПК = хімічна потреба у кисні). Ці відносно високі концентрації мають певну перевагу в аналітичній надійності. Сполуки, що мають токсичні властивості, можуть затримувати чи уповільнювати процес деструкції.

У даному методі, вимірювання концентрації РОВ чи ХПК використовують для оцінки повної біологічної деструкції досліджуваної речовини.

Одночасне використання конкретного аналітичного методу може дозволити оцінку першочергової біологічної деструкції речовини (зникнення первинної хімічної структури речовини).

Метод може застосовуватися лише для тих органічних досліджуваних речовин, які, у концентрації, використаній у тестуванні:

- розчиняються у воді в умовах проведення тесту,

- мають настільки мале значення тиску пари, яким можна знехтувати в умовах проведення тесту,

- не стримують розвиток бактерій,

- всмоктуються досліджуваною системою лише до певної межі,

- не втрачаються з досліджуваної речовини через піноутворення.

Інформація про відповідні пропорції основних компонентів досліджуваного матеріалу може бути корисною для інтерпретації отриманих результатів, особливо у тих випадках, коли результати є низькими чи мінімальними.

Також бажано мати інформацію про токсичність даної речовини для мікроорганізмів для вірної інтерпретації низьких результатів та відбору відповідних концентрацій, використаних у дослідженні.

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ ТА ОДИНИЦІ ВИМІРЮВАННЯ

Об'єм досягнутої деструкції по закінченню тестування відображається як "біологічна деструкція у тесті Зан-Велленса":

(C - C ) T B D (%) = (1 - ----------) x 100

T (C - C ) A BA

Де:

D = біологічна деструкція (%) за період часу Т,

C = значення РОВ (або ХПК) досліджуваної суміші, виміряне за

три голини після  початку  тестування  (мг/л)  (РОВ  =  розчинений
органічний вуглець, ХПК = хімічна потреба в кисні),

C = значення РОВ чи ХПК досліджуваної суміші на момент

взяття проби (мг/л),

C = значення РОВ чи ХПК холостої проби на момент взяття

проби (мг/л),

C = значення РОВ чи ХПК холостої проби, виміряне за три

години після початку тестування (мг/л).

Ступінь деструкції округляють до найближчого з цілих відсоткових значень.

Відсоткове значення деструкції виражають як відсотковий зміст РОВ (або ХПК), який видалено з досліджуваної речовини.

Різниця між значеннями, виміряними через три години, та вирахуваними, чи бажано виміряними початковими значеннями може надати корисну інформацію щодо видалення речовини (див. пункт 3.2, Інтерпретація результатів).

1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ

У деяких випадках, коли проводиться дослідження нової речовини, використання еталонних речовин є доцільним. Проте, поки що неможливо рекомендувати використання якихось конкретно визначених еталонних речовин.

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ТЕСТУВАННЯ

Активований мул, мінеральні поживні речовини та досліджуваний матеріал, як єдине джерело вуглецю, у водному розчині разом поміщають до скляного контейнера об'ємом від одного до чотирьох літрів, обладнаного мішалкою та аератором. Суміш перемішують та збагачують киснем при температурі від 20 до 25 градусів за Цельсієм при розсіяному освітленні або у темному приміщенні протягом періоду часу до 28 діб. Процес деструкції відслідковують шляхом визначення значень РОВ (або ХПК) профільтрованого розчину, щоденно чи за придатних регулярних часових проміжків. Співвідношення значення видаленого РОВ (або ХПК) після кожного проміжку до значення, зафіксованого за три години після початку тесту, виражають як відсотковий вміст біологічної деструкції, який слугує для вимірювання ступеню біологічної деструкції на даний момент часу. Результат відображають графічно залежно від часу, що минув, і таким чином, отримують криву біологічної деградації.

Коли застосовується конкретний аналітичний метод, зміни у концентрації первинної молекули, пов'язані з біологічною деструкцією, також можна виміряти (здатність до первинної біологічної деструкції).

1.5. КРИТЕРІЇ ЯКОСТІ

Відтворюваність даного тесту повністю задовольняється у кільцевому дослідженні.

Чутливість методу визначається здебільшого мінливістю холостої проби і, меншою мірою, точністю визначення розчиненого органічного вуглецю та рівнем досліджуваної сполуки у водному розчині.

1.6. ОПИС ПРОЦЕДУРИ ТЕСТУВАННЯ

1.6.1. Приготування

1.6.1.1. Реагенти

Вода для тесту: питна вода із вмістом органічного вуглецю менше ніж 5 мг/літр. Сумарна концентрація іонів кальцію та магнію не повинна перевищувати 2,7 ммоль/літр; інакше слід розбавляти воду відповідною кількістю деіонізованої чи дистильованої води.

Сірчана кислота, аналітичний реагент (A.P.)            50 г/л

Розчин їдкого натру (A.P.)                             40 г/л

Розчин мінеральної поживної речовини: розчинити

в одному літрі деіонізованої води:

Хлористий амоній, NH Cl, (A.P.) 38,5 г 4

дигідрогенфрсфатнатрію NaH PO .2H O, (A.P.) 33,4 г 2 4 2

дигідрогенфосфат калію KH PO , (A.P.) 8,5 г 2 4

дикаліймоногідрофосфат K HPO (A.P.) 21,75 г 2 4

Суміш слугує одночасно поживною речовиною та буферною системою.

1.6.1.2. Апаратура

- Скляні контейнери об'ємом від одного до чотирьох літрів (наприклад, циліндричні контейнери).

- Мішалка зі скляним чи металічним змішувачем зі штангою відповідної довжини (він повинен обертатися на відстані від 5 до 10 см від дна контейнера). Замість нього можна використовувати магнітний змішувач зі штоком довжиною від 7 до 10 см.

- Скляна трубка із внутрішнім діаметром від 2 до 4 мм для подачі повітря. Отвір трубки повинен знаходитися на висоті приблизно 1 см від дна контейнера.

- Центрифуга (біля 3 550 g).

- Вимірювач рН.

- Прилад вимірювання вмісту розчиненого кисню.

- Паперові фільтри.

- Апарат мембранної фільтрації.

- Мембранні фільтри з розміром вічка 0.45 мкм. Такі фільтри вважаються придатними для проведення тесту, якщо вони гарантовано не вивільняють вуглець і не всмоктують речовину на стадії фільтрації.

- Обладнання для визначення вмісту органічного вуглецю та хімічної потреби в кисні.

1.6.1.3. Підготовка інокуляту

Активний мул зі станції біологічної очистки омивають (повторним) центрифугуванням чи відстоюванням у дослідній воді (див. вище).

Активний мул має бути у стані, придатному для проведення тесту. Такий тип мулу можна отримати з належно працюючої станції очистки каналізаційних вод. Щоб отримати якомога більше видів чи штамів бактерій, можна змішати інокулят, отриманий з різних джерел (наприклад, різних очисних станцій, екстрактів ґрунту, річкової води тощо). Отриману суміш обробляють як вказано вище.

Для перевірки діяльності активного мулу див. розділ "Контроль функціональності" нижче.

1.6.1.4. Підготовка досліджуваних розчинів

До дослідного контейнера поміщають 500 мл дослідної води, 2,5 мл/літр розчин мінеральної поживної речовини та активний мул у об'ємі співвідношення від 0,2 до 1,0 г/літр сухої речовини у кінцевій суміші. Потім додають достатню кількість запасного розчину речовини, що досліджується, так щоб досягнути концентрації РОВ у кінцевій суміші на рівні від 50 до 400 мг/літр. Відповідні значення ХПК становлять від 100 до 1000 мг/літр. З'єднують розчин з водою, доводячи сумарний об'єм до величини від одного до чотирьох літрів. Сумарний об'єм, якого потрібно досягти, залежить від кількості проб, які потрібно взяти для визначення РОВ чи ХПК, та об'ємів, необхідних для здійснення аналітичних процедур.

Зазвичай об'єм у два літри вважається задовільним. Принаймні один контрольний контейнер (холоста проба) досліджується паралельно з кожною серією тестів; він містить лише активний мул та розчин мінеральної поживної речовини, поєднаний з дослідною водою так, щоб досягти того ж сумарного об'єму, що і в дослідних контейнерах.

1.6.2. Проведення тесту

Вміст дослідних контейнерів перемішують магнітними змішувачами чи гребними гвинтами за умов розсіяного освітлення чи у темному приміщенні при температурі від 20 до 25 градусів за Цельсієм. Збагачення киснем виконують за допомогою стислого повітря, очищеного ватним фільтром та, за необхідності, за допомогою промивної склянки. Потрібно потурбуватися про те, щоб активний мул не осідав, а концентрація кисню не падала нижче 2 мг/літр.

Коефіцієнт рН слід перевіряти через регулярні проміжки часу (наприклад, щодня) та за необхідності коригувати його значення, щоб вони залишалися у діапазоні від 7 до 8.

Втрати від випаровування компенсують безпосередньо перед кожним забором проби шляхом додавання потрібного об'єму деіонізованої чи дистильованої води. Не зайвим буде відмітити рівень рідини на стінці контейнера перед початком проведення тесту. Нові відмітки роблять після кожного забору проби (без збагачення киснем та перемішування). Перші проби завжди беруть за три години після початку проведення тесту, щоб виявити всмоктування досліджуваного матеріалу активним мулом.

Після руйнування досліджуваного матеріалу проводять визначення РОВ чи ХПК, щоденно чи з іншим регулярним інтервалом часу. Проби, взяті з дослідного контейнера та контрольного контейнера, фільтрують через ретельно промитий паперовий фільтр. Перші 5 мл фільтрату досліджуваного розчину відкидають. Частини осаду мулу, що погано піддаються фільтрації, можна попередньо видалити шляхом центрифугування протягом 10 хвилин. Визначення РОВ чи ХПК проводять щонайменше у два заходи. Період дослідження може тривати до 28 днів.

Примітка: проби, що залишилися мутними, профільтровують за допомогою мембранних фільтрів. Ці фільтри не повинні виділяти чи всмоктувати будь-який органічний матеріал.

Контроль функціональності активного мулу

Контейнер, що містить відому речовину, потрібно досліджувати паралельно з кожною серією дослідження, щоб перевірити функціональну здатність активного мулу. Діетиленгліколь вважається придатною речовиною для такої перевірки.

Адаптація

Якщо аналізи проводяться через відносно невеликі проміжки часу (наприклад щоденно), адаптацію можна легко помітити з кривої деструкції (див. Малюнок 2). Тому дослідження не варто розпочинати наприкінці робочого тижня.

Якщо адаптація відбувається наприкінці періоду дослідження, його можна продовжити доти, доки не закінчиться деструкція.

Примітка: якщо потрібно дізнатися більше про поведінку адаптованого мулу, той же активний мул ще раз піддають дії того ж досліджуваного матеріалу згідно з наступною процедурою:

Вимкнути змішувач та аератор і дозволити мулу осісти. Відцідити надосадову рідину, довести об'єм мулу до двох літрів, розбавивши його водою для досліду, перемішувати 15 хвилин і знову дати осісти. Після повторного зціджування надосадової рідини, використати залишок мулу для повторення дослідження з тим же матеріалом згідно пунктів 1.6.1.4 та 1.6.2, наведених вище. Активний мул можна також відділити шляхом центрифугування (замість відстоювання).

Адаптований мул можна змішати зі свіжим мулом до концентрації від 0,2 до 1 г сухої ваги на літр рідини.

Аналітичні засоби

Зазвичай проби фільтрують через ретельно промиті паперові фільтри (промивання слід здійснювати деіонізованою водою).

Проби, що залишилися мутними, фільтрують через мембранні фільтри (0,45 мкм).

Концентрацію РОВ визначають двічі з фільтрату проб (причому перші 5 мл відкидають і не використовують) за допомогою інструментарію ТПК. Якщо фільтрат не можна проаналізувати того ж дня, його потрібно зберігати в холодильнику до наступного дня; не рекомендовано зберігати його протягом довшого періоду часу.

Концентрація ХПК визначається з фільтрату проби за допомогою установки для аналізу ХПК за процедурою, описаною у посиланні (2) нижче.

2. ДАНІ ТА ЇХ ОЦІНКА

Концентрації РОВ та/чи ХПК визначають принаймні двічі зі взятих проб, як вказано вище у пункті 1.6.2. Деструкцію за період часу Т вираховують за формулою (наведеною з визначеннями) пункту 1.2 вище.

Ступінь деградації округлюють до найближчого цілого значення у відсотках. Об'єм деструкції, отриманий наприкінці дослідження, вказують у звіті як "біологічну деструкцію в тесті Зан-Велленса."

Примітка: якщо повної деструкції було досягнуто до закінчення часу дослідження, і цей результат підтверджено повторним аналізом наступного дня, таке дослідження можна вважати завершеним.

3. ЗВІТНІСТЬ

3.1. ЗВІТ ПРО ДОСЛІДЖЕННЯ

Звіт про дослідження повинен, по можливості, містити інформацію про:

- початкову концентрацію речовини,

- всю іншу інформацію та експериментальні результати, що стосуються досліджуваної речовини, еталонної речовини (якщо така застосовувалася) та холостої проби,

- концентрація за три години після початку дослідження,

- біологічна деструкція; крива з описом,

- час та місце взяття проби піддослідних організмів, стан адаптації, концентрація, використана у дослідженні тощо,

- наукове обґрунтування будь-яких змін під час проведення дослідження.

3.2. ІНТЕРПРЕТАЦІЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

Видалення РОВ (ХПК), що поступово відбувається протягом днів чи тижнів, вказує на те, що досліджувана речовина піддається процесу біологічної деструкції.

Проте у деяких випадках фізико-хімічна адсорбція може відігравати певну роль, і на це вказують, коли з самого початку виявлено повне чи часткове видалення, протягом перших трьох годин, а різниця між контрольною та досліджуваною надосадовими рідинами знаходиться на надзвичайно низькому рівні.

Необхідно провести подальші дослідження, якщо потрібно розмежувати біологічну деструкцію (чи часткову біологічну деструкцію) та адсорбцію.

Це можна зробити кількома шляхами, але найбільш переконливим є використання надосадової рідини чи мулу в якості інокуляту для базового дослідження (бажано спірометричного дослідження).

Досліджувані речовини, що дають високий відсоток неадсорбційного видалення РОВ (ХПК) у даному дослідженні, слід вважати потенційно придатними для біологічної деструкції. Часткове, неадсорбційне видалення вказує на те, що ця хімічна речовина принаймні має певну придатність до біологічної деструкції. Низьке або взагалі нульове видалення РОВ (ХПК) може бути пов'язаним з пригніченням діяльності мікроорганізмів даною речовиною, і це також можна виявити шляхом лізису та втрати мулу, який продукує мутну надосадову рідину. Дослідження необхідно повторити з використанням нижчої концентрації досліджуваної речовини.

Використання типоспецифічного аналітичного методу чи 14 С-міченої досліджуваної речовини може допомогти в досягненні 14

вищої  чутливості  дослідження.  У  випадку  з    С  досліджуваною
                    14
сполукою, видалення   СО  підтвердить факт біологічної деструкції.
                        2

Коли результати виражають шляхом ступеню первинної біологічної деструкції, необхідно, по можливості, надати пояснення змін хімічної структури, що призводять до втрати реакції початкової досліджуваної речовини.

Підтвердження дійсності аналітичного методу потрібно надавати разом з реакцією, отриманою у досліджуваному середовищі холостої проби.

4. ПОСИЛАННЯ

(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 302 B, Decision of the Council C(81) 30 final.

(2) Annex V C.9 Degradation: Chemical Oxygen Demand, Commission Directive 84/449/EEC, (OJ L251,19.9.1984, p. 1).

Додаток

ПРИКЛАД ОЦІНКИ

Органічна сполука:                4-етоксилобензоїдна кислота

Теоретична досліджувана

концентрація:                     600 мг\л

Теоретичний  РОВ:                 390 мг\л

Інокулят:                         станція очистки
                                       каналізаційних вод

Концентрація:                     1 г сухої речовини/літр

Стан адаптації:                   не адаптований

Аналіз:                           визначення РОВ

Об'єм проби:                      3 мл

Контрольна речовина:              діетиленгліколь

Токсичність сполуки:              токсичний вплив відсутній
                                       для концентрації нижче
                                       1000 мг/л

Використане дослідження:          дослідження бродильних
                                       пробірок

----------------------------------------------------------------------
|    Час    |      Контрольна речовина       | Досліджувана речовина |
|дослідження|--------------------------------+-----------------------|
|           |Холоста|РОВ  |РОВ    |Деструкція|ХПК  |ХПК   |Деструкція|
|           |проба  |(1)  |чистий,|%         |(1)  |чистий|%         |
|           |РОВ(1) |мг\л |мг\л   |          |мг\л |мг\л  |          |
|           |мг\л   |     |       |          |     |      |          |
|-----------+-------+-----+-------+----------+-----+------+----------|
|0          |-      |-    |300,0  |-         |-    |390,0 |-         |
|3 годин    |4,0    |298,0|294,0  |2         |371,6|367,6 |6         |
|1 день     |6,1    |288,3|282,2  |6         |373,3|367,2 |6         |
|2 дні      |5,0    |281,2|276,2  |8         |360,0|355,0 |9         |
|5 днів     |6,3    |270,5|264,2  |12        |193,8|187,5 |52        |
|6 днів     |7,4    |253,3|245,9  |18        |143,9|136,5 |65        |
|7 днів     |11,3   |212,5|201,2  |33        |104,5|93,2  |76        |
|8 днів     |7,8    |142,5|134,7  |55        |58,9 |51,1  |87        |
|9 днів     |7,0    |35,0 |28,0   |91        |18,1 |11,1  |97        |
|10 днів    |18,0   |37,0 |19,0   |94        |20,0 |2,0   |99        |
|--------------------------------------------------------------------|
|(1) середні показники тричі проведеного дослідження                 |
----------------------------------------------------------------------

Малюнок 1

Приклад кривої біологічної деструкції ( 994_b14 )

Малюнок 2

Приклад адаптації мулу ( 994_b14 )

С.10. БІОЛОГІЧНА ДЕСТРУКЦІЯ

ДОСЛІДЖЕННЯ МОДЕЛЮВАННЯ АКТИВНОГО МУЛУ

1. МЕТОД

1.1. ВСТУП

1.1.1. Загальні положення

Цей метод може застосовуватися лише до тих органічних речовин, які в концентрації, використаній у дослідженні:

- є водорозчинними до ступеня, необхідного для приготування дослідного розчину,

- мають настільки малий тиск пари, що ним можна знехтувати за умов дослідження,

- не пригнічують діяльність бактерій.

Інформація про відносні пропорції основних компонентів досліджуваного матеріалу буде корисною для інтерпретації отриманих результатів, особливо в тих випадках, коли результати низькі або мають мінімальний рівень.

Бажано мати інформацію про токсичність речовини для мікроорганізмів для інтерпретації низьких результатів та при підборі відповідної концентрації для дослідження.

1.1.2. Визначення здатності до повної біологічної деструкції (аналіз РОВ/ХПК)

Метою методу є визначення здатності до повної біологічної деструкції шляхом вимірювання видалення речовини та будь-яких метаболітів у моделі активного мулу при концентрації, яка співвідноситься з величиною більше 12 мг РОВ/літр (або приблизно 40 мг ХПК/літр); 20 мг РОВ/літр можна вважати оптимальним значенням. (РОВ = розчинений органічний вуглець, ХПК = хімічна потреба в кисні)

Потрібно встановити вміст органічного вуглецю (або хімічну потребу в кисні) досліджуваного матеріалу.

1.1.3. Визначення первинної здатності до біологічної деструкції (спеціальний аналіз)

Метою даного методу є визначення первинної здатності до біологічної деструкції для речовини в моделі активного мулу, при концентрації приблизно 20 мг/літр, з використанням спеціального аналітичного методу (якщо аналітичний метод та міркування токсичності дозволяють, то можна використовувати більші або менші концентрації). Це дозволить провести оцінку первинної здатності до біологічної деструкції (руйнування початкової хімічної структури речовини) для даної речовини.

Метою методу не можна вважати визначення мінералізації досліджуваної речовини.

Для визначення досліджуваної речовини потрібно мати відповідний аналітичний метод.

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ ТА ОДИНИЦІ ВИМІРЮВАННЯ

Аналіз РОВ/ХПК

Ступінь видалення речовини вираховують наступним чином:

T - (E - E )
                                    0
                     TD = ------------ x 100                (1(a))
                               T

де:

С = ступінь видалення у відсотках РОВ (або ХПК) у межах

середнього періоду відстоювання з урахуванням матеріалу

Т = концентрація досліджуваного матеріалу в притоці виражена у міліграмах РОВ/літр (або міліграмах ХПК/літр)

Е = концентрація РОВ (або ХПК) у очищених стічних водах дослідної установки, виражена в міліграмах РОВ/літр (або міліграмах ХПК/літр)

Е = концентрація РОв (або ХПК) у очищених стічних водах

контрольної  установки,  виражена  в  міліграмах   РОВ/літр   (або
міліграмах ХПК/літр).

Деструкцію виражають як відсоток видалення РОВ (або ХПК) у межах даного часу відстоювання з урахуванням досліджуваного матеріалу.

1.2.2. Спеціальний аналіз

Відсоткове вираження видалення досліджуваної речовини з водної фази (R ) у межах даного середнього періоду відстоювання w

вираховують так:

C  - C
                                 1    o
                          R  = ---------                    (1(b))
                           w       C
                                    1

де:

С = концентрація речовини в інфлюенті досліджуваної

установки (міліграми речовини/літр, визначена конкретним аналізом)

С = концентрація речовини в очищених стічних водах

контрольної   установки   (міліграми   речовини/літр,    визначена
конкретним аналізом)

1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ

У деяких випадках, коли проводиться дослідження нової речовини, використання еталонних речовин є доцільним. Проте неможливо поки що рекомендувати використання якихось конкретно визначених еталонних речовин.

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДІВ ДОСЛІДЖЕННЯ

Для визначення повної здатності до біологічної деструкції, дві експериментальні установки активованого мулу (підтверджуюча перевірка ОЄСР на, або пориста чашка) використовують паралельно. Досліджувану речовину додають до інфлюенту (каналізаційні стоки синтетичного чи побутового походження) одної з установок, в той час як до іншої подають самі лише стічні води. Для визначення первинної здатності до біологічної деструкції з конкретним аналізом у інфлюенті та очищеній воді використовують лише одну установку.

Концентрації РОВ (або ХПК) вимірюють у очищених водах. Концентрації речовини також можна визначати спеціальним методом аналізу.

РОВ досліджуваного матеріалу на вимірюють, а просто констатують.

Після виконання вимірювань РОВ (або ХПК), різниця у середніх значеннях концентрацій між досліджуваною та контрольною очищеними водами вважається такою, що відноситься до досліджуваного матеріалу, який не піддавався деструкції.

Після виконання спеціальних аналізів можна провести вимірювання змін концентрації (біологічної деструкції) у первинній молекулі.

Установки можна використовувати за так званим методом спарених установок, шляхом процедури трансінокуляції.

1.5. КРИТЕРІЇ ЯКОСТІ

Початкова концентрація речовини залежить від типу виконуваного аналізу та його обмежень.

1.6. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

1.6.1. Підготовка

1.6.1.1. Апаратура

Потрібна пара установок однакового типу, за винятком випадків виконання спеціального аналізу. Можна використовувати два прийоми:

ОЄСР Перевірка на підтвердження

Обладнання (Додаток 1) складається з контейнера для зберігання синтетичних стічних вод (А), дозуючого насоса (B), контейнера для аерації (C), сепаратора (D), ерліфта (E) для рециркуляції активованого мулу, та контейнера (F) для збору обробленої очищеної води.

Контейнери (А) та (F) повинні бути зроблені зі скла чи відповідного типу пластику та мати ємність принаймні 24 літри. Насос (B) мусить забезпечувати постійне надходження синтетичних стічних вод до контейнера аерації. Для цього можна застосовувати будь-яку придатну систему, яка забезпечуватиме дотримання концентрації та подачу матеріалу. За нормальних умов роботи висота сепаратора (D) встановлюється таким чином, щоб об'єм змішаної рідини у аераційному контейнері складав три літри. Металокерамічний аераційний куб (G) розміщують у контейнері (C) на вершині конуса. Кількість повітря, що вдувається через аератор, можна відслідковувати за допомогою приладу вимірювання витрати повітря.

Ерліфт (E) встановлюють так, щоб активований мул із сепаратора постійно та регулярно знову подавався до контейнера аерації (C).

Пориста ємність

Пориста ємність складається з листів пористого поліетилену (2 мм завтовшки, максимальний розмір пор 95 мкм), з яких зроблено циліндри 14 см у діаметрі з конічної основою під кутом 45 градусів (див. Малюнки 1 та 2 у Додатку 2). Ємність поміщають у водонепроникний контейнер з відповідного типу пластику, діаметром 15 см з вихідним отвором на висоті 17,2 см на циліндричній його частині, який визначає об'єм (три літри) даної ємності чашки. Верхня окружність внутрішнього контейнера утримується жорстким кільцем з відповідного типу пластику, що дозволяє мати простір для очищеної води - приблизно 0, 5 см між внутрішнім та зовнішнім контейнерами.

Пористі ємності можуть встановлюватися у нижній частині водяних бань, керованих термостатом. На нижній частині внутрішнього контейнера розміщено дифузори, до яких подається повітря.

Контейнери (А) та (E) мають бути зі скла чи відповідного типу пластику і мати об'єм щонайменше 24 літри. Насос (B) мусить забезпечувати постійну подачу синтетичних стічних вод до контейнера аерації. Для цього можна застосовувати будь-яку підходящу систему, яка забезпечуватиме дотримання концентрації та подачу матеріалу.

Додаткові внутрішні пористі ємності необхідні для заміни тих ємностей, які можуть забиватися у процесі використання. Несправні ємності очищують шляхом занурення на 24 години у розчин гіпохлориту, а потім промивають у проточній водопровідній воді.

1.6.1.2. Фільтрація

Апарат мембранної фільтрації та мембранні фільтри з розміром вічка 0,45 мкм. Мембранні фільтри є придатними для використання, якщо вони не віддають вуглець і не адсорбують речовину на стадії фільтрації.

1.6.1.3. Стічні води

Можна застосовувати придатні для аналізу синтетичні або побутові стічні води.

Приклад синтетичних стічних вод.

Розчинити у кожному літрі водопровідної води:

пептону                                                160 мг
     м'ясного екстракту                                      10 мг
     сечовини                                                30 мг
     NaCl                                                     7 мг
     Ca Cl  2H O                                              4 мг
          2   2
     MgSO  7H O                                               2 мг
         4   2
     K HPO                                                   28 мг
      2   4

Побутові стічні води:

їх потрібно збирати знову кожного дня з верхнього водоскиду першої відстійної камери септика станції обробки, що проводить очищення переважно побутових стічних вод.

1.6.1.4. Запасний розчин досліджуваного матеріалу

Розчин досліджуваного матеріалу, наприклад 1%, потрібно приготувати для додавання до дослідної установки. Потрібно визначити концентрацію матеріалу так, щоб було відомо той об'єм, який потрібно буде додати до стічних вод чи прямо до установки через другий насос, забезпечуючи таким чином концентрацію, потрібну для дослідження.

1.6.1.5. Інокулят

Примітка: при використанні побутових стічних вод використання інокуляту з низькою концентрацією бактерій не буде доцільним, але можна використати активований мул.

Можна використовувати різні типи інокуляту.

Приведемо три приклади інокуляту, придатного для дослідження:

(а) інокулят зі стічних вод вторинної очистки

Цей інокулят потрібно отримати зі стічних вод вторинної очистки гарної якості, зібраного зі станції очистки, яка переважно обробляє побутові стічні води. Очищені стічні води потрібно утримувати в аеробних умовах на період часу між відбором проби та використанням. Для приготування інокуляту пробу профільтровують через фільтр грубої очистки, а перші 200 мл фільтрату відкидають. Фільтрат утримують в аеробних умовах до часу використання. Інокулят потрібно використати у той же день, коли його було зібрано. Принаймні 3 мл його використовують для посіву мікроорганізмів (інокуляції).

(b) композитний інокулят

Інокулят зі стічних вод вторинної очистки:

(див. опис вище)

Інокулят з ґрунту:

100 г садової землі (родючої, нестерильної) розводять до стану суспензії у 1000 мл нехлорованої питної води (ґрунти з надзвичайно високим вмістом глини, піску чи гумусу не є придатними для цього). Після перемішування суспензію залишають для відстоювання протягом 30 хвилин. Надосадову рідину фільтрують через паперовий фільтр грубої очистки, а перші 200 мл фільтрату відкидають. Наступний фільтрат зразу ж піддають збагаченню киснем і утримують у таких умовах до моменту його використання. Інокулят потрібно використати у день збору.

Інокулят з поверхневої води:

Наступний частковий інокулят створюють з мезосапробної поверхневої води. Пробу профільтровують через грубий папір, відкидаючи перші 200 мл. Фільтрат утримують в аеробному стані до моменту використання. Інокулят потрібно використати у день збору.

Рівні об'єми проб трьох часткових інокулятів з'єднують, добре розмішують, і з даної суміші отримують кінцевий інокулят. Для посіву мікроорганізмів використовують щонайменше 3 мл інокуляту.

Певний об'єм (не більше трьох літрів) активованого мулу (вміст твердих часток у суспензії до 2,5 г/літр) виймають з аеротенку станції, що очищає переважно побутові стічні води, та використовують у якості інокуляту.

1.6.2. Процедура

Дослідження виконують при кімнатній температурі у діапазоні від 18 до 25 градусів за Цельсієм.

Якщо необхідно, дослідження можна проводити при нижчій температурі (до 10 градусів); якщо речовина підлягає деструкції, то зазвичай інших дій виконувати не потрібно. Якщо ж деструкцію не проводитимуть, то дослідження потрібно здійснювати при постійній температурі між 18 та 25 градусами за Цельсієм.

1.6.2.1. Період дії: утворення мулу/стабілізація установок

Період росту/стабілізації мулу є періодом, протягом якого концентрація твердих часток у суспензії активованого мулу та робота установок наближаються до стабільного стану за створених умов роботи.

Період дії є періодом, який триває з моменту, коли досліджувана речовина вперше вводиться до установки і до часу, коли її видалення сягає горизонтального рівня значення (відносно постійного значення). Цей період не повинен перевищувати шести тижнів.

Оціночним періодом є проміжок у три тижні, тобто три тижні після моменту, коли видалення досліджуваної речовини досягає відносно постійного і зазвичай високого значення. Для речовин, що виявляють низьку деструкцію (чи її повну відсутність) протягом перших шести тижнів, за оціночний період приймають наступні три тижні.

Спочатку наповнюють установку (установки), використовувані для одного дослідження інокулятом, змішаним з інфлюентом.

Потім вмикають аератор (і ерліфт (E) у випадку використання установок для ОЄСР перевірки підтвердження) та дозуючий пристрій (B).

Інфлюент без досліджуваної речовини повинен пройти через контейнер аерації (В) або ж зі швидкістю один літр за годину, або ж зі швидкістю півлітра за годину: це забезпечує середній час відстоювання, що складає від трьох до шести годин.

Швидкість аерації потрібно вибирати таким чином, щоб вміст контейнера (С) весь час перебував у стані суспензії, в той час як вміст розчиненого кисню повинен становити принаймні 2 мг/літр.

Піноутворення потрібно уникати шляхом вжиття відповідних заходів, проте не слід застосовувати хімічні речовини, які уповільнюють дію активованого мулу.

Мул, що зібрався у верхній частині контейнеру аерації (С) (та, у випадку використання установок для перевірки підтвердження ОЄСР, у нижній частині контейнера для відстоювання (D), та у циркуляційному тракті, потрібно повертати до перемішаної суміші принаймні раз на день шляхом чистки щіточкою чи іншим доступним способом.

Коли мул не осідає, його густину можна підвищити додаванням порцій 5%-розчину хлориду заліза, по 2 мл кожна, повторюючи таке додавання при потребі.

Очищені стічні води збирають у контейнер (E) або (F) на період часу від 20 до 24 годин, а потім після ретельного перемішування беруть пробу. Контейнери (E) або (F) повинні бути добре очищеними та вимитими.

Для того, щоб відслідковувати та контролювати ефективність перебігу процесу, хімічну потребу у кисні (ХПК) чи розчинений органічний вуглець (РОВ) у фільтраті зібраних очищених стічних вод вимірюють принаймні двічі на тиждень, так само як і аналогічні величини для профільтрованого інфлюенту (потрібно використовувати мембрану з розміром вічка 0,45 мкм, а перші 20 мл (приблизна кількість) фільтрату відкинути).

Зменшення значень РОВ чи ХПК повинно вирівнятися на час досягнення приблизно регулярного темпу щоденної деструкції.

Вміст сухої речовини в активованому мулі у аеротенкі потрібно визначати двічі на тиждень (у грамах на літр). Установки можуть працювати у двох режимах: або ж вимірювати вміст сухої речовини в активованому мулі у аеротенці двічі на тиждень, і, якщо цей вміст перевищує 2,5 грами/літр, надлишок активованого мулу відкидають або ж 500 мл перемішаної суміші видаляють з кожної чашки щоденно, забезпечуючи середній період відстоювання мулу, що складає шість днів.

Коли виміряні та приблизно оцінені параметри (такі як ефективність процесу (видалення РОВ чи ХПК), концентрація мулу, його здатність до осідання, ступінь непрозорості очищених стічних вод тощо) двох установок є задовільно стабільними, досліджувану речовину можна додавати до інфлюенту одної з установок, слідуючи вказівкам пункту 1.6.2.2.

У якості альтернативи, досліджувану речовину додають на початку періоду утворення мулу (1.6.2.1.), особливо коли мул додають у якості інокуляту.

1.6.2.2. Процедура дослідження

Умови роботи під час пускового періоду підтримують на потрібному рівні, а до інфлюенту дослідної установки додають достатню кількість резервного розчину (приблизно 1%), для досягнення потрібної концентрації досліджуваного матеріалу в стічних водах (приблизно від 10 до 20 мг РОВ/літр або 40 мг ХПК/літр). Для цього резервний розчин підмішують до стічних вод щоденно, або ж використовують окрему нагнітальну систему. Цієї концентрації можна добиватися поступово. Якщо токсичний вплив досліджуваної речовини на активований мул відсутній, можна також проводити дослідження з використанням вищих концентрацій.

Установка для холостого дослідження заповнюється лише інфлюентом без додавання інших речовин. Відповідні об'єми очищених стічних вод беруть для аналізу та фільтрують через мембранні фільтри (0,45 мкм), відкидаючи перші 20 мл (приблизно) фільтрату.

Профільтровані проби потрібно проаналізувати того ж дня, інакше ж їх потрібно зберігати будь-яким придатним способом, наприклад, додавши 0,05 мл 1% розчину сулеми (HgCl ) на кожні 2

10 мл фільтрату. Їх також можна зберігати при температурі від 2 до
4 градусів за Цельсієм (до 24 годин), чи при температурі нижчій за
-18 градусів (на довший період часу).

Пусковий період з додаванням досліджуваної речовини не повинен перевищувати шести тижнів, а період оцінки не повинен бути коротшим за три тижні; таким чином повинна існувати можливість для проведення 14-20 аналізів для підрахунку кінцевого результату.

Режим спарених установок

Установки роблять спареними шляхом обміну 1,5 літра перемішаної суміші (з мулом включно) з контейнерів аерації активованого мулу між двома установками один раз на день. Якщо в дослідженні використано матеріали з сильною абсорбцією, 1,5 літри над осадової рідини відбирають з контейнерів відстоювання та доливають до контейнера з активованим мулом іншої установки.

1.6.2.3. Аналіз

Можна проводити два види аналізу для того, щоб відслідковувати поведінку речовини:

РОВ та ХПК

Аналіз концентрації РОВ робиться двічі з допомогою аналізатора вуглецю і/чи значень ХПК згідно посилання (2).

Спеціальний аналіз

Концентрації досліджуваної речовини визначають придатним для цього аналітичним методом. При можливості, потрібно також провести спеціальний аналіз речовини, що адсорбувалася мулом.

2. ДАНІ ТА ОЦІНКА

2.1. РЕЖИМ СПАРЕНИХ УСТАНОВОК

У цьому режимі щоденний ступінь видалення, DR, вираховують згідно з вказівками пункту 1.2.1.

Ці щоденні значення видалення DR коригують на значення DRc для передачі матеріалу, пов'язаної з процедурою трансінокуляції за допомогою рівняння (2) для тригодинного чи рівняння (3) для шестигодинного періоду відстоювання.

4        100
                       DRc = --- DR - -----                    (2)
                              3         3

8        100
                       DRc = --- DR - -----                    (3)
                              7         7

Вираховують середнє значення серії значень DRc, і додатково також стандартне відхилення за рівнянням (4):

------------------
                            | n   _          2
                            | Z  (DRc - DRc )
                   S    = - |i=1           i                   (4)
                    DRc    \|----------------
                            |      n - 1

де:

Z = знак суми

S = стандартне відхилення серії значень DRc

DRc

DRc = середнє значення DRc

n = кількість аналізів

Крайні значення серії DRc видаляють згідно придатної статистичної процедури, наприклад, за Налімовим (b), на рівні ймовірності 95%, а середнє значення та стандартне відхилення крайніх вільних даних DRc обчислюють знову.

Потім остаточний результат обчислюють за рівнянням (5) як

t          s
                          _     n-1; альфа
                   DRc = DRc = ------------ DRc                (5)
                                   ---
                                  \|n

де:

t ; альфа = табличне значення t для n пар значень E та E і

n-1                                                      0
статистичної імовірності Р (Р = 1 - альфа),  де Р задано на  рівні
95% (1).

Результат констатують як середнє значення з межами допустимого відхилення на рівні ймовірності 95%, відповідним стандартним відхиленням та кількістю даних групи крайніх вільних даних DR, та кількість крайніх даних, наприклад:

DR = 98,6 +/- 2,3% видалення РОВ

s = 4,65% видалення РОВ

n = 18

x = кількість крайніх значень

2.2. РЕЖИМ НЕСПАРЕНИХ УСТАНОВОК

Роботу установок можна перевірити наступним чином:

РОВ чи ХПК стоків - РОВ чи ХПК очищених стоків
     відсоткове вираження  = ---------------------------------------------- x 100
     видаленого РОВ чи ХПК                  РОВ чи ХПК стоків

Це щоденне видалення можна зобразити у формі графіка для виявлення певних тенденцій, наприклад, акліматизації.

2.2.1. Використання аналізів визначення РОВ/ХПК

Щоденний ступінь видалення DR вираховують відповідно до вказівок пункту 1.2.1.

Середнє значення серії значень DR вираховують, а додатково обчислюють також його стандартне відхилення згідно:

------------------
                         | n   _          2
                         | Z  (DRc - DR  )
                 S   = - |i=1           i                      (6)
                  DR    \|----------------
                         |      n - 1

де:

Z = знак суми

DR = середнє відхиленні серії значень DR i

DR = середнє значення значень DR i

n = кількість аналізів

Крайні значення серії DR видаляють згідно придатної статистичної процедури, наприклад, за Налімовим (6), на рівні ймовірності 95%, а середнє значення та стандартне відхилення групи крайніх вільних даних DR обчислюють знову.

Потім остаточний результат обчислюють за рівнянням (7) як:

t          s
                       _    n-1; альфа
                 DR = DR = ------------ DR                     (7)
                               ---
                              \|n

де:

t ; альфа = табличне значення t для n пар значень E та E і

n-1                                                      0
статистичної  імовірності Р (Р = 1 - альфа),  де Р задано на рівні
95% (1).

DR = (98,6 +/- 2,3)% видалення РОВ

s = (4,65)% видалення РОВ

n = 18

x = кількість крайніх значень

2.2.2. Використання спеціального аналізу

Відсоткова частка видалення досліджуваної речовини з водної фази (R ) обчислюється вказівок відповідно до вказівок пункту w

1.2.2.

3. ЗВІТНІСТЬ

3.1. ЗВІТ ПРО ДОСЛІДЖЕННЯ

Звіт про дослідження повинен містити, якщо це можливо, наступну інформацію:

- бланк, зразок якого подано у Додатку 3, що демонструє робочі умови дослідження,

- яку апаратуру використано (перевірка підтвердження ОЄСР чи пориста ємність),

- який режим роботи використано - спарені установки чи ні,

- які стічні води використано - синтетичні чи побутові;

- якщо побутові, вказати дату й місце забору проби,

- який тип інокуляту використано, вказавши дату й місце забору проби,

- формулювання та опис аналітичного методу, якщо було зроблено спеціальні аналізи,

- графік видалення ХПК чи РОВ за часом, включно з відображенням даних про період функціонування та період оцінювання,

- аналітичне видалення досліджуваної речовини як ХПК чи РОВ у резервному розчині,

- графік відсотку видалення досліджуваної речовини з водної фази за часом (період функціонування та період оцінювання), якщо було зроблено спеціальні аналізи

- середнє значення видалення ХПК чи РОВ досліджуваної речовини та стандартне відхилення, вирахувані з результатів періоду оцінювання; тобто коли зареєстровано постійне видалення досліджуваного матеріалу або період постійної роботи,

- графік концентрації активованого мулу за часом,

- будь-які зауваження, що стосуються активованого мулу (видалення надлишкового мулу, наявність збільшення об'єму, FeCl 3 тощо),

- концентрація речовини, використана в дослідженні,

- будь-які результати, що стосуються аналізів мулу,

- вся інформація та експериментальні результати, що стосуються досліджуваної речовини та еталонної речовини, якщо така використовувалася,

- наукове обґрунтування будь-яких змін, внесених до процедури дослідження.

3.2. ІНТЕРПРЕТАЦІЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

Низький рівень видалення досліджуваної речовини з водної фази може бути спричинений пригніченням діяльності мікроорганізмів досліджуваною речовиною. Це можна також виявити лізисом та втратою мулу, що продукує мутну надосадову рідину, та зменшенням ефективності видалення ХПК (або РОВ) на дослідній станції очистки.

Фізико-хімічна адсорбція може також інколи відігравати важливу роль. Відмінності між біологічною дією на молекулу та фізико-хімічною адсорбцією можуть бути виявлені аналізом мулу після відповідної десорбції.

Існує необхідність у проведенні подальших досліджень, якщо потрібно провести розмежування між біологічною деструкцією (або частковою біологічною деструкцією) та адсорбцією.

Це можна зробити багатьма способами, але найбільш переконливим є використання надосадової рідини в якості інокуляту для базового дослідження (бажано щоб це було спірометричне дослідження).

Якщо спостерігається високий рівень видалення ХПК чи РОВ, тоді це пов'язано з біологічною деструкцією, в той час як при низьких рівнях видалення біологічну деструкцію важко відрізнити від знищення. Наприклад, якщо розчинна сполука виявляє високе значення константи адсорбції, що становить 98% і коефіцієнт надлишкового використаного мулу сягає 10% на день, тоді знищення до 40% речовини є можливим; якщо коефіцієнт надлишкового використаного мулу складатиме 30%, то знищення речовини через адсорбцію до мулу та видалення з надлишковим мулом може зрости до 65% (4).

При використанні спеціальних аналізів потрібно звернути увагу на зв'язок між структурою речовини та видом спеціального аналізу, що використовується. У даному випадку те явище, котре спостерігатиметься, не можна інтерпретувати як мінералізацію речовини.

4. ПОСИЛАННЯ

(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 303 A, Decision of the Council C(81) 30 final.

(2) Annex V C9 Degradation Test - Chemical Oxygen Demand, Commission Directive 84/449/EEC, (OJ L 251, 19.9.1984, p. 1).

(3) Painter, H.A., King, E.F., WRC Porous-Pot method for assessing biodegradability, Technical Report TR70, June 1978, Water Research Centre, United Kingdom.

(4) Wierich, P., Gerike, P., The fate of soluble, recalcitrant, and adsorbing compounds in activated sludge plants, Ecotoxicology and Environmental Safety, vol.5, No 2, June 1981, p.161-171.

(5) Директива Ради 82/242/EEC та 82/243/EEC, (OJ, No L109, 22.4.1982, p.1), що вносить поправки до Директив Ради 73/404/EEC та 73/405/EEC про здатність пральних засобів до біологічної деструкції, (OJL347, 17.12.1973, с. 51).

(6) Streuli,H.,Fehlerhafte Interpretationund Anwendungvon AusreSertests, insbesondere bei Ring versuchenzur Oberprufung analytisch-chemischer Untersuchungsmethoden, Fresenius-Zeitschrift fur Analytische Chemie, 303 (1980), p. 406-408.

Додаток 1

Малюнок 1 ( 994_b14 )

Додаток 1

Малюнок 2 ( 994_b14 )

Додаток 2

Малюнок 1

Обладнання, що використовують для оцінки здатності до біологічної деструкції ( 994_b14 )

Малюнок 2

Розріз трилітрового контейнера аерації пористої ємкості ( 994_b14 )

Додаток 3

Робочі умови для дослідження симуляції активованого мулу

Перевіряти в кожній групі

Апарат

підтвердження ОЄСР                               ------------
     пориста ємкість                                  |----------|
                                                      ------------

Режим роботи

одна установка                                   ------------
     спарені установки                                |----------|
     неспарені установки                              |----------|
                                                      ------------

Трансінокуляція

відсутня                                         ------------
     активований мул                                  |----------|
     надосадова рідина                                |----------|
                                                      ------------

Середній час відстоювання

три години                                       ------------
     шість години                                     |----------|
                                                      ------------

Базова речовина

побутові стічні води                             ------------
     синтетичні стічні води                           |----------|
                                                      ------------

Інокулят

стічні води вторинного очищення                  ------------
     композитний                                      |----------|
     активований мул                                  |----------|
                                                      ------------

Додавання досліджуваного матеріалу

спочатку                                         ------------
     поступове збільшення                             |----------|
     після утворення мулу                             |----------|
                                                      ------------

Аналіз

------------
     спеціальний                                      |----------|
     ХПК                                              |----------|
     РОВ                                              ------------

С.11. БІОЛОГІЧНА ДЕСТРУКЦІЯ

ДОСЛІДЖЕННЯ ЗАТРИМКИ ІНТЕНСИВНОСТІ ДИХАННЯ АКТИВОВАНОГО МУЛУ

1. МЕТОД

1.1. ВСТУП

Описаний метод дає можливість оцінити вплив досліджуваної речовини на мікроорганізми шляхом вимірювання інтенсивності дихання за визначених умов у присутності різних концентрацій досліджуваної речовини.

Метою цього методу є надання швидкого способу визначення наявності речовин, що можуть нас причиняти шкідливий вплив на станції аеробної мікробної очистки, та визначення підходящої концентрації досліджуваних речовин, які не пригнічуватимуть діяльності мікробів; такі концентрації можна буде згодом використати у дослідженнях здатності до біологічної деструкції.

Дослідження діапазонів можна провести перед визначальним дослідженням. Воно надасть інформацію про діапазон концентрацій для використання в основному дослідженні.

Дві контрольні групи без досліджуваної речовини задіяні за схемою даного дослідження, - одна на початку та інша наприкінці серії досліджень. Кожна партія активованого мулу повинна піддаватися перевірці за допомогою еталонної речовини.

Цей метод найлегше застосовувати до речовин, які, через їх водорозчинність та низькі леткі характеристики, скоріше за все залишаться у воді.

Для речовин з обмеженою розчинністю у середовищі даного дослідження можливі труднощі із визначенням ЕК . 50

Результати, зроблені на основі споживання кисню, можуть призвести до помилкових висновків, коли досліджувана речовина має схильність до блокування оксидативної фосфориляції.

Для проведення дослідження потрібно мати наступну інформацію про досліджувану речовину:

- властивість водорозчинності,

- тиск пари,

- структурна формула,

- чистота досліджуваної речовини.

Рекомендації:

Активований мул може містити потенційно патогенні організми, тому з ним потрібно поводитися обережно.

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ ТА ОДИНИЦІ ВИМІРЮВАННЯ

Інтенсивність дихання є споживанням кисню мікроорганізмами у стічних водах у аеробному мулі, що зазвичай наводиться у міліграмах О на міліграм мулу на годину. 2

Для того, щоб обчислити пригнічуючий вплив досліджуваної речовини за її конкретної концентрації, інтенсивність дихання процент подається як відсоток середнього значення інтенсивності дихання двох контрольних груп:

2Rs
             (1 - ---------) x 100 = % пригнічення
                  Rc  + Rc
                    1     2

де:

Rs = норма витрат кисню досліджуваної речовини, використаної в досліді.

Rc = норма витрат кисню, контрольна група 1 1

Rc = норма витрат кисню, контрольна група 2. 2

ЕК у даному методі є концентрацією досліджуваної речовини, 50

інтенсивність дихання якої становить 50%  від значення, показаного
контрольною групою в умовах, описаних для даного методу.

1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ

Рекомендовано застосовувати 3,5 дихлорфенол, відомий як інгібітор респірації, як еталонну речовину та досліджувати на ЕК 50 кожну партію активованого мулу для перевірки мулу на наявність надчутливості.

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

Інтенсивність дихання активованого мулу, до якого додано стандартний об'єм синтетичних стічних вод, вимірюють після контакту, що триває 30 хвилин або три години, або ж через обидва проміжки часу. Інтенсивність дихання того самого активованого мулу за різної концентрацій досліджуваної речовини чи за інших аналогічних умов також підлягає вимірюванню. Пригнічуючий вплив досліджуваної речовини при конкретній концентрації подається у відсотках від середнього значення інтенсивності дихання у двох контрольних групах. Значення ЕК вираховують з результатів 50

аналізу різних концентрацій.

1.5. КРИТЕРІІ ЯКОСТІ

Результати дослідження вважаються дійсними, якщо:

- значення інтенсивності дихання у двох контрольних групах відрізняються у межах 15%,

- значення ЕК для 3,5-дихлорфенолу (через 30 хвилин та/чи 50

три години)   знаходяться   у   прийнятному  діапазоні  від  5  до
30 мг/літр.

1.6. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

1.6.1. Реагенти

1.6.1.1. Розчини досліджуваної речовини

Розчини досліджуваної речовини готують безпосередньо на початку дослідження, використовуючи резервний розчин. Концентрація резервного розчину 0,5 г/літр вважається прийнятною за умов дотримання процедури, описаної нижче.

1.6.1.2. Розчин контрольної речовини

Розчин 5,5-дихлорфенолу можна приготувати шляхом розчинення 0,5 г 3,5-дихлорфенолу у 10 мл 1 М NaOH, розбавивши отриманий розчин дистильованою водою приблизно до 30 мл, додаючи з помішуванням 0,5 М H SO до моменту початку осідання - потрібно 2 4

приблизно  8  мл  0,5  М  H SO   -  і  зрештою   розбавити   суміш
                           2  4
дистильованою  водою  до  об'єму  1 літр.  Коефіцієнт рН при цьому
повинен бути 7-8.

Синтетичні стічні води

Суміш синтетичних стічних вод готують розчиненням наступної кількості речовин у одному літрі води:

- 16 г пептону,

- 11 г м'ясного екстракту

- 3 г сечовини,

- 0,7 г NaCl,

- 0,4 г CaCl 2H O, 2 2

- 0,2 г MgSO .7H O 4 2

- 2,8 г K HPO . 2 4

Примітка 1: вказані штучні стоки є стократною концентрацією розчинів, описаних у Технічному Звіті OECP "Запропоновані методи визначення здатності до біологічного розпаду поверхнево активних речовин, що використовуються у синтетичних миючих засобах" (11 червня 1976 року) з додаванням гідрофосфату дикалію.

Примітка 2: якщо приготоване середовище не використовується одразу, його необхідно зберігати у темному приміщенні при температурі 0-4 град.С, протягом не більше одного тижня, в умовах, що не призводять до змін у його складі. Перед зберіганням середовище можна стерилізувати, або ж додавати м'ясний екстракт та пептон безпосередньо перед проведенням дослідження. Перед використанням його необхідно ретельно перемішати та встановити потрібний рівень рН.

1.6.2. Апаратні засоби

Вимірювальні прилади: дотримання певних вимог до дизайну не вимагається. Проте, над рідиною повинен бути вільний простір, а зонд повинен щільно прилягати до шийки вимірювальної колби.

Використовується звичайне лабораторне обладнання, зокрема:

- вимірювальні прилади,

- прилад для аерації,

- електрод для вимірювання рН та вимірювальне обладнання,

- електрод для вимірювання О . 2

1.6.3. Підготовка інокулянту

Активований мул, отриманий з установки для очищення стічних вод, переважно, побутового походження, використовується у дослідженні у якості мікробного інокулянту.

За необхідності, після отримання мулу лабораторією, великі частинки можна усунути шляхом відстоювання протягом короткого часу (напр. 15 хвилин) та використання зібраного верхнього шару дрібніших твердих частинок. Як варіант, мул можна перемішати за допомогою блендера протягом кількох секунд.

Крім того, якщо вважається, що у мулі присутні гальмівні сполуки, його необхідно промити водою з-під крана або ізотонічним розчином. Після центрифугування збирається супернатант. (процедура повторюється тричі).

Невелику кількість мулу зважують та висушують. З цього значення можна вивести кількість вологого мулу, яку необхідно суспендувати у воді для отримання інтервалу загальної кількості твердих частинок, суспендованих у стічній рідині, між 2 і 4 г/літр. За такого рівня, концентрація у дослідному середовищі коливається від 0,8 до 1,6 г/літр, за умови, що виконується процедура, рекомендована нижче.

Якщо немає можливості використати мул у день збору, до кожного літру активованого мулу, підготованого, як описано вище, додається 50 мл штучних стоків; отриманий розчин необхідно провітрювати протягом ночі при температурі 20 +- 2 град.С та протягом дня до моменту використання. Перед використанням перевіряється рН і за необхідності, встановлюється на рівні рН 6-8. Загальна кількість твердих частинок, суспендованих у стічній рідині, визначається, як описано у попередньому абзаці.

Якщо вимагається, щоб та ж сама порція мулу використовувалась протягом кількох днів (максимум чотири дні), 50 мл штучних стоків повинні додаватись на літр мулу в кінці кожного робочого дня.

1.6.4. Виконання дослідження

Тривалість/час контакту: 30 хвилин та/або три години, протягом яких відбувається аерація

Вода:                      Питна вода (дехлорована,
                                якщо потрібно)

Подача повітря:            Чисте, безмасляне повітря. Потік
                                повітря 0,5-1 літр/хв.

Вимірювальні прилади:      Колба з пласким дном, подібна до
                                склянки БПК

Лічильник кисню:           Відповідний електрод для
                                вимірювання кисню, з самописним
                                приладом

Живильний розчин: Штучні стоки (див. вище)

Дослідна речовина: Дослідний розчин готується безпосередньо перед початком дослідження

Контрольна речовина: напр. 3,5-дихлорфенол (щонайменше три розчини з різними концентраціями)

Еталонні розчини: Інокульовані проби без додавання дослідної речовини

Температура:               20 +- 2 град.С

Можлива процедура, що може застосовуватись як для контрольної, так і для дослідної речовини, з тригодинним часом контакту подається нижче:

Використовуються декілька ємностей (напр. однолітрові хімічні склянки).

Повинні використовуватись щонайменше п'ять розчинів з концентраціями, що відрізняються на сталу величину, яка бажано не повинна перевищувати 3,2.

В час "0" 16 мл живильних штучних стоків розбавляються водою до 300 мл. Додаються 200 мл мікробного інокулянту і весь розчин (500 мл) виливається у першу ємність (перший контрольний розчин С ). 1

Дослідні ємності потрібно постійно провітрювати таким чином, щоб кількість розчиненого О не була меншою, ніж 2,5 мг/літр і щоб 2

безпосередньо   перед    вимірюванням    інтенсивності    дихання,
концентрація О  була на рівні 6,5 мг/літр.
              2

В час "15 хвилин" (інтервал 15 хвилин є умовним, проте зручним) зазначена вище процедура повторюється, проте до 16 мл штучних стоків додаються 100 мл основного розчину дослідної речовини, потім отримана суміш заповнюється водою до 300 мл та мікробним інокулянтом до 500 мл. Після цього розчин виливається у другу ємність і провітрюється, як вказано вище. Процедура повторюється з інтервалом у 15 хвилин, з різними об'ємами основного розчину дослідної речовини, в результаті чого отримуємо ряд ємностей з різними концентраціями дослідної речовини. В кінці готується ще один еталонний розчин.

Після трьох годин фіксується рівень рН, і ретельно перемішаний вміст першої ємності виливається у вимірювальний прилад, інтенсивність дихання вимірюється за період до 10 хвилин.

Процедура визначення застосовується до вмісту кожної ємності таким чином, щоб час контакту для кожної ємності становив три години.

Дія контрольної речовини досліджується на кожній порції мікробного інокулянту таким же чином.

Інші умови (напр. більше, ніж один лічильник кисню) можуть вимагатись у випадку, якщо вимірювання здійснюються після 30 хвилин контакту.

Якщо потрібно виміряти хімічне поглинання кисню, додатково готуються ємності, що містять дослідну речовину, штучні стоки та воду, але не містять активованого мулу. Поглинання кисню вимірюється і фіксується після аерації протягом 30 хвилин та/або трьох годин (час контакту).

2. ДАНІ ТА ОЦІНКА

Інтенсивність дихання обраховується за кривою самописця приблизно між 6,5 мг О /літр та 2,5 мг О /літр або за 10-хвилинний 2 2

період,  коли інтенсивність дихання є низькою. Відрізок кривої, за
яким обраховується інтенсивність дихання повинен бути лінійним.

У випадку, коли значення інтенсивності дихання двох еталонних розчинів відрізняються більше, ніж на 15% або значення ЕС (після 50

30  хвилин  та/або  трьох  годин) контрольної речовини виходить за
допустимі межі (від 5 до 10 мг/л для 3,5 дихлорфенолу) дослідження
вважається недійсним, і його необхідно повторити.

Для кожного розчину з певною концентрацією вираховується відсоток інгібування (див. 1.2). Відсоток інгібування накладається на значення концентрації на нормальному (або імовірнісному) логарифмічному папері і звідси виводиться значення ЕС . 50

Довірчий інтервал 95% для значень ЕС можна визначити 50

стандартним способом.

3. ЗВІТУВАННЯ

3.1. ЗВІТ ПРО ДОСЛІДЖЕННЯ

За можливості, звіт про дослідження повинен включати наступне:

- дослідна речовина: дані про хімічну ідентифікацію,

- дослідна система: джерело, концентрація та попередня обробка активованого мулу,

- умови дослідження:

* рН реакційної суміші перед вимірюванням інтенсивності дихання

* температура, за якої відбувалось дослідження

* тривалість дослідження

* контрольна речовина та отримане для неї значення ЕС 50

* абіотичне поглинання кисню (якщо спостерігалось).

- результати:

* усі дані вимірювань

* крива інгібування та метод обрахунку ЕС 50

* значення ЕС50 та, якщо можливо, довірчі межі 95%, ЕС та 20

ЕС  ,
  80

* всі спостереження та будь-які відхилення, що могли вплинути на результати дослідження.

3.2. ПОЯСНЕННЯ ДАНИХ

Значення ЕС повинне розглядатись лише як приблизний 50

показник токсичного впливу дослідної речовини на  активований  мул
або    мікроорганізми    у   стічних   водах,   оскільки   складні
взаємозв'язки,  що  існують  у  довкіллі,  не  можуть  бути  точно
відтворені в лабораторних умовах. Крім того, дослідна речовина, що
може мати інгібувальний вплив  на  окислення  аміаку,  може  також
спричиняти  нетипові  криві  інгібування.  Відповідно,  такі криві
необхідно аналізувати з обережністю.

4. ДОВІДКОВА ЛІТЕРАТУРА

(1) Міжнародний Стандарт ISO 8192-1986.

(2) Broecker, B., Zahn, R., Water Research 11, 1977, C. 165.

(3) Brown, D., Hitz, H.R., Schaefer, L., Chemosphere 10, 1981, C. 245.

(4) ETAD (Екологічна і токсикологічна асоціація виробництва барвників та органічних пігментів), Рекомендований метод N 103, також описаний у:

(5) Robra, B., Wasserl Abwasser 117, 1976, С. 80.

(6) Schefer, W., Textilveredlung 6, 1977, С. 247.

(7) ОЕСР, Париж, 1981, Принципи досліджень 209, Рішення Ради С(84) 30 остаточне.

С.12 БІОЛОГІЧНИЙ РОЗПАД МОДИФІКОВАНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ НБАМ

1. МЕТОД

1.1. ВСТУП

Метою даного методу є оцінка потенційної граничної здатності до біологічного розпаду розчинних у воді, нелетких органічних речовин під дією відносно високих концентрацій мікроорганізмів впродовж тривалого інтервалу часу. Життєздатність мікроорганізмів протягом цього часу підтримується шляхом щоденного додавання відстояних стоків для живлення (Стоки для використання протягом вихідних днів можуть зберігатись при температурі 4 град.С. Також можна використовувати штучні стоки отримані з перевірки на відповідність технічним умовам ОЕСР.)

Можливим є фізико-хімічне поглинання суспендованих твердих часток, його необхідно враховувати під час пояснення результатів.

З огляду на тривалий час відстоювання рідкої фази (36 годин) та періодичне додавання поживних речовин, дослідження не відтворює умов, які мають місце в установках для очищення стічних вод. Результати, отримані з використанням різних дослідних речовин, вказують на те, що дане дослідження має високий потенціал для біологічного розпаду.

Умови даного дослідження є вкрай сприятливими для проведення відбору та/або адаптації мікроорганізмів, що мають здатність до розчеплення дослідної сполуки. (Дану процедуру можна також застосовувати для отримання акліматизованого інокулянту для використання у інших дослідженнях.)

У даному методі для оцінки граничної здатності до біологічного розпаду дослідних речовин використовується міра концентрації розчиненого органічного вуглецю (РОВ). Визначення РОВ бажано здійснювати після закислення та очищення, а не за різницею С - С . загальний органічний

Одночасне використання конкретних аналітичних методів може дати змогу оцінити первинний розпад речовини (зникнення початкової хімічної структури).

Метод може застосовуватись лише для органічних дослідних речовин, які за концентрацій, що використовуються в дослідженні:

- є розчинними у воді (мінімум 20 мг розчиненого органічного вуглецю на літр),

- мають незначний тиск пари

- не гальмують розвиток бактерій

- мають незначний ступінь поглинання дослідною системою

- не втрачаються у дослідному розчині через омилення.

Вміст органічного вуглецю у дослідній речовині повинен бути встановлений.

Інформація про відносне співвідношення основних компонентів дослідної речовини буде корисною під час пояснення отриманих результатів, особливо, коли вони низькі або граничні.

Інформація про токсичність мікроорганізмів, що містяться в речовині, може бути корисною під час пояснення низьких результатів та підбору потрібної дослідної концентрації.

1.2. ОЗНАЧЕННЯ ТА ОДИНИЦІ ВИМІРЮВАННЯ

С = концентрація дослідної сполуки, що дорівнює концентрації

органічного вуглецю,  наявного чи доданого до відстояних стоків на
початку аерації (мг/літр),

С = концентрація розчиненого органічного вуглецю, виявленого

у надмуловій рідині дослідної речовини в кінці аерації (мг/літр),

С = концентрація розчиненого органічного вуглецю, виявленого

у надмуловій рідині еталонної речовини в кінці аерації (мг/літр).

Біологічний розпад у даному методі визначається як зникнення органічного вуглецю. Біологічний розпад може бути виражений як:

1. Процент видалення D кількості речовини, що додається da

щоденно:

C  - (C  - C )
                           T     T    C
                   D   = --------------- x 100                 (1)
                    da         C
                                T

де

D = розпад/кількість речовини, що додається щоденно

2. Процент видалення D кількості речовини, наявної на ssd

початку кожного дня:

2C  + C   - C   - C       + 3C
                T    ti    ci    t(i+1)     c(i+1)
       D    = ------------------------------------ x 100    (2(a))
        ssd              2C  + C   + C
                           T    ti    ci

2С  - 2(C  - C )
                   T      t    c
       приблизно ---------------- x 100                     (2(b))

2C + (C - C ) T t c

де

D = розпад/кількість речовини, наявної на початку дня;

ssd

індекси і та (і+1) позначають день проведення вимірювань.

Рівняння 2(а) рекомендується застосовувати, коли елюат РОВ щоденно змінюється, в той час як рівняння 2(b) може застосовуватись, коли елюат залишається відносно стабільним.

1.3. КОНТРОЛЬНІ РЕЧОВИНИ

У деяких випадках, коли досліджуються нові речовини, доцільним є використання контрольних речовин; проте жодної конкретної речовини тут не зазначається.

Дані для багатьох сполук, оцінених шляхом кільцевої проби подаються (див. Додаток 1) переважно з метою забезпечення періодичного калібрування методу та для зіставлення результатів у випадках, коли застосовується інший метод.

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

Активований мул, добутий з установки для очищення стоків, поміщується в блок для напівбезперервного активованого мулу (НБАМ). Додається дослідна сполука та побутові стоки, суміш провітрюється протягом 23 годин. Після цього аерація припиняється, мул повинен осісти, а надмулову рідину необхідно видалити.

Мул, що залишається у камері для аерації, перемішується з наступною аліквотою дослідної сполуки та стоків, і цикл повторюється.

Біологічний розпад встановлюється шляхом визначення вмісту розчиненого органічного вуглецю в надмуловій рідині. Це значення порівнюється із значенням, встановленим для стічної рідини, отриманої з контрольної пробірки, заповненої лише відстояними стоками.

Використання конкретного аналітичного методу дає змогу виміряти зміни концентрації первинної молекули, пов'язані з біологічним розпадом (первинна здатність до біологічного розпаду).

1.5. КРИТЕРІЇ ЯКОСТІ

Відтворюваність даного методу, що базується на видаленні розчиненого органічного вуглецю, досі не встановлено. (Щодо первинного біологічного розпаду, точні дані отримуються для речовин, що мають значний рівень розпаду).

Чутливість даного методу переважно визначається мінливістю контрольної проби і меншою мірою, точністю визначення розчиненого органічного вуглецю та рівнем вмісту дослідної сполуки у стічній рідині на початку кожного циклу.

1.6. ОПИС ПРОЦЕДУРИ ДОСЛІДЖЕННЯ

1.6.1. Приготування

Може використовуватись достатня кількість чистих блоків для аерації, або ж фірмовий блок НБАМ ємністю 1,5 літра, патрубки для підведення повітря (Малюнок 1) приєднуються для кожної дослідної речовини та еталонних розчинів. Стиснене повітря, що подається у блоки, очищене за допомогою ватного фільтра, не повинне містити органічного вуглецю і повинне попередньо насичуватись водою для зменшення втрат через випаровування.

Зразок мулової суміші, що містить від 1 до 4 г суспендованих твердих часток на літр, отримується із станції аерації стічних вод активованим мулом, що обробляє переважно побутові стоки. Приблизно 150 мл мулової суміші необхідно для кожного аераційного блоку.

Основні розчини дослідної речовини готуються у дистильованій воді; зазвичай вимагається концентрація 400 мг/літр, що визначається за органічним вуглецем і дає концентрацію дослідної сполуки 20 мг вуглецю/літр на початку кожного аераційного циклу, якщо не відбувається біологічного розпаду.

Можливим є застосування вищих концентрацій, за відповідної токсичності мікроорганізмів.

Вимірюється вміст органічного вуглецю.

1.6.2. Дослідні умови

Дослідження повинне відбуватись при температурі від 20 до 25 град.С.

Використовується висока концентрація мікроорганізмів (від 1 до 4 г/літр суспендованих твердих часток), час ефективного відстоювання становить 36 годин. Вуглецева речовина у стоках активно окислюється, зазвичай, протягом восьми годин після початку кожного аераційного циклу. Після цього мул дихає ендогенно впродовж решти періоду аерації, і впродовж цього часу єдиним доступним субстратом залишається лише дослідна сполука, аж поки вона також повністю не метаболізується. Вказані властивості у поєднанні із щоденною інокуляцією проби, коли побутові стоки використовуються у якості середовища, забезпечують сприятливі умови як для акліматизації, так і для стрімкого зниження біологічного розпаду.

1.6.3. Виконання дослідження

Зразок мулової суміші отримується з відповідної станції аерації стічних вод активованим мулом, що обробляє переважно побутові стоки, або з лабораторної установки і живиться киснем до використання у лабораторії. Кожен аераційний блок, включаючи блок з еталонними розчинами, заповнюється 150 мл мулової суміші (якщо використовується фірмовий блок НБАМ, вказані об'єми необхідно помножити на 10), і починається аерація. Після 23 годин аерація припиняється і мулові дають можливість осісти протягом 45 хвилин. По черзі відкриваються крани кожної посудини, і зливаються 100 мл надмулової рідини. Зразок відстояних побутових стоків отримується безпосередньо перед використанням, і 100 мл додаються до мулу, що залишається у кожному аераційному блоці. Аерація починається знову. На цій стадії дослідна сполука не додається, у блоки щоденно подаються лише побутові стоки до тих пір, поки після відстоювання не буде отримано прозору надмулову рідину. Зазвичай це займає до двох тижнів, протягом цього часу показник розчиненого органічного вуглецю в кінці кожного аераційного циклу наближається до сталого значення.

В кінці цього періоду відстояний мул з окремих блоків змішується, і в кожний блок додається 50 мл отриманого змішаного мулу.

95 мл відстояних стоків і 5 мл води додаються у еталонні блоки, 95 мл відстояних стоків і 5 мл відповідного основного розчину дослідної сполуки (400 мг/літр) додаються у дослідні блоки. Аерація починається знову і продовжується 23 години. Потім мулові дають можливість осісти протягом 45 хвилин, відділяється супернатант, і у ньому аналізується вміст розчиненого органічного вуглецю.

Описана процедура періодичного наповнення повторюється щоденно впродовж дослідження.

Перед відстоюванням може виникнути потреба прочистити стінки блоків для того, щоб запобігти накопиченню твердих часток над рівнем рідини. Для кожного блоку використовується окрема щітка або шкребок для запобігання перехресного забруднення.

Теоретично, вміст розчиненого органічного вуглецю у супернатанті необхідно визначати щоденно, проте менша частота проведення аналізів є припустимою. Перед аналізом стічні рідини пропускаються крізь промиті мембранні фільтри з порою 0,45 мю м або центрифугуються. Використання мембранних фільтрів допускається, якщо встановлено, що вони не випускають атомів вуглецю і не вбирають речовину під час фільтрації. Температура проби у центрифузі не повинна перевищувати 40 град.С.

Тривалість дослідження для сполук, які не піддаються або виявляють слабку здатність до біологічного розпаду, невизначено, але досвід свідчить про те, що загалом вона повинна становити 12 тижнів і не перевищувати 26 тижнів.

2. ДАНІ ТА ОЦІНКА

Будується залежність вмісту розчиненого вуглецю в надмулових рідинах у дослідних та еталонних блоках від часу.

В процесі біологічного розпаду рівень вмісту в дослідних речовинах наближатиметься до рівня в еталонах. Як тільки три послідовні вимірювання дають сталу різницю між двома рівнями, виконується необхідна для статистичної обробки даних кількість подальших вимірювань і вираховується відсоток біологічного розпаду дослідної сполуки (D або D , див. 1.2). da ssd

3. ЗВІТУВАННЯ

3.1. ЗВІТ ПРО ДОСЛІДЖЕННЯ

Звіт про дослідження повинен за можливості включати наступне:

- всю інформацію про тип стоків, тип блоків, що застосовувався, та результати експерименту, що стосуються дослідної речовини, стандартної речовини, якщо використовувалась, та холостої проби,

- температура,

- крива видалення з поясненням, спосіб підрахунків (див 1.2),

- дата і місце збору активованого мулу та стоків, стан адаптації, концентрація тощо,

- наукове обґрунтування будь-яких змін процедури дослідження,

- дата і підпис.

3.2. ПОЯСНЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

Оскільки речовина, що досліджується за допомогою даного методу, не повністю піддається біологічному розпаду, будь-яке видалення РОВ шляхом лише біологічного розпаду відбувається поступово протягом декількох днів або тижнів, крім випадків, коли акліматизація відбувається раптово, на що вказує різке зникнення протягом кількох тижнів.

Проте, часом значну роль відіграє фізико-хімічне поглинання; воно супроводжується повним або частковим видаленням доданого РОВ на початковій фазі дослідження. Подальший розвиток залежить від таких факторів, як рівні поглинання та концентрації суспендованих твердих часток у забракованому елюаті. Зазвичай різниця між концентраціями РОВ у надмулових рідинах еталону та дослідної речовини поступово збільшується порівняно з початковим значенням і зберігається на досягнутому рівні до кінця експерименту, поки не буде проведено акліматизацію.

У випадку, коли потрібно відокремити біологічний розпад (або частковий біологічний розпад) від поглинання, необхідними є додаткові дослідження. Їх можна провести багатьма способами, але найбільш переконливим є використання надмулової рідини або мулу в якості інокулянту в дослідженні з базовою множиною (бажано, в спірометричному дослідженні).

Дослідні сполуки, що виявляють під час даного дослідження високий рівень неабсорбційного видалення РОВ, повинні вважатися потенційно здатними до біологічного розпаду. Часткове, неабсорбційне видалення вказує на те, що хімічна речовина принаймні піддається певному біологічному розпаду.

Відсутність або низький рівень видалення РОВ може спричинюватись гальмуванням мікроорганізмів дослідною речовиною, на це також вказує лізис та втрата мулу з утворенням мутного супернатанту. Дослідження необхідно повторити з нижчою концентрацією дослідної речовини.

Використання конкретного аналітичного методу або дослідної 14

речовини,  міченої за   С, дозволяє досягнути кращої чутливості. У
                                          14                 14
випадку використання дослідної сполуки з    С,  відновлення    СО
                                                                 2
свідчить про те, що відбувся біологічний розпад.

Якщо результати подаються стосовно первинного біологічного розпаду, необхідно за можливості надати пояснення щодо зміни хімічної будови, яка призводить до втрати чутливості до початкової дослідної сполуки.

Необхідно надати підтвердження аналітичного методу, а також реакцію на середовище холостого досліду.

4. ДОВІДКОВА ЛІТЕРАТУРА

(1) ОЕСР, Париж, 1981, Вказівки з проведення досліджень 302 А, Рішення Ради С(81) 30 остаточне.

Додаток 1

Дослідження НБАМ: приклад формулювання результатів

------------------------------------------------------------------
|     Речовина     |  С    |C  - C  |   Відсоток   | Тривалість  |
|                  |   T   | t    c | біологічного | дослідження |
|                  |(мг/л) | (мг/л) | розпаду, D   |    (дні)    |
|                  |       |        |           da |             |
|------------------+-------+--------+--------------+-------------|
|     4-ацетил     | 17,2  |  2,0   |      85      |     40      |
|   амінобензол    |       |        |              |             |
|    сульфонат     |       |        |              |             |
|------------------+-------+--------+--------------+-------------|
|  Тетра пропілен  | 17,3  |  8,4   |     51,4     |     40      |
| бензол сульфонат |       |        |              |             |
|------------------+-------+--------+--------------+-------------|
|   4-нітрофенол   | 16,9  |  0,8   |     95,3     |     40      |
|------------------+-------+--------+--------------+-------------|
| Діетиленгліколь  | 16,5  |  0,2   |     98,8     |     40      |
|------------------+-------+--------+--------------+-------------|
|      Анілін      | 16,9  |  1,7   |     95,9     |     40      |
|------------------+-------+--------+--------------+-------------|
|Циклопентан тетра | 17,9  |  3,2   |     81,1     |     120     |
|   карбоксилат    |       |        |              |             |
------------------------------------------------------------------

Додаток 2

Зразок приладу для дослідження

Малюнок 1 ( 994_b14 )

С.13. БІОЛОГІЧНЕ НАКОПИЧЕННЯ: ДОСЛІДЖЕННЯ НА РИБІ У ПРОТОЧНОМУ РЕЖИМІ

1. МЕТОД

Даний метод біологічного накопичення є ідентичним методу OECD TG 305 (1996).

1.1. ВСТУП

Цей метод описує порядок оцінки потенційної здатності речовин до накопичення в організмі риб у проточних умовах. Хоча проточні режими дослідження рекомендуються, допускається використання напівстатичних режимів за умови відповідності критеріям валідності.

У цьому методі подаються необхідні відомості для проведення дослідження, одночасно, відповідний простір надається для пристосування схеми досліду до умов окремих лабораторій та мінливих характеристик дослідних речовин. Описана схема найбільш точно використовується для стабільних органічних речовин з коефіцієнтами розподілення октанолу/води (log P ) між 1,5 та 6,0 ow

(1), але також може застосовуватись до надліпофільних речовин (з log P > 6,0). Попереднє значення коефіцієнта біологічного

ow
накопичення  (BCF),  який  часом   позначається   як   KB,   таких
надліпофільних   речовин   буде   вірогідно  вищим,  ніж  значення
коефіцієнта біологічного накопичення у стабільному стані  (BCF  ),
                                                              SS
який  очікується  отримати  в  результаті лабораторних досліджень.
Попереднє  значення  коефіцієнта  біологічного   накопичення   для
органічних  речовин з log P   до 9 можна отримати,  використовуючи
                           ow
рівняння  Бінштейна  та  ін.  (2).  Параметри,  що  характеризують
потенціал    біологічного    накопичення    включають    константу
інтенсивності поглинання (k ),  константу  інтенсивності  очищення
                           1

(k ) та BCF . 2 SS

Використання мічених радіоізотопів може полегшити аналіз зразків води та риби і може використовуватись для визначення доцільності проведення ідентифікації та кількісного визначення продуктів розпаду. У випадку, якщо вимірюється загальна кількість радіоактивних залишків (напр. методом спалювання або збільшення розчинності тканин), BCF базується на початковій сполуці, будь-яких утриманих метаболітах, а також асимільованому вуглецю. Таким чином, значення BCF, отримані від аналізу загального вмісту радіоактивних залишків, не можна безпосередньо порівнювати з BCF, виведеним лише за хімічним аналізом окремих елементів початкової сполуки.

Очисні процедури можуть проводитись під час дослідження за допомогою мічених радіоізотопів з метою визначення BCF за початковою сполукою, основні метаболіти можуть характеризуватись, якщо це вважається необхідним. Також можливим є поєднання дослідження метаболізму риб та дослідження біологічної концентрації шляхом аналізу та ідентифікації залишків у тканинах.

1.2. ОЗНАЧЕННЯ ТА ОДИНИЦІ ВИМІРЮВАННЯ

Біологічна концентрація/Біологічне накопичення це збільшення концентрації дослідної речовини в організмі або на його поверхні (або в окремих його тканинах), пов'язане із збільшенням концентрації дослідної сполуки в оточуючому середовищі.

Коефіцієнт біологічної концентрації (BCF або K ) у будь-який B

час впродовж фази поглинання даного  дослідження  є  концентрацією
дослідної сполуки в організмі риби, на його поверхні або в окремих
тканинах  (C , мю г/г  (частинок   на   мільйон)),  поділеною   на
            f
концентрацію хімічної    сполуки    в    оточуючому    середовищі.
(C , мю г/мл (чнм)).
  w

Коефіцієнт біологічної концентрації у стабільному стані (BCF or K ) не зазнає суттєвих змін впродовж тривалого інтервалу

ss     B
часу,  протягом якого концентрація дослідної речовини в оточуючому
середовищі залишається постійною.

Плато або стабільна фаза досягається на графіку залежності концентрації дослідної речовини у рибі (C ) від часу, коли крива f

стає  паралельною  до  осі  часу,  і  результати трьох послідовних
аналізів C ,  виконаних на пробах, взятих з інтервалом принаймні у
          f
два дні, не відрізняються один від одного більше, ніж на +- 20%, і
між трьома періодами вибірки не було зафіксовано суттєвої різниці.
Коли  досліджується об'єднана проба,  вимагаються щонайменше п'ять
послідовних  аналізів.  Для  дослідних   речовин,   які   повільно
поглинаються, інтервали повинні складати сім днів.

Коефіцієнти біологічної концентрації, що підраховуються безпосередньо за кінетичними константами швидкості (k /k ), 1 2 позначаються терміном "коефіцієнт кінетичної концентрації", BCFK.

Коефіцієнт розподілу в октанолі-воді (P ) є співвідношенням ow

між  розчинністю  хімічної  сполуки в н-октанолі та у воді в стані
рівноваги  (Метод  А.8),  також  позначається  K  .  Логарифм  P
                                                ow              ow
використовується   в   якості   показника   здатності  сполуки  до
біологічного накопичення у водних організмах.

Час контакту або фаза поглинання це час, протягом якого риба піддається дії дослідної сполуки.

Константа інтенсивності поглинання (k ) є чисельною 1

величиною, що визначає швидкість збільшення концентрації дослідної
речовини в організмі або на поверхні дослідної риби (або в окремих
тканинах),  під  час  її  контакту  з   дослідною   сполукою   (k
                                                                 1
                  -1
виражається у днях  ).

Пост-контакт або фаза очищення (виведення) це час після переміщення риби із середовища з дослідною речовиною, в середовище, яке не містить її, протягом якого досліджується очищення дослідної риби (або окремих її тканин) від речовини (або загальний обсяг виведення).

Константа інтенсивності очищення (виведення) це чисельна величина, що визначає швидкість зменшення концентрації дослідної сполуки у дослідній рибі (або окремих тканинах) після переміщення риби із середовища з дослідною речовиною, в середовище, яке не -1

містить її (k  виражається у днях  ).
             2

1.3. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

Дослідження складається з двох фаз: контакт (поглинання) та пост-контакт (виведення). Під час фази поглинання окремі групи риб одного виду поміщують у принаймні два розчини з різними концентраціями дослідної речовини. Після цього їх переміщують у середовище, що не містить дослідної речовини для проведення фази очищення. Фаза очищення є обов'язковою, крім випадків, коли поглинання речовини під час фази поглинання було незначним (напр. BCF менше 10). Протягом обох фаз постійно відстежується концентрація дослідної речовини в організмі чи на поверхні риби (або в окремих тканинах). Крім двох дослідних груп, контрольна група риби утримується в ідентичних умовах, за винятком відсутності дослідної сполуки, з метою встановлення зв'язку між можливими негативними наслідками, поміченими під час дослідження біологічної концентрації, та відповідною контрольною групою, а також визначення фонової концентрації дослідної речовини.

Фаза поглинання триває 28 днів, крім випадків, коли встановлено, що рівноваги було досягнуто раніше. Тривалість фази вбирання та часу встановлення стабільного стану можна передбачити за допомогою рівняння у Додатку 3. Після цього починається фаза очищення, під час якої риба переміщується у іншу чисту ємність, в аналогічне середовище, але без дослідної речовини. За можливості, коефіцієнт біологічного накопичення підраховується і як відношення (BCF ) концентрації у рибі (C ) та у воді (C ) за видимого

ss                            f                 w
стабільного  стану,  і  як   кінетичний   коефіцієнт   біологічної
концентрації,   BCF ,   що  дорівнює  відношенню  між  константами
                   K
інтенсивності  поглинання  (k )  та  очищення  (k ),  передбачаючи
                             1                   2
здійснення кінетики першого порядку. Якщо кінетика першого порядку
не  здійснюється,   необхідно   застосовувати   складніші   моделі
визначення (Додаток 5).

Якщо стабільного стану не вдалося досягнути впродовж 28 днів, фазу поглинання необхідно продовжувати, поки його не буде досягнуто, або протягом 60 днів; після цього починається фаза очищення.

Константа інтенсивності поглинання, константа (або константи, якщо використовуються більш складні моделі) інтенсивності очищення (виведення), коефіцієнт біологічної концентрації, та за можливості, довірчі межі кожного з цих параметрів підраховуються за моделлю, яка найкраще описує концентрації дослідної речовини у рибі та воді.

BCF виражається як функція загальної сирої ваги риби. Проте, у певних випадках можна використовувати окремі тканини та органи (напр., м'язи, печінка), якщо риба достатньо велика або її можна розділити на їстівну (філе) та неїстівну (тельбухи) частини. Оскільки для багатьох органічних речовин існує чітка залежність між здатністю до біологічної концентрації та ліпофільністю, отримане значення біологічної концентрації таких сполук також відповідно залежить від вмісту жиру в рибі та. Таким чином, з метою зменшення коливань результатів для речовин з високою ліпофільністю (тобто, з log P > 3), значення біологічної ow

концентрації повинне виражатись у співвідношенні до  вмісту  жиру,
крім загальної ваги тіла.

За можливості, вміст жиру повинен визначатись з використанням того ж біологічного матеріалу, що використовується для визначення концентрації дослідної речовини.

1.4. ІНФОРМАЦІЯ ПРО ДОСЛІДНУ РЕЧОВИНУ

Перед виконанням дослідження біологічної концентрації, потрібно отримати наступні дані щодо дослідної речовини:

- розчинність у воді

- коефіцієнт розподілення в октанові-воді P (який також ow

позначається K   і визначається методом ВЕРХ у Додатку 8)
              ow

- гідроліз

- фотоперетворення у воді, що визначається під дією сонячного або штучного сонячного опромінювання, а також в умовах опромінювання даного дослідження біологічної концентрації (3)

- поверхневий натяг (напр. для речовин, у яких неможливо визначити log P ) ow

- тиск пари

- повна здатність до біологічного розпаду (за необхідності).

Також необхідними є дані про токсичність для виду риб, що використовується, бажано асимптотичне значення LC (напр. 50

незалежне від часу).  Повинен вказуватись відповідний  аналітичний
метод   з   відомою   точністю,  вірогідністю  та  чутливістю,  що
використовується для кількісного визначення дослідної  речовини  у
дослідному  розчині  та біологічному матеріалі,  а також відомості
про підготовку та зберігання проби. Також повинна зазначатись межа
визначення дослідної речовини у воді та тканині риби.  У випадках,
                                          14
коли використовуються мічені радіоізотопи   С, повинен вказуватись
відсоток радіоактивності, пов'язаної з домішками.

1.5. ВІРОГІДНІСТЬ ДОСЛІДЖЕННЯ

Дослідження вважається вірогідним за дотримання наступних умов:

- коливання температури не перевищує +- 2 град.С;

- концентрація насичення розчиненим киснем не падає нижче 60%;

- концентрація дослідної речовини у камерах підтримується в межах +- 20% від середнього значення величин, отриманих в результаті вимірювання під час фази поглинання;

- смертність, хвороби або інші негативні наслідки у контрольній та дослідній групах риб становлять менше, ніж 10% в кінці дослідження; у випадках, коли дослідження триває декілька тижнів або місяців, смертність або інші негативні наслідки повинні становити менше, ніж 5% на місяць і не перевищувати 30% в цілому.

1.6. СТАНДАРТНІ СПОЛУКИ

Стандартні сполуки з відомою здатністю до накопичення можуть використовуватись для перевірки процедури проведення експерименту, коли це необхідно. Проте, наразі немає можливості порадити жодних конкретних речовин.

1.7. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

1.7.1. Прилади

Увагу необхідно звернути на запобігання використання у будь-яких частинах обладнання матеріалів, що мають здатність до розчинення, сорбування та вилужнення і можуть зашкодити рибі. Можуть використовуватись стандартні резервуари прямокутної або циліндричної форми, виготовлені з хімічно інертного матеріалу, ємність яких відповідає робочому навантаженню. Використання пластику необхідно мінімізувати. Бажано використовувати трубки з тефлону(R), нержавіючої сталі або скла. Як показав досвід, для речовин з високими коефіцієнтами адсорбції, таких як синтетичні перитроїди, може вимагатись силанізоване скло. В таких випадках, обладнання використовується одноразово.

1.7.2. Вода

Як правило, використовується природна вода, отримана з незабрудненого джерела однорідної якості. Якість води для розбавлення повинна бути достатньою для забезпечення життя відібраного виду риб протягом акліматизації та дослідження без відхилень поведінки та зовнішнього вигляду. Теоретично, необхідно встановити, що дослідний вид може виживати, рости та розмножуватись у воді для розбавлення (напр. під час дослідження лабораторних культур або впливу токсичності на життєвий цикл). Вода повинна бути охарактеризована принаймні за рН, твердістю, загальним вмістом твердих частинок, органічного вуглецю та, бажано, амонію, нітритами та лужністю, а для морських видів - за вмістом солі. Параметри, необхідні для оптимальної життєдіяльності риби є цілком відомими, проте, у Додатку 1 подаються максимальні значення концентрації ряду параметрів води для дослідження з використанням прісноводної та морської риби.

Вода повинна мати постійну якість протягом дослідження. Значення рН повинне знаходитись в межах від 6,0 до 8,5, але під час даного дослідження воно не повинне коливатись більше, ніж на 0,5 одиниць рН. З метою уникнення надмірного впливу води для розбавлення на результати дослідження (напр. комплексоутворення дослідної сполуки) або негативного впливу на групу риб, через певні інтервали необхідно відбирати проби для аналізу. У випадку, якщо встановлено, що вода для розбавлення має відносно постійну якість, приблизно раз у три місяці потрібно визначати вміст важких металів (напр. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni), основних аніонів та катіонів (напр. Ca, Mg, Na, K, Cl, SO ), пестицидів (напр. 4

загальний  вміст  органофосфорних  та  хлорорганічних пестицидів),
загальний  вміст  органічного  вуглецю  та  суспендованих  твердих
часток.  Якщо  підтверджено,  що якість води залишається постійною
впродовж принаймні року,  визначення можна проводити рідше  (напр.
раз у шість місяців).

Вміст природних частинок, а також загальний вміст органічного вуглецю (ЗОВ) у воді для розбавлення повинен бути якомога меншим для уникнення поглинання дослідної сполуки органічною речовиною, що може зменшити біологічну доступність першої (4). Максимальним допустимим значенням є 5 мг/л для твердих частинок (частинок, що затримуються фільтром з діаметром пори 0,45 мю м) і 2 мг/л для органічного вуглецю (див. Додаток 1). За необхідності, воду необхідно профільтрувати перед використанням. Потрапляння у воду органічного вуглецю з дослідної риби (виділення) та залишків їжі необхідно звести до мінімуму. Під час дослідження концентрація органічного вуглецю в дослідній ємності не повинна перевищувати концентрацію органічного вуглецю, що походить від дослідної речовини та розчинника, якщо використовується, більше, ніж на 10 мг/л (+- 20%).

1.7.3. Дослідні розчини

Готується основний розчин дослідної сполуки з відповідною концентрацією. Бажано готувати його шляхом перемішування або збовтування дослідної речовини у воді для розбавлення. Не рекомендується використовувати розчинники або дисперсанти; проте, у деяких випадках їх доводиться застосовувати для отримання потрібної концентрації основного розчину. У якості розчинників можуть використовуватись етанол, метанол, етилен гліколь диметиловий ефір, диметилформамід та триетилен гліколь. У якості дисперсантів можуть застосовуватись Cremophor RH40, Tween 80, метилцелюлоза 0,01% та HCO-40. Речовини, що мають здатність до повного біологічного розпаду повинні використовуватись з обережністю, оскільки можуть спричиняти проблеми під час досліджень у проточному режимі, пов'язані з ростом бактерій. Дослідна речовина може містити мічені радіоізотопи і повинна мати високий ступінь очищення (напр. бажано > 98%).

Під час досліджень у проточному режимі вимагається використання системи, яка постійно розподіляє та розбавляє основний розчин дослідної сполуки (напр. дозувальний насос, пропорційний дилютер, сатураторна система), для подачі дослідного розчину в дослідні камери. Бажано щодня здійснювати принаймні п'ять заміщень об'єму рідини у кожній камері. Перевага надається дослідженням у проточному режимі, але у випадках коли їх проведення є неможливим (напр. через негативний вплив на дослідні організми), допускається застосування напівстатичної методики, за умови дотримання критеріїв вірогідності. Швидкість потоку основного розчину та води для розбавлення повинна перевірятись за 48 годин до початку дослідження і потім щонайменше раз на день впродовж дослідження. Перевірка включає визначення швидкості потоку в кожній камері та контроль за тим, щоб її коливання не перевищували 20% всередині та між камерами.

1.7.4. Підбір виду риби

Важливими критеріями підбору риби є її доступність, можливість отримати рибу потрібних розмірів та належним чином утримувати її в лабораторії. Інші критерії включають рекреаційну, комерційну та екологічну важливість, а також відносну чутливість, успішний досвід використання тощо.

Рекомендовані види риб подаються у Додатку 2. Допускається використання інших видів, але тоді може виникнути потреба змінити порядок дослідження для забезпечення відповідних умов. У такому випадку обґрунтування підбору виду риб та експериментального методу повинне подаватись у звіті.

1.7.5. Утримання риби

Дозвольте косяку риби акліматизуватись протягом принаймні двох тижнів у воді з температурою, яка використовуватиметься під час дослідження. Раціон риби повинен бути ідентичним дослідному.

Після 48-годинного періоду адаптації фіксується смертність і застосовуються наступні критерії:

- смертність перевищує 10% популяції протягом семи днів: група не приймається;

- смертність становить від 5% до 10% популяції: сім додаткових днів відводиться на акліматизацію; якщо протягом наступних семи днів смертність перевищує 5%, група не приймається;

- смертність нижче 5% популяції протягом семи днів: група приймається.

Переконайтесь, що риба не має видимих захворювань та відхилень. Риба не повинна отримувати ліки від хвороб за два тижні до дослідження та протягом дослідження.

1.8. ВИКОНАННЯ ДОСЛІДЖЕННЯ

1.8.1. Попереднє дослідження

Попереднє дослідження може виявитись корисним для оптимізації умов визначення, напр. підбору концентрації (концентрацій) дослідної речовини, тривалості фаз поглинання та очищення.

1.8.2. Умови контакту

1.8.2.1. Тривалість фази вбирання

Тривалість фази вбирання можна передбачити, використовуючи практичний досвід (отриманий, наприклад, з попередніх досліджень або хімічної речовини, пов'язаної з накопиченням) або певні емпіричні зв'язки, знаючи або розчинність дослідної сполуки у воді, або її коефіцієнт розподілення в октанові-воді (див. Додаток 3).

Фаза вбирання повинна тривати 28 днів, крім випадків, коли встановлено, що рівноваги було досягнуто раніше. Якщо стабільного стану не було досягнуто впродовж 28 днів, фазу вбирання необхідно продовжити, виконуючи подальші вимірювання, до тих пір, поки не буде досягнуто стабільного стану або протягом 60 днів (залежно від того, який строк є коротшим).

1.8.2.2. Тривалість фази очищення

Зазвичай, час, що становить половину тривалості фази поглинання, є достатнім для належного (напр. 95%) зменшення вмісту речовини в організмі (див. пояснення розрахунків у Додатку 3). У випадку, якщо час, необхідний для виведення 95% речовини, є непрактично тривалим і, наприклад, вдвічі перевищує нормальну тривалість фази поглинання (більше 56 днів), може встановлюватись коротший період (доки концентрація дослідної речовини не становитиме менше, ніж 10% концентрації за стабільного стану). Проте, для речовин, що мають більш складні схеми поглинання та очищення, ніж ті, що представлені однокамерною моделлю риби і підпорядковуються кінетиці першого порядку, необхідно збільшити тривалість фази очищення для визначення констант швидкості виведення. Проте, тривалість даного періоду може обумовлюватись часом, протягом якого концентрація дослідної речовини в рибі залишається над межею аналітичного визначення.

1.8.2.3. Кількість дослідної риби

Підберіть таку кількість риби на один дослідний розчин, щоб принаймні чотири рибини припадали на одну пробу під час кожного взяття проб. Якщо вимагається більша статистична надійність, необхідно відібрати більше рибин у розрахунку на одну пробу.

Якщо використовується доросла риба, зафіксуйте у звіті її стать. У випадку, якщо використовується риба обох статей, перед початком контактної фази потрібно документально підтвердити, що різниця у вмісті жиру між ними є незначною; може виявитись необхідним об'єднання всієї риби жіночої та чоловічої статей.

Під час будь-якого дослідження відбирається риба приблизно однакової ваги, таким чином, що вага найменших особин складає не менше, ніж дві третіх ваги найбільших. Вся риба повинна бути одного покоління та походити з одного джерела. Оскільки вага та вік риби часом суттєво впливають на значення BCF (1), ці відомості ретельно фіксуються. Перед початком дослідження рекомендується зважити певну кількість риби, взятої з дослідного косяку для визначення середньої ваги.

1.8.2.4. Завантаження

Великі значення відношення води до риби встановлюються з метою мінімізації зменшення C через додавання риби на початку w

дослідження,  а  також  для  запобігання  зменшення   концентрації
розчиненого  кисню.  Важливо,  щоб  рівень завантаження відповідав
видові   риби,   що   використовується.   У   будь-якому   випадку
рекомендується  завантажувати  0,1-1,0  г риби (сира вага) на літр
води на день.  Високі рівні завантаження можуть використовуватись,
якщо   було   підтверджено,   що  концентрація  дослідної  сполуки
залишається стабільною у межах (+-  20%,  а  насичення  киснем  не
падає нижче 60%.

Під час підбору оптимальних режимів завантаження береться до уваги середовище проживання риби. Наприклад, для донної риби можуть виявитись необхідними акваріуми з більшою площею дна відносно об'єму води, ніж для морських видів.

1.8.2.5. Годування

Впродовж акліматизації та дослідження раціон риби повинен мати відомий вміст жирів та загальний вміст протеїну, що є достатніми для підтримання здоров'я та сталої ваги риби. Протягом цього часу риба годується щодня з інтенсивністю приблизно від 1 до 2 відсотків від ваги тіла на день; такий режим дозволяє підтримувати відносно сталу концентрацію жиру в організмі риб більшості видів впродовж дослідження. Кількість корму необхідно перераховувати з періодичністю, наприклад, раз на тиждень, для того, щоб вага тіла відповідала вмістові жиру. Для здійснення даного перерахування вага риби у кожній камері визначається за вагою особин, відібраних з даної камери для найбільш недавньої проби. Не зважуйте рибу, що залишилась у кожній камері.

Залишки їжі та екскременти відкачуються з дослідних камер щодня безпосередньо після годування (після 30-60 хвилин). Впродовж дослідження камери підтримуються по можливості чистими з метою забезпечення якомога меншої концентрації органічної речовини, оскільки наявність органічного вуглецю може обмежити біологічну доступність дослідної речовини (1).

Оскільки велика кількість кормів виготовляються з рибної муки, їх необхідно проаналізувати на наявність дослідної речовини. Також бажано проаналізувати їх на вміст пестицидів та важких металів.

1.8.2.6. Світло та температура

Фотоперіод зазвичай становить від 12 до 16 годин, а температура (+- 2 град.С) повинна підходити для дослідних видів риби (див. Додаток 2). Тип та характеристики освітлення повинні бути відомими. Необхідно звернути увагу на можливість фотоперетворення дослідної сполуки в дослідних умовах освітлення. Потрібно дотримуватись належного режиму освітлення для запобігання контакту риби з неприродними фотопродуктами. У деяких випадках може знадобитись фільтр для захисту від УФ випромінювання нижче 290 нм.

1.8.2.7. Дослідні розчини

Риба піддається дії щонайменше двох розчинів дослідної сполуки у воді в проточному режимі. Зазвичай, вища (або найвища) концентрація дослідної сполуки встановлюється на рівні 1% від гострого асимптотичного значення LC та щонайменше у десять разів 50

перевищує межу визначення у воді за допомогою аналітичного методу,
що застосовується в даному дослідженні.

Найвищу дослідну концентрацію можна також визначити, розділивши значення гострого LC для 96 годин на відповідний 50

показник  відношення  гострої/хронічної  токсичності   (відповідні
показники для деяких елементів можуть становити від 3 до 100).  За
можливості,  підберіть  іншу  концентрацію  (концентрації)   таким
чином, щоб вона відрізнялась від описаної вище в 10 разів. Якщо це
неможливо з огляду  на  значення  1%  LC    або  аналітичну  межу,
                                        50
допускається  використання  меншого  дільника,  ніж  10,  а  також
                                                              14
розглядається  можливість  застосування  мічених   ізотопів     С.
Концентрація   дослідної   сполуки   не  повинна  перевищувати  її
розчинність.

У випадках використання розчинників, концентрація не повинна перевищувати 0,1 мл/л і повинна бути однаковою у всіх дослідних ємностях. Частка розчинників у загальному вмісті органічного вуглецю, так само як і частка дослідної речовини, повинні бути відомими. Проте, потрібно намагатись уникати використання таких речовин.

1.8.2.8. Контрольні розчини

Один контрольний розчин з водою для розбавлення або контрольний розчин з розчинником, якщо використовується, повинен аналізуватись разом із розчинами дослідної речовини, якщо було встановлено, що розчинник не має шкідливого впливу на рибу. В іншому випадку необхідно використовувати обидва контрольні розчини.

1.8.3. Частота аналізу якості води

Під час дослідження у всіх ємностях необхідно вимірювати значення розчиненого кисню, ЗОВ, рН та температури. Загальну жорсткість та, якщо потрібно, солоність води необхідно вимірювати у контрольних розчинах та в ємності з вищою (або найвищою) концентрацією. Вміст розчиненого кисню та солоність, якщо використовується, необхідно вимірювати щонайменше тричі - на початку, приблизно в середині та в кінці фази поглинання - та один раз на тиждень під час фази очищення.

ЗОВ потрібно вимірювати на початку дослідження (за 24 та 48 годин до початку фази поглинання) перед завантаженням риби та щонайменше раз на тиждень протягом фаз поглинання та очищення. Температуру необхідно вимірювати щодня, рН - на початку та в кінці кожного періоду, а жорсткість - один раз протягом дослідження. Бажано постійно стежити за температурою у принаймні одній ємності.

1.8.4. Відбір проб, аналіз риби та води

1.8.4.1. План відбору проб води та риби

Проба води з дослідних камер для визначення концентрації дослідної речовини береться перед зануренням риби, під час фаз поглиння і очищення. Проба води береться як мінімум в той же час, що й проба риби, і перед годівлею риби. Під час фази поглинання концентрація дослідної речовини визначається для того, щоб перевірити її відповідність критеріям вірогідності.

Проба риби береться щонайменше п'ять разів протягом фази поглинання і щонайменше чотири рази протягом фази очищення. Оскільки у деяких випадках важко розрахувати достатньо точне значення BCF за такою кількістю зразків, особливо коли застосовується кінетика, що відрізняється від кінетики першого порядку, рекомендується збільшити частоту відбору проб протягом обох періодів (див. Додаток 4). Додаткова проба зберігається і аналізується тільки тоді, коли результати першої серії аналізів виявляться недостатніми для розрахунку BCF з необхідною точністю.

Приклад допустимого плану відбору проб подається у Додатку 4. Інші плани можна легко розрахувати, використовуючи інші допустимі значення P для визначення тривалості контакту для рівня ow

поглинання 95%.

Відбір проб продовжується під час фази поглинання до моменту встановлення стабільного стану або протягом 28 днів, в залежності від того, який термін є коротшим. Якщо стабільного стану не буде досягнуто протягом 28 днів, відбір проб продовжується до моменту досягнення стабільного стану або протягом 60 днів, в залежності від того, який термін є коротшим. Перед початком фази очищення рибу поміщають у чисті резервуари.

1.8.4.2. Відбір та підготовка проби

Проби води для проведення аналізу отримуються, наприклад, шляхом відкачування за допомогою інертної трубки з центральної точки дослідної камери. Оскільки фільтрація та центрифугування не завжди відділяють біологічно недоступні частинки дослідної речовини від тих, які є біологічно доступними (особливо для надліпофільних елементів з log P > 5) (1)(5), проби можуть не ow

піддававатися такій обробці.

Натомість, потрібно вжити заходів для підтримання максимальної чистоти баків, а вміст загального органічного вуглецю потрібно контролювати протягом фази поглинання та фази очищення.

Відповідну кількість риби (зазвичай не менше, ніж чотири рибини) дістають з дослідної камери під час кожного відбору проб. Відібрану рибу швидко промивають водою, насухо витирають, одразу умертвляють найбільш прийнятним та гуманним способом і потім зважують.

Бажано проаналізувати проби риби та води одразу після відбору метою запобігти розпаду або іншим втратам, і розрахувати приблизну інтенсивність поглинання і очищення, в процесі дослідження. Швидке виконання аналізу також дозволяє уникнути затримки у розрахунку, коли досягнуто стабілізації.

У випадку пізнішого виконання аналізу проби зберігаються відповідним способом. Перед початком дослідження потрібно отримати інформацію про спосіб зберігання, що застосовується для певної дослідної речовини - наприклад, глибоке замороження, зберігання при 4 град.С, тривалість зберігання, витягнення тощо.

1.8.4.3. Якість аналітичного методу

Оскільки уся процедура визначається головним чином точністю, правильністю і чутливістю аналітичного методу, який використовується для дослідної речовини, перевірте експериментально, чи правильність і відтворюваність хімічного аналізу, а також відновлення дослідної речовини з води і риби, відповідають обраному методу. Перевірте також, чи дослідна речовина не виявляється у розбавленій воді, що використовується.

За необхідності, значення С і C , отримані в результаті w f

дослідження,  коректуються  для  приведення  у   відповідність   з
показниками   відновлення   та  початковими  величинами  еталонних
розчинів.  Протягом дослідження з пробами води  та  риби  потрібно
обходитися  таким  чином,  щоб  мінімізувати забруднення та втрати
(напр. через адсорбцію або прилад для взяття проби).

1.8.4.4. Аналіз проб риби

Якщо у дослідженні використовуються матеріали, позначені радіоактивним ізотопом, можна проводити аналіз на наявність абсолютного радіоактивного ізотопу (тобто початкової сполуки та метаболітів), або проба може бути очищена, для окремого аналізу вихідної сполуки. Також, метаболіти можна характеризувати або у стабільному стані, або в кінці фази поглинання, залежно від того, який термін є коротшим. Якщо BCF загальних радіоактивних залишків становить >= 1000%, бажано, а для деяких видів хімікатів, таких як пестициди, переконливо рекомендується виявити і розрахувати кількість продуктів розпаду, що становлять >= 10% загальних залишків у тканинах риби у стабільному стані. Якщо продукти розпаду, що становлять >= 10% від загальних радіоактивних залишків у тканинах риби виявлено і розраховано, рекомендується також виявити і розрахувати кількість продуктів розпаду в дослідній воді.

Концентрація дослідної речовини зазвичай визначається для кожної окремо зваженої риби. Якщо це є неможливим, можна провести об'єднання проб під час кожного відбору проб, але об'єднання значно обмежує статистичні методики, які можуть бути застосовані при обробці даних. Якщо вимагається застосовувати певну статистичну методику з визначеною потужністю, кількість риби потрібно підігнати під потрібний порядок об'єднання та статистичну потужність (6)(7).

BCF потрібно виражати як функцію загальної повної ваги риби, а для ліпофільних речовин, у вигляді функції ліпідного вмісту. Ліпідний вміст риби за можливості визначається для кожного окремого відбору проб. Для визначення ліпідного вмісту потрібно використовувати відповідні методи (посилання 8 і Додаток 3). Метод екстракції за допомогою хлороформу/метанолу рекомендується у якості стандартного методу (9). Різні методи дають неоднакові значення (10), тому важливо давати детальний опис методу, що використовується. За можливості, аналіз ліпіду потрібно проводити на тій самій вибірці, що використовується для виявлення дослідної речовини, оскільки досить часто ліпіди потрібно вилучати з вибірки перед тим, як проводити хроматографічний аналіз. Вміст ліпіду в рибі (мг/кг сухої ваги) в кінці експерименту не повинен відрізнятися від початкового більше, ніж на 25%. Потрібно також вказувати у звіті відсоток сухої речовини в тканині для того, щоб дозволити перетворення концентрації речовини із значення виміряного на основі сирої ваги у значення виміряне на основі сухої ваги.

2. ДАНІ

2.1. ОБРОБКА РЕЗУЛЬТАТІВ

Криву поглинання дослідної речовини отримують шляхом графічного зображення її концентрації в/на поверхні риби (або у окремих тканинах) у фазі поглинання в залежності від часу на арифметичній шкалі. Якщо крива досягає рівня (точки) стабілізації, тобто стає приблизно асимптотичною на осі часу, стабільний стан BCF вираховується за формулою: ss

C за стабільного стану (середнє значення) f

------------------------------------------
       C  за стабільного стану (середнє значення)
        w

C  як стала - стан
        f
       _____________________________
       C  як стала - стан (значення)
        w

Якщо не досягається стабільний стан, можна вирахувати BCF з ss достатньою точністю для оцінки ризику у стабільному стані при рівновазі 80% (1,6/k ) або 95% (3,0/k ). 2 2

Також коефіцієнт концентрації (BCF ) визначається як k

співвідношення k /k ,  двох  кінетичних  сталих  першого  порядку.
                1  2
Стала  (k )  швидкості очищення як правило вираховується за кривою
         2
очищення (тобто,  графік спаду концентрації дослідної  речовини  у
рибі в залежності від часу).  Тоді стала швидкості поглинання (k )
                                                                1
вираховується за допомогою k  і величини  С ,  яка  виводиться  за
                            2              f
кривою  поглинання (див.  також Додаток 5).  Найкращим методом для
отримання BCF  та констант інтенсивності,  k  і k  є  використання
             k                              1    2
оцінки нелінійних параметрів на комп'ютері (11). В іншому випадку,
для вирахування k  і k  можна застосовувати графічні методи.  Якщо
                 1    2
крива  очищення  очевидно  не  є кривою першого порядку,  потрібно
використовувати більш складні моделі (див.  посилання у Додатку 3)
і звернутись за допомогою до спеціаліста з біостатистики.

2.2. ПОЯСНЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

Результати потрібно пояснювати, з обережністю за концентрації досліджуваних речовин, що наближаються до межі виявлення аналітичного методу.

Точно визначені криві поглинання і продуктів виведення є показником хорошої якості даних про накопичення. Коливання сталих поглинання/очищення між двома дослідними концентраціями не повинні перевищувати 20%. Виявлені значні відхилення у швидкості поглинання/очищення між двома дослідними концентраціями повинні фіксуватися із зазначенням можливих пояснень. Загалом, довірча межа BCFs добре спланованого дослідження дорівнює приблизно +- 20%.

3. ЗВІТНІСТЬ

Звіт про дослідження повинен містити наступну інформацію:

3.1. ДОСЛІДНА РЕЧОВИНА:

- фізична природа і, за необхідності, фізико-хімічні властивості;

- дані про хімічну ідентифікацію (включаючи, за наявності, вміст органічного вуглецю);

- якщо речовина мічена радіоактивними ізотопами, точне розміщення мічених атомів і відсоток радіоактивності, пов'язаної із забрудненням.

3.2. ДОСЛІДНІ ВИДИ:

- наукова назва, вид, джерело, будь-який вид попередньої обробки, адаптація, вік, градація розмірів тощо.

3.3. УМОВИ ДОСЛІДЖЕННЯ:

- використовувана методика дослідження (наприклад, поточні і напівстатичні режими),

- тип та особливості освітлення та фотоперіод(и),

- планування дослідження (наприклад, кількість і розмір дослідних камер, швидкість заміщення об'єму води, кількість повторних досліджень, кількість риби у дублюючих пробах, кількість дослідних концентрацій, тривалість фаз поглинання та очищення, частота взяття проб риби і води,

- методика підготовки основних розчинів і частота оновлення (розчинний агент, при використанні необхідно зазначати його концентрацію і вплив на вміст органічного вуглецю у дослідній воді),

- номінальні дослідні концентрації, середні значення виміряних величин, і їх стандартне відхилення в дослідних камерах, метод, за допомогою якого визначаються ці дані,

- джерело води для розбавлення, опис будь-якого виду попередньої обробки, результати будь-якого прояву здатності риби до проживання у воді та властивості води: pH, жорсткість, температура, концентрація розчиненого кисню, рівні залишкового хлору (у випадку проведення вимірювань), загальний органічний вуглець, зважені тверді частинки, мінералізація дослідного середовища (за необхідності) та інші виконані вимірювання,

- якість води у дослідних камерах, pH, жорсткість, ЗОВ, температура і концентрація розчиненого кисню,

- детальна інформація про годування (наприклад, вид корму, постачальник, склад - принаймні вміст ліпідів і білків, якщо можливо, кількість корму та частота годування),

- інформація про обробку риби та проб води, включаючи деталі підготовки, зберігання, вилучення і аналітичні методи (і точність) для дослідної речовини і вмісту ліпідів (у випадку проведення вимірювань).

3.4. РЕЗУЛЬТАТИ:

- результати будь-яких проведених раніше досліджень;

- смертність риби в еталонних розчинах та кожній дослідній камері, а також будь-які помічені відхилення поведінки;

- вміст ліпідів у рибі (якщо визначається у процесі дослідження);

- криві (що включають усі виміряні дані), які показують поглинання і очищення дослідних хімікатів у рибі, час досягнення стабільного стану;

- C і C (зі стандартним відхиленням та інтервалами, за f w

необхідності)  під час кожного відбору проби (C , виражене  у мю/g
                                               f
ваги у вологому стані (ppm)  від  ваги  всього  тіла  або  окремих
тканин, наприклад, ліпідів, і C  у мю g/ml (ppm). C  для еталонних
                               w                   w
груп (також потрібно зазначати фонові значення);

- коефіцієнт біологічного накопичення у стабільному стані (BCF ) і/або кінетичний коефіцієнт накопичення (BCF ) та довірчі

ss                                              K
межі  для  констант  швидкості  поглинання та очищення (виведення)
(виражаються відносно маси тіла та загального вмісту ліпідів, якщо
вони  вимірювалися  у  організмах  тварин  або  окремих тканинах),
границі довірчого  інтервалу  і  стандартні  відхилення  і  методи
аналізу    розрахунку/даних   кожної   дослідної   речовини,   яка
використовувалась;

- якщо використовуються речовини, мічені радіоактивними ізотопами, і якщо це необхідно, можуть бути представлені дані про накопичення виявлених метаболітів;

- усі відхилення, помічені під час дослідженні, будь-які відхилення від описаних процедур та інша інформація;

результати "не виявлено за даної межі виявлення" необхідно звести до мінімуму шляхом попередньої розробки методу та експериментального планування, оскільки такі результати не можуть бути використані для розрахунків констант інтенсивності.

4. ДОВІДКОВА ЛІТЕРАТУРА

(1) Connell D.W. (1988) Bioaccumulation behaviour of persistent chemicals with aquatic organisms. Rev. Environ.Contam.Toxicol.102, p. 117-156.

(2) Bintein S., Devillers J. and Karcher W. (1993) Nonlinear dependence of fish bioconcentration on n-octanol/water partition coefficient. SAR and QSAR in Environmental Research, 1, p. 29-390.

(3) OECD, Paris (1996) Direct Phototransformation of chemicals in water. Environmental Health and Safety Guidance Document Series on Testing and Assessment of Chemicals. No 3.

(4) Kristensen P. (1991) Bioconcentration in fish: Comparison of bioconcentration factors derived from OECD and ASTM testing methods;influence of particulate organic matter to the bioavailability of chemicals. Water Quality Institute, Denmark.

(5) US EPA 822-R-94-002 (1994) Great Lake Water Quality Initiative Technical Support Document for the Procedure to Determine Bioaccumulation Factors. July 1994.

(6) US FDA, (Food and Drug Administration) Revision. Pesticide analytical manual, 1, 5600 Fisher's Lane, Rockville, MD 20852, July 1975.

(7) US EPA (1974). Section 5, A(1) Analysis of Human or Animal Adipose Tissue, in Analysis of Pesticide Residues in Human and Environmental Samples, Thompson J.F.(ed.) Research Triangle Park , N. C. 27711.

(8) Compaan H. (1980) in С The determination of the possible effects of chemicals and wastes on the aquatic environment: degradation, toxicity, bioaccumulation ТCh.2.3, Part II. Government Publishing Office, The Hague, The Netherlands.

(9) Gardner et al, (1995) Limn. & Oceanogr. 30, p. 1099-1105.

(10) Randall R.C., Lee H., Ozretich R.J., Lake J.L. and Pruell R.J. (1991). Evaluation of selected lipid methods for normalising pollutant bioaccumulation. Envir. Toxicol. Chem. 10, p. 1431-1436.

(11) CEC, Bioconcentration of chemical substances in fish:the flow-through method-Ring Test Programme, 1984 to 1985. Final report March 1987. Authors: P.Kristensen and N.Nyholm.

(12) ASTM E-1022-84 (Reapproved 1988) Standard Practice for conducting Bioconcentration Tests with Fishes and Saltwater Bivalve Molluscs.

Додаток 1

Хімічні характеристики прийнятної води для розбавлення

------------------------------------------------------------------
|  |                  Речовина                   |Граничний вміст|
|--+---------------------------------------------+---------------|
|1 |Тверді частки                                |     5 мг/л    |
|--+---------------------------------------------+---------------|
|2 |Загальний вміст органічного вуглецю          |     2 мг/л    |
|--+---------------------------------------------+---------------|
|3 |Неіонізований аміак                          |   1 мю г/л    |
|--+---------------------------------------------+---------------|
|4 |Залишковий хлор                              |  10 мю г/л    |
|--+---------------------------------------------+---------------|
|5 |Загальний вміст фосфорорганічних пестицидів  |    50 нг/л    |
|--+---------------------------------------------+---------------|
|6 |Загальний вміст хлорорганічних пестицидів та |    50 нг/л    |
|  |поліхлорованих біфенілів                     |               |
|--+---------------------------------------------+---------------|
|7 |Загальний вміст органічного хлору            |    25 нг/л    |
|--+---------------------------------------------+---------------|
|8 |Алюміній                                     |   1 мю г/л    |
|--+---------------------------------------------+---------------|
|9 |Арсеній                                      |   1 мю г/л    |
|--+---------------------------------------------+---------------|
|10|Хром                                         |   1 мю г/л    |
|--+---------------------------------------------+---------------|
|11|Кобальт                                      |   1 мю г/л    |
|--+---------------------------------------------+---------------|
|12|Мідь                                         |   1 мю г/л    |
|--+---------------------------------------------+---------------|
|13|Залізо                                       |   1 мю г/л    |
|--+---------------------------------------------+---------------|
|14|Свинець                                      |   1 мю г/л    |
|--+---------------------------------------------+---------------|
|15|Нікель                                       |   1 мю г/л    |
|--+---------------------------------------------+---------------|
|16|Цинк                                         |   1 мю г/л    |
|--+---------------------------------------------+---------------|
|17|Кадмій                                       |   100 нг/л    |
|--+---------------------------------------------+---------------|
|18|Меркурій                                     |   100 нг/л    |
|--+---------------------------------------------+---------------|
|19|Срібло                                       |   100 нг/л    |
------------------------------------------------------------------

Додаток 2

Види риб, рекомендовані для проведення перевірки

------------------------------------------------------------------
| | Рекомендовані види |   Рекомендований   |    Рекомендована   |
| |                    |інтервал температури|  загальна довжина  |
| |                    |   для проведення   |піддослідної тварини|
| |                    |    перевірки (С)   |                    |
|-+--------------------+--------------------+--------------------|
|1|Danio rerio(1)      |        20-25       |                    |
| |(Костисті, Коропові)|                    |                    |
| |(Hamilton-Buchanan) |                    |                    |
| |Риба-зебра          |                    |                    |
|-+--------------------+--------------------+--------------------|
|2|Pimephales promelas |        20-25       |                    |
| |(Костисті, Коропові)|                    |                    |
| |(Rafinesque)        |                    |                    |
| |Чорний товстоголов  |                    |                    |
|-+--------------------+--------------------+--------------------|
|3|Cyprinus carpio     |        20-25       |                    |
| |(Костисті, Коропові)|                    |                    |
| |Короп звичайний     |                    |                    |
|-+--------------------+--------------------+--------------------|
|4|Oryzias latipes     |        20-25       |                    |
| |(Костисті,          |                    |                    |
| |Пецилієві)          |                    |                    |
| |(Temminck and       |                    |                    |
| |Schlegel)           |                    |                    |
| |Рисова риба         |                    |                    |
|-+--------------------+--------------------+--------------------|
|5|Poecilia reticulata |        20-25       |                    |
| |(Костисті,          |                    |                    |
| |Пецилієві) (Peters) |                    |                    |
| |Гуппі               |                    |                    |
|-+--------------------+--------------------+--------------------|
|6|Lepomis macrochirus |        20-25       |                    |
| |(Костисті,          |                    |                    |
| |Центрархові)        |                    |                    |
| |(Rafinesque)        |                    |                    |
| |Сонячна риба        |                    |                    |
|-+--------------------+--------------------+--------------------|
|7|Oncorhynchus mykiss |        13-17       |                    |
| |(Костисті, Лососеві)|                    |                    |
| |(Walbaum)           |                    |                    |
| |Радужна форель      |                    |                    |
|-+--------------------+--------------------+--------------------|
|8|Gasterosteus        |        18-20       |                    |
| |aculeatus (Костисті,|                    |                    |
| |Колючкові)          |                    |                    |
| |(Linnaeus) Звичайна |                    |                    |
| |трьохголкова колючка|                    |                    |
|----------------------------------------------------------------|
|  (1) Meyer A., Orti G. (1993) Proc. Royal Society of London,   |
|      Series B., Vol. 252, p. 231.                              |
------------------------------------------------------------------

В різних країнах використовувались різні види морських та естуарних риб, серед яких:

Плямистий горбиль                 Leiostomus xanthurus

Ципринодон варіативний            Cyprinodon variegatus

Менідія срібляста                 Menidia beryllina

Шайнер                            Cymatogaster aggregata

Морський язик                     Parophrys vetulus

Бичок-рогач                       Leptocottus armatus

Звичайна трьохголкова колючка     Gasterosteus aculeatus

Морський окунь                    Dicentracus labrax

Верховодка                        Alburnus alburnus

Збір

Прісноводні види риб, перелічені у таблиці вище, легко вирощуються, а також є загальнодоступними впродовж року, в той час як розповсюдженість морських та естуарних видів обмежується певними країнами. Їх можна вирощувати у рибних фермах та лабораторіях, в умовах з контрольованим рівнем паразитів та збудників хвороб - тоді дослідна тварина буде здоровою і мати визначене походження. Ці види риб є доступними у багатьох частинах світу.

Додаток 3

Прогнозування тривалості фаз поглинання та очищення

1. Прогнозування тривалості фази поглинання

Перед виконанням дослідження попереднє значення k , а отже і 2

певний  відсоток  від часу,  потрібного для досягнення стабільного
стану,  можна  отримати  з  емпіричних   відношень   між   k    та
                                                            2
коефіцієнтом  розподілення  н-октанолу  у  воді  (Р  )  або  k  та
                                                   ow         2
значенням розчинності у воді (s).

-1
     Попереднє значення  k   (день  )  можна отримати з наступного
                          2
емпіричного відношення (1):

2
 log  k  = 0,414 log  (P  ) + 1,47 (r  = 0,95)        (рівняння 1)
    10 2            10  ow

Для ознайомлення з іншими співвідношеннями див. Довідкова література (2)

У випадку, коли коефіцієнт розподілення (Р ) невідомий, ow

попереднє значення  можна  вирахувати  за  показником  розчинності
речовини у воді:

2
 log  (P  ) = 0,862 log  (s) + 0,710 (r  = 0,994)     (рівняння 2)
    10  ow             10

де

s = розчинність (моль/л) : (n=36)

Дане відношення застосовується лише за умови, що значення log P знаходиться між 2 та 6,5 (4).

Час, необхідний для досягнення певного відсотку стабільного стану, можна вирахувати шляхом застосування попереднього значення k , отриманого із загального кінетичного рівняння, яке описує 2

поглинання та очищення (кінетика першого порядку):

dC
                       f
                     ---- = k  · C  - k  · C
                      dt     1    w    2    f

або якщо Сw є сталою:

k              - k t
                         1                2
                   C  = ---- · C  (1 - e     )        (рівняння 3)
                    f    k      w
                          2

Якщо значення   стабільного   стану   є   наближеним   (t  ->
нескінченність), рівняння 3 можна спростити (5) (6) до:

k
                  1
           C  = ---- · C  or C /C  = k /k  = BCF
            f    k      w     f  w    1  2
                  2

Тоді k /k ( C приблизно дорівнюватиме концентрації в рибі у 1 2 w

"стабільному стані". (C   )
                       f,s

Рівняння 3 можна перетворити у:

- k t      C          - k t
                        2        f            2
       C  = C   (1 - e    ) or ----- = 1 - e          (рівняння 4)
        f    fs                 C
                                 fs

Рівняння 4 дозволяє передбачити час, необхідний для досягнення певного відсотку стабільного стану, в той час як величина k попередньо підраховується за рівнянням 1 або 2. 2

Орієнтовно, оптимальна тривалість фази поглинання для отримання статистично прийнятних даних (BCF ) дорівнює часові, K

протягом якого крива логарифму концентрації дослідної  речовини  у
рибі, викладена в залежності від лінійного часу, досягає середини,
або 1,6/k ,  або 80%  стабільного стану, але не більше, ніж 3,0/k
         2                                                       2
або 95% стабільного стану.

Час досягнення 80% стабільного стану дорівнює (рівняння 4):

- k t
                    2 80          1,6
     0,80 = 1 - e        or t   = ----                (рівняння 5)
                             80    k
                                    2

Аналогічно, 95 відсотків стабільного стану дорівнює:

3,0
                      t   = ----                      (рівняння 6)
                       95    k
                              2

Наприклад, тривалість фази поглинання (up) для дослідної речовини з log P = 4 становитиме (використовуючи рівняння 1, 5, ow

6):

-1
     log  k  = - 0,414.(4) + 1,47 k  = 0,652 днів
        10 2                       2

up (80%) = 1,6/0,652, тобто, 2,45 днів (59 годин)

або up (95%) = 3,0/0,652, тобто, 4,60 днів (110 годин)

-5 Аналогічно, для дослідної речовини з s = 10 моль/л (log(s)= - 5,0), тривалість максимуму становитиме (використовуючи рівняння 1, 2, 5, 6):

log (P ) = 0,862 (-5,0) + 0,710 = 5,02 10 ow

log K = 0,414 (5,02) + 1,47 10 2

-1 k = 0,246 днів 2

up (80%) = 1,6/0,246, тобто, 6,5 днів (156 годин)

або up (95%) = 3,0/0,246, тобто, 12,2 днів (293 годин)

В якості альтернативи, для підрахування часу досягнення ефективного стабільного стану (4) може використовуватись рівняння:

3 t = 6,54 x 10 P + 55,31 (hours) eq ow

2. Прогнозування тривалості фази очищення

Прогнозування часу, необхідного для зменшення вмісту шкідливих речовин у тілі риб до певного відсотку від початкової концентрації, може виконуватись за допомогою загального рівняння, що описує абсорбцію та очищення (кінетика першого порядку) (1) (8).

Для фази очищення значення C прирівнюється до нуля. Рівняння w

можна спростити:

dC - k t f 2

----- = - k C  or C  = C    · e
                 dt       2 f     f    f,o

де С , o це концентрація на початку фази очищення. Тоді 50% f

очищення буде досягнуто протягом часу (t  ):
                                        50

C - k t f 1 2 50 0,693

------ = --- = e        or t   = -----
               C        2                 50    k
                f,o                              2

Аналогічно, 95% очищення буде досягнуто протягом:

3,0
                           t   = -----
                            95    k
                                   2

Якщо для першого періоду (1,6/k ) необхідно 80% поглинання і 2

90%  виведення  під  час  фази очищення (3,0/k ),  тривалість фази
                                              2
очищення буде приблизно вдвічі більшою, ніж фази поглинання.

Проте, важливо зазначити, що описані підрахунки відштовхуються від припущення, що схеми поглинання та очищення підпорядковуються кінетиці першого порядку. Якщо встановлено, що кінетика першого порядку не справджується, необхідно застосувати більш складні моделі (напр. Дов. (1))

Довідкова література (Додатку 3)

(1) Spacie A. and Hamelink J.L. (1982) Alternative models for describing the bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. and Chem. 1, pp 309-320.

(2) Kristensen P. (1991) Bioconcentration in fish: comparison of BCF's derived from OECD and ASTM testing methods; I nfluence of particulate matter to the bioavailability of chemicals. Danish Water Quality Institute.

(3) Chiou C.T. and Schmedding D.W. (1982) Partitioning of organic compounds in octanol-water systems. Environ. Sci. Technol. 16 (1), pp 4-10.

(4) Hawker D.W. and Connell D.W. (1988) Influence of partition coefficient of lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish. Wat. Res. 22 (6), pp 701-707.

(5) Branson D.R., Blau G.E., Alexander H.C. and Neely W.B. (1975) Transactions of the American Fisheries Society, 104 (4), pp 785-792.

(6) Ernst W. (1985) Accumulation in Aquatic organisms. In: Appraisal of tests to predict the environmental behaviour of chemicals. Ed. by Sheehman P., Korte F., Klein W. and Bourdeau P.H. Part 4.4 pp 243-255. SCOPE, 1985, John Wiley & Sons Ltd. N.Y.

(7) Reilly P.M., Bajramovic R., Blau G.E., Branson D.R. and Sauerhoff M.W. (1977) Guidelines for the optimal design of experiments to estimate parameters in first order kinetic models, Can. J. Chem. Eng. 55, pp 614-622.

(8) Kоnemann H. and Van Leeuwen K. (1980) Toxicokinetics in fish: Accumulation and Elimination of six Chlorobenzenes by Guppies. Chemosphere, 9, pp 3-19.

Додаток 4

Теоретичний приклад графіку відбору проб для дослідження біологічного накопичення речовин з log P = 4 ow

------------------------------------------------------------------
|Відбір проб |   Графік відбору проб   | Кількість  | Кількість  |
|    риби    |-------------------------| проб води  |   риби,    |
|            | Мінімальна |  Додаткові |            | відібрана  |
|            |  частота   |    проби   |            | для проби  |
|            |   (дні)    |            |            |            |
|------------+------------+------------+------------+------------|
|    Фаза    |     -1     |            |     2(*)   |Додайте     |
| поглинання |      0     |            |      2     |45-80 рибин |
|------------+------------+------------+------------+------------|
|    1-ша    |    0,3     |    0,4     |      2     |      4     |
|            |            |            |     (2)    |     (4)    |
|------------+------------+------------+------------+------------|
|    2-га    |    0,6     |    0,9     |      2     |      4     |
|            |            |            |     (2)    |     (4)    |
|------------+------------+------------+------------+------------|
|    3-тя    |    1,2     |    1,7     |      2     |      4     |
|            |            |            |     (2)    |     (4)    |
|------------+------------+------------+------------+------------|
|    4-та    |    2,4     |    3,3     |      2     |      4     |
|            |            |            |     (2)    |     (4)    |
|------------+------------+------------+------------+------------|
|    5-та    |    4,7     |            |      2     |      6     |
|------------+------------+------------+------------+------------|
|    Фаза    |            |            |            |Перемістіть |
|  очищення  |            |            |            |рибу у воду,|
|            |            |            |            |що не       |
|            |            |            |            |містить     |
|            |            |            |            |дослідної   |
|            |            |            |            |сполуки     |
|------------+------------+------------+------------+------------|
|    6-та    |    5,0     |    5,3     |            |      4     |
|            |            |            |            |     (4)    |
|------------+------------+------------+------------+------------|
|    7-ма    |    5,9     |    7,0     |            |      4     |
|            |            |            |            |     (4)    |
|------------+------------+------------+------------+------------|
|    8-ма    |    9,3     |    11,2    |            |      4     |
|            |            |            |            |     (4)    |
|------------+------------+------------+------------+------------|
|    9-та    |    14,0    |    17,5    |            |      6     |
|            |            |            |            |     (4)    |
|----------------------------------------------------------------|
|(*) Вода для проби береться після проходження щонайменше        |
|3 камер.                                                        |
|Значення в дужках означають кількість зразків (води, риби), яку |
|необхідно взяти для додаткової проби.                           |
|Примітка: попереднє значення k  для log P   = 4,0 становить     |
|                               2          ow                    |
|          -1                                                    |
|0,652 днів  . Загальна тривалість експерименту                  |
|дорівнюватиме 3 x up = 3 x 4,6 днів, тобто 14 днів. Для         |
|підрахунку значення "up" див. Додаток 3.                        |
------------------------------------------------------------------

Додаток 5

Визначення моделі

Вважається, що більшість даних про біологічне накопичення описується з "достатньою" точністю за допомогою простої моделі з двома компонентами/двома параметрами, на що вказує пряма, що наближається до точок концентрації в рибі під час фази очищення, які наносяться на напівлогарифмічний папір. (У випадках, коли ці точки не можна описати за допомогою прямої, необхідно застосовувати більш складні моделі, див., наприклад, Spacie та Hamelink, Дов. 1 до Додатку 3).

Графічний метод визначення константи інтенсивності очищення (виведення) k 2

Нанесіть на напівлогарифмічному папері концентрацію дослідної речовини у кожній пробі риби в залежності від часу відбору проби. Нахил отриманої кривої дорівнюватиме k . 2

ln (C  /C  )
                                  f1  f2
                        k  = -------------

2 t - t 2 1

( 994_b14 )

Зауважте, що відхилення від прямолінійного графіка можуть вказувати на більш складну схему очищення, ніж та, що підпадає під кінетику першого порядку. Графічний метод може застосовуватись для опису типів очищення, що відхиляються від кінетики першого порядку.

Графічний метод для визначення константи інтенсивності поглинання k 1

Отримавши значення k , підрахуйте k наступним чином: 2 1

C k
                         f 2
               k  = ----------------                  (рівняння 1)
                1              -k t
                                 2
                    C  x (1 - e    )
                     w

Значення C отримується з середньої точки згладженої кривої f

поглинання,  побудованої  на   основі   даних   шляхом   нанесення
логарифмічного  вираження  концентрації  в залежності від часу (на
арифметичній шкалі).

Комп'ютерний метод підрахунку констант інтенсивності
                поглинання та очищення (виведення)

Найкращим способом визначення коефіцієнту біологічного накопичення, а також констант інтенсивності k та k є 1 2

використання нелінійних методів оцінки параметрів  на  комп'ютері.
Програми  знаходять  значення k  та k  після введення набору даних
                               1     2
про концентрацію впродовж часової послідовності та задання моделі:

k           -k t
                    1            2
         C  = C  · --- x (1 - e    ) 0 < t < t        (рівняння 2)
          f    w   k                          c
                    2

k       -k (t - t )   -k t
                    1        2      c      2
         C  = C  · --- x (e           - e    ) t > t  (рівняння 3)
          f    w   k                                c
                    2

де t  = час в кінці фази поглинання.
         c

Даний підхід дозволяє отримати стандартні значення відхилення k та k . 1 2

Оскільки значення k , у більшості випадків можна отримати з 2

кривої очищення з відносно високою  точністю,  та  оскільки  існує
стійка   взаємозалежність   між  значеннями  k   та  k ,  якщо  їх
                                              1       2
підраховувати одночасно, рекомендується спочатку підрахувати k  за
                                                              2
даними  про  очищення,  а  потім  -  k   за даними про поглинання,
                                      2
використовуючи нелінійну регресію.

С.14. ДОСЛІДЖЕННЯ РОСТУ МАЛЬКА

1. МЕТОД

Даний метод дослідження впливу токсичності на ріст є ідентичним методу OECD TG 215 (2000).

1.1. ВСТУП

Даний метод дослідження було розроблено з метою оцінки наслідків продовженого контакту з хімічними елементами для росту малька. Він ґрунтується на методі, розробленому та перевіреному (1)(2) в Європейському Союзі, для оцінки впливу хімічних елементів на ріст райдужної форелі (Oncorynchus mykiss) в проточному режимі. Допускається використання інших видів риби, за умови наявності документально підтвердженого досвіду використання останніх. Наприклад, існує досвід застосування у дослідженнях впливу на ріст малька даніо (Danio rerio)(1) (3)(4) та рисової риби (медака, Oryzias latipes) (5)(6)(7).

----------------

(1) Meyer, A., Bierman, C.H. and Orti, G. (1993). The phylogenetic position of the zebrafish (Danio rerio), a model system in developmental biology: an invitation to the comparative method. Proc. R. Soc. Lond. B. 252, 231-236.

Див. також Загальний вступ, Частина С.

1.2. ОЗНАЧЕННЯ

Найнижча спостережена ефективна концентрація (НСЕК): найнижча концентрація дослідної речовини, при якій спостерігається значний ефект (на рівні p < 0,05) у порівнянні з контролем. Проте всі тестові концентрації, які є вищими за НСЕК, повинні мати шкідливий вплив, що дорівнює або вищий за той, який спостерігається при НСЕК.

Концентрація, що не призводить до видимих ефектів (КНВЕ): концентрація дослідної речовини, що безпосередньо нижча НСЕК.

EC : у даному методі дослідження є концентрацією дослідної x

сполуки,   що   спричинює  відхилення  х%  швидкості  росту  риби,
порівняно з контролями.

Інтенсивність завантаження: сира вага риби на одиницю об'єму води.

Густина завантаження: кількість риби на одиницю об'єму води.

Питомий темп росту особини: відображає темп росту однієї особини відносно її початкової ваги.

Середній питомий темп росту по акваріуму: відображає середній темп росту акваріумної популяції за однієї концентрації.

Псевдо питомий темп росту: виражає ріст окремої особини у порівнянні з початковою середньою вагою акваріумної популяції.

1.3. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕНЯ

Після зважування мальок риби, що знаходиться у фазі експоненціального росту, поміщується у дослідні камери і піддається дії ряду сублетальних концентрацій дослідної речовини, розчиненої у воді, бажано, в проточному режимі або, якщо це неможливо, у відповідному напівстатичному (статично-відновному) режимі. Тривалість дослідження становить 28 днів. Риба годується щоденно. Раціон риби залежить від початкової ваги і може повторно розраховуватись після 14 днів. Після закінчення дослідження риба зважується повторно. Наслідки для темпів росту аналізуються з використанням регресійної моделі з метою підрахунку концентрації, яка спричинює відхилення темпу росту х%, тобто, EC (напр. EC , x 10 EC або EC ). Як варіант, дані можна зіставити з контрольними 20 30

величинами для того, щоб визначити найнижчу спостережену ефективну
концентрацію (НСЕК) та звідси,  концентрацію,  що не призводить до
видимих ефектів (КНВЕ).

1.4. ІНФОРМАЦІЯ ПРО ДОСЛІДНУ РЕЧОВИНУ

Результати дослідження гострого токсичного впливу (див. Метод Дослідження С.1.), бажано, виконаний із застосуванням того ж виду риби, що використовується у даному дослідженні, повинні бути в наявності. Це означає наявність даних про розчинність у воді та тиск пари дослідної сполуки, а також надійного аналітичного методу для кількісного визначення речовини у дослідних розчинах з відомою та задокументованою точністю та межею визначення.

Корисна інформація включає структурну формулу, чистоту речовини, стійкість до дії води та світла, pK , P та результати a ow

дослідження на повний біологічний розпад.

1.5. ВІРОГІДНІСТЬ ДОСЛІДЖЕННЯ

Дослідження вважається вірогідним за дотримання наступних умов:

- смертність в контрольній групі (групах) не повинна перевищувати 10% на кінець дослідження;

- середня вага риби в контрольній групі (групах) повинна збільшитись достатньо для виявлення мінімального відхилення темпу росту, що вважається суттєвим. Кільцева проба (2) показала, що для райдужної форелі збільшення середньої ваги риби в контрольних групах повинна становити половину (50%) їх початкової середньої ваги протягом 28 днів; напр. початкова вага: 1 г/риби (= 100%), кінцева вага після 28 днів: >= 1,5 г/риби (>= 150%);

- протягом дослідження концентрація розчиненого кисню не повинна падати нижче 60% від показника насичення повітрям (ASV)

- температура води у дослідних камерах не повинна відрізнятись більше, ніж на +-1 С у будь-який час протягом дослідження і повинна підтримуватись в межах 2 град.С від інтервалів температури, зазначених для дослідних видів (Додаток 1).

1.6. ОПИС МЕТОДУ

1.6.1. Апаратні засоби

Звичайне лабораторне обладнання та, зокрема, наступне:

- лічильники кисню та рН;

- обладнання для визначення жорсткості та лужності води;

- відповідне обладнання для контролю температури та, бажано, безперервного моніторингу;

- акваріуми, виготовлені з хімічно інертного матеріалу, достатньої ємності для рекомендованої інтенсивності та густини завантаження (див. Розділ 1.8.5 та Додаток 1);

- ваги з відповідною точністю (з точністю до 0,5%).

1.6.2. Вода

У якості води для дослідження може використовуватись будь-яка вода, у якій дослідний вид може тривалий час жити та рости. Вода повинна бути постійної якості впродовж дослідження. Значення рН повинне знаходитись між 6,5 та 8,5, але під час даного дослідження воно не повинне коливатись більше, ніж на +- 0,5 одиниць рН. Рекомендується жорсткість понад 140 мг/л (за CaCO ). З метою 3

уникнення надмірного впливу води  для  розбавлення  на  результати
дослідження  (напр.  через  комплексоутворення  дослідної сполуки)
через певні інтервали необхідно відбирати  проби  для  аналізу.  У
випадку,  якщо  встановлено,  що вода для розбавлення має відносно
постійну якість,  приблизно раз у три  місяці  потрібно  визначати
вміст важких металів (напр.  Cu,  Pb,  Zn,  Hg,  Cd, Ni), основних
аніонів та катіонів (напр.  Ca,  Mg,  Na,  K, Cl, SO ), пестицидів
                                                    4

(напр. загальний вміст органофосфорних та хлорорганічних пестицидів), загальний вміст органічного вуглецю та суспендованих твердих часток. Якщо підтверджено, що якість води залишається постійною впродовж принаймні року, визначення можна проводити рідше (напр. раз у шість місяців). Деякі хімічні характеристики прийнятної води для розбавлення подаються в Додатку 2.

1.6.3. Дослідні розчини

Дослідні розчини з обраними концентраціями готуються шляхом розбавлення основного розчину.

Бажано готувати основний розчин шляхом звичайного перемішування або збовтування дослідної речовини у воді для розбавлення, використовуючи механічні засоби (змішувач або ультразвук). Колонки для насичення (розчинення) можуть використовуватись для отримання відповідної концентрації основного розчину.

У деяких випадках необхідно застосовувати дисперсанти (розчинники) для отримання потрібної концентрації основного розчину. У якості розчинників можуть використовуватись ацетон, етанол, метанол, диметилсульфоксид, диметилформамід та триетиленгліколь. У якості дисперсантів можуть застосовуватись Cremophor RH40, Tween 80, метилцелюлоза 0,01% та HCO-40. Речовини, що мають здатність до повного біологічного розпаду (напр. ацетон) та/або леткі сполуки повинні використовуватись з обережністю, оскільки можуть спричиняти проблеми під час досліджень у проточному режимі, пов'язані з ростом бактерій. Використання розчинника не повинне суттєво впливати на ріст риби або мати помітні негативні наслідки для малька відповідно до показників контрольного розчину, що містить лише розчинник.

Для випробувань у напівстатичному режимі (режимі оновлення), частота оновлення води залежатиме від стабільності дослідної речовини, проте, рекомендується здійснювати його щоденно. Якщо попередні випробування стабільності (див. Розділ 1.4) свідчать про те, що концентрація випробувальної субстанції є нестійкою (тобто за межами 80-120% від номінальної або нижче 80% від виміряної початкової концентрації) протягом періоду оновлення, доцільно розглянути можливість застосування проточного режиму.

1.6.4. Підбір видів риби

Для даного дослідження рекомендується використовувати райдужну форель (Oncorhynchus mykiss), оскільки найчастіше у кільцевих дослідження використовувався саме цей вид риби (1)(2). Допускається використання інших видів риби, за умови наявності документально підтвердженого досвіду використання останніх. Наприклад, існує досвід застосування даніо (Danio rerio) (3)(4) та рисової риби (медака, Oryzias latipes) (5)(6)(7). У такому випадку обґрунтування підбору виду риб та експериментального методу повинне подаватись у звіті.

1.6.5. Утримання риби

Риба для дослідження відбирається з популяції одного косяку, бажано, одного нересту і утримується протягом принаймні двох тижнів до початку дослідження у воді та освітленні, ідентичних дослідним. Раціон риби повинен складати мінімум 2% від ваги тіла, але бажано, щоб він складав 4% від ваги тіла на день впродовж попереднього утримання та дослідження.

Після 48-годинного періоду адаптації фіксується смертність і застосовуються наступні критерії:

- смертність перевищує 10% популяції протягом семи днів: група не приймається;

- смертність нижче 5% популяції протягом семи днів: група приймається.

Риба не повинна отримувати ліки від хвороб за два тижні до дослідження та протягом дослідження.

1.7. ПЛАН ДОСЛІДЖЕННЯ

У "плані дослідження" описується вибір кількості та інтервалу концентрацій дослідного розчину, кількість акваріумів з кожною концентрацією та кількість риби у кожному акваріумі. Теоретично, під час затвердження плану дослідження повинні враховуватись:

- мета дослідження;

- метод статистичного аналізу, що використовуватиметься;

- доступність та вартість засобів, необхідних для дослідження.

Формулювання мети повинне, за можливості, включати статистичну потужність, з якою необхідно визначити даний обсяг відмінності (напр. в темпах росту), або як варіант, точність, з якою необхідно підрахувати EC (напр. при х = 10, 20 або 30, але x

бажано,  не менше 10).  Без цього неможливо чітко встановити обсяг
дослідження.

Важливо усвідомити, що оптимальний план дослідження (той, який дозволяє оптимально використовувати засоби) для одного методу статистичного аналізу, не завжди є оптимальним для іншого. Таким чином, для визначення НСЕК/КНВЕ рекомендується відмінний план від того, що рекомендується для аналізу за регресією.

У більшості випадків перевага надається використанню аналізу за регресією, в порівнянні з дисперсійним аналізом, через причини, описані Stephan та Rogers (8). Проте, якщо не було підібрано 2

відповідної моделі регресії (r  < 0,9),  необхідно використовувати
значення КНВЕ/НСЕК.

1.7.1. План для аналізу за регресією

У плані дослідження, що аналізуватиметься за регресією, важливо врахувати наступні пункти:

- Дослідні концентрації розчинів повинні обов'язково включати концентрацію впливу (напр. ЕС ) та діапазон концентрацій, 10, 20, 30

за   яких   вплив   дослідної  речовини  представляє  інтерес  для
дослідження. Підрахунки концентрацій впливу виконуються з найвищою
точністю, якщо значення концентрації впливу знаходиться посередині
діапазону досліджених концентрацій.  Попередній  діапазонний  тест
може допомогти визначити необхідні концентрації для дослідження.

- З метою забезпечення задовільного статистичного моделювання, у дослідженні повинен використовуватись щонайменше один контрольний акваріум та п'ять додаткових акваріумів з різними концентраціями. Поряд з дослідними резервуарами повинен досліджуватись один контрольний акваріум з найвищою перевіреною концентрацією розчинника, якщо останній використовується. (див. Розділи 1.8.3. та 1.8.4.).

- Може використовуватись геометрична або логарифмічна прогресія (9) (див. Додаток 3). Перевага надається інтервалам концентрації на основі логарифмічної прогресії.

- Якщо в наявності є більше, ніж шість акваріумів, концентрація у додаткових резервуарах може або дублювати або розподілятися в межах діапазону концентрацій з метою забезпечення менших інтервалів між концентраціями.

1.7.2. План для визначення КНВЕ/НСЕК за допомогою дисперсійного аналізу (ANOVA)

Бажано, щоб кожне значення концентрації дублювалось у додаткових резервуарах, а статистичний аналіз проводився на рівні резервуару (10). Без додаткових резервуарів неможливо врахувати дисперсію результатів між резервуарами, крім тих, що були спричинені окремими рибинами. Проте, як показав досвід (11), у випадку, що розглядається, дисперсія між резервуарами є несуттєвою, в порівнянні з дисперсією всередині резервуару (тобто, між окремими рибинами).

Зазвичай, використовується щонайменше п'ять дослідних концентрацій у геометричній прогресії, бажано, з фактором, що не перевищує 3,2.

Загалом, під час дослідження з використанням додаткових резервуарів для дублювання, кількість додаткових контрольних резервуарів, а відтак і риби, повинна бути вдвічі більшою, ніж кількість дослідних резервуарів з однаковою концентрацією. (12)(13)(14) І навпаки, за відсутності додаткових резервуарів кількість риби в контрольній групі повинна дорівнювати кількості в кожному резервуарі з певною концентрацією.

Якщо дисперсійний аналіз (ANOVA) здійснюється на рівні резервуару, а не окремих особин (що вимагало б або маркування окремих рибин, або використання показників "псевдо" питомого росту (див. Розділ 2.1.2)), необхідною є достатня кількість резервуарів для дублювання з метою визначення стандартного відхилення у резервуарах в межах однієї концентрації. Це означає, що ступінь свободи для похибки під час дисперсійного аналізу становитиме принаймні 5 (10).

Якщо дублюються контрольні розчини, виникає загроза поширення дисперсії похибки, оскільки її обсяг може збільшуватись разом із середнім значенням темпу зростання, що розглядається. Оскільки вірогідно, що темп зростання зменшуватиметься в міру збільшення концентрації, це призведе до завищеного значення дисперсії.

1.8. ПОРЯДОК ВИКОНАННЯ ДОСЛІДЖЕННЯ

1.8.1. Відбір та зважування риби

На початку дослідження важливо зменшити різницю між вагою рибин. Прийнятні інтервали ваги для різних видів, що рекомендуються до застосування у даному дослідженні, подаються в Додатку 1. Теоретично, вага окремих рибин в межах групи на початку дослідження не повинна відрізнятись від середнього арифметичного значення ваги більше, ніж на (10%, у будь-якому випадку різниця не повинна перевищувати 25%. Рекомендується перед початком дослідження відібрати підгрупу риби для вимірювання середньої ваги.

За 24 години до початку дослідження годування риби припиняється. Потім відбираються довільні зразки риби. Використовуючи загальну анестезію (напр. водний розчин 100 мг/л сульфонату метану (MS 222), нейтралізований шляхом додавання двох частин бікарбонату натрію на одну частину MS 222), необхідно виміряти сиру вагу окремих рибин (після протирання насухо) з точністю, поданою в Додатку 1. Риба, вага якої знаходиться в прийнятних межах, відділяється і потім довільно розподіляється між дослідними ємностями. Фіксується загальна вага риби у кожній дослідній ємності. Використання анестетиків, а також переміщення риби (включаючи протирання та зважування) може спричинити стрес та поранення малька, особливо, дрібних видів. З огляду на це, мальок потрібно переміщувати з надзвичайною обережністю, з метою уникнення стресу та поранень дослідних тварин.

У 28-ий день дослідження риба зважується повторно (див. Розділ 1.8.6). Проте, якщо це необхідно для повторного розрахування раціону, рибу можна зважити у 14-ий день (див. Розділ 1.8.2.3). Інші методи, напр. фотографічний, можуть використовуватись для визначення змін розміру риби і подальшого пристосування раціону.

1.8.2. Умови контакту

1.8.2.1. Тривалість

Тривалість дослідження - не менше, ніж 28 днів.

1.8.2.1. Інтенсивність та густина завантаження

Важливо, щоб інтенсивність та густина завантаження були придатним для видів, що використовуються для дослідження (див. Додаток 1). Якщо густина завантаження є надто високою, надмірне скупчення може призвести до стресу, в результаті якого зменшується темп росту та збільшується можливість захворювань. Надто низька густина завантаження сприяє розвитку територіалізму, що теж може відбитися на темпах росту. У будь-якому випадку густина завантаження повинна дозволяти підтримувати значення ASV на рівні щонайменше 60% без аерації. Кільцеве дослідження (2) показало, що для райдужної форелі прийнятною інтенсивністю завантаження є 16 рибин вагою 3-5 г на 40 літрів об'єму.

1.8.2.3. Годування

Рибу необхідно годувати придатним для неї кормом (Додаток 1) в достатньому обсязі для забезпечення прийнятного темпу росту. Необхідно звернути увагу на запобігання збільшення числа бактерій та мутності води. Для райдужної форелі раціон, що складає 4% від ваги тіла на день, дозволяє відповідати цим умовам (2)(15)(16)(17). Щоденний раціон можна розділити на дві рівні порції, які даватимуться рибі з інтервалом у мінімум 5 годин. Раціон розраховується на основі загальної ваги риби у кожній ємності. Якщо риба зважується після 14 днів дослідження, раціон розраховується повторно. Годування риби припиняється за 24 години до зважування.

Залишки їжі та екскременти повинні щоденно видалятись з дослідних ємностей шляхом обережного очищення дна кожного резервуару за допомогою всисної системи.

1.8.2.4. Світло та температура

Температура води та фотоперіод повинні бути придатними для дослідних видів (Додаток 1).

1.8.3. Дослідні розчини

Зазвичай необхідно п'ять розчинів дослідної сполуки з різними концентраціями, незалежно від плану дослідження (див. Розділ 1.7.2.). Попередні відомості про токсичність дослідної сполуки (отримані, наприклад, з дослідження на гострий токсичний вплив або з діапазонних тестів) повинні допомогти підібрати відповідні дослідні концентрації. Якщо використовуються менше п'яти концентрацій, необхідно надати роз'яснення. Найвища концентрація дослідної сполуки не повинна перевищувати її межу розчинності у воді.

У випадку використання розчинника для підготовки основного розчину, його кінцева концентрація не повинна перевищувати 0,1 мл/л, також бажано, щоб вона була однаковою у всіх дослідних ємностях (див. Розділ 1.6.3). Проте, потрібно намагатись уникати використання таких речовин.

1.8.4. Контролі

Кількість контролів води для розбавлення залежить від плану дослідження (див. Розділи 1.7-1.7.2). Якщо використовується розчинник, необхідно включити кількість контролів розчинника, що дорівнює кількості контролів води для розбавлення.

1.8.5. Частота аналітичних визначень та вимірювань

Під час досліджень у проточному режимі значення інтенсивності потоку розбавляча та основного розчину токсинів повинні перевірятись через певні інтервали, бажано щоденно, і не повинні коливатись більше, ніж на 10% протягом дослідження. У випадках, коли передбачається, що концентрація дослідної сполуки не відрізнятиметься від номінальних величин більше, ніж на +- 20% (тобто в межах 80-120%; див Розділи 1.6.2 та 1.6.3) рекомендується аналізувати принаймні найвищі та найнижчі концентрації на початку дослідження та щотижня протягом дослідження. Якщо очікується, що коливання концентрації дослідної речовини перевищуватиме +- 20% від номінальної (на основі даних про стабільність дослідної речовини), необхідно аналізувати всі дослідні концентрації, дотримуючись аналогічного режиму.

Під час досліджень у напівстатичному режимі (режимі оновлення), якщо відомо, що концентрація дослідної сполуки не відрізнятиметься від номінальних величин більше, ніж на 20%, рекомендується аналізувати принаймні найвищі та найнижчі концентрації одразу після приготування та перед оновленням води на початку дослідження, а також щонеділі під час дослідження. Якщо очікується, що коливання концентрації дослідної речовини перевищуватиме +- 20% від номінальної, необхідно аналізувати всі дослідні концентрації, дотримуючись такого ж режиму, як і для більш стійких сполук.

Рекомендується розраховувати результати на основі концентрацій, отриманих після вимірювання. Проте, якщо є переконливі свідчення того, що протягом дослідження концентрація дослідної речовини в розчині підтримувалась в межах +- 20% від номінального значення або отриманого після початкового вимірювання, результат дозволяється розраховувати, відштовхуючись від номінальних або початкових величин.

Може виникнути необхідність пропустити проби через фільтр (напр. з діаметром пори 0,45 мю м) або центрифугу. Перевага надається центрифугуванню. Проте, якщо дослідна речовина не поглинається фільтрами, їх використання також допускається.

Під час дослідження у всіх ємностях необхідно вимірювати значення розчиненого кисню, рН та температури. Загальну жорсткість та, якщо потрібно, солоність води необхідно вимірювати у контрольних розчинах та в ємності з найвищою концентрацією. Вміст розчиненого кисню та солоність, якщо потрібно, необхідно вимірювати щонайменше тричі (на початку, приблизно в середині та в кінці дослідження). Під час досліджень в напівстатичному режимі рекомендується частіше вимірювати кількість розчиненого кисню, бажано, до та після оновлення води або принаймні щотижня. Рівень рН потрібно вимірювати на початку та в кінці кожного оновлення води під час досліджень у режимі статичного оновлення, та щонайменше щотижня для досліджень у проточному режимі. Жорсткість та лужність вимірюється один раз протягом дослідження. Бажано безперервно контролювати температуру принаймні у одній дослідній ємності.

1.8.6. Спостереження

Вага: в кінці дослідження вимірюється сира вага (після протирання насухо) всієї риби, що вижила, або дослідними групами, або окремо кожної рибини. Перевага надається зважуванню за дослідними групами, оскільки зважування окремих особин вимагає маркування риби. У випадку, якщо вимірювання ваги окремих особин потрібне для визначення питомого темпу росту, методика маркування не повинна бути стресогенною для риби (придатними можуть бути альтернативи маркуванню за допомогою замороження, напр. використання кольорової риболовної волосіні).

Щодня протягом дослідження рибу необхідно перевіряти на наявність будь-яких відхилень у зовнішньому вигляді (таких як кровотеча або втрата кольору) та поведінці. Смерть риби повинна фіксуватись, а мертва риба якомога швидше видалятись з резервуару. Не потрібно завантажувати рибу замість померлої, оскільки інтенсивність та густина завантаження дозволяють уникати впливу зміни кількості риби у резервуарі на темп росту. Проте кількість корму повинна бути відповідно змінена.

2. ДАНІ ТА ЗВІТУВАННЯ

2.1. ОБРОБКА РЕЗУЛЬТАТІВ

Рекомендується участь фахівця зі статистики у плануванні та аналізі дослідження, оскільки даний метод допускає суттєві варіювання плану дослідження, наприклад, кількості дослідних камер, дослідних концентрацій, риби тощо. З огляду на велику кількість можливих варіантів плану дослідження, конкретні вказівки щодо порядку статистичної обробки тут не подаються.

Темпи росту не враховуються для дослідних ємностей, у яких смертність перевищила 10%. Проте, рівень смертності повинен фіксуватись для усіх дослідних концентрацій.

Незалежно від методу, що використовується для аналізу даних, основним поняттям є питомий темп росту r між часом t і t . Його 1 2

можна визначити багатьма способами, залежно від того, чи була риба
промаркована і чи потрібні дані про питомий ріст по акваріуму.

log w  - log  w
             e 2      e  1
     r  = ---------------- x 100
      1      t  - t
              2    1

log w  - log  w
             e 2      e  1
     r  = ---------------- x 100
      2      t  - t
              2    1

log w  - log  w
             e 2      e  1
     r  = ---------------- x 100
      3      t  - t
              2    1

де:

r = питомий темп росту особини

r = питомий темп росту по акваріуму

r = "псевдо" питомий темп росту

w , w = значення ваги окремої риби у час t та t відповідно

1   2                                     1     2

loge w = логарифм ваги окремої риби на початку періоду 1

дослідження

loge w = логарифм ваги окремої риби в кінці періоду 2

дослідження

loge w = середнє значення логарифмів w для риби в акваріумі 1 1

на початку періоду дослідження

loge w = середнє значення логарифмів w для риби в акваріумі 2 2

в кінці періоду дослідження

t , t = час (дні) на початку та в кінці періоду дослідження

1 2

значення r , r , r можна підрахувати за період з нульового 1 2 3

по 28-ий день та якщо потрібно (напр. коли вимірювання проводились
у 14-ий день) за періоди з  нульового  по  14-ий  та  з  14-го  по
28-ий дні.

2.1.1. Аналіз результатів за регресією (моделювання реакції на концентрацію)

У цьому методі аналізу встановлюються відповідні математичні співвідношення між питомим темпом росту та концентрацією, що дозволяє підрахувати "EC ", тобто будь-яке значення ЕС. За x

використання цього методу не потрібно підраховувати значення r для
окремих особин (r ),  натомість  аналіз  базується  на  середньому
                 1
значенні  питомого  темпу  збільшення  ваги  по  акваріуму r (r ).
                                                               2
Даному методу надається перевага.  Він також краще  підходить  для
дрібних видів риби.

Темпи середнього питомого росту по акваріуму (r ) потрібно 2

графічно   нанести   в   залежності   від  концентрації,  з  метою
дослідження залежності між концентрацією та реакцією.

Для вираження залежності між r та концентрацією необхідно 2

підібрати належну модель та обґрунтувати вибір.

Якщо кількість риби, що вижила у кожному акваріумі відрізняється, під час підбору моделі, незалежно від того чи є вона простою чи нелінійною, необхідно задавати вагові коефіцієнти для врахування різних розмірів груп.

Метод підбору моделі повинен давати змогу підрахувати, наприклад, значення ЕС та його дисперсію (стандартну похибку або 20

довірчий інтервал).  На основі  даних  необхідно  створити  графік
підібраної  моделі  таким  чином,  щоб була видною її адекватність
(8)(18)(19)(20).

2.1.2. Аналіз результатів визначення НСЕК

У випадку, якщо дослідження передбачало дублювання резервуарів з усіма концентраціями, визначення НСЕК може проводитись на основі аналізу дисперсії (ANOVA) середнього питомого темпу росту по акваріуму (див. Розділ 2.1), який супроводжується відповідним аналітичним методом (напр. тест Дюннета або Вільямса (12)(13)(14)(21)), що полягає у порівнянні середнього значення r для кожної концентрації із середнім значенням r для контролів, з метою визначення найнижчої концентрації, за якої між цими значеннями спостерігається суттєва різниця, за рівня ймовірності 0,05. Якщо для параметричних методів не виконуються потрібні припущення - розподілення відрізняється від нормального (напр. тест Шапіро-Вілка) або неоднорідна дисперсія (тест Барлета), доцільно звести дані до однорідних дисперсій перед виконанням дисперсійного аналізу, або ввести коефіцієнти ваги.

Якщо ж у дослідженні не використовувались дублюючі резервуари кожної концентрації, аналіз дисперсії за резервуарами буде нечутливим або неможливим. У такій ситуації допустимим рішенням є побудувати аналіз дисперсії на інтенсивності псевдо-питомого росту r для кожної особини. 3

Тоді середнє значення r можна порівняти із середнім r 3 3 контролів. НСЕК можна визначити як описано вище. Потрібно визнати, що такий метод не враховує і не захищає від можливості дисперсії між резервуарами, окрім того, що враховує дисперсію між окремими особинами. Проте, як показав досвід (8), дисперсія між резервуарами є незначною, в порівнянні з дисперсією в межах резервуару (між особинами). Якщо окремі особини не враховуються під час аналізу, необхідно надати метод визначення аномальних значень та обґрунтування використання такого методу аналізу.

2.2. ПОЯСНЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

Результати дослідження потрібно пояснювати з обережністю, якщо виміряні концентрації токсинів у дослідному розчині наближаються до межі визначення або, у напівстатичних режимах, коли концентрація дослідної речовини падає після додавання щойно приготованого розчину та перед оновленням води.

2.3. ЗВІТ ПРО ДОСЛІДЖЕННЯ

- Звіт про дослідження повинен включати наступні дані:

2.3.1. Дослідна речовина

- фізична природа та фізико-хімічні властивості;

- дані про хімічну ідентифікацію, включаючи чистоту та аналітичний метод кількісного визначення дослідної речовини, якщо потрібно.

2.3.2. Дослідні види

- наукова назва, можливо

- вид, розмір, постачальник, будь-яка попередня обробка тощо.

2.3.3. Дослідні умови

- дослідна процедура, що використовувалась (напр. напівстатичний режим/оновлення, протічний режим, завантаження, густина завантаження тощо),

- план дослідження (напр. кількість дослідних ємностей, дослідні концентрації то дублюючі розчини, кількість риби у ємностях)

- метод підготовки основних розчинів та частота оновлень води (необхідно вказувати розчинник та його концентрацію, якщо використовується)

- номінальні дослідні концентрації, середні значення виміряних показників та їх стандартні відхилення у дослідних ємностях, а також методи їх підрахунку та підтвердження того, що вимірювання стосуються концентрацій дослідної речовини у наявних розчинах,

- властивості води для розбавлення: рН, жорсткість, лужність, температура, концентрація розчиненого кисню, рівні хлорних залишків (якщо вимірювались), загальний вміст органічного вуглецю, суспендовані тверді частки, солоність дослідного середовища (якщо вимірювалась) та будь-які інші виконані виміри,

- якість води у дослідних ємностях: рН, жорсткість, температура та концентрація розчиненого кисню,

- докладні відомості про годування (напр. тип корму (кормів), постачальник, раціон та частота годування).

2.3.4. Результати:

- підтвердження того, що виживання риби в контрольних розчинах відповідає критеріям якості, та дані про смертність у всіх дослідних концентраціях,

- статистична аналітична методика, що використовувалась, статистичні дані, що ґрунтуються на дублюючих резервуарах, або окремих особинах, обробка даних та обґрунтування методик, що використовувались,

- табличні дані про питому та середню вагу риби у нульовий, 14-ий (якщо вимірювалась) та 28-ий дні дослідження, значення середнього темпу росту по резервуару або, якщо потрібно, псевдо-питомого темпу росту за 0-28 або за 0-14 та 14-28 дні дослідження,

- результати статистичного аналізу (тобто, аналізу дисперсії або ANOVA), бажано, у формі таблиць та графіків, а також значення КНВЕ або EC , за можливості, стандартні похибки, якщо потрібно, x

- випадки нетипової реакції риби або видимі відхилення зовнішнього вигляду, спричинені дослідною сполукою.

3. ПЕРЕЛІК ДОВІДКОВОЇ ЛІТЕРАТУРИ

(1) Solbe J.F. de LG (1987) Environmental Effects of Chemicals (CFM 9350 SLD). Report on a UK Ring Test of a Method for Studying the Effects of Chemicals on the Growth rate of Fish. WRc Report No PRD 1388-M/2.

(2) Ashley S., Mallett M.J. and Grandy N.J., (1990) EEC Ring Test of a Method for Determining the Effects of Chemicals on the Growth Rate of Fish. Final Report to the Commission of the European Communities. WRc Report No EEC 2600-M.

(3) Crossland N.O. (1985) A method to evaluate effects of toxic chemicals on fish growth. Chemosphere, 14, p. 1855-1870.

(4) Nagel R., Bresh H., Caspers N., Hansen P.D., Market M., Munk R., Scholz N. and Hufte B.B., (1991) Effect of 3,4-dichloroaniline on the early life stages of the Zebrafish (Brachydanio rerio): results of a comparative laboratory study. Ecotox. Environ. Safety, 21, p. 157-164.

(5) Yamamoto, Tokio., (1975) Series of stock cultures in biological field. Medaka (killifish) biology and strains. Keigaku Publish. Tokio, Japan.

(6) Holcombe, G.W., Benoit D.A., Hammermeister, D.E., Leonard, E.N. and Johnson, R.D., (1995) Acute and long-term effects of nine chemicals on the Japanese medaka (Oryzias latipes).Arch. Environ. Conta. Toxicol. 28, p. 287-297.

(7) Benoit, D.A., Holcombe, G.W. and Spehar, R.L., (1991) Guidelines for conducting early life toxicity tests with Japanese medaka (Oryzias latipes). Ecological Research Series EPA-600/3-91-063. U.S. Environmental Protection Agency, Duluth, Minesota. L 142/598 EN Official Journal of the European Union 31.5.2008

(8) Stephan C.E. and Rogers J.W., (1985) Advantages of using regression analysis to calculate results of chronic toxicity tests. Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: Eighth Symposium, ASTM STP 891, R C Bahner and D J Hansen, Eds., American Society for Testing and Materials, Philadelphia, p. 328-338.

(9) Environment Canada, (1992) Biological test method: toxicity tests using early life stages of salmonid fish (rainbow trout, coho salmon, or Atlantic salmon). Conservation and Protection, Ontario, Report EPS 1/RM/28, p. 81.

(10) Cox D.R., (1958) Planning of experiments. Wiley Edt.

(11) Pack S., (1991) Statistical issues concerning the design of tests for determining the effects of chemicals on the growth rate of fish. Room Document 4, OECD Ad Hoc Meeting of Experts on Aquatic Toxicology, WRc Medmenham, UK, 10-12 December 1991.

(12) Dunnett C.W., (1955) A Multiple Comparisons Procedure for Comparing Several Treatments with a Control, J. Amer. Statist. Assoc., 50, p. 1096-1121.

(13) Dunnett C.W., (1964) New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20, p. 482-491.

(14) Williams D.A., (1971) A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27, p. 103-117.

(15) Johnston, W.L., Atkinson, J.L., Glanville N.T., (1994) A technique using sequential feedings of different coloured food to determine food intake by individual rainbow trout, Oncorhynchus mykiss: effect of feeding level. Aquaculture 120, p. 123-133.

(16) Quinton, J. C. and Blake, R.W., (1990) The effect of feed cycling and ration level on the compensatory growth response in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Journal of Fish Biology, 37, p. 33-41.

(17) Post, G., (1987) Nutrition and Nutritional Diseases of Fish. Chapter IX in Testbook of Fish Health. T.F.H. Publications, Inc. Neptune City, New Jersey, USA. p. 288.

(18) Bruce, R.D. and Versteeg D.J., (1992) A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environ. Toxicol. Chem. 11, p. 1485-1494.

(19) DeGraeve, G.M., Cooney, J.M., Pollock, T.L., Reichenbach, J.H., Dean, Marcus, M.D. and McIntyre, D.O., (1989) Precision of EPA seven-day fathead minnow larval survival and growth test; intra and interlaboratory study. report EA-6189 (American Petroleum Institute Publication, No 4468). Electriс Power Research Institute, Palo alto, CA.

(20) Norbert-King T.J., (1988) An interpolation estimate for chronic toxicity: the ICp approach. US Environmental Protection Agency. Environmental Research Lab., Duluth, Minesota. Tech. Rep. No 05-88 of National Effluent Toxicity Assesment Center. Sept. 1988. p. 12.

(21) Williams D.A., (1972) The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28, p. 510-531

Додаток 1

ВИДИ РИБИ, ЩО РЕКОМЕНДУЮТЬСЯ ДЛЯ ДОСЛІДЖЕННЯ ТА ПРИДАТНІ ДОСЛІДНІ УМОВИ

------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
|      Види     |Рекомендований|Фотоперіод|Рекомендований| Потрібна |Інтенсивність|  Густина   |  Раціон   | Тривалість|
|               |   діапазон   | (години) |   діапазон   | точність |завантаження |завантаження|           |дослідження|
|               |  дослідної   |          |  початкової  |вимірювань|    (г/л)    | (на літр)  |           |   (дні)   |
|               | температури  |          |ваги риби (г) |          |             |            |           |           |
|               |     (С)      |          |              |          |             |            |           |           |
|---------------+--------------+----------+--------------+----------+-------------+------------+-----------+-----------|
|Рекомендовані  |              |          |              |          |             |            |           |           |
|види           |              |          |              |          |             |            |           |           |
|Oncorhynchus   |  12,5-16,0   |  12-16   |      1-5     |з точністю|             |  1,2-2,0   |Спеціальний|   >= 28   |
|mykiss         |              |          |              |до 100 мг |             |            |сухий      |           |
|райдужна форель|              |          |              |          |             |            |піджарений |           |
|               |              |          |              |          |             |            |лососевий  |           |
|               |              |          |              |          |             |            |корм       |           |
|---------------+--------------+----------+--------------+----------+-------------+------------+-----------+-----------|
|Інші види,     |              |          |              |          |             |            |           |           |
|використання   |              |          |              |          |             |            |           |           |
|яких           |              |          |              |          |             |            |           |           |
|задокументовано|              |          |              |          |             |            |           |           |
|Danio rerio    |    21-25     |  12-16   |  0,050-0,100 |з точністю|             |  0,2-1,0   |Живий корм |   >= 28   |
|даніо          |              |          |              |до 1 мг   |             |            |(Brachionus|           |
|               |              |          |              |          |             |            |Artemia)   |           |
|Oryzias latipes|    21-25     |  12-16   |  0,050-0,100 |з точністю|             |  0,2-1,0   |Живий корм |   >= 28   |
|рисівка        |              |          |              |до 1 мг   |             |            |(Brachionus|           |
|(Медака)       |              |          |              |          |             |            |Artemia)   |           |
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Додаток 2

ДЕЯКІ ХАРАКТЕРИСТИКИ ПРИДАТНОЇ ВОДИ ДЛЯ РОЗБАВЛЕННЯ

------------------------------------------------------------------
|     |                  Речовина                   |  Граничний |
|     |                                             |    вміст   |
|-----+---------------------------------------------+------------|
|  1  |Тверді частки                                |< 20 мг/л   |
|-----+---------------------------------------------+------------|
|  2  |Загальний вміст органічного вуглецю          |< 2 мг/л    |
|-----+---------------------------------------------+------------|
|  3  |Неіонізований аміак                          |< 1 мю г/л  |
|-----+---------------------------------------------+------------|
|  4  |Залишковий хлор                              |< 10 мю г/л |
|-----+---------------------------------------------+------------|
|  5  |Загальний вміст фосфорорганічних пестицидів  |< 50 нг/л   |
|-----+---------------------------------------------+------------|
|  6  |Загальний вміст хлорорганічних пестицидів та |< 50 нг/л   |
|     |поліхлорованих біфенілів                     |            |
|-----+---------------------------------------------+------------|
|  7  |Загальний вміст органічного хлору            |< 25 нг/л   |
------------------------------------------------------------------

Додаток 3

Логарифмічний ряд концентрацій, придатних для дослідження токсичності (9)

------------------------------------------------------------------
|Колонка (Кількість концентрацій між 100 і 10 або між 10 та 1)(*)|
|----------------------------------------------------------------|
|   1    |   2    |   3    |   4    |   5    |   6    |    7     |
|--------+--------+--------+--------+--------+--------+----------|
|  100   |  100   |  100   |  100   |  100   |  100   |   100    |
|--------+--------+--------+--------+--------+--------+----------|
|   32   |   46   |   56   |   62   |   68   |   72   |    75    |
|--------+--------+--------+--------+--------+--------+----------|
|   10   |   22   |   32   |   40   |   46   |   52   |    56    |
|--------+--------+--------+--------+--------+--------+----------|
|  3,2   |   10   |   18   |   25   |   32   |   37   |    42    |
|--------+--------+--------+--------+--------+--------+----------|
|  1,0   |  4,6   |   10   |   16   |   22   |   27   |    32    |
|--------+--------+--------+--------+--------+--------+----------|
|        |  2,2   |  5,6   |   10   |   15   |   19   |    24    |
|--------+--------+--------+--------+--------+--------+----------|
|        |  1,0   |  3,2   |  6,3   |   10   |   14   |    18    |
|--------+--------+--------+--------+--------+--------+----------|
|        |        |  1,8   |  4,0   |  6,8   |   10   |    13    |
|--------+--------+--------+--------+--------+--------+----------|
|        |        |  1,0   |  2,5   |  4,6   |  7,2   |    10    |
|--------+--------+--------+--------+--------+--------+----------|
|        |        |        |  1,6   |  3,2   |  5,2   |   7,5    |
|--------+--------+--------+--------+--------+--------+----------|
|        |        |        |  1,0   |  2,2   |  3,7   |   5,6    |
|--------+--------+--------+--------+--------+--------+----------|
|        |        |        |        |  1,5   |  2,7   |   4,2    |
|--------+--------+--------+--------+--------+--------+----------|
|        |        |        |        |  1,0   |  1,9   |   3,2    |
|--------+--------+--------+--------+--------+--------+----------|
|        |        |        |        |        |  1,4   |   2,4    |
|--------+--------+--------+--------+--------+--------+----------|
|        |        |        |        |        |  1,0   |   1,8    |
|--------+--------+--------+--------+--------+--------+----------|
|        |        |        |        |        |        |   1,3    |
|--------+--------+--------+--------+--------+--------+----------|
|        |        |        |        |        |        |   1,0    |
|----------------------------------------------------------------|
|(*) З кожної колонки можна обрати послідовність з п'яти (або    |
|більше) концентрацій. Проміжні значення між концентраціями у    |
|колонці (х) знаходяться у колонці (2х+1). Вказані величини      |
|можуть позначати концентрації, виражені у відсотках на одиницю  |
|об'єму або ваги (мг/л або мю г/л). За потреби, значення можна   |
|множити або ділити на будь-який степінь 10. Колонку 1 можна     |
|використовувати, якщо спостерігалась суттєва невизначеність щодо|
|рівня токсичності.                                              |
------------------------------------------------------------------

C.15. РИБА, ЕКСПРЕС-ДОСЛІДЖЕННЯ НА ТОКСИЧНІСТЬ ДЛЯ РІЗНИХ СТАДІЙ РОЗВИТКУ ЕМБРІОНІВ ТА ПЕРЕДЛИЧИНОК

1. МЕТОД

Цей метод експрес-дослідження на токсичність є аналогом дослідження ОЕСР TG 212 (1998).

1.1. ВСТУП

Цей метод експрес-дослідження на токсичність для різних стадій розвитку ембріонів та передличинок охоплює стадії життя від щойно відкладених ікринок до кінцевої стадії розвитку передличинок. У дослідженні не передбачається годування ембріонів та передличинок, тому дослідження припиняється, коли передличинка все ще одержує живлення із жовткового мішка.

Дослідження призначене для з'ясування летального, і в незначній мірі, сублетального впливу хімічних речовин на піддослідні види, що знаходяться на певних стадіях розвитку. Дослідження дозволяє одержати корисну інформацію і може: (а) послужити джерелом проміжної інформації між дослідженнями летального та сублетального впливу; (b) використовуватися як попереднє дослідження при проведенні комплексних досліджень для ранньої стадії розвитку або досліджень хронічної токсичності і (с) використовуватися для дослідження видів у разі, якщо рибогосподарські технології є недостатньо досконалими, щоб охопити період переходу від ендогенного до екзогенного живлення.

Необхідно мати на увазі, що лише дослідження, які охоплюють усі стадії життя риби, можуть дати точну оцінку хронічної токсичності хімічних речовин для риби, і що в разі неповного охоплення життєвих стадій може зменшитись чутливість досліджень, що в результаті призведе до недооцінки хронічної токсичності. Тому очікується, що дослідження ембріонів та передличинок буде менш чутливим, ніж комплексне дослідження для ранньої стадії розвитку, особливо, що стосується хімічних речовин з високою ліпофільністю (log P > 4) та хімічних речовин зі специфічною токсичною дією. ow

Однак  різниця  між  чутливістю   обох   досліджень   буде   менше
проявлятися  для  хімічних  речовин  з неспецифічним,  наркотичним
ефектом (1).

До публікації цього дослідження для ембріонів та передличинок найбільше досвіду щодо нього було одержано стосовно прісноводної риби Danio rerio Гамільтона-Буханана (Teleostei, Cyprinidae, звичайна назва - смугастий даніо). Тому більш детальна інформація щодо дослідження для цього виду наведена в Доповненні 1. Це не виключає використання дослідження для інших видів, щодо яких також наявний досвід (Таблиця 1).

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ

1.3. ПРИНЦИП ДОСЛІДЖЕННЯ

Риба на стадіях ембріона та передличинки піддається дії низки концентрацій дослідної речовини, розчиненої у воді. За протоколом можливий вибір між напівстатичною та проточною процедурами. Вибір залежить від характеру дослідної речовини. Дослідження розпочинається поміщенням запліднених ікринок у дослідні камери і припиняється безпосередньо до того, як жовтковий мішок будь-якої личинки в будь-якій із дослідних камер буде повністю поглинений, або до початку загибелі від голоду контрольних зразків. Летальний та сублетальний ефект оцінюється та порівнюється з контролем, визначається найнижча концентрація, що призводить до видимих ефектів, і відповідно, концентрація, що не призводить до видимих ефектів. Як альтернатива, для оцінки концентрації, яка призведе до заданого процентного відношення ефекту, може використовуватися аналіз за допомогою регресійної моделі (наприклад, LC/EC , де x - x

задане процентне відношення ефекту).

1.4. ІНФОРМАЦІЯ ЩОДО ДОСЛІДНОЇ РЕЧОВИНИ

Повинні бути наявними результати дослідження на гостру токсичність (див. Метод С.1.), бажано проведеного з видами, вибраними для цього дослідження. Ці результати можуть бути корисними при виборі необхідного діапазону концентрацій для дослідження ранньої стадії розвитку. Повинні бути відомими розчинність води (включаючи розчинність у дослідній воді) та пружність парів дослідної речовини. Повинен бути наявним достовірний метод аналізу кількості речовини в дослідних розчинах із відомою і підтвердженою точністю та межею виявлення.

Інформація щодо дослідної речовини, яка може бути корисною при встановленні умов дослідження, включає в себе: структурну формулу, чистоту речовини, стабільність на світлі, стабільність в умовах дослідження, pK , P та результати дослідження на повну a ow

біологічну розкладність (див. Метод С.4.).

1.5. ДОСТОВІРНІСТЬ ДОСЛІДЖЕННЯ

Достовірність дослідження підтверджується такими умовами:

- загальний рівень виживання запліднених ікринок у контролі і, якщо прийнятно, в посудинах, що містять лише розчинник, більший або дорівнює межам, визначеним у Доповненнях 2 та 3;

- концентрація розчиненого кисню протягом всього дослідження перебуває в межах від 60 до 100% показника насичення повітря (ASV);

- температура води не відрізняється більше ніж на +- 1,5 град.С між дослідними камерами або між послідовними днями у будь-який час протягом дослідження і перебуває в межах температурних діапазонів, визначених для дослідних видів (Доповнення 2 та 3).

1.6. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

1.6.1. Дослідні камери

Можуть використовуватися будь-які скляні або інші хімічно інертні посудини. Розміри посудин повинні бути достатніми, щоб відповідати рівню завантаження (див. Секцію 1.7.1.2). Рекомендується довільно розміщувати дослідні камери в дослідній зоні. Довільне блочне розташування, при якому кожен варіант присутній у кожному блоці, більш бажане, ніж повністю довільне розташування, у разі якщо наявні систематичні прояви, які можна буде контролювати за допомогою блочного розташування. Блочне розташування, якщо воно використовується, повинне бути враховане в подальшому аналізі даних. Дослідні камери повинні бути захищені від небажаного впливу.

1.6.2. Вибір видів риб

Рекомендовані види риб зазначені в Таблиці 1А. Це не виключає використання інших видів (приклади подані в Таблиці 1В), але може бути необхідною адаптація дослідних процедур для забезпечення прийнятних умов дослідження. У такому випадку повинні бути наведені обґрунтування вибору видів та експериментальних методів.

1.6.3. Розведення риб-плідників

Інформацію щодо сприятливих умов розведення маточного стада можна знайти в OECD TG 210(1) та посиланнях (2)(3)(4)(5)(6).

1.6.4. Поводження з ембріонами та личинками

Ембріони та личинки можуть поміщатися в невеликі посудини, розташовані в головній посудині, одна сторона чи кінчик яких закриті сіткою, через яку в посудини може проходити дослідний розчин. Нетурбулентний потік розчину через ці невеликі посудини може забезпечуватися шляхом підвішування їх до важеля, який під'єднаний до механізму руху вгору і вниз, причому організми повинні завжди бути занурені; може також використовуватися сифонна система. Запліднені ікринки лососевих риб можна розміщувати на решітках або сітках з апертурою достатньою для того, щоб личинки випали після вилуплення. Доцільне використання пастерівської піпетки для вилучення ембріонів та личинок у напівстатичних дослідженнях з повним щоденним оновленням (див. частину 1.6.6).

У разі використання контейнерів для ікринок або решіток чи сіток для підтримки ікринок, після вилуплення личинок(1) потрібно їх прибрати, крім випадків, коли сітки використовуються для запобігання втечі риби. При переміщенні личинок потрібно запобігати їх контакту з повітрям, а для звільнення риби із контейнерів для ікринок не можна використовувати сачки (це застереження може не застосовуватися стосовно менш вразливих видів, наприклад, коропа). Строки такого переміщення залежать від виду і воно не завжди може бути необхідним. Для проведення дослідження за напівстатичним методом можуть використовуватися лабораторні склянки або неглибокі контейнери, обладнані, в разі необхідності, сітчастою перегородкою, розташованою трохи вище дна посудини. Якщо об'єм цих контейнерів достатній для задоволення вимог щодо завантаження (див. 1.7.1.2), переміщення ембріонів чи личинок не потрібне.

----------------

(1) ОЕСР, Париж, 1992, Інструкція щодо проведення досліджень 210, "Риба, дослідження на токсичність для ранньої стадії розвитку".

1.6.5. Вода

Для дослідження підходить будь-яка вода, яка відповідає хімічним характеристикам розчинної води, зазначеним у Доповненні 4, і в якій контроль виживання дослідних видів не гірший ніж описано в Доповненнях 2 та 3. Вода повинна бути незмінної якості протягом усього дослідження. Показник pH повинен залишатися в межах +- 0,5 пунктів. Щоб запобігти негативному впливу розчинної води на результати дослідження (наприклад, комплексоутворення в дослідній речовині) або на продуктивність маточного стада, потрібно періодично брати проби води для аналізу. Дослідження води на вміст важких металів (наприклад, Cu, Pb, Zn, Hg, Cd та Ni), основних аніонів та катіонів (наприклад, Ca, Mg, Na, K, Cl та SO ), пестицидів (наприклад, загальний вміст фосфорорганічних та 4

загальний   вміст   хлорорганічних  пестицидів),  загальний  вміст
органічного  вуглецю  та  твердих  зависей  повинні   проводитися,
наприклад,  кожні  три місяці,  якщо відомо,  що розчинна вода має
відносно  незмінну  якість.  Якщо  вода  показує  незмінну  якість
протягом принаймні одного року,  аналізи можуть бути менш частими,
а періодичність їх  проведення  може  бути  подовжена  (наприклад,
проводитись щопівроку).

1.6.6. Дослідні розчини

Дослідні розчини визначених концентрацій готуються шляхом розбавлення базового розчину. Базовий розчин краще готувати шляхом простого збовтування або змішування дослідного розчину в розчинній воді за допомогою механічних засобів (наприклад, збовтування чи ультразвукової обробки). Для одержання базового розчину необхідної концентрації можуть використовуватися сатураційні колони (розріджувальні колони). Наскільки можливо, потрібно уникати використання розчинників або диспергаторів (розчинювальних реагентів); однак у деяких випадках вони можуть бути потрібні для приготування базового розчину необхідної концентрації. До прийнятних розчинників належать: ацетон, етанол, метанол, диметилформамід та триетиленгліколь. До прийнятних диспергаторів належать: Cremophor RH40, Tween 80, метилцелюлоза 0,01% та HCO-40. Потрібно особливо обережно застосовувати повністю біологічно розкладні реагенти (наприклад, ацетон) та/або реагенти з високою леткістю, оскільки вони можуть призвести до проблем з накопиченням бактерій у дослідженнях з проточною процедурою. При використанні розчинювального реагенту, він не повинен мати істотного впливу на виживаність і видимого негативного впливу на стадії раннього розвитку, що аналізується за допомогою порівняння з контрольними зразками, які перебувають лише в розчиннику. Однак потрібно робити все можливе для уникнення використання таких матеріалів.

Що стосується напівстатичного методу, можуть застосовуватися дві різні процедури оновлення середовища: (i) приготування нових дослідних розчинів у чистих посудинах і обережне перенесення ікринок та личинок, що вижили, в нові посудини в невеликій кількості старого розчину з недопущенням контакту з повітрям або (ii) збереження дослідних організмів у старих посудинах із зміною певної кількості (принаймні трьох четвертей) дослідної води. Періодичність оновлення середовища залежить від стабільності дослідного розчину, але рекомендується щоденне оновлення води. Якщо попередні дослідження стабільності (див. Секцію 1.4) показують, що концентрація дослідної речовини є нестабільною (тобто виходить за рамки 80-120% від номіналу або падає нижче 80% від виміряної початкової концентрації) протягом періоду оновлення, потрібно розглянути можливість проведення проточного дослідження. У будь-якому разі, потрібно запобігти завданню стресу личинкам під час процесу оновлення води.

Що стосується досліджень за проточною методикою, для подачі низки концентрацій до дослідних камер використовується система, яка забезпечує постійну подачу та розрідження базового розчину дослідної речовини (наприклад, дозуючий насос, пропорційний розріджувач, сатураційна система). Рівень подачі базових розчинів та розчинної води повинен періодично перевірятись, бажано щодня, і не повинен відрізнятися більше ніж на 10% протягом усього дослідження. Прийнятним був визнаний рівень подачі, який дорівнює об'ємам принаймні п'яти дослідних камер, за 24 години (2).

1.7. ПРОЦЕДУРА

Корисна інформація щодо ефективності досліджень на токсичність для ембріонів та передличинок риби наведена в літературі, деякі приклади якої включені в секцію "Посилання" цього тексту (7)(8)(9).

1.7.1. Застосування

1.7.1.1. Тривалість

Найкраще розпочинати дослідження протягом 30 хвилин після запліднення ікринок. Ембріони занурюються в дослідний розчин до, або якнайшвидше після початку стадії дроблення бластодиска і у будь-якому разі до настання стадії гаструли. Над ікринками, одержаними від постачальника, може не бути можливості розпочати дослідження одразу після запліднення. Оскільки затримка початку дослідження може значно вплинути на його чутливість, дослідження повинно розпочатись протягом восьми годин після запліднення. Оскільки личинки не одержують живлення протягом перебування в середовищі, дослідження повинно бути припинене безпосередньо до того, як жовтковий мішок будь-якої личинки в будь-якій із дослідних камер буде повністю поглинений, або до початку загибелі від голоду контрольних зразків. Тривалість залежить від видів, що використовуються для дослідження. Деяка рекомендована тривалість наведена в Доповненнях 2 та 3.

1.7.1.2. Завантаження

Кількість запліднених ікринок на початку дослідження повинна бути достатньою для задоволення статистичних вимог. Вони повинні бути довільно розподілені між варіантами дослідження, а на кожну концентрацію повинно припадати принаймні 30 запліднених ікринок, розподілених порівну (або якомога більш рівномірно, оскільки одержання рівних кількостей може бути складним для деяких видів) між принаймні трьома аналогічними дослідними камерами. Рівень завантаження (біомаси на об'єм дослідного розчину) повинен бути достатньо низьким, щоб витримувалася без аерації концентрація розчиненого кисню принаймні 60% ASV. У разі використання проточного методу, рекомендований рівень завантаження, що не перевищує 0,5 г/л на 24 години і не перевищує 5 г/л розчину в будь-який час (2).

1.7.1.3. Світло і температура

Світловий період та температура дослідної води залежать від піддослідних видів (Доповнення 2 та 3). Для цілей контролю температури може бути доцільним використання додаткової дослідної посудини.

1.7.2. Дослідні концентрації

Зазвичай достатнє використання п'яти концентрацій дослідної речовини, інтервал між якими дорівнює постійному фактору, що не перевищує 3,2. Діапазон дослідних концентрацій вибирається, виходячи з кривої відношення LC до періоду перебування в 50

середовищі.  У  деяких  випадках  може бути доцільним використання
менше п'яти концентрацій,  наприклад,  у граничних дослідженнях, а
також  менший  крок концентрацій.  У разі використання менше п'яти
концентрацій  повинно  надаватися  обґрунтування.  Дослідження   з
концентраціями  речовини,  що  вищі ніж LC   протягом 96 годин або
                                          50
100 мг/л,  залежно від того,  що  менше,  проводити  не  потрібно.
Речовини  не  потрібно  досліджувати в концентрації,  що перевищує
межу їх розчинності в дослідній воді.

У разі використання розчинювального реагенту для приготування дослідних розчинів (див. Секцію 1.6.6), його кінцева концентрація в дослідних посудинах не повинна перевищувати 0,1 мл/л і повинна бути однаковою в усіх посудинах.

1.7.3. Контроль

Під час дослідження повинен використовуватися один контроль у розчинній воді (належним чином скопійований), а також, у разі необхідності, один контроль із розчинювальним реагентом (належним чином скопійований).

1.7.4. Періодичність аналітичних перевірок і вимірювань

Протягом усього дослідження періодично перевіряються концентрації дослідної речовини.

У напівстатичних дослідженнях, де сталість концентрації дослідної речовини очікується на рівні +- 20% від номіналу (тобто в межах від 80 до 120%; див. Секцію 1.4 та 1.6.6), рекомендується проведення аналізу, як мінімум, найвищої та найнижчої концентрації в щойно приготовленому розчині, а також концентрації безпосередньо перед оновленням - принаймні у трьох випадках, рівномірно розподілених у часі протягом дослідження (тобто, аналізи проводяться на зразку із одного розчину - щойно приготовленого і при оновленні).

У дослідженнях, де сталість концентрації дослідної речовини не очікується на рівні +- 20% від номіналу (на основі даних про стабільність речовини), необхідно аналізувати усі дослідні концентрації як у щойно приготовленому розчині, так і при оновленні, але в такому ж режимі (тобто принаймні в трьох випадках, рівномірно розподілених у часі протягом дослідження). Визначення концентрації дослідної речовини до оновлення потрібно проводити лише в одній реплікації посудини на кожну дослідну концентрацію. Інтервал між перевірками не повинен перевищувати сім днів. Рекомендується, щоб результати дослідження ґрунтувались на результатах вимірювання концентрацій. Однак, якщо наявні дані, які свідчать про те, що концентрація дослідної речовини в розчині була протягом усього дослідження задовільним чином витримана в межах +- 20% від номіналу або виміряної початкової концентрації, результати можуть ґрунтуватись на номінальному та виміряному початковому значеннях.

Що стосується дослідження з використанням проточного методу, застосовується режим відбору зразків, подібний до того, який описується для напівстатичних досліджень (однак вимірювання "старих" розчинів у цьому випадку не є прийнятним). Однак, якщо тривалість дослідження складає більше семи днів, рекомендується збільшити кількість відборів протягом першого тижня (тобто три вимірювання), щоб гарантувати стабільність дослідних концентрацій.

Може бути потрібно центрифугувати або відфільтрувати зразки (з проникністю фільтра, наприклад, 0,45 мікрона). Однак, оскільки ні центрифугування, ні фільтрування, як виявляється, не завжди дозволяють відокремити не біодоступні частки дослідного розчину від біодоступних, зразки можна не піддавати такій обробці.

Під час дослідження в усіх посудинах потрібно вимірювати рівень розчиненого кисню, pH і температуру. В контролі й одній посудині з найвищою концентрацією потрібно вимірювати загальну жорсткість і мінералізацію (якщо прийнятно). Як мінімум, необхідно тричі (на початку, в середині та в кінці дослідження) виміряти розчинений кисень та мінералізацію (якщо прийнятно). У напівстатичних дослідженнях рекомендується частіше вимірювати розчинений кисень, бажано до і після кожного оновлення води або принаймні один раз на тиждень. pH потрібно вимірювати на початку та в кінці кожного оновлення води в напівстатичних дослідженнях і принаймні щотижня в проточних дослідженнях. Жорсткість потрібно вимірювати один раз протягом кожного дослідження. Температуру потрібно вимірювати щодня, а принаймні в одній посудині - контролювати постійно.

1.7.5. Спостереження

1.7.5.1. Стадія ембріонального розвитку

Стадія ембріонального розвитку (тобто стадія гаструли) на початку поміщення в середовище дослідної речовини повинна бути встановлена якомога точніше. Це можна зробити шляхом вибору репрезентативного зразка ікринки, належним чином збереженого і очищеного. Опис та ілюстрацію стадій ембріонального розвитку можна знайти в літературі (2)(5)(10)(11).

1.7.5.2. Вилуплення та виживання

Спостереження за вилупленням та виживанням повинні проводитися принаймні один раз на день, та відповідна кількість повинна записуватися. Може бути бажаним робити спостереження частіше на початку дослідження (наприклад, кожні 30 хвилин протягом перших трьох годин), оскільки в деяких випадках інформація про тривалість виживання може бути більш корисною, ніж лише кількість смертей (наприклад, при наявності гострих токсичних проявів). Загиблі ембріони та личинки потрібно видаляти одразу після їх виявлення, оскільки вони можуть швидко розкластися. Видалення загиблих особин потрібно робити з особливою обережністю, щоб не вдарити чи фізично пошкодити сусідні ікринки/личинки, які є надзвичайно тендітними і чутливими. Критерії для визначення смерті залежно від стадії життя:

- для ікринок: особливо на ранніх стадіях, виражена втрата прозорості та зміна забарвлення, спричинена коагуляцією та/або преципітацією білка, що призводить до набуття білого непрозорого вигляду,

- для ембріонів: відсутність рухів тулуба та/або відсутність серцебиття, та/або втрата прозорості у видів, чиї ембріони зазвичай прозорі,

- для личинок: нерухомість та/або відсутність респіраторних рухів, та/або відсутність серцебиття, та/або біле непрозоре забарвлення центральної нервової системи, та/або відсутність реакції на механічні подразники.

1.7.5.3. Анормальний вигляд

Кількість личинок, у яких проявляється анормальна форма тулуба та/або пігментація, та стадія поглинання жовткового мішка, повинні фіксуватися з адекватною періодичністю, залежно від тривалості дослідження та характеру виявленої анормальності. Потрібно відзначити, що присутність анормальних ембріонів та личинок є природною і в контролі може досягати порядку кількох відсотків у деяких видів. Анормальні личинки видаляються із дослідних посудин лише після смерті.

1.7.5.4. Анормальна поведінка

Анормальності, такі як гіпервентиляція, некоординоване плавання та атипова нерухомість, повинні фіксуватися з адекватною періодичністю, залежно від тривалості дослідження. Ці прояви, хоча їх і важко порахувати, можуть у разі їх виявлення допомогти в поясненні даних щодо смертності, тобто є джерелом інформації щодо характеру токсичної дії речовини.

1.7.5.5. Довжина

У кінці дослідження рекомендується провести вимірювання індивідуальної довжини зразків; може використовуватися методика вимірювання стандартної довжини, довжини за Шмідтом або загальної довжини. Однак, у випадках гниття хвостового плавника або ерозії плавника потрібно використовувати метод вимірювання стандартної довжини. Загалом, у належно проведеному дослідженні коефіцієнт розбіжності довжини серед реплікацій у контролях повинен становити <= 20%.

1.7.5.6. Вага

У кінці дослідження можна провести вимірювання індивідуальної ваги зразків; бажано проводити вимірювання ваги сухих зразків (висушених протягом 24 годин при 60 град.С), ніж мокрих (чи висушених промоканням). Загалом, у належно проведеному дослідженні коефіцієнт розбіжності ваги серед реплікацій у контролях повинен становити <= 20 %.

Ці спостереження послужать збору деяких або всіх нижчезазначених даних для статистичного аналізу:

- сукупна смертність,

- кількість живих личинок на кінець дослідження,

- час до початку вилуплення і до закінчення вилуплення (тобто, 90% вилуплень у кожній реплікації),

- кількість личинок, що вилуплюються щодня,

- довжина (і вага) тварин, що вижили на кінець дослідження,

- кількість личинок із спотвореним або анормальним виглядом,

- кількість личинок, що показують анормальну поведінку.

2. ДАНІ ТА ЗВІТНІСТЬ

2.1. ОБРОБКА РЕЗУЛЬТАТІВ

Як до розробки, так і до аналізу результатів дослідження рекомендується залучити спеціаліста зі статистики, оскільки метод передбачає велику кількість варіантів структури дослідження, наприклад, що стосується кількості дослідних камер, кількості дослідних концентрацій, початкової кількості запліднених ікринок та вимірюваних параметрів.

У зв'язку з існуванням різних варіантів структури дослідження, тут не подаються окремі інструкції щодо статистичних процедур. Якщо необхідно оцінити НСЕК/КНВЕ, потрібно проаналізувати відмінності в кожному наборі реплікацій з використанням процедур дисперсійного аналізу (ANOVA) або таблиці статистичної структури. Для проведення множинного порівняння між результатами за окремими концентраціями та контролями може використовуватися метод Даннетта (12)(13). Є також інші корисні приклади (14)(15). Ступінь впливу, який виявляється за допомогою ANOVA або інших процедур (тобто потужність критерію), повинен розраховуватися і зазначатися в протоколі. Потрібно відзначити, що не всі спостереження, перелічені в Секції 1.7.5.6 підходять для статистичного аналізу з використанням ANOVA. Наприклад, сукупну смертність та кількість живих личинок на кінець дослідження потрібно аналізувати за допомогою пробіт-методів.

Для оцінки LC/EC , до даних, що викликають інтерес, x

підбираються відповідні  криві,  наприклад,  логістична  крива,  з
використанням  статистичного метода,  наприклад,  метода найменших
квадратів або метода  нелінійних  найменших  квадратів.  Параметри
кривих  повинні бути такими,  щоб можна було безпосередньо оцінити
LC/EC , які викликають інтерес, та їх середньоквадратичну помилку.

Це  значно  полегшить  розрахунок меж довірчого інтервалу відносно
LC/EC .  Крім випадків,  коли є достатні підстави віддати перевагу

різним   довірчим   рівням,   у   протоколі   потрібно   зазначити
двосторонній 95%  довірчий інтервал.  Бажано,  щоб процес  підбору
кривих  передбачав можливість оцінки значимості відсутності згоди.
Можна використовувати графічні методи підбору кривих.  Регресійний
аналіз  підходить  для  всіх  спостережень,  перелічених  у Секції
1.7.5.6.

2.2. ІНТЕРПРЕТАЦІЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

У разі, якщо виміряні концентрації токсичної речовини у дослідних розчинах перебувають на рівні межі чутливості аналітичного методу, до інтерпретації результатів потрібно підходити з обережністю. Також з обережністю потрібно ставитися до інтерпретації результатів при концентраціях речовини, яка вища рівня розчинності води.

2.3. ПРОТОКОЛ ДОСЛІДЖЕННЯ

До протоколу дослідження включається така інформація:

2.3.1. Дослідна речовина:

- фізичний характер та відповідні фізико-хімічні властивості;

- дані хімічної ідентифікації, включаючи чистоту та аналітичний метод визначення кількості дослідної речовини, де прийнятно.

2.3.2. Дослідні види:

- наукова назва, різновид, кількість батьківської риби (тобто скільки самок було використано для одержання необхідної кількості ікринок для дослідження), джерело і метод збору запліднених ікринок та наступне поводження з ними.

2.3.3. Умови дослідження:

- використана процедура дослідження (наприклад, напівстатична чи проточна, період часу від запліднення до початку дослідження, завантаження тощо);

- світловий період (періоди);

- структура дослідження (наприклад, кількість дослідних камер та реплікацій, кількість ембріонів на реплікацію);

- метод приготування базових розчинів та періодичність оновлення (у разі використання, повинен бути зазначений розчинювальний реагент та його концентрація);

- номінальні дослідні концентрації, виміряні значення, їх середні значення і середньоквадратичні відхилення в дослідних посудинах та метод, за допомогою якого значення були одержані, а також, якщо дослідна речовина розчинна у воді при концентраціях, що менші ніж досліджені, інформація про те, що вимірювання стосуються концентрацій дослідної речовини в розчині;

- характеристики розчинної води: pH, жорсткість, температура, концентрація розчиненого кисню, рівні залишкового хлору (якщо вимірювалося), загальний вміст органічного вуглецю, тверді зависі, мінералізація дослідного середовища (якщо вимірювалося) та інші проведені вимірювання;

- якість води в дослідних посудинах: pH, жорсткість, температура та концентрація розчиненого кисню.

2.3.4. Результати:

- результати будь-яких попередніх досліджень щодо стабільності дослідної речовини;

- інформація про відповідність контролю стандарту загальної виживаності дослідних видів (Доповнення 2 та 3);

- дані щодо смертності/виживаності на стадіях ембріона та личинки, а також загальна смертність/виживаність;

- днів до вилуплення личинок та їх кількість;

- дані щодо довжини (та ваги);

- кількість та опис морфологічних анормальностей, якщо такі є;

- кількість та опис поведінкових проявів, якщо такі є;

- статистичний аналіз та обробка даних;

- для досліджень, проаналізованих за допомогою ANOVA, найнижча спостережена ефективна концентрація (НСЕК), при p = 0,05, та концентрація, що не призводить до видимих ефектів (КНВЕ), по кожній оціненій реакції, включаючи опис використаних статистичних процедур та інформацію про те, який за обсягом ефект міг бути виявлений;

- для досліджень, проаналізованих за допомогою регресійних методів, LC/EC та довірчі інтервали, а також графік моделі, x

вибраної для їх розрахунку;

- пояснення будь-яких відхилень від методу дослідження.

3. ПОСИЛАННЯ

(1) Kristensen P., (1990) Evaluation of the Sensitivity of Short Term Fish Early Life Stage Tests in Relation to other FELS Test Methods. Final report to the Commission of the European Communities, p. 60. June 1990.

(2) ASTM (1988) Standard Guide for Conducting Early Life-Stage Toxicity Tests with Fishes. American Society for Testing and Materials. E 1241-88. p. 26

(3) Brauhn J.L. and Schoettger R.A., (1975) Acquisition and Culture of Research Fish: Rainbow trout, Fathead minnows, Channel Catfish and Bluegills. p. 54, Ecological Research Series, EPA-660/3-75-011, Duluth, Minnesota.

(4) Brungs W.A. and Jones B.R., (1977) Temperature Criteria for Freshwater Fish: Protocol and Procedures p. 128, Ecological Research Series EPA-600/3-77-061, Duluth, Minnesota.

(5) Laale H.W., (1977) The Biology and Use of the Zebrafish (Brachydanio rerio) in Fisheries Research. A Literature Review. J.Biol. 10, p. 121-173.

(6) Legault R. (1958) A Technique for Controlling the Time of Daily Spawning and Collecting Eggs of the Zebrafish, Brachydanio rerio (Hamilton-Buchanan) Copeia, 4, p. 328-330.

(7) Dave G., Damgaard B., Grande M., Martelin J.E., Rosander B. and Viktor T., (1987) Ring Test of an Embryo-larval Toxicity Test with Zebrafish (Brachydanio rerio) Using Chromium and Zinc as Toxicants. Environmental Toxicology and Chemistry, 6, p. 61-71.

(8) Birge J.W., Black J.A. and Westerman A.G., (1985) Short-term Fish and Amphibian Embryo-larval Tests for Determining the Effects of Toxicant Stress on Early Life Stages and Estimating Chronic Values for Single Compounds and Complex Effluents. Environmental Toxicology and Chemistry 4, p. 807-821.

(9) Van Leeuwen C.J., Espeldoorn A. and Mol F. (1986) Aquatic Toxicological Aspects of Dithiocarbamates and Related Compounds. III. Embryolarval Studies with Rainbow Trout (Salmo gairdneri). J. Aquatic Toxicology, 9, p. 129-145.

(10) Kirchen R.V. and W.R. West (1969) Teleostean Development. Carolina Tips 32(4): 1-4. Carolina Biological Supply Company.

(11) Kirchen R.V. and W.R. West (1976) The Japanese Medaka. Its care and Development. Carolina Biological Supply Company, North Carolina. p. 36.

(12) Dunnett C.W., (1955) A Multiple Comparisons Procedure for Comparing Several Treatments with Control. J. Amer. Statist. Assoc., 50, p. 1096-1121.

(13) Dunnett C.W. (1964) New Tables for Multiple Comparisons with a Control. Biometrics, 20, p. 482-491.

(14) Mc Clave J.T., Sullivan J.H. and Pearson J.G., (1980) Statistical Analysis of Fish Chronic Toxicity Test Data. Proceedings of 4th Aquatic Toxicology Symposium, ASTM, Philadelphia.

(15) Van Leeuwen C.J., Adema D.M.M. and Hermes J., (1990) Quantitative Structure-Activity Relationships for Fish Early Life Stage Toxicity. Aquatic Toxicology, 16, p. 321-334.

(16) Environment Canada., (1992) Toxicity Tests Using Early Life Stages of Salmonid Fish (Rainbow Trout, Coho Salmon or Atlantic Salmon). Biological Test Method Series. Report EPS 1/RM/28, December 1992, p. 81.

(17) Dave G. and Xiu R., (1991) Toxicity of Mercury, Nickel, Lead and Cobalt to Embryos and Larvae of Zebrafish, Brachydanio rerio. Arch. of Environmental Contamination and Toxicology, 21, p. 126-134.

(18) Meyer A., Bierman C.H. and Orti G., (1993) The phylogenetic position of the Zebrafish (Danio rerio), a model system in developmental biology - an invitation to the comperative methods. Proc. Royal Society of London, Series B, 252: 231-236.

(19) Ghillebaert F., Chaillou C., Deschamps F. and Roubaud P., (1995) Toxic Effects, at Three pH Levels, of Two Reference Molecules on Common Carp Embryo. Ecotoxicology and Environmental Safety 32, p. 19-28.

(20) US EPA, (1991) Guidelines for Culturing the Japanese Medaka, Oryzias latipes. EPA report EPA/600/3-91/ 064, Dec. 1991, EPA, Duluth.

(21) US EPA, (1991) Guidelines for Conducting Early Life Stage Toxicity Tests with Japanese Medaka, (Oryzias latipes). EPA report EPA/600/3-91/063, Dec. 1991, EPA, Duluth.

(22) De Graeve G.M., Cooney J.D., McIntyre D.O., Poccocic T.L., Reichenbach N.G., Dean J.H. and Marcus M.D., (1991) Validity in the performance of the seven-day Fathead minnow (Pimephales promelas) larval survival and growth test: an intra- and interlaboratory study. Environ. Tox. Chem. 10, p. 1189-1203.

(23) Calow P., (1993) Handbook of Ecotoxicology, Blackwells, Oxford. Vol. 1, chapter 10: Methods for spawning, culturing and conducting toxicity tests with Early Life stages of Estuarine and Marine fish.

(24) Balon E.K., (1985) Early life history of fishes: New developmental, ecological and evolutionary perspectives, Junk Publ., Dordrecht, p. 280.

(25) Blaxter J.H.S., (1988) Pattern and variety in development, In: W.S.Hoar and D.J.Randall Eds., Fish Physiology, vol. XIA, Academic press, p. 1-58.

Таблиця 1А

Види риби, рекомендовані для проведення дослідження

------------------------------------------------------------------
|                          ПРІСНОВОДНІ                           |
|----------------------------------------------------------------|
|Oncorhynchus mykiss                                             |
|Райдужна форель (9)(16)                                         |
|Danio rerio                                                     |
|Смугастий даніо (7)(17)(18)                                     |
|Cyprinus caprio                                                 |
|Короп звичайний (8)(19)                                         |
|Oryzias latipes                                                 |
|Японський медак (20)(21)                                        |
|Pimephales promelas                                             |
|Товстоголов (8)(22)                                             |
------------------------------------------------------------------

Таблиця 1В

Приклади інших документально підтверджених видів, які використовувалися для дослідження

------------------------------------------------------------------
|          ПРІСНОВОДНІ           |          СОЛОНОВОДНІ          |
|--------------------------------+-------------------------------|
|Carassius auratus               |Menidia peninsulae             |
|Срібний карась (8)              |Менідія (23)(24)(25)           |
|Lepomis macrochirus             |Clupea harengus                |
|Синьозяберник (8)               |Оселедець (24)(25)             |
|                                |Gadus morhua                   |
|                                |Тріска (24)(25)                |
|                                |Cyprinodon variegatus          |
|                                |Мінливий карпозубик (23)(24)   |
|                                |(25)                           |
------------------------------------------------------------------

Доповнення 1

ІНСТРУКЦІЇ ЩОДО ПРОВЕДЕННЯ ДОСЛІДЖЕННЯ НА ТОКСИЧНІСТЬ ДЛЯ ЕМБРІОНІВ ТА ПЕРЕДЛИЧИНОК СМУГАСТОГО ДАНІО (BRACHYDANIO RERIO)

ВСТУП

Смугастий даніо походить з Коромандельського узбережжя Індії, де він населяє швидкоплинні потоки. Це розповсюджена акваріумна рибка сімейства коропових і інформацію щодо догляду за нею та її розведення можна знайти у стандартних довідниках щодо тропічної риби. Її біологія та використання в дослідженнях була описана Лаалем (1).

Риба рідко перевищує 45 мм у довжину. Тулуб - циліндричний з 7-9 горизонтальними темно-синіми та сріблястими смужками. Ці смужки досягають хвостової частини та анальних плавників. Спинка - оливково-зелена. Самці тонші за самок. Самки більш сріблясті, їх черевна порожнина більш видовжена, особливо в період, що передує ікрометанню.

Дорослі риби можуть витримувати великі перепади температури, pH та жорсткості води. Однак, щоб одержати здорових риб, які можуть метати ікру гарної якості, потрібно підтримувати оптимальні умови.

У період ікрометання самці переслідують і торкаються самок, а після викидання ікри запліднюють її. Ікринки, які є прозорими та неклейкими, падають на дно, де їх можуть з'їсти батьки. Ікрометання залежить від світла. У разі наявності достатнього ранкового світла риба зазвичай мече ікру протягом кількох годин після світанку.

Самка може виробляти ікру порціями до кількох сотень ікринок з тижневою періодичністю.

УМОВИ УТРИМАННЯ БАТЬКІВСЬКОЇ РИБИ, ВІДТВОРЕННЯ ТА РАННІ СТАДІЇ ЖИТТЯ

Необхідна кількість здорової риби утримується в прийнятній воді (див. Додаток 4) протягом принаймні двох тижнів до планованого ікрометання. Група риби повинна принаймні один раз дати потомство до вироблення порції ікри, яка буде використовуватися для дослідження. Скупченість риби протягом цього періоду не повинна перевищувати 1 грам риби на літр. У разі регулярної заміни води або використання очищувальних систем скупченість може бути більшою. Температура в резервуарах, у яких утримується риба, повинна підтримуватися на рівні 25 +- 2 град.C. Риба повинна одержувати різноманітну дієту, яка може складатися з, наприклад, відповідного комерційного сухого корму, живих щойно вилуплених артемій, хірономід, дафній, білих черв'яків (Enchytraeids).

Нижче наведені дві процедури, які на практиці дозволили одержати достатню кількість здорових запліднених ікринок для проведення дослідження:

i) Вісім самок і 16 самців розміщуються в резервуарі з 50 літрами розчинної води, захищені від прямого світла і залишені в якнайбільшому спокої протягом принаймні 48 годин. Увечері напередодні початку дослідження на дно акваріума ставиться ящик для ікри. Ящик для ікри складається з рамки (з плексигласу або іншого придатного матеріалу) заввишки 5-7 см, а також крупної сітки (2-5 мм) зверху рамки та дрібної сітки (10-30 мікрон) знизу рамки. До крупної сітки приєднується низка мотузок із некрученого нейлону у вигляді "дерев для нересту". Після того, як риба провела в темряві 12 годин, вмикається слабке світло, що стимулює початок ікрометання. Через дві-чотири години після ікрометання ящик для ікри вилучається, а ікра збирається. Ящик для ікри не дозволить рибі з'їсти ікру і, водночас, дозволить легко її зібрати. До того ікрометання, ікра від якого використовуватиметься для дослідження, група риби повинна провести принаймні одне ікрометання.

ii) Від п'яти до десяти самців та самок розміщуються окремо протягом принаймні двох тижнів до планованого ікрометання. Через 5-10 днів черевні порожнини самок видовжуються, а їх статеві горбики стають видимими. У самців горбики відсутні. Ікрометання відбувається у резервуарах, на дні яких знаходиться сітка (як описано вище). Резервуар наповнюється розчинною водою таким чином, щоб глибина води над сіткою складала від 5 до 10 см. Одна самка і два самці поміщаються в резервуар напередодні планованого ікрометання. Температура води поступово збільшується на один градус вище, ніж температура акліматизації. Світло вимикається, а резервуар залишається в якнайбільшому спокої. Вранці вмикається слабке світло, що стимулює початок ікрометання. Через дві-чотири години риба видаляється, а ікра збирається. У разі, якщо потрібна більша кількість ікри, ніж може бути одержано від однієї самки, паралельно закладається кілька резервуарів. Якщо до початку дослідження фіксувати продуктивність (кількість та якість порції ікри) окремих самок, можна відбирати найпродуктивніших із них для розведення.

Ікра переноситься до дослідних посудин за допомогою скляної трубки (внутрішній діаметр не менше ніж 4 мм), до якої приєднаний гнучкий ковпачок-насос. Ікринки потрібно переносити в якнайменшій кількості води. Ікринки важчі ніж вода і спливають на поверхню води в трубці. Потрібно запобігти контакту ікринок (і личинок) з повітрям. Для перевірки відсутності анормальностей на початкових стадіях розвитку потрібно провести дослідження зразка/зразків партії/партій ікри за допомогою мікроскопа. Дезінфекція ікри не допускається.

Рівень смертності ікринок вищий протягом перших 24 годин після запліднення. Протягом цього періоду часто спостерігається смертність на рівні 5-40%. Ікринки дегенерують в результаті неуспішного запліднення або вад розвитку. Якість партії ікри, як здається, залежить від самки, оскільки деякі самки продукують ікру гарної якості постійно, тоді як деякі ніколи. Також, від однієї партії до іншої різняться швидкість розвитку та швидкість вилуплення. Успішно запліднені ікринки та передличинки мають гарну виживаність, зазвичай на рівні вище 90%. При температурі 25 град.С вилуплення відбувається протягом трьох-п'яти днів після запліднення, а жовтковий мішок поглинається приблизно через 13 днів після запліднення.

Ембріональний розвиток був добре вивчений (Хісоака та Беттл) (2). Оскільки ікринки та личинки, що вилупилися, є прозорими, за розвитком риби можна спостерігати і виявляти будь-які вади розвитку. Приблизно через чотири години після ікрометання незапліднені ікринки можна відрізнити від запліднених (3). Для цього ікринки та личинки поміщаються в дослідні посудини невеликого об'єму і вивчаються під мікроскопом.

Умови дослідження, які стосуються ранніх стадій життя, перелічені в Доповненні 2. Оптимальні показники pH та жорсткості розчинної води складають 7,8 і 250 мг CaCO /л відповідно. 3

РОЗРАХУНКИ ТА СТАТИСТИКА

Пропонується підхід у два етапи. Спочатку проводиться статистичний аналіз даних щодо смертності, анормального розвитку та строків вилуплення. Потім, щодо тих концентрацій, за якими не було виявлено жодних негативних ефектів за будь-яким із цих параметрів, проводиться статистична оцінка довжини тулуба. Цей підхід є рекомендованим, оскільки токсична речовина може вибірково вбивати меншу рибу, затримувати час вилуплення та спричиняти значні вади розвитку, що, таким чином, призводить до одержання спотворених вимірювань довжини. Крім того, під час кожної процедури вимірюватиметься приблизно однакова кількість риби, що забезпечить достовірність статистичного аналізу.

ВИЗНАЧЕННЯ LC ТА EC 50 50

Відсоток ікринок та личинок, що вижили, підраховується і коригується на смертність у контролях за формулою Ебботта (4):

C - P'
                     P = 100 - (------ x 100)
                                  C

де:

P = скоригований % виживання

Р' = % виживання в дослідній концентрації

С = % виживання в контролі.

Якщо можливо, LC визначається прийнятним методом наприкінці 50

дослідження.

Якщо потрібно включити морфологічні анормальності із використанням методу EC , інструкції можна знайти у праці Стефана 50

(5).

ОЦІНКА НСЕК ТА КНВЕ

Метою дослідження для ікри та передличинок є порівняння ненульових концентрацій із контролем, тобто визначити НСЕК. Тому необхідне використання процедур множинного порівняння (6)(7)(8)(9)(10).

ПОСИЛАННЯ

(1) Laale H.W., (1977) The Biology and Use of the Zebrafish (Brachydanio rerio) in Fisheries Research. A Literature Review. J. Fish Biol. 10, p. 121-173.

(2) Hisaoka K.K. and Battle H.I., (1958). The Normal Development Stages of the Zebrafish Brachydanio rerio (Hamilton-Buchanan) J. Morph., 102, p. 311.

(3) Nagel R., (1986). Untersuchungen zur Eiproduktion beim Zebrabarbling (Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan). Journal of Applied Ichthyology, 2, p. 173-181.

(4) Finney D.J., (1971). Probit Analysis, 3rd ed., Cambridge University Press, Great Britain, p. 1-333.

(5) Stephan C.E., (1982). Increasing the Usefulness of Acute Toxicity Tests. Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: Fifth Conference, ASTM STP 766, J.G. Pearson, R.B. Foster and W.E. Bishop, Eds., American Society for Testing and Materials, p. 69-81.

(6) Dunnett C.W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for Comparing Several Treatments with a Control. J. Amer. Statist. Assoc., 50, p. 1096-1121.

(7) Dunnett C.W., (1964) New Tables for Multiple Comparisons with a Control. Biometrics, 20, p. 482-491.

(8) Williams D.A., (1971). A Test for Differences Between Treatment Means when Several Dose Levels are Compared with a Zero Dose Control. Biometrics, 27, p. 103-117.

(9) Williams D.A., (1972). The Comparison of Several Dose Levels with a Zero Dose Control. Biometrics 28, p. 519-531.

(10) Sokal R.R. and Rohlf F.J., (1981). Biometry, the Principles and Practice of Statistics in Biological Research, W.H. Freeman and Co., San Francisco.

Доповнення 2

УМОВИ ДОСЛІДЖЕННЯ, ТРИВАЛІСТЬ ТА КРИТЕРІЇ ВИЖИВАННЯ ДЛЯ РЕКОМЕНДОВАНИХ

-------------------------------------------------------------------------------------------------------------
|    Види    |Температура|Мінералізація|Світловий|  Тривалість стадій |  Типова   |  Виживання в контролі   |
|            | (град.С)  |    (0/00)   |  період |       (днів)       |тривалість |       (мінімум %)       |
|            |           |             | (годин) |--------------------|дослідження|-------------------------|
|            |           |             |         |Ембріон|Передличинка|           |  Успішне   |    Після   |
|            |           |             |         |       |            |           |вилуплювання|вилуплювання|
|------------+-----------+-------------+---------+-------+------------+-----------+------------+------------|
|ПРІСНОВОДНІ |           |             |         |       |            |           |            |            |
|------------+-----------+-------------+---------+-------+------------+-----------+------------+------------|
|Danio rerio |  25 +- 1  |      -      |  12-16  |  3-5  |    8-10    |Якнайшвидше|     80     |     90     |
|Смугастий   |           |             |         |       |            |після      |            |            |
|даніо       |           |             |         |       |            |запліднення|            |            |
|            |           |             |         |       |            |(рання     |            |            |
|            |           |             |         |       |            |стадія     |            |            |
|            |           |             |         |       |            |гаструли), |            |            |
|            |           |             |         |       |            |до 5 днів  |            |            |
|            |           |             |         |       |            |після      |            |            |
|            |           |             |         |       |            |вилуплення |            |            |
|            |           |             |         |       |            |(8-10 днів)|            |            |
|------------+-----------+-------------+---------+-------+------------+-----------+------------+------------|
|Oncorhynchus| 10 +- 1(1)|      -      |  0(a)   | 30-35 |    25-30   |Якнайшвидше|     66     |     70     |
|mykiss      | 12 +- 1(2)|             |         |       |            |після      |            |            |
|Райдужна    |           |             |         |       |            |запліднення|            |            |
|форель      |           |             |         |       |            |(рання     |            |            |
|            |           |             |         |       |            |стадія     |            |            |
|            |           |             |         |       |            |гаструли), |            |            |
|            |           |             |         |       |            |до 20 днів |            |            |
|            |           |             |         |       |            |після      |            |            |
|            |           |             |         |       |            |вилуплення |            |            |
|            |           |             |         |       |            |(50-55     |            |            |
|            |           |             |         |       |            |днів)      |            |            |
|------------+-----------+-------------+---------+-------+------------+-----------+------------+------------|
|Cyprinus    |   21-25   |      -      |  12-16  |   5   |    > 4     |Якнайшвидше|     80     |     75     |
|caprio      |           |             |         |       |            |після      |            |            |
|Короп       |           |             |         |       |            |запліднення|            |            |
|звичайний   |           |             |         |       |            |(рання     |            |            |
|            |           |             |         |       |            |стадія     |            |            |
|            |           |             |         |       |            |гаструли), |            |            |
|            |           |             |         |       |            |до 4 днів  |            |            |
|            |           |             |         |       |            |після      |            |            |
|            |           |             |         |       |            |вилуплення |            |            |
|            |           |             |         |       |            |(8-9 днів) |            |            |
|------------+-----------+-------------+---------+-------+------------+-----------+------------+------------|
|Oryzias     |24 +- 1(1) |      -      |  12-16  |  8-11 |    4-8     |Якнайшвидше|     80     |     80     |
|latipes     |23 +- 1(2) |             |         |       |            |після      |            |            |
|Японський   |           |             |         |       |            |запліднення|            |            |
|медак       |           |             |         |       |            |(рання     |            |            |
|            |           |             |         |       |            |стадія     |            |            |
|            |           |             |         |       |            |гаструли), |            |            |
|            |           |             |         |       |            |до 5 днів  |            |            |
|            |           |             |         |       |            |після      |            |            |
|            |           |             |         |       |            |вилуплення |            |            |
|            |           |             |         |       |            |(13-16     |            |            |
|            |           |             |         |       |            |днів)      |            |            |
|------------+-----------+-------------+---------+-------+------------+-----------+------------+------------|
|Pimephales  |  25 +- 2  |      -      |    16   |  4-5  |      5     |Якнайшвидше|     60     |     70     |
|promelas    |           |             |         |       |            |після      |            |            |
|Товстоголов |           |             |         |       |            |запліднення|            |            |
|            |           |             |         |       |            |(рання     |            |            |
|            |           |             |         |       |            |стадія     |            |            |
|            |           |             |         |       |            |гаструли), |            |            |
|            |           |             |         |       |            |до 4 днів  |            |            |
|            |           |             |         |       |            |після      |            |            |
|            |           |             |         |       |            |вилуплення |            |            |
|            |           |             |         |       |            |(8-9 днів) |            |            |
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------

----------------

(1) Для ембріонів.

(2) Для личинок.

(a) Темрява для ембріона та личинки протягом одного тижня з моменту вилуплення за винятком часу на перевірку. Потім приглушене світло протягом усього дослідження.

Доповнення 3

Умови дослідження, тривалість та критерії виживання для інших документально підтверджених видів

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------
|    Види     |Температура|Мінералізація|Світловий|  Тривалість стадій |   Типова   |  Виживання в контролі   |
|             | (град.С)  |    (0/00)   |  період |       (днів)       | тривалість |       (мінімум %)       |
|             |           |             | (годин) |--------------------|дослідження |-------------------------|
|             |           |             |         |Ембріон|Дослідження |ембріона та |  Успішне   |    Після   |
|             |           |             |         |       |передличинки|передличинки|вилуплювання|вилуплювання|
|-------------+-----------+-------------+---------+-------+------------+------------+------------+------------|
|ПРІСНОВОДНІ  |           |             |         |       |            |            |            |            |
|-------------+-----------+-------------+---------+-------+------------+------------+------------+------------|
|Carassius    |  24 +- 1  |      -      |    -    |  3-4  |    > 4     |Якнайшвидше |      -     |     80     |
|auratus      |           |             |         |       |            |після       |            |            |
|Срібний      |           |             |         |       |            |запліднення |            |            |
|карась       |           |             |         |       |            |(рання      |            |            |
|             |           |             |         |       |            |стадія      |            |            |
|             |           |             |         |       |            |гаструли),  |            |            |
|             |           |             |         |       |            |до 4 днів   |            |            |
|             |           |             |         |       |            |після       |            |            |
|             |           |             |         |       |            |вилуплення  |            |            |
|             |           |             |         |       |            |(7 днів)    |            |            |
|-------------+-----------+-------------+---------+-------+------------+------------+------------+------------|
|Leopomis     |  21 +- 1  |      -      |    16   |   3   |    > 4     |Якнайшвидше |      -     |     75     |
|macrochirus  |           |             |         |       |            |після       |            |            |
|Синьозяберник|           |             |         |       |            |запліднення |            |            |
|             |           |             |         |       |            |(рання      |            |            |
|             |           |             |         |       |            |стадія      |            |            |
|             |           |             |         |       |            |гаструли),  |            |            |
|             |           |             |         |       |            |до 4 днів   |            |            |
|             |           |             |         |       |            |після       |            |            |
|             |           |             |         |       |            |вилуплення  |            |            |
|             |           |             |         |       |            |(7 днів)    |            |            |
|-------------+-----------+-------------+---------+-------+------------+------------+------------+------------|
|СОЛОНОВОДНІ  |           |             |         |       |            |            |            |            |
|-------------+-----------+-------------+---------+-------+------------+------------+------------+------------|
|Menidia      |   22-25   |    15-22    |    12   |  1,5  |     10     |Якнайшвидше |     80     |     60     |
|peninsulae   |           |             |         |       |            |після       |            |            |
|Менідія      |           |             |         |       |            |запліднення |            |            |
|             |           |             |         |       |            |(рання      |            |            |
|             |           |             |         |       |            |стадія      |            |            |
|             |           |             |         |       |            |гаструли),  |            |            |
|             |           |             |         |       |            |до 5 днів   |            |            |
|             |           |             |         |       |            |після       |            |            |
|             |           |             |         |       |            |вилуплення  |            |            |
|             |           |             |         |       |            |(6-7 днів)  |            |            |
|-------------+-----------+-------------+---------+-------+------------+------------+------------+------------|
|Clupea       |  10 +- 1  |    8-15     |    12   | 20-25 |    3-5     |Якнайшвидше |     60     |     80     |
|harengus     |           |             |         |       |            |після       |            |            |
|Оселедець    |           |             |         |       |            |запліднення |            |            |
|             |           |             |         |       |            |(рання      |            |            |
|             |           |             |         |       |            |стадія      |            |            |
|             |           |             |         |       |            |гаструли),  |            |            |
|             |           |             |         |       |            |до 3 днів   |            |            |
|             |           |             |         |       |            |після       |            |            |
|             |           |             |         |       |            |вилуплення  |            |            |
|             |           |             |         |       |            |(23-27 днів)|            |            |
|-------------+-----------+-------------+---------+-------+------------+------------+------------+------------|
|Gadus morhua |   5 +- 1  |    5-30     |    12   | 14-16 |    3-5     |Якнайшвидше |     60     |     80     |
|Тріска       |           |             |         |       |            |після       |            |            |
|             |           |             |         |       |            |запліднення |            |            |
|             |           |             |         |       |            |(рання      |            |            |
|             |           |             |         |       |            |стадія      |            |            |
|             |           |             |         |       |            |гаструли),  |            |            |
|             |           |             |         |       |            |до 3 днів   |            |            |
|             |           |             |         |       |            |після       |            |            |
|             |           |             |         |       |            |вилуплення  |            |            |
|             |           |             |         |       |            |(18 днів)   |            |            |
|-------------+-----------+-------------+---------+-------+------------+------------+------------+------------|
|Cyprinodon   |  25 +- 1  |    15-30    |    12   |   -   |      -     |Якнайшвидше |    > 75    |     80     |
|variegatus   |           |             |         |       |            |після       |            |            |
|Мінливий     |           |             |         |       |            |запліднення |            |            |
|карпозубик   |           |             |         |       |            |(рання      |            |            |
|             |           |             |         |       |            |стадія      |            |            |
|             |           |             |         |       |            |гаструли),  |            |            |
|             |           |             |         |       |            |до 4/7 днів |            |            |
|             |           |             |         |       |            |після       |            |            |
|             |           |             |         |       |            |вилуплення  |            |            |
|             |           |             |         |       |            |(28 днів)   |            |            |
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Доповнення 4

ДЕЯКІ ХІМІЧНІ ХАРАКТЕРИСТИКИ ПРИЙНЯТНОЇ РОЗЧИННОЇ ВОДИ

------------------------------------------------------------------
|                      Речовина                     |Концентрація|
|---------------------------------------------------+------------|
|Тверді частинки                                    |  < 20 мг/л |
|---------------------------------------------------+------------|
|Загальний вміст органічного вуглецю                |  < 2 мг/л  |
|---------------------------------------------------+------------|
|Неіонізований аміак                                |  < 1 мкг/л |
|---------------------------------------------------+------------|
|Залишковий хлор                                    | < 10 мкг/л |
|---------------------------------------------------+------------|
|Загальний вміст фосфорорганічних пестицидів        |  < 50 нг/л |
|---------------------------------------------------+------------|
|Загальний вміст хлорорганічних пестицидів плюс     |  < 50 нг/л |
|поліхлорбіфеніли                                   |            |
|---------------------------------------------------+------------|
|Загальний вміст органічного хлору                  |  < 25 нг/л |
------------------------------------------------------------------

C.16. МЕДОНОСНІ БДЖОЛИ - ДОСЛІДЖЕННЯ НА ГОСТРУ ПЕРОРАЛЬНУ ТОКСИЧНІСТЬ

1. МЕТОД

Цей метод дослідження на гостру токсичність є аналогом дослідження ОЕСР TG 213 (1998).

1.1. ВСТУП

Це дослідження на токсичність є лабораторним методом, призначеним для оцінки гострої пероральної токсичності продуктів захисту рослин та інших хімічних речовин для дорослих робочих медоносних бджіл.

При оцінці токсичних характеристик речовин може бути необхідним визначення їх гострої пероральної токсичності для медоносних бджіл, наприклад, коли існує ймовірність потрапляння бджіл у середовище з певною хімічною речовиною. Дослідження на гостру пероральну токсичність проводиться для визначення токсичності, притаманної пестицидам та іншим хімічним речовинам, для бджіл. Результати цього дослідження використовуються для визначення необхідності проведення подальших досліджень. Зокрема, цей метод може використовуватися у комплексних програмах оцінки небезпеки пестицидів для бджіл з послідовним переходом від лабораторних досліджень на токсичність до напів-польових та польових експериментів (1). Пестициди можуть досліджуватися як за своїми активними речовинами, так і як складені продукти.

Для перевірки чутливості бджіл та точності процедури дослідження використовуються стандарти токсичності.

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ

Гостра пероральна токсичність: негативні ефекти, що проявляються протягом максимального періоду, який складає 96 годин, після перорального введення однієї дози дослідної речовини.

Доза: обсяг спожитої дослідної речовини. Доза виражається як маса (мкг) дослідної речовини на одну піддослідну тварину (мкг/бджолу). Реальна доза для кожної бджоли не може бути розрахована, оскільки бджоли годуються разом, натомість оцінюється середня доза (загальна кількість спожитої дослідної речовини на кількість піддослідних бджіл у одній клітці).

LD (середня летальна доза), пероральна: статистично 50

розрахована   доза   прийнятої   перорально   речовини,  яка  може
спричинити смерть 50%  тварин.  Значення LD    виражається  у  мкг
                                           50
дослідної  речовини  на  бджолу.  Для пестицидів дослідна речовина
може бути або активною речовиною,  або складеним  продуктом,  який
містить одну або більше активних речовин.

Смертність: тварина вважається мертвою, якщо вона повністю нерухома.

1.3. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

Дорослі робочі медоносні бджоли (Apis mellifera) піддаються впливу низки доз дослідної речовини, розчиненої в розчині цукрози. Потім бджоли одержують таку ж дієту без дослідної речовини. Смертність фіксується щоденно протягом принаймні 48 годин і порівнюється з контролем. Якщо рівень смертності збільшується в період між 24 та 48 годинами, тоді як у контролі смертність лишається на прийнятному рівні, тобто <= 10%, доцільно продовжити тривалість дослідження до максимум 96 годин. Для розрахунку LD 50 результати аналізуються станом на 24 годину та 48 годину, а якщо тривалість дослідження була продовжена, то станом на 72 годину і на 96 годину.

1.4. ДОСТОВІРНІСТЬ ДОСЛІДЖЕННЯ

Достовірність дослідження підтверджується такими умовами:

- на кінець дослідження середня смертність у контролі не перевищує 10% від загальної кількості бджіл у контролі;

- LD стандарту токсичності перебуває у встановлених межах. 50

1.5. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

1.5.1. Збирання бджіл

Для дослідження використовуються молоді робочі бджоли однієї раси, тобто бджоли одного віку, харчового статусу тощо. Відбираються бджоли, які адекватно харчувалися, здорові, із благополучних і керованих королевою колоній з відомою історією та фізіологічним станом. Бджоли можуть збиратися вранці в день дослідження або ввечері напередодні дослідження і утримуватися до наступного дня в умовах дослідження. Підходять бджоли, відібрані з рамок, без наприску. Потрібно уникати збирання бджіл ранньою весною або пізньою осінню, оскільки в цей час у бджіл відбуваються фізіологічні зміни. Якщо дослідження потрібно провести ранньою весною або пізньою осінню, бджіл можна помістити в інкубатор і протягом одного тижня годувати "бджолиним хлібом" (пилком, відібраним із стільників) і розчином цукрози. Бджіл, яких лікували хімічними речовинами, такими як антибіотики, противаротозні препарати тощо, використовувати для дослідження на токсичність не можна протягом чотирьох тижнів після закінчення останнього лікування.

1.5.2. Умови утримання і годування

Використовуються легкі в прибиранні та добре вентильовані клітки. Можуть використовуватися клітки, виготовлені з будь-якого прийнятного матеріалу, наприклад, нержавіючої сталі, дротяної сітки, пластику або ж одноразові дерев'яні клітки тощо. Бажано в одній клітці розміщувати групу з 10 бджіл. Розмір дослідних кліток повинен відповідати кількості бджіл, тобто забезпечувати достатньо місця для їх розміщення.

Бджоли утримуються у темряві в експериментальній кімнаті при температурі 25 +- 2 град.C. Відносна вологість, зазвичай, повинна становити близько 50-70% і повинна фіксуватися протягом усього дослідження. Робота з бджолами, включаючи догляд за ними та проведення спостережень, може виконуватися при (денному) світлі. Для годування бджіл використовується водний розчин цукрози з кінцевою концентрацією 500 г/л (співвідношення ваги і об'єму 50%). Після застосування дослідних доз годування здійснюється без обмежень. Система подачі корму повинна дозволяти проводити фіксацію прийому їжі для кожної клітки (див. Секцію 1.6.3.1). Можна використовувати скляну трубку довжиною приблизно 50 мм і шириною приблизно 10 мм, відкритий кінчик якої звужений до діаметру приблизно 2 мм.

1.5.3. Підготовка бджіл

Зібрані бджоли довільно розміщуються по дослідних клітках, які довільно розташовуються в експериментальній кімнаті.

Бджоли можуть бути позбавлені їжі за 2 години до початку дослідження. Рекомендується позбавляти бджіл їжі, щоб вони мали однаковий стан наповнення кишечника до початку дослідження. Перед початком дослідження вмираючі бджоли повинні бути вилучені і замінені здоровими.

1.5.4. Підготовка доз

Якщо дослідна речовина є сполукою, розчинною у воді, її можна розчинити безпосередньо в 50% розчині цукрози. Для технічних продуктів та речовин з низькою розчинністю у воді можна використовувати такі реагенти, як органічні розчинники, емульгатори або диспергатори з низькою токсичністю (наприклад, ацетон, диметилформамід, диметилсульфоксид). Концентрація реагенту залежить від розчинності дослідної речовини і повинна бути однаковою для всіх дослідних концентрацій. Однак, прийнятна концентрація реагенту, яка не повинна перевищуватися, складає 1%.

Потрібно підготувати відповідні контрольні розчини. Тобто, якщо для розчинення дослідної речовини необхідне використання розчинника або диспергатора, потрібно створити два контролі: водний розчин і розчин цукрози з додаванням розчинника/реагенту з такою концентрацією, яка відповідає дослідним розчинам.

1.6. ПРОЦЕДУРА

1.6.1. Дослідні та контрольні групи

Кількість дослідних доз та реплікацій повинна відповідати статистичним вимогам для визначення LD з 95% довірчим 50

інтервалом.  Зазвичай  для  проведення  дослідження  достатнім   є
використання  п'яти  доз  в  геометричній прогресії з множником не
більше 2,2,  які б охоплювали необхідний для LD   діапазон. Однак,
                                               50
потрібно    визначити    коефіцієнт   розрідження   та   кількість
концентрацій  для  підготовки  доз  залежно  від   нахилу   кривої
токсичності  (відношення  дози  та  смертності)  та  з урахуванням
статистичного методу, вибраного для аналізу результатів. Необхідні
концентрації    можна    визначити   за   допомогою   діапазонного
дослідження.

Дозу кожної дослідної концентрації повинні одержати мінімум три реплікації дослідних груп по 10 бджіл кожна. Крім дослідних груп повинні бути створені мінімум три контрольні групи по 10 бджіл кожна. Контрольні групи також повинні бути створені з використанням застосованих розчинників/реагентів (див. Секцію 1.5.4).

1.6.2. Стандарт токсичності

Дослідження повинно включати перевірку з використанням стандарту токсичності. Потрібно вибрати принаймні три дози в межах очікуваного показника LD . Кожна дослідна доза повинна 50

застосовуватися мінімум у трьох реплікаціях  кліток  по  10  бджіл
кожна.  Бажаний  стандарт  токсичності - диметоат,  відносно якого
підтверджений  пероральний  LD  /24  год.  перебуває  в  діапазоні
                              50
0,10-0,35  мкг  активної  речовини  на  бджолу (2).  Однак,  можна
використовувати  інші  стандарти  токсичності  у  разі   наявності
достатніх   даних   для   перевірки  очікуваної  реакції  на  дозу
(наприклад, паратіон).

1.6.3. Застосування

1.6.3.1. Застосування доз

Кожна дослідна група бджіл одержує 100-200 мкл 50% водного розчину цукрози, який містить відповідну концентрацію дослідної речовини. Для речовин з низькою розчинністю, низькою токсичністю чи низькою концентрацією в продукті може бути потрібен більший об'єм, оскільки до розчину цукрози потрібно буде додати більшу частку таких речовин. Потрібно спостерігати за кількістю дослідної їжі, спожитою в кожній групі. Після споживання (зазвичай протягом 3-4 годин), годівниця видаляється із клітки і замінюється годівницею, яка містить лише розчин цукрози. Надалі його вже можна споживати без обмежень. Через максимум 6 годин неспожита дослідна їжа замінюється звичайним розчином цукрози. Стосовно деяких сполук в їх вищих концентраціях, відмова від дослідної дози може призвести до незначного споживання або повної відсутності споживання їжі. Через максимум 6 годин неспожита дослідна їжа замінюється звичайним розчином цукрози. Обсяг спожитої дослідної їжі потрібно оцінити (наприклад, шляхом вимірювання об'єму/ваги дослідної їжі, що залишилася).

1.6.3.2. Тривалість

Бажана тривалість дослідження - 48 годин після заміни дослідного розчину розчином, що містить лише цукрозу. Якщо смертність продовжує зростати більше ніж на 10% після перших 24 годин, тривалість дослідження потрібно продовжити максимум до 96 годин за умови, що в контролі смертність не перевищує 10%.

1.6.4. Спостереження

Смертність фіксується станом на 4 годину з моменту початку дослідження, а потім станом на 24 та 48 години (тобто після одержання дози). У разі продовження періоду спостереження, подальша фіксація здійснюється з 24-годинними інтервалами до максимум 96 години, за умови, що смертність в контролі не перевищує 10%.

Обсяг спожитої їжі по кожній групі потрібно оцінити. Порівняння рівнів споживання дослідної і звичайної їжі протягом 6 годин може надати інформацію щодо смакової привабливості дослідної їжі.

Потрібно фіксувати всі прояви анормальної поведінки, помічені під час дослідження.

1.6.5. Граничне дослідження

У деяких випадках (наприклад, коли очікується, що дослідна речовина має низьку токсичність) може бути проведене граничне дослідження з дозою 100 мкг активної речовини на бджолу, щоб підтвердити, що показник LD більший за одержане значення. 50

Використовується   така  ж  процедура,  включаючи  три  реплікації
дослідних  груп,  відповідні  контролі,  оцінку  обсягу   спожитої
дослідної  їжі  та  використання  стандарту  токсичності.  У  разі
наявності смертей, проводиться повне дослідження. У разі наявності
сублетальних проявів (див. Секцію 1.6.4), вони фіксуються.

2. ДАНІ ТА ЗВІТНІСТЬ

2.1. ДАНІ

Готуються підсумкові таблиці, які повинні містити дані по кожній дослідній групі, а також групах контролю та стандарту токсичності, щодо кількості використаних бджіл, смертності на кожен період спостереження та кількості бджіл з анормальною поведінкою. Дані щодо смертності аналізуються за допомогою відповідних статистичних методів (наприклад, пробіт-аналізу, змінного середнього, біноміальної вірогідності) (3)(4). Будуються криві реакції на дозу станом на кожен рекомендований період спостереження, розраховуються нахили кривих і середні летальні дози LD з 95% довірчим інтервалом. Корекція на смертність у 50

контролі може здійснюватися за допомогою методу Ебботта (4)(5).  У
разі,  якщо оброблена їжа спожита не повністю,  потрібно визначити
дозу дослідної речовини,  спожиту в групі.  LD   виражається в мкг
                                              50
дослідної речовини на бджолу.

2.2. ПРОТОКОЛ ДОСЛІДЖЕННЯ

До протоколу дослідження включається така інформація:

2.2.1. Дослідна речовина:

- фізичний характер та відповідні фізико-хімічні властивості (наприклад, стабільність у воді, пружність парів),

- дані хімічної ідентифікації, включаючи структурну формулу, чистоту (тобто, для пестицидів, найменування та концентрація активної речовини/речовин).

2.2.2. Піддослідні види:

- наукова назва, раса, приблизний вік (у тижнях), метод збирання, дата збирання,

- інформація щодо колоній, використаних для збирання піддослідних бджіл, включаючи рівень здоров'я, будь-які хвороби дорослих особин, будь-яке попереднє лікування тощо.

2.2.3. Умови дослідження:

- температура і відносна вологість у експериментальному приміщенні,

- умови утримання, включаючи тип, розмір і матеріал кліток,

- методи підготовки базового та дослідного розчинів (у разі використання, потрібно зазначити назву розчинника та його концентрацію),

- структура дослідження, тобто кількість використаних дослідних концентрацій, кількість контролів; по кожній концентрації і контролю, кількість реплікацій кліток та кількість бджіл на клітку,

- дата дослідження.

2.2.4. Результати:

- результати попереднього діапазонного дослідження, якщо воно проводилося,

- вихідні дані: смертність по кожній дослідній дозі станом на кожен період спостереження,

- графік реакції на дози станом на кінець дослідження,

- показники LD50 з 95% довірчим інтервалом станом на кожен період спостереження стосовно дослідної речовини та стандарту токсичності,

- статистичні процедури, використані для визначення LD , 50

- смертність у контролях,

- інші біологічні ефекти, помічені або виміряні, наприклад, анормальна поведінка бджіл (включаючи відмову від прийняття дослідної дози), рівень споживання їжі в групах, що одержували дослідну і звичайну їжу,

- будь-які відхилення від процедур дослідження, описаних у цьому документі, та будь-яка інша доречна інформація.

3. ПОСИЛАННЯ

(1) EPPO/Council of Europe (1993) Decision-Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Products - Honeybees. EPPO bulletin, vol. 23, N.1, 151-165. March 1993.

(2) Gough, H. J., McIndoe, E.C., Lewis, G.B., (1994) The use of dimethoate as a reference compound in laboratory acute toxicity tests on honeybees (Apis mellifera L.) 1981-1992. Journal of Apicultural Research, 22, p. 119-125.

(3) Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F., (1949) A simplified method of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, p. 99-113.

(4) Finney, D.J., (1971) Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, London and New-York.

(5) Abbott, W.S., (1925) A method for computing the effectiveness of an insecticide. Jour. Econ. Entomol., 18, p. 265-267.

C.17. МЕДОНОСНІ БДЖОЛИ - ДОСЛІДЖЕННЯ НА ГОСТРУ КОНТАКТНУ ТОКСИЧНІСТЬ

1. МЕТОД

Цей метод дослідження на гостру токсичність є аналогом дослідження ОЕСР TG 214 (1998).

1.1. ВСТУП

Це дослідження на токсичність є лабораторним методом, призначеним для оцінки гострої контактної токсичності продуктів захисту рослин та інших хімічних речовин для дорослих робочих медоносних бджіл.

При оцінці токсичних характеристик речовин може бути необхідним визначення їх гострої контактної токсичності для медоносних бджіл, наприклад, коли існує ймовірність потрапляння бджіл у середовище з певною хімічною речовиною. Дослідження на гостру контактну токсичність проводиться для визначення токсичності, притаманної пестицидам та іншим хімічним речовинам, для бджіл. Результати цього дослідження використовуються для визначення необхідності проведення подальших досліджень. Зокрема, цей метод може використовуватися у комплексних програмах оцінки небезпеки пестицидів для бджіл з послідовним переходом від лабораторних досліджень на токсичність до напів-польових та польових експериментів (1). Пестициди можуть досліджуватися як за своїми активними речовинами, так і як складені продукти.

Для перевірки чутливості бджіл та точності процедури дослідження використовуються стандарти токсичності.

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ

Гостра контактна токсичність: негативні ефекти, що проявляються протягом максимального періоду, який складає 96 годин, після місцевого нанесення однієї дози дослідної речовини.

Доза: обсяг застосованої дослідної речовини. Доза виражається як маса (мкг) дослідної речовини на одну піддослідну тварину (мкг/бджолу).

LD (середня летальна доза), контактна: статистично 50

розрахована доза місцево нанесеної речовини,  яка може  спричинити
смерть  50%  тварин.  Значення  LD    виражається  у мкг дослідної
                                  50
речовини на бджолу. Для пестицидів дослідна речовина може бути або
активною речовиною, або складеним продуктом, який містить одну або
більше активних речовин.

Смертність: тварина вважається мертвою, якщо вона повністю нерухома.

1.3. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

Дорослі робочі медоносні бджоли (Apis mellifera) піддаються впливу низки доз дослідної речовини, розчиненої у відповідному реагенті, шляхом прямого нанесення на грудний відділ (краплями). Тривалість дослідження - 48 годин. Якщо рівень смертності збільшується в період між 24 та 48 годинами, тоді як у контролі смертність лишається на прийнятному рівні, тобто < 10%, доцільно продовжити тривалість дослідження до максимум 96 годин. Смертність фіксується щоденно і порівнюється з контролем. Для розрахунку LD 50 результати аналізуються станом на 24 годину та 48 годину, а якщо тривалість дослідження була продовжена, то станом на 72 годину і на 96 годину.

1.4. ДОСТОВІРНІСТЬ ДОСЛІДЖЕННЯ

Достовірність дослідження підтверджується такими умовами:

- LD стандарту токсичності перебуває у встановлених межах. 50

1.5. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

1.5.1. Збирання бджіл

1.5.2.Умови утримання і годування

Використовуються легкі в прибиранні та добре вентильовані клітки. Можуть використовуватися клітки, виготовлені з будь-якого прийнятного матеріалу, наприклад, нержавіючої сталі, дротяної сітки, пластику або ж одноразові дерев'яні клітки тощо. Розмір дослідних кліток повинен відповідати кількості бджіл, тобто забезпечувати достатньо місця для їх розміщення. Бажано в одній клітці розміщувати групу з 10 бджіл.

Бджоли утримуються у темряві в експериментальній кімнаті при температурі 25 +- 2 град.C. Відносна вологість, зазвичай, повинна становити близько 50-70% і повинна фіксуватися протягом усього дослідження. Робота з бджолами, включаючи догляд за ними та проведення спостережень, може виконуватися при (денному) світлі. Для годування бджіл використовується водний розчин цукрози з кінцевою концентрацією 500 г/л (співвідношення ваги і об'єму 50%). Годування здійснюється без обмежень із використанням годівниці для бджіл. Для цього можна використовувати скляну трубку довжиною приблизно 50 мм і шириною приблизно 10 мм, відкритий кінчик якої звужений до діаметру приблизно 2 мм.

1.5.3. Підготовка бджіл

Для нанесення дослідної речовини можна анестезувати зібраних бджіл за допомогою вуглекислого газу або азоту. Сила та час анестезії повинні бути мінімальними. Перед початком дослідження вмираючі бджоли повинні бути вилучені і замінені здоровими.

1.5.4. Підготовка доз

Дослідна речовина наноситься як розчин у реагенті, тобто органічному розчиннику, або водному розчині зі змочувальним засобом. Як органічний розчинник бажано використовувати ацетон, але можна використовувати інші органічні розчинники, які малотоксичні для бджіл (наприклад, диметилформамід, диметилсульфоксид). Щодо водорозчинних продуктів та високополярних органічних речовин, які не розчиняються в органічних розчинниках, розчини може бути легше наносити, якщо готувати їх у слабкому розчині комерційних змочувальних засобів (наприклад, Agral, Cittowett, Lubrol, Triton, Tween).

Потрібно підготувати відповідні контрольні розчини. Тобто, якщо для розчинення дослідної речовини необхідне використання розчинника або диспергатора, потрібно створити дві контрольні групи: одну з застосуванням води і одну з застосуванням розчинника/диспергатора.

1.6. ПРОЦЕДУРА

1.6.1. Дослідні та контрольні групи

інтервалом.  Зазвичай  для  проведення  дослідження  достатнім   є
використання  п'яти  доз  в  геометричній прогресії з множником не
більше 2,2,  які б охоплювали необхідний для LD   діапазон. Однак,
                                               50
потрібно  визначити  кількість  концентрацій  для  підготовки  доз
залежно  від  нахилу  кривої  токсичності  (відношення   дози   та
смертності)  та з урахуванням статистичного методу,  вибраного для
аналізу результатів.  Необхідні концентрації  можна  визначити  за
допомогою діапазонного дослідження.

Дозу кожної дослідної концентрації повинні одержати мінімум три реплікації дослідних груп по 10 бджіл кожна.

Крім дослідних груп повинні бути створені мінімум три контрольні групи по 10 бджіл кожна. У разі використання органічного розчинника чи змочувального засобу потрібно створити три додаткові контрольні групи, по 10 бджіл кожна, з додаванням застосованого розчинника/змочувального засобу.

1.6.2. Стандарт токсичності

застосовуватися  мінімум  у  трьох  реплікаціях кліток по 10 бджіл
кожна.  Бажаний стандарт токсичності -  диметоат,  відносно  якого
підтверджений контактний  LD  /24  год.  перебуває   в   діапазоні
                            50
0,10-0,30 мкг  активної  речовини  на  бджолу  (2).  Однак,  можна
використовувати  інші  стандарти  токсичності  у  разі   наявності
достатніх   даних   для   перевірки  очікуваної  реакції  на  дозу
(наприклад, паратіон).

1.6.3. Застосування

1.6.3.1. Застосування доз

На кожну окрему бджолу, яка перебуває під анестезією, місцево наноситься дослідна доза. Бджоли довільно розподіляються між різними дослідними дозами та контролями. Розчин об'ємом 1 мкл із вмістом дослідної речовини відповідної концентрації за допомогою мікроаплікатора наноситься на задню частину грудного відділу кожної бджоли. Якщо це виправдано, можуть наноситися інші об'єми розчину. Після нанесення бджоли поміщаються до дослідних кліток і одержують розчин цукрози.

1.6.3.2. Тривалість

Бажана тривалість дослідження - 48 годин. Якщо смертність зростає більше ніж на 10% у період від 24 до 48 години, тривалість дослідження потрібно продовжити максимум до 96 годин за умови, що в контролі смертність не перевищує 10%.

1.6.4. Спостереження

Смертність фіксується станом на 4 годину з моменту початку дослідження, а потім станом на 24 та 48 години. У разі продовження періоду спостереження, подальша фіксація здійснюється з 24-годинними інтервалами до максимум 96 години, за умови, що смертність в контролі не перевищує 10%.

Потрібно фіксувати всі прояви анормальної поведінки, помічені під час дослідження.

1.6.5. Граничне дослідження

Використовується  така  ж  процедура,  включаючи  три   реплікації
дослідних  груп  на  дозу,  відповідні  контролі  та  використання
стандарту токсичності. У разі наявності смертей, проводиться повне
дослідження.  У  разі наявності сублетальних проявів (див.  Секцію
1.6.4), вони фіксуються.

2. ДАНІ ТА ЗВІТНІСТЬ

2.1. ДАНІ

Готуються підсумкові таблиці, які повинні містити дані по кожній дослідній групі, а також групах контролю та стандарту токсичності, щодо кількості використаних бджіл, смертності на кожен період спостереження та кількості бджіл з анормальною поведінкою. Дані щодо смертності аналізуються за допомогою відповідних статистичних методів (наприклад, пробіт-аналізу, змінного середнього, біноміальної вірогідності) (3)(4). Будуються криві реакції на дозу станом на кожен рекомендований період спостереження (тобто 24 години, 48 годин і, якщо прийнятно, 72 години і 96 годин), розраховуються нахили кривих і середні летальні дози (LD ) з 95% довірчим інтервалом. Корекція на 50

смертність у  контролі  може  здійснюватися  за  допомогою  методу
Ебботта  (4)(5).  У разі,  якщо оброблена їжа спожита не повністю,
потрібно визначити дозу дослідної речовини,  спожиту в групі. LD
                                                                50
виражається в мкг дослідної речовини на бджолу.

2.2. ПРОТОКОЛ ДОСЛІДЖЕННЯ

До протоколу дослідження включається така інформація:

2.2.1. Дослідна речовина:

2.2.2. Піддослідні види:

- наукова назва, раса, приблизний вік (у тижнях), метод збирання, дата збирання,

2.2.3. Умови дослідження:

- температура і відносна вологість у експериментальному приміщенні,

- умови утримання, включаючи тип, розмір і матеріал кліток,

- методи застосування дослідного розчину, наприклад, використання розчинного засобу, об'єм нанесеного дослідного розчину, використані анестетики,

- структура дослідження, наприклад, кількість використаних дослідних доз, кількість контролів; по кожній дослідній дозі і контролю, кількість реплікацій кліток та кількість бджіл на клітку,

- дата дослідження.

2.2.4. Результати:

- результати попереднього діапазонного дослідження, якщо він проводився,

- вихідні дані: смертність по кожній дослідній дозі станом на кожен період спостереження,

- графік реакції на дози станом на кінець дослідження,

- показники LD з 95% довірчим інтервалом станом на кожен 50

період спостереження  стосовно  дослідної  речовини  та  стандарту
токсичності,

- статистичні процедури, використані для визначення LD  ,
                                                           50

- смертність у контролях,

- інші біологічні ефекти, помічені або виміряні, та будь-яка анормальна поведінка бджіл,

3. ПОСИЛАННЯ

(1) EPPO/Council of Europe (1993) Decision-Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Products - Honeybees. EPPO bulletin, vol. 23, N.1, 151-165. March 1993.

(2) Gough, H. J., McIndoe, E.C., Lewis, G.B., (1994) The use of dimethoate as a reference compound in laboratory acute toxicity tests on honeybees (Apis melliferaL.) 1981-1992. Journal of Apicultural Research, 22, p. 119-125.

(3) Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F., (1949) A simplified method of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, p. 99-113.

(4) Finney, D.J., (1971) Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, London and New-York.

(5) Abbott, W.S., (1925) A method for computing the effectiveness of an insecticide. Jour. Econ. Entomol., 18, p. 265-267.

C.18. АДСОРБЦІЯ/ДЕСОРБЦІЯ З ВИКОРИСТАННЯМ МЕТОДУ РІВНОВАГИ

1. МЕТОД

Цей метод є аналогом методу ОЕСР TG 106 щодо визначення адсорбції/десорбції ґрунту з використанням методу рівноваги (2000).

1.1. ВСТУП

Цей метод передбачає проведення кільцевого дослідження та описує процедури відбору ґрунту для проведення дослідження на адсорбцію (1)(2)(3)(4), а також враховує існуючі на національному рівні правила (5)(6)(7)(8)(9)(10)(11).

Дослідження адсорбції/десорбції потрібне для одержання базової інформації щодо руху та розповсюдження хімічних речовин у ґрунтовій, водній та повітряній частинах біосфери (12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21). Інформація може використовуватися для прогнозування або оцінки, наприклад, можливості розпаду хімічної речовини (22)(23), її трансформації та поглинання організмами (24); вилужнювання ґрунтового профілю (16)(18)(19)(21)(25)(26)(27)(28); леткості із ґрунту (21)(29)(30); стікання із поверхні землі в природні води (18)(31)(32). Дані щодо адсорбції можуть використовуватися для цілей порівняння та моделювання (19)(33)(34)(35).

Поширення хімічної речовини між ґрунтовою та водною фазами є комплексним процесом, на який впливає низка різних факторів: хімічний характер речовини (12)(36)(37)(38)(39)(40), характеристики ґрунту (4)(12)(13)(14)(41)(42)(43)(44)(45)(46)(47)(48)(49) та кліматичні фактори, такі як дощ, температура, сонячне світло та вітер. Таким чином, численні феномени та механізми, які впливають на процес адсорбції хімічної речовини в ґрунті, не можуть бути повністю визначені за допомогою спрощеної лабораторної моделі, такої як цей метод. Однак, навіть якщо це дослідження не може охопити всі можливі в довкіллі випадки, воно є джерелом цінної інформації щодо впливу адсорбції певної хімічної речовини на довкілля.

Дивіться також Загальний вступ.

1.2. МАСШТАБ

Цей метод призначений для оцінки адсорбційної/десорбційної поведінки речовини в ґрунті. Метою дослідження є одержання показника сорбції, який може використовуватися для прогнозування розпаду залежно від різних умов довкілля; з цією метою коефіцієнти адсорбційної рівноваги хімічної речовини в різних типах ґрунту визначаються як функція характеристик ґрунту (тобто вміст органічного вуглецю, вміст глини, текстура ґрунту та pH). Для охоплення якомога більшого діапазону взаємозв'язків певної речовини з ґрунтами, що зустрічаються в природі, в дослідженні використовуються різні типи ґрунтів.

У цьому методі адсорбція являє собою процес, при якому відбувається зв'язування хімічної речовини з поверхнею ґрунту; в методі не розрізняються різні процеси адсорбції (фізична та хімічна адсорбція) і такі процеси як поверхнева каталізована деградація, масова адсорбція або хімічні реакції. Адсорбція, що відбувається на колоїдних частинках ґрунту (діаметром < 0,2 мікрона), не враховується.

Параметри ґрунту, які вважаються найбільш важливими для дослідження адсорбції: вміст органічного вуглецю (3)(4)(12)(13)(14)(41)(43)(44)(45)(46)(47)(48); вміст глини та текстура ґрунту (3)(4)(41)(42)(43)(44)(45)(46)(47)(48), а також pH для сполук, що іонізуються (3)(4)(42). Інші параметри ґрунту, які можуть мати вплив на адсорбцію/десорбцію певної речовини, - це ефективна ємність поглинання ґрунту (ECEC), вміст аморфних оксидів заліза та алюмінію, особливо у вулканічних та тропічних ґрунтах (4), а також особливі характеристики поверхні (49).

Дослідження покликане оцінити адсорбцію хімічної речовини в різних типах ґрунту зі змінним вмістом органічного вуглецю та глини, змінними текстурою ґрунту та pH. Воно складається з трьох етапів:

Етап 1: попереднє дослідження для визначення:

- співвідношення ґрунту та розчину,

- час досягнення адсорбційної рівноваги та обсяг дослідної речовини, адсорбованої на момент рівноваги,

- адсорбція дослідної речовини на поверхнях дослідних посудин та стабільність дослідної речовини протягом дослідження.

Етап 2: відбірне дослідження: досліджується кінетика адсорбції на п'яти різних типах ґрунту з використанням однієї концентрації речовини і визначається коефіцієнт розповсюдження K d та K .

oc

Етап 3: визначення ізотерм адсорбції Фрейндліха для встановлення впливу концентрації речовини на ступінь адсорбції в ґрунті.

Дослідження десорбції за допомогою кінетики десорбції/ізотерм десорбції Фрейндліха (Доповнення 1).

1.3. ВИЗНАЧЕННЯ ТА ОДИНИЦІ

----------------------------------------------------------------------
|   Позначення   |        Визначення         |       Одиниця         |
|----------------+---------------------------+-----------------------|
|At              |відсоток адсорбції на      |%                      |
|  i             |момент часу t              |                       |
|                |             i             |                       |
|----------------+---------------------------+-----------------------|
|A               |відсоток адсорбції на      |%                      |
| eq             |момент адсорбційної        |                       |
|                |рівноваги                  |                       |
|----------------+---------------------------+-----------------------|
| ads            |маса дослідної речовини,   |мкг                    |
|m    (t )       |адсорбованої в ґрунті на   |                       |
| s     i        |момент часу t              |                       |
|                |             i             |                       |
|----------------+---------------------------+-----------------------|
| ads            |маса дослідної речовини,   |мкг                    |
|m    (Дельта t )|адсорбованої в ґрунті      |                       |
| s            i |протягом періоду часу      |                       |
|                |Дельта t                   |                       |
|                |        i                  |                       |
|----------------+---------------------------+-----------------------|
| ads            |маса дослідної речовини,   |мкг                    |
|m    (eq)       |адсорбованої в ґрунті на   |                       |
| s              |момент адсорбційної        |                       |
|                |рівноваги                  |                       |
|----------------+---------------------------+-----------------------|
|m               |маса дослідної речовини в  |мкг                    |
| 0              |дослідній колбі на момент  |                       |
|                |початку дослідження        |                       |
|                |адсорбції                  |                       |
|----------------+---------------------------+-----------------------|
| ads            |маса дослідної речовини,   |мкг                    |
|m    (t )       |виміряна в аліквотній      |                       |
| m     i        |         A                 |                       |
|                |частині V  на момент       |                       |
|                |         a                 |                       |
|                |часу t                     |                       |
|                |      i                    |                       |
|----------------+---------------------------+-----------------------|
| ads            |маса дослідної речовини в  |мкг                    |
|m    (eq)       |розчині на момент          |                       |
| aq             |адсорбційної рівноваги     |                       |
|----------------+---------------------------+-----------------------|
|m               |величина фази ґрунту,      |г                      |
| soil           |виражена сухою масою       |                       |
|                |ґрунту                     |                       |
|----------------+---------------------------+-----------------------|
|C               |масова концентрація        |      -3               |
| st             |базового розчину речовини  |мкг см                 |
|----------------+---------------------------+-----------------------|
|C               |початкова масова           |      -3               |
| 0              |концентрація базового      |мкг см                 |
|                |розчину, який контактує з  |                       |
|                |ґрунтом                    |                       |
|----------------+---------------------------+-----------------------|
| ads            |масова концентрація        |      -3               |
|C    (t )       |речовини у водній фазі на  |мкг см                 |
| aq    i        |момент часу проведення     |                       |
|                |аналізу t                  |                       |
|                |         i                 |                       |
|----------------+---------------------------+-----------------------|
| ads            |вміст речовини,            |     -1                |
|C    (eq)       |адсорбованої в ґрунті на   |мкг г                  |
| s              |момент адсорбційної        |                       |
|                |рівноваги                  |                       |
|----------------+---------------------------+-----------------------|
| ads            |масова концентрація        |      -3               |
|C    (eq)       |речовини у водній фазі на  |мкг см                 |
| aq             |момент адсорбційної        |                       |
|                |рівноваги                  |                       |
|----------------+---------------------------+-----------------------|
|V               |початковий об'єм водної    |куб.см                 |
| 0              |фази, який контактує з     |                       |
|                |ґрунтом протягом           |                       |
|                |дослідження адсорбції      |                       |
|----------------+---------------------------+-----------------------|
| A              |об'єм аліквотної частини   |                       |
|V               |для вимірювання дослідної  |                       |
| a              |речовини                   |                       |
|----------------+---------------------------+-----------------------|
|K               |коефіцієнт розповсюдження  |        -1             |
| d              |для адсорбції              |куб.см г               |
|----------------+---------------------------+-----------------------|
|K               |коефіцієнт адсорбції з     |        -1             |
| oc             |поправкою на органічний    |куб.см г               |
|                |вуглець                    |                       |
|----------------+---------------------------+-----------------------|
|K               |коефіцієнт адсорбції з     |        -1             |
| om             |поправкою на органічну     |куб.см г               |
|                |речовину                   |                       |
|----------------+---------------------------+-----------------------|
| ads            |коефіцієнт адсорбції       |   1-1/n        1/n  -1|
|K               |Фрейндліха                 |мкг      куб.см     г  |
| F              |                           |                       |
|----------------+---------------------------+-----------------------|
|1/n             |експонента Фрейндліха      |                       |
|----------------+---------------------------+-----------------------|
|Dt              |відсоток десорбції на      |%                      |
|  i             |момент часу t              |                       |
|                |             i             |                       |
|----------------+---------------------------+-----------------------|
|D               |відсоток десорбції протягом|%                      |
| (Дельта t )    |періоду часу Дельта t      |                       |
|          i     |                     i     |                       |
|----------------+---------------------------+-----------------------|
|K               |позірний коефіцієнт        |        -1             |
| des            |десорбції                  |куб.см г               |
|----------------+---------------------------+-----------------------|
| des            |коефіцієнт десорбції       |   1-1/n        1/n  -1|
|K               |Фрейндліха                 |мкг      куб.см     г  |
| F              |                           |                       |
|----------------+---------------------------+-----------------------|
| des            |маса дослідної речовини,   |мкг                    |
|m    (t )       |десорбованої із ґрунту на  |                       |
| aq    i        |момент часу t              |                       |
|                |             i             |                       |
|----------------+---------------------------+-----------------------|
| des            |маса дослідної речовини,   |мкг                    |
|m    (Дельта t )|десорбованої із ґрунту     |                       |
| m            i |протягом періоду часу      |                       |
|                |Дельта t                   |                       |
|                |        i                  |                       |
|----------------+---------------------------+-----------------------|
| des            |аналітично визначена маса  |мкг                    |
|m    (eq)       |речовини у водній фазі на  |                       |
| m              |момент десорбційної        |                       |
|                |рівноваги                  |                       |
|----------------+---------------------------+-----------------------|
| des            |загальна маса дослідної    |мкг                    |
|m    (eq)       |речовини, десорбованої на  |                       |
| aq             |момент десорбційної        |                       |
|                |рівноваги                  |                       |
|----------------+---------------------------+-----------------------|
| des            |маса речовини, що          |мкг                    |
|m    (Дельта t )|залишається адсорбованою в |                       |
| s            i |ґрунті після періоду часу  |                       |
|                |Дельта t                   |                       |
|                |        i                  |                       |
|----------------+---------------------------+-----------------------|
| A              |маса речовини, що          |мкг                    |
|m               |залишилася після           |                       |
| aq             |адсорбційної рівноваги     |                       |
|                |через неповне заміщення    |                       |
|                |об'єму                     |                       |
|----------------+---------------------------+-----------------------|
| des            |вміст дослідної речовини,  |     -1                |
|C    (eq)       |що залишається             |мкг г                  |
| s              |адсорбованою в ґрунті на   |                       |
|                |момент десорбційної        |                       |
|                |рівноваги                  |                       |
|----------------+---------------------------+-----------------------|
| des            |масова концентрація        |      -3               |
|C    (eq)       |дослідної речовини у       |мкг см                 |
| aq             |водній фазі на момент      |                       |
|                |десорбційної рівноваги     |                       |
|----------------+---------------------------+-----------------------|
|V               |загальний об'єм водної     |куб.см                 |
| T              |фази, яка контактує з      |                       |
|                |ґрунтом під час дослідження|                       |
|                |кінетики десорбції,        |                       |
|                |проведеного за серійним    |                       |
|                |методом                    |                       |
|----------------+---------------------------+-----------------------|
|V               |об'єм надосадового розчину,|куб.см                 |
| R              |видаленого з колби після   |                       |
|                |досягнення адсорбційної    |                       |
|                |рівноваги і заміщеного     |                       |
|                |таким же об'ємом розчину   |                       |
|                |0,01 М CaCl                |                       |
|                |           2               |                       |
|----------------+---------------------------+-----------------------|
| D              |об'єм аліквотної проби,    |куб.см                 |
|V               |взятої для цілей аналізу   |                       |
| a              |на момент часу (і) під час |                       |
|                |дослідження кінетики       |                       |
|                |десорбції, проведеного     |                       |
|                |за серійним методом        |                       |
|----------------+---------------------------+-----------------------|
| r              |об'єм розчину, взятого із  |куб.см                 |
|V               |колби (і) для              |                       |
| r              |вимірювання дослідної      |                       |
|                |речовини під час           |                       |
|                |дослідження кінетики       |                       |
|                |десорбції (паралельний     |                       |
|                |метод)                     |                       |
|----------------+---------------------------+-----------------------|
| F              |об'єм розчину, взятого     |куб.см                 |
|V               |із колби (і) для           |                       |
| r              |вимірювання дослідної      |                       |
|                |речовини на момент         |                       |
|                |десорбційної рівноваги     |                       |
|----------------+---------------------------+-----------------------|
|MB              |баланс речовини            |%                      |
|----------------+---------------------------+-----------------------|
|m               |загальна маса дослідної    |мкг                    |
| E              |речовини, одержаної        |                       |
|                |із ґрунту та стінок        |                       |
|                |дослідної посудини в два   |                       |
|                |етапи                      |                       |
|----------------+---------------------------+-----------------------|
|V               |об'єм надосадової речовини,|куб.см                 |
| rec            |одержаної після            |                       |
|                |адсорбційної рівноваги     |                       |
|----------------+---------------------------+-----------------------|
|P               |коефіцієнт розділення      |                       |
| ow             |октанол/вода               |                       |
|----------------+---------------------------+-----------------------|
|pKa             |константа дисоціації       |                       |
|----------------+---------------------------+-----------------------|
|S               |розчинність води           |   -1                  |
| W              |                           |г л                    |
----------------------------------------------------------------------

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

Відомі об'єми розчинів дослідної речовини, не мічені або радіоактивно мічені, з відомими концентраціями в розчині 0,01 М CaCl додаються до зразків ґрунту з відомою сухою масою, які були

2
попередньо врівноважені в розчині 0,01 М  CaCl .  Суміш  достатньо
                                              2
збовтується.   Після   цього  ґрунтові  суспензії  сепаруються  за
допомогою  центрифугування  і,  за   бажанням,   фільтрування,   і
аналізується водна фаза.  Обсяг дослідної речовини, адсорбованої в
зразку ґрунту,  розраховується як різниця між  початковим  обсягом
дослідної  речовини  і  обсягом дослідної речовини,  що залишилася
після закінчення експерименту (непрямий метод).

Як варіант, обсяг адсорбованої дослідної речовини можна визначити безпосередньо шляхом аналізу ґрунту (прямий метод). Ця процедура, яка полягає в поетапному екстрагуванні речовини з ґрунту за допомогою відповідного розчинника, рекомендована в тих випадках, коли різницю між концентраціями речовини в розчинах не можна точно визначити. Приклади таких випадків: адсорбція дослідної речовини на поверхні дослідних посудин, нестабільність дослідної речовини протягом експерименту, низька адсорбція, яка призводить до незначної зміни концентрації в розчині, а також сильна адсорбція, яка призводить до одержання низьких концентрацій, які не можна точно визначити. Якщо використовується радіоактивно мічена речовина, екстракції з ґрунту можна уникнути, провівши аналіз ґрунтової фази за допомогою горіння та рідинно-сцинтиляційного підрахунку. Однак, рідинно-сцинтиляційний підрахунок є неспецифічною технологією, яка не розрізняє вихідні та трансформовані продукти, тому її потрібно використовувати, лише якщо дослідна хімічна речовина стабільна протягом усього дослідження.

1.5. ІНФОРМАЦІЯ ЩОДО ДОСЛІДНОЇ РЕЧОВИНИ

Хімічні речовини повинні бути чистими для аналізу. Рекомендується використання не мічених дослідних речовин з відомим складом і, бажано, з 95% чистотою або радіоактивно мічених дослідних речовин з відомим складом і радіоактивною чистотою. У випадку з мітками, які мають короткий період напіврозпаду, потрібно застосовувати поправки на розпад.

Для проведення дослідження адсорбції-десорбції потрібно мати таку інформацію щодо дослідної речовини:

(a) розчинність води (А.6);

(b) щільність парів (А.4) та/або константа закону Генрі;

(d) коефіцієнт розділення (А.8);

(e) повна біологічна розкладність (С.4) або аеробна та анаеробна трансформація в ґрунті;

(f) pKa речовин, що іонізуються;

(g) прямий фотоліз у воді (тобто спектри поглинання в ультрафіолетовому та видимому спектрі у воді, квантовий вихід) та фотодеградація на ґрунті.

1.6. ЗАСТОСОВНІСТЬ ДОСЛІДЖЕННЯ

Дослідження проводиться з хімічними речовинами, для яких існує метод аналізу достатньої точності. Важливим параметром, який може впливати на достовірність результатів, особливо при застосуванні непрямого методу, є стабільність дослідної речовини протягом дослідження. Таким чином, необхідною передумовою дослідження є перевірка стабільності за допомогою попереднього дослідження; якщо під час попереднього дослідження виявляється трансформація речовини, рекомендується проводити основне дослідження з аналізом як ґрунтової, так і водної фаз.

Можуть виникнути складнощі при проведенні дослідження з дослідними речовинами, які мають низьку розчинність у воді -4 -1

(S < 10 г л ), або високозаряджених речовин, оскільки їх w

концентрація  у  водній  фазі  не  може бути з достатньою точністю
виміряна  аналітично.  У  таких  випадках   необхідне   проведення
додаткових   етапів.   Інструкції  щодо  розв'язання  цих  проблем
містяться у відповідних секціях цього методу.

При дослідженні летких речовин потрібно не допускати їх втрат під час проведення експериментів.

1.7. ОПИС МЕТОДУ

1.7.1. Обладнання та хімічні речовини

Використовується стандартне лабораторне обладнання, а саме:

(a) колби або посудини для проведення експериментів. Важливо, щоб ці колби чи посудини

- могли вставлятися безпосередньо в пристрій для центрифугування, щоб мінімізувати помилки при маніпуляції з ними,

- були зроблені з інертного матеріалу, щоб мінімізувати адсорбцію дослідної речовини на їх поверхні,

(b) пристрій для збовтування: оборотний змішувач або еквівалентне обладнання; пристрій для збовтування повинен забезпечувати перебування ґрунту в суспензії під час збовтування,

(c) центрифуга: бажано високошвидкісна, тобто з відцентровою силою > 3 000 g, з контролем температури, з можливістю видалення із водного розчину частинок з діаметром більше 0,2 мікрона. Під час збовтування та центрифугування контейнери повинні бути закриті ковпачками, щоб уникнути випаровування та втрати води; щоб мінімізувати адсорбцію в ковпачках, потрібно використовувати деактивовані ковпачки, що закручуються, із тефлоновими вкладками,

(d) опціонально: фільтраційний пристрій; фільтри з проникністю 0,2 мікрона, стерильні, одноразового використання. З особливою ретельністю повинен добиратися матеріал, з якого виготовлений фільтр, щоб запобігти будь-яким втратам на ньому дослідної речовини; для погано розчинних дослідних речовин не рекомендуються використовувати фільтри з органічних матеріалів,

(e) обладнання для проведення аналізів, придатне для вимірювання концентрації дослідної речовини,

(f) лабораторна піч, в якій може підтримуватися температура від 103 град.С до 110 град.С.

1.7.2. Характеристики та підбір ґрунту

Ґрунт повинен характеризуватися трьома параметрами, які вважаються основними для адсорбційної здатності: органічний вуглець, вміст глини та текстура ґрунту, а також pH. Як уже було зазначено (див. Масштаб), на адсорбцію/десорбцію певної речовини можуть впливати інші фізико-хімічні властивості ґрунту, які також повинні враховуватися.

Методи, що використовуються для характеризування ґрунту, мають велике значення і можуть справляти великий вплив на результат. Тому, рекомендується вимірювати pH у розчині 0,01 M CaCl (тобто розчині, що використовується в дослідженні

2
адсорбції/десорбції)   згідно   з    відповідним    методом    ISO
(ISO-10390-1).    Також    згідно    із    стандартними   методами
рекомендується  визначати  інші  відповідні   властивості   ґрунту
(наприклад,  "Настанова  щодо  аналізу ґрунту" ISO);  це дозволить
побудувати аналіз  даних  сорбції  на  глобально  стандартизованих
параметрах  ґрунту.  Деякі  рекомендації щодо існуючих стандартних
методів аналізу та характеризування ґрунту наведені  в  посиланнях
(50-52).    Для   методів   калібрування   ґрунту   рекомендується
використання еталонних ґрунтів.

Рекомендації щодо підбору ґрунту для дослідження адсорбції/десорбції наведені в Таблиці 1. Сім ґрунтів, що наведені в таблиці, охоплюють типи ґрунтів, які зустрічаються в географічних зонах з помірним кліматом. Що стосується дослідних речовин, які іонізуються, потрібно вибирати ґрунти з широким діапазоном pH, щоб можна було оцінити адсорбцію речовини в її іонізованій і неіонізованій формах. Рекомендації щодо кількості різних ґрунтів, які використовуються на різних стадіях дослідження, наведені в секції 1.9 "Проведення дослідження".

Якщо для дослідження вибрані інші ґрунти, вони повинні мати такі ж параметри і подібне різноманіття у властивостях, як описано в Таблиці 1, навіть якщо вони не повністю відповідають критеріям.

Таблиця 1:

Рекомендації щодо відбору зразків ґрунту для дослідження адсорбції-десорбції

------------------------------------------------------------------
|Тип ґрунту | Діапазон pH |   Вміст    |Вміст глини |  Текстура  |
|           |  (у розчині |органічного |    (%)     | ґрунту(1)  |
|           |0,01 M CaCl )|вуглецю (%) |            |            |
|           |           2 |            |            |            |
|-----------+-------------+------------+------------+------------|
|     1     |  4,5 - 5,5  |  1,0 - 2,0 |    65-80   |  глинозем  |
|-----------+-------------+------------+------------+------------|
|     2     |    > 7,5    |  3,5 - 5,0 |    20-40   |  глинистий |
|           |             |            |            |  суглинок  |
|-----------+-------------+------------+------------+------------|
|     3     |  5,5 - 7,0  |  1,5 - 3,0 |    15-25   |  пилуватий |
|           |             |            |            |  суглинок  |
|-----------+-------------+------------+------------+------------|
|     4     |  4,0 - 5,5  |  3,0 - 4,0 |    15-30   |  суглинок  |
|-----------+-------------+------------+------------+------------|
|     5     | < 4,0 - 6,0 |< 0,5 - 1,5 |< 10-15 (2) |  глинистий |
|           |     (2)     |  (2) (3)   |            |    пісок   |
|-----------+-------------+------------+------------+------------|
|     6     |    > 7,0    |< 0,5 - 1,0 |    40-65   |  глинистий |
|           |             |  (2) (3)   |            |  суглинок/ |
|           |             |            |            |  глинозем  |
|-----------+-------------+------------+------------+------------|
|     7     |    < 4,5    |    > 10    |    < 10    |   пісок/   |
|           |             |            |            |  глинистий |
|           |             |            |            |    пісок   |
|----------------------------------------------------------------|
|(1) Згідно з системою FAO та США (85).                          |
|(2) Бажано, щоб відповідні змінні мали значення в               |
|наведеному діапазоні. Однак, якщо є труднощі із підбором        |
|відповідного ґрунту, допускаються значення, що нижчі за         |
|зазначений мінімум.                                             |
|(3) Ґрунти, в яких вміст органічного вуглецю менший ніж 0,3%,   |
|можуть порушити кореляцію між вмістом органічних речовин        |
|та адсорбцією. Тому, рекомендується використання ґрунтів, у яких|
|мінімальний вміст органічного вуглецю складає 0,3%.             |
------------------------------------------------------------------

1.7.3. Відбір та зберігання зразків ґрунту

1.7.3.1. Відбір

Немає рекомендованих технологій чи засобів відбору зразків; технологія відбору зразків залежить від мети дослідження (53)(54)(55)(56)(57)(58).

Потрібно врахувати таке:

(a) потрібна докладна інформація щодо історії місця відбору; це включає місце розташування, рослинність, обробку пестицидами та/або добривами, наявність біологічних добавок або випадкових забруднень. Для опису місця відбору зразків потрібно дотримуватися рекомендацій стандарту ISO щодо відбору зразків ґрунту (ISO 10381-6);

(b) місце відбору зразків повинне бути визначене за допомогою UTM (універсальної поперечної проекції Меркатора/Європейської горизонтальної вісі координат) або географічних координат; це допоможе зробити повторний відбір певного ґрунту в майбутньому або допоможе визначити ґрунт згідно з різними системами класифікації, що використовуються в різних країнах. Зразок ґрунту відбирається лише з А-горизонту і з максимальної глибини 20 см. Стосовно лише ґрунту типу N 7, якщо в ґрунті присутній горизонт Oh, його потрібно включити в зразок.

Зразки ґрунту транспортуються за допомогою контейнерів за таких температурних умов, які гарантують збереження без значних змін початкових властивостей ґрунту.

1.7.3.2. Зберігання

Бажане використання щойно відібраного ґрунту. Лише у разі, коли це не можливо, ґрунт можна зберігати за температури довкілля із вільним доступом повітря. Немає рекомендацій щодо максимального періоду зберігання, але ґрунти, що зберігались більше трьох років, перед використанням підлягають повторному аналізу на вміст органічного вуглецю та pH, а також ємність поглинання ґрунту.

1.7.3.3. Підготовка зразків ґрунту для дослідження

Ґрунт перебуває на відкритому повітрі за температури довкілля (бажано в межах від 20 до 25 град.С). Поділ ґрунту на частини проводиться з мінімальними зусиллями, щоб максимально зберегти його текстуру. Ґрунт просівається через сито для утворення частинок розміром <= 2 мм; при просіванні потрібно дотримуватися рекомендацій стандарту ISO щодо відбору зразків ґрунту (ISO 10381-6). Рекомендується додержуватися гомогенізації, оскільки це покращить відтворюваність результатів. Вміст вологи в кожному зразку ґрунту визначається висушуванням третіх частин зразків при температурі 105 град.С доки їх вага істотно не відрізнятиметься (приблизно 12 годин). В усіх розрахунках маса ґрунту означає масу ґрунту, висушеного в печі, тобто вагу ґрунту, скориговану на вміст вологи.

1.7.4. Підготовка дослідної речовини до нанесення на ґрунт

Дослідна речовина розчиняється в розчині 0,01 M CaCl , 2 приготовленому в дистильованій чи деіонізованій воді; розчин CaCl 2 використовується як фаза водного розчинника для покращення центрифугування і мінімізації катіонного обміну. Бажано, щоб концентрація базового розчину була на три порядки вищою, ніж межа виявлення використовуваного методу аналізу. Цей поріг забезпечить проведення точних вимірювань згідно з методологією, що використовується в цьому методі; крім того, концентрація базового розчину повинна бути нижчою рівня розчинності дослідної речовини у воді.

Бажано, щоб базовий розчин готувався одразу перед нанесенням на зразки ґрунту і зберігався закритим у темряві при температурі 4 град.С. Термін зберігання залежить від стабільності дослідної речовини та її концентрації в розчині.

Лише що стосується речовин з низькою розчинністю -4 -1

(S < 10 г л ), у разі виникнення труднощів з розчиненням w

дослідної речовини,  може бути необхідним  додавання  відповідного
розчинювального   реагенту.   Такий  розчинювальний  реагент:  (а)
повинен змішуватися з водою,  наприклад,  метанол або ацетонітрил;
(b)  повинен  мати  концентрацію,  яка не перевищує 1%  загального
об'єму базового розчину,  і яка менша  за  концентрацію  дослідної
речовини в розчині,  що контактуватиме з ґрунтом (бажано менше ніж
0,1%);  і (с) не повинен бути поверхнево-активною речовиною  і  не
повинен  вступати  в  сольволітичні  реакції  з дослідною хімічною
речовиною.  Використання  розчинювального  реагенту  повинно  бути
описане і обґрунтоване в протоколі дослідження.

Іншою альтернативою для речовин з поганою розчинністю є ін'єкція дослідної речовини в дослідну систему: дослідна речовина розчиняється в органічному розчиннику, аліквотна частина якого додається до системи, що складається із ґрунту та розчину 0,01 M CaCl , приготовленому в дистильованій чи деіонізованій 2

воді.  Вміст органічного розчинника у водній фазі повинен бути  на
якомога меншому рівні,  зазвичай не більше 0,1%.  Метод ін'єкції з
використанням органічного розчину  має  недолік,  який  полягає  у
невідтворюваності   об'єму.   Тому   потрібно   вводити  додаткову
поправку,   оскільки   концентрація    дослідної    речовини    та
співрозчинника не будуть однаковими в усіх дослідженнях.

1.8. ПЕРЕДУМОВИ ПРОВЕДЕННЯ ДОСЛІДЖЕННЯ АДСОРБЦІЇ/ДЕСОРБЦІЇ

1.8.1. Аналітичний метод

Ключовими параметрами, які можуть вплинути на точність вимірювань сорбції, є точність аналітичного методу при аналізі як фази розчину, так і фази адсорбції, стабільність і чистота дослідної речовини, досягнення сорбційної рівноваги, величина зміни концентрації розчину, співвідношення ґрунту та розчину, а також зміна структури ґрунту протягом процесу врівноважування (35)(59-62). Деякі приклади проблем, пов'язаних з точністю вимірювань, наведені в Доповненні 2.

Достовірність використовуваного аналітичного методу повинна перевірятися в діапазоні концентрацій, які можуть утворитися протягом дослідження. Експериментатор може на власний розсуд розробляти відповідні методи з відповідними точністю, чіткістю, відтворюваністю, межами виявлення та регенерацією. Інструкції щодо того, як провести таке дослідження, містяться у нижченаведеному експерименті.

Певний об'єм розчину 0,01 M CaCl , наприклад 100 куб.см, 2

збовтується протягом  4  годин із зразком ґрунту вагою,  наприклад
20 г,  який має високу адсорбційність,  тобто  з  високим  вмістом
органічного  вуглецю та глини;  ці маси та об'єми можуть різнитися
залежно від потреб аналізу, але найбільш зручною вихідною точкою є
співвідношення   ґрунту   та   розчину   в  пропорції  1:5.  Суміш
центрифугується,  а водна  фаза  може  профільтровуватися.  Певний
об'єм базового розчину дослідної речовини додається до водної фази
для  досягнення  номінальної  концентрації   в   межах   діапазону
концентрацій,  які  ймовірно  матимуть місце протягом дослідження.
Цей об'єм не  повинен  перевищувати  10%  від  остаточного  об'єму
водної фази, щоб якомога менше змінювати характеристики розчину до
врівноваження. Розчин аналізується.

Закладається одна контрольна система, що складається з ґрунту + розчин CaCl (без дослідної речовини), для здійснення перевірки 2

на наявність артефактів у аналітичному методі та ефектів  матриці,
спричинених ґрунтом.

Аналітичні методи, які можуть використовуватися для вимірювання сорбції, включають газорідинну хроматографію (GLC), високоефективну рідинну хроматографію (HPLC), спектрометрію (наприклад, спектрометрію GC/маса, спектрометрію HPLC/маса) та рідинно-сцинтиляційний підрахунок (для радіоактивно мічених речовин). Незалежно від використовуваного методу, він вважається прийнятним, якщо регенерація перебуває на рівні від 90% до 110% від номінального значення. Для того, щоб після розділення можна було провести виявлення та оцінку, межа виявлення аналітичного методу повинна бути принаймні на два порядки нижчою від номінальної концентрації.

Характеристики та межа виявлення аналітичного методу, що використовується для проведення дослідження адсорбції, відіграють важливу роль у визначені умов дослідження та загального ходу експерименту. У цьому методі дотримується загальна експериментальна методика і надаються рекомендації та вказівки щодо можливих альтернативних рішень у разі, коли аналітичний метод та лабораторне обладнання мають певні обмеження.

1.8.2. Підбір оптимальних співвідношень ґрунту та розчину

Підбір відповідних співвідношень ґрунту та розчину для дослідження сорбції залежить від коефіцієнту розповсюдження K та d

бажаного відносного ступеня адсорбції. Зміна концентрації речовини
в  розчині  визначає статистичну точність вимірювань,  залежно від
форми  рівняння  адсорбції  та  межі  аналітичного   методу,   при
визначенні   концентрації   хімічної  речовини  в  розчині.  Тому,
зазвичай корисно встановити кілька фіксованих  співвідношень,  для
яких процент адсорбції вищий 20%  і,  бажано, > 50% (62), разом із
підтриманням концентрації дослідної  речовини  у  водній  фазі  на
достатньо   високому   рівні,   щоб   можна  було  провести  точні
вимірювання.  Це особливо важливо у випадку з високими процентними
відношенням адсорбції.

Зручний підхід до підбору відповідних співвідношень ґрунту та води ґрунтується на оцінці значення K за допомогою попереднього d

дослідження  або  встановленої  методики  оцінки  (Доповнення  3).
Підбір  відповідного  співвідношення  потім  може здійснюватися на
основі графіка співвідношення ґрунту  та  води  і  K   для  певних
                                                    d
рівнів адсорбції (Рис.  1).  Нижчезазначений графік побудований на
лінійному рівнянні адсорбції(1).  Необхідне відношення досягається
шляхом перетворення рівняння (4) K  у форму рівняння (1):
                                  d

V           m
                      o           o
                   ------ = (---------- - 1) K                 (1)
                    m          ads            d
                     soil     m    (eq)
                               s

----------------

(1) ads ads C (eq) = K · C (eq) s d aq

або в його логарифмічну форму, припускаючи,

ads
                                     m   (eq)
                                      s
     що, R = m    /V  а:  A  %/100 = --------
              soil  0      eq           m
                                         0

(A %/100) eq log R = - log K + log (--------------) (2)

d (1 - A %/100) eq

Рис. 1 Відношення між співвідношенням ґрунту та розчину і K при різних рівнях d адсорбції дослідної речовини ( 994_b14 )

На рис. 1 показані співвідношення ґрунту та розчину і K для d

різних рівнів адсорбції.  Наприклад,  при співвідношенні ґрунту та
розчину 1:5 та K  20,  адсорбція  складатиме  приблизно  80%.  Для
                d
досягнення  50%  адсорбції  при такому ж K  співвідношення повинно
                                          d
складати 1:25. Такий підхід до підбору відповідного співвідношення
ґрунту   та  розчину  надає  досліднику  необхідну  гнучкість  для
досягнення експериментальних цілей.

Існують більш складні випадки: коли хімічна речовина має високу або занадто низьку адсорбцію. У разі низької адсорбції рекомендується співвідношення ґрунту та розчину 1:1, хоча для деяких типів ґрунтів з високим вмістом органічних речовин для одержання суміші може бути потрібне використання менших співвідношень. Потрібно уважно застосовувати аналітичні методи при вимірюванні незначних змін у концентрації речовини, інакше вимірювання адсорбції буде неточним. З іншого боку, при дуже високих коефіцієнтах розповсюдження K може бути потрібним d

співвідношення ґрунту та розчину 1:100 для  того,  щоб  у  розчині
була   присутня   достатня  кількість  хімічної  речовини.  Однак,
потрібно приділити увагу  ретельному  змішуванню  та  забезпеченню
достатнього часу для врівноваження системи. Альтернативний підхід,
що  може  використовуватися  у  таких  особливих  випадках,   коли
відсутні  адекватні  аналітичні  методи,  полягає  в прогнозуванні
значення K  за допомогою методики оцінки, основаної, наприклад, на
          d
значеннях P   (Доповнення 3).  Він може бути особливо корисним для
           ow
використання з хімічними речовинами,  що мають  низьку  адсорбцію,
або  полярними  речовинами  з  P    <  20,  а  також  ліпофільними
                                ow                            4
речовинами та речовинами, що мають високу сорбцію, із P   > 10 .
                                                       ow

1.9. ПРОВЕДЕННЯ ДОСЛІДЖЕННЯ

1.9.1. Умови дослідження

Усі експерименти проводяться за температури довкілля і, якщо можливо, за постійної температури від 20 град.С до 25 град.С.

Умови центрифугування повинні забезпечувати видалення із розчину частинок більших за 0,2 мікрона. Це значення є межею між твердими та колоїдними частинками, а процес дозволяє одержати найменші частинки, які вважаються твердими. Інструкції щодо визначення умов центрифугування наведені в Доповненні 4.

Якщо обладнання для центрифугування не може гарантувати видалення частинок, що більші за 0,2 мікрона, можна доповнити процес центрифугування процесом фільтрування з застосуванням фільтрів проникністю 0,2 мікрона. Ці фільтри повинні бути зроблені з інертного матеріалу, щоб уникнути будь-яких втрат дослідної речовини на їх поверхні. У будь-якому разі, потрібно перевірити і підтвердити відсутність втрат дослідної речовини під час фільтрування.

1.9.2. Етап 1 - Попереднє дослідження

Мета проведення попереднього дослідження вже була зазначена в секції Масштаб. Інструкції щодо проведення такого дослідження наведені в нижчезазначеному експерименті.

1.9.2.1. Підбір оптимальних співвідношень ґрунту та розчину

Використовується два типи ґрунту і три співвідношення ґрунту та розчину (шість експериментів). Один тип ґрунту має високий вміст органічного вуглецю і низький вміст глини, а інший - низький вміст органічного вуглецю і високий вміст глини. Пропонуються такі співвідношення ґрунту та розчину:

- 50 г ґрунту і 50 куб.см водного розчину дослідної речовини (співвідношення 1/1),

- 10 г ґрунту і 50 куб.см водного розчину дослідної речовини (співвідношення 1/5),

- 2 г ґрунту і 50 куб.см водного розчину дослідної речовини (співвідношення 1/25).

Мінімальна кількість ґрунту, з якою може бути проведений експеримент, залежить від лабораторного обладнання та ефективності використовуваних аналітичних методів. Однак для одержання достовірних результатів дослідження рекомендується використовувати принаймні 1 г, а бажано 2 г ґрунту.

Один контрольний зразок, що містить лише досліджувану речовину в розчині 0,01 M CaCl (без ґрунту), піддається таким же 2

процедурам,  що і дослідні системи, з метою перевірки стабільності
дослідної  речовини  в  розчині  CaCl   і її можливої адсорбції на
                                     2
поверхнях дослідних посудин.

Одна контрольна система на кожен ґрунт з тим же вмістом ґрунту і загальним об'ємом 50 куб.см розчину 0,01 M CaCl (без 2

дослідної речовини) піддається тим же дослідним  процедурам.  Вона
служить  контролем  для  аналізу на наявність сторонніх речовин чи
забрудненого ґрунту.

Усі експерименти, включаючи контролі та контрольні системи, повинні проводитися принаймні в двох реплікаціях. Загальна кількість зразків, які готуються для дослідження, розраховується відповідно до використовуваної методології.

Методи попереднього дослідження та основного дослідження загалом однакові, а у разі наявності відхилень, вони зазначаються, де необхідно.

Висушені на повітрі зразки ґрунту врівноважуються шляхом збовтування у мінімальному об'ємі 45 куб.см розчину 0,01 M CaCl 2 протягом ночі (12 годин) напередодні експерименту. Після цього додається певна кількість базового розчину дослідної речовини для доведення остаточного об'єму до 50 куб.см. Цей об'єм доданого базового розчину: (а) не повинен перевищувати 10% від кінцевого об'єму 50 куб.см водної фази, щоб, якомога менше змінювати характеристики розчину до врівноваження; і (b) бажано, повинен створити таку початкову концентрацію дослідної речовини, що контактує з ґрунтом (С ), яка принаймні на два порядки вища ніж 0

межа виявлення аналітичного методу;  цей поріг дозволить  провести
точні вимірювання, навіть у разі якщо відбудеться значна адсорбція
(>  90%),  і   пізніше   визначити   ізотерми   адсорбції.   Також
рекомендується,  якщо можливо, щоб початкова концентрація речовини
(С ) не перевищувала половину своєї межі розчинності.
  0

Приклад розрахунку концентрації базового розчину (С ) st наведений нижче. Якщо припустити, що межа виявлення становить -3

0,01 мкг см  ,  а  адсорбція  -  90%,  то  бажано,  щоб  початкова
концентрація дослідної речовини, що контактує з ґрунтом, становила
         -3
1 мкг  см    (на  два  порядки  вище  ніж  межа  виявлення).  Якщо
припустити,  що доданий максимальний рекомендований об'єм базового
розчину, тобто  від  5  до   45   куб.см   розчину   врівноваження
0,01 M  CaCl   (=  10%  базового  розчину  -  до загального об'єму
            2
50 куб.см  водної  фази),   то   концентрація   базового   розчину
                     -3
становитиме 10 мкг см  ; це на три порядки вище ніж межа виявлення
аналітичного методу.

Показник pH водної фази вимірюється до і після контакту з ґрунтом, оскільки він відіграє важливу роль у всьому процесі адсорбції, особливо що стосується речовин, які іонізуються.

Суміш збовтується до досягнення адсорбційної рівноваги. Періоди врівноваження в ґрунті значно різняться, залежно від хімічної речовини та ґрунту; періоду з 24 годин зазвичай достатньо (77). Для попереднього дослідження зразки можуть відбиратися послідовно протягом 48 годин змішування (наприклад, станом на 4, 8, 24, 48 годину). Однак, час проведення аналізів повинен бути гнучким, залежно від графіку роботи лабораторії.

Є два варіанти аналізу дослідної речовини у водному розчині: (а) паралельний метод і (b) серійний метод. Слід відзначити, що хоча паралельний метод експериментально більш трудомісткий, математична обробка його результатів простіша (Доповнення 5). Однак, вибір використовуваної методології залишається за експериментатором, який повинен врахувати наявне лабораторне обладнання і можливості.

(а) паралельний метод: готуються зразки з однаковим співвідношенням ґрунту та розчину, їх кількість повинна відповідати кількості часових інтервалів, після яких вивчатиметься кінетика адсорбції. Після центрифугування і, за бажанням, фільтрування, водна фаза першої колби якомога повніше вилучається і вимірюється через, наприклад, 4 години, другої колби - через 8 годин, третьої - через 24 години і т.д.

(b) серійний метод: готується лише по два зразки на кожне співвідношення ґрунту та розчину. У визначені часові інтервали суміш центрифугується для розділення фаз. Невеличка аліквотна частина водної фази негайно аналізується на предмет дослідної речовини; потім експеримент продовжується з рештою суміші. Якщо після центрифугування застосовується фільтрування, в лабораторії повинні бути наявні можливості проведення фільтрування невеликих водних частин. Рекомендується, щоб загальний об'єм аліквотних частин не перевищував 1% від загального об'єму розчину; це потрібно для того, щоб істотно не змінювати співвідношення ґрунту та розчину і не зменшувати масу розчиненої речовини для адсорбції протягом дослідження.

Процент адсорбції A розраховується на кожен момент часу t i

(t ) на основі номінальної початкової концентрації та виміряної i

концентрації на момент відбору (t ) зразка з поправкою на значення
                                 i
контрольної системи.  Для оцінки  досягнення  рівноваги  будуються
графіки  співвідношення  A    та часу (рис.  1,  Доповнення 5)(1).
                          t
                           i
Також розраховується значення K  на момент рівноваги.  Виходячи  з
                               d
цього  значення  K ,  за  допомогою рис.  1 підбираються необхідні
                  d
співвідношення  ґрунту  та  розчину  таким  чином,   щоб   процент
адсорбції  перевищував 20%,  а бажано,  становив > 50%  (61).  Усі
необхідні рівняння та принципи побудови графіків наведені в секції
щодо Даних та звітності в Доповненні 5.

----------------

(1) Графіки співвідношення концентрації дослідної речовини у водній фазі та часу можна також використовувати для оцінки досягнення рівноваги (див. рис. 2 у Доповненні 5).

1.9.2.2. Визначення періоду адсорбційної рівноваги та кількості дослідної речовини, адсорбованої на момент рівноваги

ads Як уже зазначалося, графіки відношення A або C до часу t aq i

дозволяють оцінити досягнення адсорбційної рівноваги та  кількості
дослідної речовини, адсорбованої на момент рівноваги. На рис. 1 та
2  Доповнення  5  показані   зразки   таких   графіків.   Періодом
врівноваження   є   час,  який  потрібен  системі  для  досягнення
стабілізації.

Якщо при дослідженні певного ґрунту стабілізація не досягається, натомість відбувається постійне зростання, це може бути спричинене ускладнюючими факторами, такими як біологічне розкладання чи повільна дифузія. Біологічне розкладання можна виявити, повторивши експеримент із стерилізованим зразком ґрунту. Якщо стабілізація не досягається навіть у цьому випадку, експериментатор повинен шукати інші феномени, які можуть бути наявними в окремих дослідженнях; це можна зробити шляхом відповідної зміни умов експерименту (температури, періоду збовтування, співвідношення ґрунту та розчину). Експериментатор повинен сам вирішити, чи продовжувати процедуру дослідження, незважаючи на можливу неспроможність досягти рівноваги.

1.9.2.3. Адсорбція на поверхні дослідної посудини та стабільність дослідної речовини

Певну інформацію щодо адсорбції дослідної речовини на поверхні дослідних посудин, а також її стабільності, можна одержати за допомогою аналізу контрольних зразків. Якщо спостерігаються втрати, що більші ніж стандартна похибка аналітичного методу, причиною цього може бути абіотична деградація та/або адсорбція на поверхні дослідної посудини. Щоб з'ясувати, який саме із цих двох феноменів має місце, можна ретельно промити стінки посудини відомим об'ємом відповідного розчинника і проаналізувати цей розчин на наявність дослідної речовини. Якщо на поверхні дослідних посудин адсорбція не спостерігається, втрати свідчать про абіотичну нестабільність дослідної речовини. Якщо ж виявлена адсорбція, потрібно замінити матеріал дослідних посудин. Однак, дані щодо адсорбції на поверхні дослідних посудин, одержані в результаті цього експерименту, не можна прямим чином екстраполювати на експеримент з ґрунтом та розчином. Присутність ґрунту впливатиме на таку адсорбцію.

Додаткову інформацію щодо стабільності дослідної речовини можна одержати шляхом визначення вихідного балансу маси за період часу. Це означає, що водна фаза, а також проби із ґрунту та стінок дослідних посудин аналізуються на наявність дослідної речовини. Різниця між масою дослідної хімічної речовини, додана до суми дослідних хімічних мас у водній фазі, пробах із ґрунту та стінок дослідних посудин, дорівнює деградованій та/або втраченій та/або не екстрагованій масі. Баланс маси можна визначити після досягнення адсорбційної рівноваги в ході експерименту.

Визначення балансу маси проводиться на обох типах ґрунту і з одним співвідношенням ґрунту та розчину на тип ґрунту, при якому спостерігаються втрати більше 20% і, бажано, > 50% на момент рівноваги. Після того, як експеримент з визначення співвідношення через 48 годин завершується аналізом останнього зразка водної фази, фази сепаруються центрифугуванням і, за бажанням, фільтруванням. Водна фаза якомога повніше видаляється і до ґрунту додається відповідний екстракційний розчинник (з коефіцієнтом екстракції принаймні 95%) для екстракції дослідної речовини. Рекомендується проводити принаймні дві послідовні екстракції. Визначається кількість дослідної речовини у пробах із ґрунту та дослідних посудин і розраховується баланс маси (рівняння 10, Дані та звітність). Якщо вона менша 90%, дослідна речовина вважається нестабільною протягом періоду часу дослідження. Однак, дослідження можна продовжувати, враховуючи нестабільність дослідної речовини; у такому разі рекомендується аналізувати обидві фази в основному дослідженні.

1.9.3. Етап 2 - Кінетика адсорбції в одній концентрації дослідної речовини

Використовується п'ять типів ґрунтів, зазначених у Таблиці 1. Може бути корисним, якщо прийнятно, включити до цих п'ятьох типів ґрунтів деякі або всі типи ґрунтів, що використовувалися в попередньому дослідженні. У цьому разі Етап 2 не потрібно повторювати для ґрунтів, використаних у попередньому дослідженні.

Період рівноваги, співвідношення ґрунту та розчину, вага зразка ґрунту, об'єм водної фази, що контактує з ґрунтом, та концентрація дослідної речовини в розчині вибираються, виходячи з результатів попереднього дослідження. Бажано проводити аналіз приблизно через 2, 4, 6, 8 (можливо також 10) і 24 години контактування; період збовтування може бути продовжений максимум до 48 годин у разі, якщо за результатами дослідження із визначення співвідношення хімічній речовині потрібно більше часу для досягнення рівноваги. Однак, повинні встановлюватися гнучкі терміни проведення аналізів.

Кожен експеримент (один ґрунт і один розчин) проводиться принаймні в двох реплікаціях, щоб можна було оцінити розбіжність результатів. Для кожного експерименту закладається одна контрольна система. Вона складається із ґрунту та розчину 0,01 M CaCl без 2

дослідної  речовини і має таку ж вагу та об'єм,  відповідно,  що й
експериментальні системи.  Контрольний  зразок,  що  містить  лише
дослідну  речовину  в розчині 0,01 M CaCl  (без ґрунту) піддається
                                         2
такій же дослідній процедурі і призначений  для  пошуку  рішень  у
разі непередбачуваних обставин.

Розраховується процент  адсорбції  на  кожен  момент часу A
                                                                t
                                                                 i
та/або період часу A          (залежно  від  потреб)  і  будується
                    дельта t
                            i
графік  співвідношення  до  часу.  Також розраховуються коефіцієнт
розповсюдження K  на момент рівноваги та коефіцієнт адсорбції  K
                d                                               oc
з   поправкою   на   вміст  органічного  вуглецю  (для  неполярних
органічних хімічних речовин).

Результати дослідження кінетики адсорбції

Значення лінійного K зазвичай достатньо точне для опису d

сорбційної поведінки в ґрунті (35)(78)  і  являє  собою  вираження
мобільності в ґрунті,  притаманної хімічним речовинам.  Наприклад,
                                              -1
загалом хімічні  речовини  з  K  <= 1 куб.см г   вважаються якісно
                               d
мобільними.  Подібним  чином,  МакКолл  та  інші  розробили  схему
класифікації  мобільності  на основі значень K   (16).  Крім того,
                                              oc
існують  схеми  класифікації   вилужнювання,   які   основані   на
взаємозв'язку між K   та DT-50(1) (32)(79).
                   oc

----------------

(1) DT-50: період деградації для 50% дослідної речовини.

Також згідно з дослідженнями, проведеними для аналізу похибок -1

(61), значення K нижчі 0,3 куб.см г не можна точно оцінити d

через  зменшення  концентрації  у   водній   фазі,   навіть   якщо
використане   найбільш   сприятливе   (з   точки   зору  точності)
співвідношення  ґрунту  та  розчину,  тобто  1:1.  У  цьому   разі
рекомендується проведення аналізу обох фаз, ґрунту та розчину.

Що стосується вищезазначених приміток, рекомендується, щоб дослідження адсорбційної поведінки хімічної речовини в ґрунті та її потенційної мобільності продовжувалося визначенням ізотерм адсорбції Фрейндліха для тих систем, для яких можливе точне визначення K за допомогою експериментальної процедури цього d

методу  дослідження.  Точне  визначення  можливе,  якщо  значення,
одержане  в  результаті  множення  K   на співвідношення ґрунту та
                                    d
води,  >  0,3,   коли   вимірювання   ґрунтуються   на   зменшенні
концентрації  у  водній  фазі  (непрямий метод),  або > 0,1,  коли
аналізуються обидві фази (прямий метод) (61).

1.9.4. Етап 3 - Ізотерми адсорбції та кінетика десорбції/ізотерми десорбції

1.9.4.1. Ізотерми адсорбції

Використовується п'ять концентрацій речовини, при цьому бажано, щоб найменша і найбільша концентрації відрізнялись на два порядки; при виборі концентрацій потрібно врахувати розчинність води та одержані, в результаті, концентрації водної рівноваги. Протягом усього дослідження повинно підтримуватися незмінне співвідношення ґрунту та розчину. Дослідження адсорбції проводиться як описано вище, з тією лише відмінністю, що водна фаза аналізується лише один раз після спливу часу, необхідного для досягнення рівноваги, як визначено раніше в Етапі 2. Визначаються концентрації рівноваги в розчині і розраховується рівень адсорбції, виходячи із зменшення кількості дослідної речовини або за допомогою прямого методу. Будується графік адсорбованої маси на одиницю маси ґрунту як функція концентрації рівноваги дослідної речовини (див. Дані та звітність).

Результати експерименту із визначення ізотерм адсорбції

Серед запропонованих на даний момент математичних моделей розрахунку адсорбції найчастіше для опису процесів адсорбції використовується ізотерма Фрейндліха. Більш детальну інформацію щодо трактування і важливості моделей адсорбції можна знайти в посиланнях (41)(45)(80)(81)(82).

Примітка: слід відзначити, що порівняння значень K F (коефіцієнт адсорбції Фрейндліха) для різних речовин можливе, лише якщо ці значення K виражені в однакових одиницях (83). F

1.9.4.2. Кінетика десорбції

Метою цього експерименту є дослідження того, чи оборотно, чи необоротно хімічна речовина адсорбована в ґрунті. Ця інформація є важливою, оскільки процес десорбції також відіграє значну роль у поведінці хімічної речовини в ґрунті. Більше того, дані щодо десорбції важливі для комп'ютерного моделювання вилужнювання та стікання. Якщо необхідно провести дослідження десорбції, рекомендується проводити його на кожній системі, для якої було можливим точне визначення K у попередньому експерименті кінетики d

адсорбції.

Так само як і в дослідженні кінетики адсорбції, є два варіанти проведення експерименту кінетики десорбції: (а) паралельний метод і (b) серійний метод. Вибір використовуваної методології залишається за експериментатором, який повинен врахувати наявне лабораторне обладнання і можливості.

(а) паралельний метод: по кожному типу ґрунту, який вибраний для проведення дослідження десорбції, готуються зразки з однаковим співвідношенням ґрунту та розчину, їх кількість повинна відповідати кількості часових інтервалів, після яких вивчатиметься кінетика адсорбції. Бажано використовувати ті ж часові інтервали, що і в досліджені кінетики адсорбції; однак, загальний час може бути продовжений як необхідно для досягнення системою рівноваги десорбції. Для кожного експерименту (один ґрунт, один розчин) закладається одна контрольна система. Вона складається із ґрунту та розчину 0,01 M CaCl без дослідної речовини і має таку ж вагу 2

та об'єм,  відповідно,  що й експериментальні системи. Контрольний
зразок,  що містить лише дослідну речовину в розчині 0,01 M  CaCl
                                                                 2
(без  ґрунту) піддається такій же дослідній процедурі.  Усі суміші
ґрунту з розчином збовтуються до досягнення адсорбційної рівноваги
(як  визначено  раніше  в  Етапі  2).  Потім  усі фази сепаруються
центрифугуванням,  а водні фази вилучаються у якнайповнішій  мірі.
Вилучений об'єм  розчину  замінюється  таким  же  об'ємом  розчину
0,01 M CaCl  без дослідної  речовини  і  нові  суміші  збовтуються
           2
знову.  Водна  фаза  першої  колби  якомога  повніше вилучається і
вимірюється через,  наприклад,  2  години,  другої  колби  - через
4 години, третьої - через 6 годин і т.д. - до досягнення рівноваги
десорбції.

(b) серійний метод: після експерименту кінетики адсорбції суміш центрифугується, а водна фаза вилучається у якнайповнішій мірі. Вилучений об'єм розчину замінюється таким же об'ємом розчину 0,01 M CaCl без дослідної речовини. Нова суміш збовтується знову 2

до  досягнення десорбційної рівноваги.  Протягом цього періоду,  у
визначені часові інтервали суміш  центрифугується  для  розділення
фаз.  Невеличка аліквотна частина водної фази негайно аналізується
на предмет дослідної речовини;  потім експеримент продовжується  з
рештою  суміші.  Об'єм  кожної  окремої аліквотної частини повинен
бути меншим 1%  від загального  об'єму  розчину.  Такий  же  об'єм
свіжого  розчину  0,01  M CaCl  додається до суміші для збереження
                              2
співвідношення ґрунту та розчину і  збовтування  продовжується  до
наступного часового інтервалу.

Розраховується процент десорбції на кожен момент часу (D ) t i та/або період часу (D ) (залежно від потреб дослідження) і дельта t i

будується  графік  співвідношення  до  часу.  Також розраховується
коефіцієнт десорбції K     на  момент  рівноваги.  Усі  відповідні
                      des
рівняння наведені в Даних та звітності в Доповненні 5.

Результати дослідження кінетики десорбції

Оцінити оборотність процесу адсорбції можна за допомогою загальних графіків відношення процентів десорбції D і адсорбції t i

A   до  часу.  Адсорбція  вважається  оборотною,  якщо  досягнення
 t
  i
десорбційної  рівноваги відбудеться в межах навіть вдвічі більшого
періоду  часу,  ніж  знадобилося   для   досягнення   адсорбційної
рівноваги,  і  загальна  десорбція складе більше 75%  адсорбованої
кількості речовини.

1.9.4.3. Ізотерми десорбції

Ізотерми десорбції Фрейндліха визначаються на тих типах ґрунту, що використовувалися в експериментах щодо ізотерм адсорбції. Дослідження десорбції проводиться як описано вище в секції "Кінетика десорбції", з однією лише відмінністю, що водна фаза аналізується лише один раз, на момент десорбційної рівноваги. Розраховується кількість десорбованої дослідної речовини. Будується графік вмісту дослідної речовини, що залишається адсорбованою в ґрунті на момент десорбційної рівноваги, як функція концентрації рівноваги дослідної речовини в розчині (див. Дані та звітність та Доповнення 5).

2. ДАНІ ТА ЗВІТНІСТЬ

Аналітичні дані подаються в табличній формі (див. Доповнення 6). Подаються окремі вимірювання та розраховані середні значення. Наводяться ізотерми адсорбції в графічній формі. Розрахунки виконуються як описано нижче.

Для цілей дослідження вважається, що вага 1 куб.см водного розчину дорівнює 1 г. Співвідношення ґрунту та розчину може бути виражене одиницями вага/вага або вага/об'єм з однаковим значенням.

2.1. АДСОРБЦІЯ

Адсорбція A визначається як процентне відношення речовини, t i

адсорбованої   в   ґрунті,   до   кількості  речовини  на  початок
дослідження,  згідно з умовами дослідження. Якщо дослідна речовина
стабільна  і не адсорбується в значній мірі на стінках контейнера,
A   розраховується на кожен момент часу t  за формулою:
 t                                       i
  i

ads
                          m   (t ) · 100
                           s    i
                    A   = --------------- (%)                  (3)
                     t         m
                      i         o

де:

A = процент адсорбції на момент часу t (%);

t                                      i
       i

ads

m (t ) = маса дослідної речовини, адсорбованої в ґрунті на

s i

момент часу t  (мкг);
             i

m = маса дослідної речовини в дослідній колбі на початок

дослідження (мкг).

Докладна інформація щодо розрахунку  проценту  адсорбції  A
                                                                t
                                                                 i
для паралельного і серійного методів наведена в Доповненні 5.

Коефіцієнт розповсюдження K - це відношення вмісту речовини d

у фазі ґрунту та масової концентрації речовини у водному  розчині,
за умов дослідження, на момент досягнення адсорбційної рівноваги.

ads        ads
          C   (eq)   m   (eq)      V
           s          s             o
     K  = -------- = --------- · ------                         (4)
      d    ads        ads        m
          C   (eq)   m   (eq)     soil
           aq         aq

де:

ads

C (eq) = вміст речовини, адсорбованої в ґрунті на момент

s -1

адсорбційної рівноваги (мкг г  );

ads

C (eq) = масова концентрація речовини у водній фазі на

aq -3

момент адсорбційної рівноваги (мкг см  ).

Ця концентрація визначається аналітично, виходячи із значень, одержаних у контрольних системах;

ads

m (eq) = маса речовини, адсорбованої в ґрунті на момент

адсорбційної рівноваги (мкг);

ads

m (eq) = маса речовини в розчині на момент адсорбційної

рівноваги (мкг);

m = величина фази ґрунту, виражена сухою масою ґрунту

soil

(г);

V = початковий об'єм водної фази, що контактує з ґрунтом

(куб.см).

Співвідношення між A та K визначається за формулою: eq d

A            V
                  eq           0      3  -1
          K  = --------- · ------- (cm  g  )                   (5)
           d   100 - A      m
                      eq     soil

де:

A = процент адсорбції на момент адсорбційної рівноваги, %.

Коефіцієнт адсорбції з поправкою на вміст органічного вуглецю K є відношенням коефіцієнта розповсюдження K до вмісту oc d

органічного вуглецю в зразку ґрунту:

100      3  -1
                   K   = K  · ------ (cm  g  )                 (6)
                    oc    d    % OC

де:

-1 % ОС = процент органічного вуглецю в зразку ґрунту (г г ).

Коефіцієнт K являє собою єдине значення, яке характеризує oc

розділення, головним чином, неполярних органічних хімічних речовин
між органічним вуглецем у ґрунті або осаді та водою. Адсорбція цих
хімічних  речовин  корелюється  з  вмістом  органічних  речовин  у
сорбуючій твердій речовині (7); таким чином, значення K   залежать
                                                       oc
від  певних характеристик гумусових фракцій,  які значно різняться
за  своїми   сорбційними   властивостями   через   відмінності   в
походженні, генезисі тощо.

2.1.1. Ізотерми адсорбції

Рівняння ізотерм адсорбції Фрейндліха є відношенням кількості адсорбованої дослідної речовини до концентрації дослідної речовини в розчині на момент рівноваги (рівняння 8).

Дані опрацьовуються так само, як наведено в секції "Адсорбція", і для кожної дослідної колби розраховується вміст дослідної речовини, адсорбованої в ґрунті після дослідження ads

адсорбції (C   (eq),  ще позначається як x/m).  Припускається,  що
            s
                                ads
рівновага   була   досягнута,  C   (eq)  а  являє  собою  значення
                                s
рівноваги:

ads              ads
                m   (eq)   (C  - C   (eq)) · V
                 s           o    aq          o      -1
     Cads(eq) = -------- = -------------------- (мю g  )       (7)
                m                m
                 soil             soil

Рівняння адсорбції Фрейндліха (8):

ads ads ads 1/n -1 C (eq) = K · C (eq) (мю g ) (8) s F aq

або в лінійній формі:

ads ads ads log C (eq) = log K + 1/n · log C (eq) (9) s F aq

де:

ads

K = коефіцієнт адсорбції Фрейндліха; він вимірюється в

F -1

куб.см г  ,  лише якщо 1/n = 1;  в усіх інших випадках  крива  1/n
                  1-1/n         1/n  -1
вимірюється в (мкг      (куб.см)    г  );

n = константа регресії; 1/n зазвичай перебуває в діапазоні 0,7-1,0, що говорить про те, що дані сорбції часто дещо нелінійні.

Будуються графіки за рівняннями (8) та (9) і методом регресійного аналізу за допомогою рівняння 9 розраховуються ads 2 значення K та 1/n. Також розраховується коефіцієнт кореляції r логарифмічного рівняння. Приклади таких графіків наведені на рис. 2.

Рис. 2 Графік адсорбції Фрейндліха, звичайний і лінеаризований ( 994_b14)

2.1.2. Баланс маси

Баланс маси (МВ) визначається як процентне відношення речовини, яке може бути одержане аналітичним шляхом після дослідження адсорбції, до номінальної кількості речовини, наявної на початку дослідження.

Обробка даних буде відрізнятися, якщо розчинник повністю розчинний у воді. У разі, якщо розчинник розчиняється у воді, для визначення кількості речовини, яка одержується в результаті екстракції за допомогою розчинника, можна скористатися розрахунками, описаними в секції "Десорбція". Якщо розчинник менш розчинний у воді, потрібно визначити кількість, що була одержана.

Баланс маси МВ для адсорбції розраховується таким чином; припускається, що термін (m ) відповідає сумі мас дослідної E

речовини, екстрагованої з ґрунту та поверхні дослідної посудини за
допомогою органічного розчинника:

ads
                   (V    · C   (eq) + m ) · 100
                     rec    aq         E
              MB = ---------------------------- (%)           (10)
                           V  · C
                            0    0

де:

МВ = баланс маси (%);

m = загальна маса дослідної речовини, екстрагованої з ґрунту

та стінок дослідної посудини в два етапи (мкг);

C = початкова масова концентрація дослідної речовини, що

0 -3

контактує з ґрунтом (мкг см  );

V = об'єм надосадової рідини, одержаної після адсорбційної

rec -3

рівноваги (см  ).

2.2. ДЕСОРБЦІЯ

Десорбція (D) визначається як процентне відношення десорбованої дослідної речовини до кількості раніше адсорбованої речовини, за умов дослідження:

des
                         m   (t )
                          aq   i
                   D   = --------- · 100 (%)                  (11)
                    t     ads
                     i   m   (eq)
                          s

де:

D = процент десорбції на момент часу t (%);

t                                      i
       i

des

m (t ) = маса дослідної речовини, десорбованої з ґрунту на

aq i

момент часу t  (мкг);
             i

ads

m (eq) = маса дослідної речовини, адсорбованої в ґрунті на

момент адсорбційної рівноваги (мкг).

Докладна інформація  щодо  розрахунку  проценту десорбції D
                                                                t
                                                                 i
для паралельного і серійного методів наведена в Доповненні.

Позірний коефіцієнт десорбції (K ) - це, за умов des

дослідження,  відношення  між  вмістом речовини,  що залишається у
фазі ґрунту,  до  масової  концентрації  десорбованої  речовини  у
водній фазі на момент досягнення десорбційної рівноваги:

ads        des
              m   (eq) - m   (eq)    V
               s          aq          T      3  -1
       K    = ------------------- · ----- (cm  g  )           (12)
        des        des              m
                  m   (eq)           soil
                   aq

де:

-1 K = коефіцієнт десорбції (куб.см г ); des

des

m (eq) = загальна маса дослідної речовини, десорбованої з

ґрунту на момент десорбційної рівноваги (мкг);

V = загальний об'єм водної фази, що контактує з ґрунтом під

час дослідження кінетики десорбції (куб.см).

des
     Рекомендації щодо розрахунку m   (eq) наведені в Доповненні 5
                                   aq
під заголовком "Десорбція".

Примітка:

Якщо попереднє дослідження адсорбції було проведене з використанням паралельного методу, то вважається, що об'єм V у T рівнянні (12) дорівнює V . 0

2.2.1. Ізотерми десорбції

Рівняння ізотерм десорбції Фрейндліха є відношенням вмісту дослідної речовини, що залишається адсорбованою в ґрунті, до концентрації дослідної речовини в розчині на момент десорбційної рівноваги (рівняння 16).

Для кожної дослідної колби розраховується вміст дослідної речовини, що залишається адсорбованою в ґрунті на момент десорбційної рівноваги:

ads        des
                         m   (eq) - m   (eq)
               des        s          aq           -1
              C   (eq) = ------------------- (мю g  )         (13)
               s               m
                                soil

des
              m   (eq) визначається як:
               aq

V
               des        des        0     A
              m   (eq) = m   (eq) · --- - m   (мю g)          (14)
               aq         m          F     aq
                                    V
                                     r

де:

des

C (eq) = вміст дослідної речовини, що залишається

s -1

адсорбованою в ґрунті на момент десорбційної рівноваги (мкг г  );

des

m (eq) = аналітично визначена маса речовини у водній фазі

на момент десорбційної рівноваги (мкг);

m = маса дослідної речовини, що залишилася після

адсорбційної рівноваги через неповне заміщення об'єму (мкг);

des

m (eq) = маса речовини в розчині на момент адсорбційної

рівноваги (мкг);

V  - V
               A     ads         0    R
              m   = m   (eq) · (-------)                      (15)
               aq    aq            V
                                    0

V = об'єм речовини, вилученої із колби для вимірювання

дослідної речовини, на момент десорбційної рівноваги (куб.см);

V = об'єм надосадової рідини, вилученої із колби після

досягнення  адсорбційної  рівноваги  та заміщеної таким же об'ємом
розчину 0,01 M CaCl  (куб.см).
                   2

Рівняння десорбції Фрейндліха (16):

des des des 1/n -1 C (eq) = K · C (eq) (мю g ) (16) s F aq

або в лінійній формі:

des des des log C (eq) = log K + 1/n · log C (eq) (17) s F aq

де:

des

K = коефіцієнт десорбції Фрейндліха;

n = константа регресії;

des

C (eq) = масова концентрація речовини у водній фазі на

aq -3

момент десорбційної рівноваги (мкг см  ).

Можна побудувати графіки за рівняннями (16) та (17) і des

розрахувати  значення  K    та 1/n методом регресійного аналізу за
                        F
допомогою рівняння 17.

Примітка:

якщо експонента адсорбції чи десорбції Фрейндліха 1/n дорівнює 1, то константа зв'язування адсорбції чи десорбції ads des

Фрейндліха (K    та K   ) дорівнюватиме константам адсорбційної чи
             F       F
десорбційної  рівноваги  (K   та  K   )  відповідно,   а   графіки
                           d       des
відношення   C   та  C    будуть  лінійними.  Якщо  експоненти  не
              s       aq
дорівнюють 1,  графіки відношення C  та C   будуть нелінійними,  а
                                   s     aq
константи адсорбції та десорбції в ізотермах відрізнятимуться.

2.2.2. Протокол дослідження

Протокол дослідження повинен містити таку інформацію:

- повну ідентифікацію використаних зразків ґрунту, включаючи,

- географічні дані місця відбору (широта, довгота),

- дату відбору,

- характер використання (наприклад, сільське господарство, ліс тощо),

- глибину відбору,

- вміст піску/глею/глини;

- значення pH (у розчині 0,01 M CaCl ), 2

- вміст органічного вуглецю,

- вміст органічних речовин,

- вміст азоту,

- співвідношення C/N,

- ємність поглинання ґрунту (ммоль/кг),

- всю інформацію щодо відбору та зберігання зразків ґрунту,

- де прийнятно, всю інформацію щодо адсорбції-десорбції дослідної речовини,

- методи, використані для визначення кожного параметра,

- іншу корисну інформацію щодо дослідної речовини,

- температуру проведення експериментів;

- умови центрифугування;

- аналітичну процедуру, використану для аналізу дослідної речовини,

- обґрунтування будь-якого використання розчинювального засобу для приготування базового розчину дослідної речовини,

- пояснення коригувань, внесених у розрахунки, якщо прийнятно,

- дані за формою (Доповнення 6) та дані, представлені в графічній формі,

- всю інформацію та спостереження, що можуть бути корисними для тлумачення результатів дослідження.

3. ПОСИЛАННЯ

(1) Kukowski H. and Brummer G., (1987) Investigations on the Adsorption and Desorption of Selected Chemicals in Soils. UBA Report 106 02 045, Part II.

(2) Franzle O., Kuhnt G. and Vetter L., (1987) Selection of Representative Soils in the EC-Territory. UBA Report 106 02 045, Part I.

(3) Kuhnt G. and Muntau H. (Eds.) EURO-Soils: Identification, Collection, Treatment, Characterisation. Special Publication No 1.94.60, Joint Research Centre. European Commission, ISPRA, December 1994.

(4) OECD Test Guidelines Programme, Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 18-20 January 1995 (June 1995).

(5) US-Environment Protection Agency: Pesticide Assessment Guidelines, Subdivision N, Chemistry: Environmental Fate, Series 163-1, Leaching and Adsorption/Desorption Studies, Addendum 6 on Data Reporting, 540/09-88-096, Date: 1/1988.

(6) US-Environment Protection Agency: Prevention, Pesticides and Toxic Substances, OPPTS Harmonized Test Guidelines, Series 835-Fate, Transport and Transformation Test Guidelines, 0PPTS No: 835.1220 Sediment and Soil Adsorption/Desorption Isotherm. EPA No: 712-C-96-048, April 1996.

(7) ASTM Standards, E 1195-85, Standard Test Method for Determining a Sorption Constant (Koc) for an Organic Chemical in Soil and Sediments.

(8) Agriculture Canada: Environmental Chemistry and Fate. Guidelines for registration of pesticides in Canada, 15 July 1987.

(9) Netherlands Commission Registration Pesticides (1995): Application for registration of a pesticide. Section G. Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air.

(10) Danish National Agency of Environmental Protection (October 1988): Criteria for registration of pesticides as especially dangerous to health or especially harmful to the environment.

(11) BBA (1990) Guidelines for the Official Testing of Plant Protection Products, Biological Research Centre for Agriculture and Forestry, Braunschweig, Germany.

(12) Calvet R., (1989) 'Evaluation of adsorption coefficients and the prediction of the mobilities of pesticides in soils', in Methodological Aspects of the Study of Pesticide Behaviour in Soil (ed. P. Jamet), INRA, Paris, (Review).

(13) Calvet R., (1980) 'Adsorption-Desorption Phenomena' in Interactions between herbicides and the soil. (R.J. Hance ed.), Academic Press, London, p. 83-122.

(14) Hasset J.J., and Banwart W.L., (1989), 'The sorption of nonpolar organics by soils and sediments' in Reactions and Movement of Organic Chemicals in Soils. Soil Science Society of America (S.S.S.A), Special Publication No 22, p. 31-44.

(15) van Genuchten M. Th., Davidson J.M., and Wierenga P.J., (1974) 'An evaluation of kinetic and equilibrium equations for the prediction of pesticide movement through porous media'. Soil Sci. Soc. Am. Proc., Vol. 38(1), p. 29-35.

(16) McCall P.J., Laskowski D.A., Swann R.L., and Dishburger H.J., (1981) 'Measurement of sorption coefficients of organic chemicals and their use, in environmental fate analysis', in Test Protocols for Environmental Fate and Movement of Toxicants. Proceedings of AOAC Symposium, AOAC, Washington DC.

(17) Lambert S.M., Porter P.E., and Schieferrstein R.H., (1965) 'Movement and sorption of chemicals applied to the soil'. Weeds, 13, p. 185-190.

(18) Rhodes R.C., Belasco I.J., and Pease H.L., (1970) 'Determination of mobility and adsorption of agrochemicals in soils'. J.Agric.Food Chem., 18, p. 524-528.

(19) Russell M.H., (1995), 'Recommended approaches to assess pesticide mobility in soil' in Environmental Behavior of Agrochemicals (ed. T.R. Roberts and P.C. Kearney). John Wiley & Sons Ltd.

(20) Esser H.O., Hemingway R.J., Klein W., Sharp D.B., Vonk J.W. and Holland P.T., (1988) 'Recommended approach to the evaluation of the environmental behavior of pesticides', IUPAC Reports on Pesticides (24). Pure Appl. Chem., 60, p. 901-932.

(21) Guth J.A., Burkhard N., and D.O. Eberle, (1976) 'Experimental models for studying the persistence of pesticides in soils'. Proc. BCPC Symposium: Persistence of Insecticides and Herbicides, p. 137-157, BCPC, Surrey, UK.

(22) Furminge C.G.L., and Osgerby J.M., (1967) 'Persistence of herbicides in soil'. J. Sci. Food Agric., 18, p. 269-273.

(23) Burkhard N., and Guth J.A., (1981) 'Chemical hydrolysis of 2-Chloro-4,6-bis(alkylamino)-1,3,5-triazine herbicides and their breakdown in soil under the influence of adsorption'. Pestic. Sci. 12, p. 45-52.

(24) Guth J.A., Gerber H.R., and Schlaepfer T., (1977) 'Effect of adsorption, movement and persistence on the biological availability of soil-applied pesticides'. Proc. Br. Crop Prot. Conf., 3, p. 961-971.

(25) Osgerby J.M., (1973) 'Process affecting herbicide action in soil'. Pestic. Sci., 4, p. 247-258.

(26) Guth J.A., (1972) 'Adsorptions- und Einwascheverhalten von Pflanzenschutzmitteln in Boden'. Schr. Reihe Ver. Wass. -Boden- Lufthyg. Berlin-Dahlem, Heft 37, p. 143-154.

(27) Hamaker J.W., (1975) 'The interpretation of soil leaching experiments', in Environmental Dynamics of Pesticides (eds R. Haque and V.H. freed), p. 135-172, Plenum Press, NY.

(28) Helling C.S., (1971) 'Pesticide mobility in soils'. Soil Sci. Soc.Amer.Proc., 35, p. 732-210.

(29) Hamaker J.W., (1972) 'Diffusion and volatilization' in Organic chemicals in the soil environment (C.A.I. Goring and J.W. Hamaker eds), Vol. I, p. 49-143.

(30) Burkhard N. and Guth J.A., (1981) 'Rate of volatilisation of pesticides from soil surfaces; Comparison of calculated results with those determined in a laboratory model system'. Pestic. Sci. 12, p. 37-44.

(31) Cohen S.Z., Creeger S.M., Carsel R.F., and Enfield C.G., (1984) 'Potential pesticide contamination of groundwater from agricultural uses', in Treatment and Disposal of Pesticide Wastes, p. 297-325, Acs Symp. Ser. 259, American Chemical Society, Washington, DC.

(32) Gustafson D.I., (1989) 'Groundwater ubiquity score: a simple method for assessing pesticide leachability'. J. Environ. Toxic. Chem., 8(4), p. 339-357.

(33) Leistra M., and Dekkers W.A., (1976) 'Computed effects of adsorption kinetics on pesticide movement in soils'. J. of Soil Sci., 28, p. 340-350.

(34) Bromilov R.H., and Leistra M., (1980) 'Measured and simulated behavior of aldicarb and its oxydation products in fallow soils'. Pest. Sci., 11, p. 389-395.

(35) Green R.E., and Karickoff S.W., (1990) 'Sorption estimates for modeling', in Pesticides in the Soil Environment: Process, Impacts and Modeling (ed. H.H. Cheng). Soil Sci. Soc. Am., Book Series No 2, p. 80-101.

(36) Lambert S.M., (1967) 'Functional relationship between sorption in soil and chemical structure'. J. Agri. Food Chem., 15, p. 572-576.

(37) Hance R.J., (1969) 'An empirical relationship between chemical structure and the sorption of some herbicides by soils'. J. Agri. Food Chem., 17, p. 667-668.

(38) Briggs G.G. (1969) 'Molecular structure of herbicides and their sorption by soils'. Nature, 223, p. 1288.

(39) Briggs G.G. (1981) 'Theoretical and experimental relationships between soil adsorption, octanol-water partition coefficients, water solubilities, bioconcentration factors, and the parachor'. J. Agric. Food Chem., 29, p. 1050-1059.

(40) Sabljic A., (1984) 'Predictions of the nature and strength of soil sorption of organic polutance by molecular topology'. J. Agric. Food Chem., 32, p. 243-246.

(41) Bailey G.W., and White J.L., (1970) 'Factors influencing the adsorption, desorption, and movement of pesticides in soil'. Residue Rev., 32, p. 29-92.

(42) Bailey G.W., J.L. White and Y. Rothberg., (1968) 'Adsorption of organic herbicides by montomorillonite: Role of pH and chemical character of adsorbate'. Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 32, p. 222-234.

(43) Karickhoff S.W., (1981) 'Semi-empirical estimation of sorption of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils'. Chemosphere 10, p. 833-846.

(44) Paya-Perez A., Riaz M. and Larsen B., (1989) 'Soil Sorption of 6 Chlorobenzenes and 20 PCB Congeners'. Environ. Toxicol. Safety 21, p. 1-17.

(45) Hamaker J.W., and Thompson J.M., (1972) 'Adsorption in organic chemicals' in Organic Chemicals in the Soil Environment (Goring C.A.I. and Hamaker J.W., eds), Vol I and II, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1972, p. 49-143.

(46) Deli J., and Warren G.F., 1971 'Adsorption, desorption and leaching of diphenamid in soils'. Weed Sci. 19, p. 67-69.

(47) Chu-Huang Wu, Buehring N., Davinson J.M. and Santelmann, (1975) 'Napropamide Adsorption, desorption and Movement in soils'. Weed Science, Vol. 23, p. 454-457.

(48) Haues M.H.B., Stacey M., and Thompson J.M., (1968) 'Adsorption of s-triazine herbicides by soil organic preparations' in Isotopes and Radiation in Soil Organic Studies, p. 75, International. Atomic Energy Agency, Vienna.

(49) Pionke H.B., and Deangelis R.J., (1980) 'Methods for distributing pesticide loss in field run-off between the solution and adsorbed phase', CREAMS, in A Field Scale Model for Chemicals, Run-off and Erosion from Agricultural Management Systems, Chapter 19, Vol. III: Supporting Documentation, USDA Conservation Research report.

(50) ISO Standard Compendium Environment: Soil Quality - General aspects; chemical and physical methods of analysis; biological methods of analysis. First Edition (1994).

(51) Scheffer F., and Schachtschabel, Lehrbuch der Bodenkunde, F. Enke Verlag, Stuttgart (1982) 11th edition.

(52) Black, Evans D.D., White J.L., Ensminger L.E., and Clark F.E., eds. 'Methods of Soil Analysis', Vol 1 and 2, American Society of Agronomy, Madison, WI, 1982.

(53) ISO/DIS 10381-1 Soil Quality - Sampling - Part 1: Guidance on the design of sampling programmes.

(54) ISO/DIS 10381-2 Soil Quality - Sampling - Part 2: Guidance on sampling techniques.

(55) ISO/DIS 10381-3 Soil Quality - Sampling - Part 3: Guidance on safety of sampling.

(56) ISO/DIS 10381-4 Soil Quality - Sampling - Part 4: Guidance on the investigation of natural and cultivated soils.

(57) ISO/DIS 10381-5 Soil Quality - Sampling - Part 5: Guidance on the investigation of soil contamination of urban and industrial sites.

(58) ISO 10381-6, 1993: Soil Quality - Sampling - Part 6: Guidance on the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.

(59) Green R.E., and Yamane V.K., (1970) 'Precision in pesticide adsorption measurements'. Soil Sci. Am. Proc., 34, 353-354.

(60) Grover R., and Hance R.J. (1970) 'Effect of ratio of soil to water on adsorption of linuron and atrazine'. Soil Sci., p. 109-138.

(61) Boesten, J.J.T.I, 'Influence of soil/liquid ratio on the experimental error of sorption coefficients in pesticide/soil system'. Pest. Sci. 1990, 30, p. 31-41.

(62) Boesten, J.J.T.I. 'Influence of soil/liquid ratio on the experimental error of sorption coefficients in relation to OECD guideline 106' Proceedings of 5th international workshop on environmental behaviour of pesticides and regulatory aspects, Brussels, 26-29 April 1994.

(63) Bastide J., Cantier J.M., et Coste C., (1980) 'Comportement de substances herbicides dans le sol en fonction de leur structure chimique'. Weed Res. 21, p. 227-231.

(64) Brown D.S., and Flagg E.W., (1981) 'Empirical prediction of organic pollutants sorption in natural sediments'. J. Environ. Qual., 10(3), p. 382-386.

(65) Chiou C.T., Porter P.E., and Schmedding D.W., (1983) 'Partition equilibria of non-ionic organic compounds between soil organic matter and water'. Environ. Sci. Technol., 17(4), p. 227-231.

(66) Gerstl Z., and Mingelgrin U., (1984) 'Sorption of organic substances by soils and sediments'. J. Environm. Sci. Health, B19 (3), p. 297-312.

(67) Vowles P.D., and Mantoura R.F.C., (1987), 'Sediment-water partition coefficient and HPLC retention factors of aromatic hydrocarbons'. Chemosphere, 16(1), p. 109-116.

(68) Lyman W.J. , Reehl W.F.and Rosenblatt D.H. (1990) Handbook of Chemical Property Estimation Methods. Environmental Behaviour of Organic Compounds. American Chemical Society, Washington DC.

(69) Keniga E.E., and Goring, C.A.I. (1980) 'Relationship between water solubility, soil sorption, octanol-water partitioning and concentration of chemicals in the biota' in Aquatic Toxicology (eds J.G. Eaton, et al.), p. 78-115, ASTM STP 707, Philadelphia.

(70) Chiou C.T., Peters L.J., and Freed V.H., (1979) 'A physical concept of soil-water equilibria for non-ionic organic compounds'. Science, Vol. 206, p. 831-832.

(71) Hassett J.J., Banwart W.I., Wood S.G., and Means J.C., (1981) 'Sorption of/-Naphtol: implications concerning the limits of hydrophobic sorption'. Soil Sci. Soc. Am. J. 45, p. 38-42.

(72) Karickhoff S.W., (1981), 'Semi-empirical estimation of sorption of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils'. Chemosphere, Vol. 10(8), p. 833-846.

(73) Moreale A., van Bladel R., (1981) 'Adsorption de 13 herbicides et insecticides par le sol. Relation solubilite - reactivite. Revue de l'Agric., 34 (4), p. 319-322.

(74) Muller M., Kordel W. (1996) 'Comparison of screening methods for the determination/estimation of adsorption coefficients on soil'. Chemosphere, 32(12), p. 2493-2504.

(75) Kordel W., Kotthoff G., Muller M. (1995) 'HPLC - screening method for the determination of the adsorption coefficient on soil - results of a ring test'. Chemosphere 30 (7), p. 1373-1384.

(76) Kordel W., Stutte J., Kotthoff G. (1993), 'HPLC - screening method for the determination of the adsorption coefficient on soil - comparison of different stationary phases. Chemosphere 27 (12), p. 2341-2352.

(77) Hance, R.J., (1967), 'The speed of Attainment of Sorption Equilibria in Some Systems Involving Herbicides'. Weed Research, Vol. 7, p. 29-36.

(78) Koskinen W.C., and Harper S.S., (1990), 'The retention processes: mechanisms' in Pesticides in the Soil Environment: Processes, Impacts and Modelling (ed. H.H. Cheng). Soil Sci. Soc. Am. Book Series, No 2, Madison, Wisconsin.

(79) Cohen S.Z., Creeger S.M., Carsel R.F., and Enfield C.G. (1984), 'Potential pesticide contamination of groundwater from agricultural uses', in Treatment and Disposal of Pesticide Wastes, p. 297-325, ACS Symp. Ser. 259, American Chemical Society, Washington, DC.

(80) Giles C.H., (1970) 'Interpretation and use of sorption isotherms' in Sorption and Transport Processes in Soils. S.C.I. Monograph No. 37, p. 14-32.

(81) Giles, C.H.; McEwan J.H.; Nakhwa, S.N. and Smith, D, (1960) 'Studies in adsorption: XI. A system of classification of solution adsorption isotherms and its use in the diagnosis of adsorption mechanisms and in measurements of pesticides surface areas of soils'. J. Chem. Soc., p. 3973-93.

(82) Calvet R., Terce M., and Arvien J.C., (1980) 'Adsorption des pesticides par les sols et leurs constituants: 3. Caracteristiques generales de l'adsorption'. Ann. Agron. 31, p. 239-251.

(83) Bedbur E., (1996) 'Anomalies in the Freundlich equation', Proc. COST 66 Workshop, Pesticides in soil and the environment, 13-15 May 1996, Stratford-upon-Avon, U.K.

(84) Guth, J.A., (1985) 'Adsorption/desorption', in Joint International Symposium, Physicochemical Properties and their Role in Environmental Hazard Assessment, July 1-3, Canterbury, UK.

(85) Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 26, p. 305 (1962).

Доповнення 1

Схема дослідження ( 994_b14 )

Доповнення 2

ВПЛИВ ТОЧНОСТІ АНАЛІТИЧНОГО МЕТОДУ ТА ЗМІНИ КОНЦЕНТРАЦІЇ НА ТОЧНІСТЬ РЕЗУЛЬТАТІВ ДОСЛІДЖЕННЯ АДСОРБЦІЇ

З нижчезазначеної таблиці (84) стає очевидним, що коли різниця між початковою масою (m = 110 мкг) і масою рівноваги 0 ads

(m (eq) = 100 мкг) дослідної речовини в розчині є дуже малою, aq

похибка в 5%  при вимірюванні концентрації рівноваги призводить до
похибки  в 50%  у розрахунку маси речовини,  адсорбованої в ґрунті
  ads

(m (eq)) і 52,4% у розрахунку K . s d

Кількість ґрунту m = 10 г soil

Об'єм розчину V = 100 куб.см 0

----------------------------------------------------------------------------------------
|            | ads    | ads    |   R    | ads    (*)| ads    (*)|    +   | K (*)|   +  |
|            |m   (eq)|C   (eq)|        |m   (eq)   |C   (eq)   |   R    |  d   |  R   |
|            | aq     | aq     |        | s         | s         |    +   |      |   +  |
|            |(мкг)   |(мкг    |        |(мкг)      |      -1   |        |      |      |
|            |        |  -3)   |        |           |(мкг г  )  |        |      |      |
|            |        |см      |        |           |           |        |      |      |
|            |-------------------------------------------------------------------------|
|            |                          ДЛЯ А = 9%                                     |
|------------+-------------------------------------------------------------------------|
|m  = 110 мкг|  100   |  1,000 |вірне   |     10    |    1,00   |вірне   |  1   |      |
| 0          |        |        |значення|           |           |значення|      |      |
|або         |--------+--------+--------+-----------+-----------+--------+------+------|
|C  = 1,100  |  101   |  1,010 |  1%    |      9    |    0,90   |  10%   | 0,891| 10,9%|
| 0          |--------+--------+--------+-----------+-----------+--------+------+------|
|мкг/куб.см  |  105   |  1,050 |  5%    |      5    |    0,50   |  50%   | 0,476| 52,4%|
|            |--------+--------+--------+-----------+-----------+--------+------+------|
|            |  109   |  1,090 |  9%    |      1    |    0,10   |  90%   | 0,092| 90,8%|
|------------+-------------------------------------------------------------------------|
|            |                          ДЛЯ А = 55%                                    |
|------------+-------------------------------------------------------------------------|
|m  = 110 мкг|  50,0  |  0,500 |вірне   |     60,0  |    6,00   |вірне   | 12,00|      |
| 0          |        |        |значення|           |           |значення|      |      |
|або         |--------+--------+--------+-----------+-----------+--------+------+------|
|C  = 1,100  |  50,5  |  0,505 |  1%    |     59,5  |    5,95   |  0,8%  | 11,78|  1,8%|
| 0          |--------+--------+--------+-----------+-----------+--------+------+------|
|мкг/куб.см  |  52,5  |  0,525 |  5%    |     57,5  |    5,75   |  4,0%  | 10,95|  8,8%|
|            |--------+--------+--------+-----------+-----------+--------+------+------|
|            |  55,0  |  0,550 |  10%   |     55,0  |    5,50   |  8,3%  | 10,00| 16,7%|
|------------+-------------------------------------------------------------------------|
|            |                          ДЛЯ А = 99%                                    |
|------------+-------------------------------------------------------------------------|
|m  = 110 мкг|  1,100 |  0,011 |вірне   |    108,9  |   10,89   |вірне   |  990 |      |
| 0          |        |        |значення|           |           |значення|      |      |
|або         |--------+--------+--------+-----------+-----------+--------+------+------|
|C  = 1,100  |  1,111 | 0,01111|  1%    |    108,889|   10,8889 | 0,01%  |  980 |  1,0%|
| 0          |--------+--------+--------+-----------+-----------+--------+------+------|
|мкг/куб.см  |  1,155 | 0,01155|  5%    |    108,845|   10,8845 | 0,05%  |  942 |  4,8%|
|            |--------+--------+--------+-----------+-----------+--------+------+------|
|            |  1,21  | 0,0121 |  10%   |    108,790|   10,8790 | 0,10%  |  899 |  9,2%|
----------------------------------------------------------------------------------------

ads                ads

(C - C (eq))V m (eq) V

ads             ads       ads         0    aq       0         s            0
     * m   (eq) = m  - m   (eq), C   (eq) = ----------------- · K  = -------- · -----
        s          0    aq        s              m               d    ads       m
                                                  soil               m   (eq)    soil
                                                                      aq

ads

m (eq) = маса дослідної речовини у фазі ґрунту на момент

рівноваги, мкг;

ads

m (eq) = маса дослідної речовини у водній фазі на момент

рівноваги, мкг;

ads

C (eq) = вміст дослідної речовини у фазі ґрунту на момент

s -1

рівноваги, мкг г  ;

ads

C (eq) = масова концентрація дослідної речовини у водній

aq -3

фазі на момент рівноваги, мкг см  ;

ads
     R = аналітична похибка при визначенні m   (eq);
                                            aq

R = розрахована похибка через аналітичну похибку R.

Доповнення 3

МЕТОДИКА ОЦІНКИ K D

1. Ця методика оцінки дозволяє спрогнозувати K на основі d

кореляцій із,  наприклад,  значеннями P   (12)(39)(63-68),  даними
                                       ow
щодо  розчинності  води  (12)(19)(21)(39)(68-73)  або  даними щодо
полярності, одержаними в результаті застосування HPLC до оборотної
фази (74-76).  Як показано в Таблицях 1 та 2, за допомогою рівнянь
розраховуються K   або K  , а потім, непрямим чином, K :
                oc      om                            d

K
             100     3  -1               d      100     3  -1
 K   = K  · ----- (cm  g  )      K   = ----- · ----- (cm  g  )
  oc    d   % OC                  om   1,724   % OC

2. Концепція цих кореляцій ґрунтується на двох припущеннях: (1) на адсорбцію речовини головним чином впливають органічні речовини, що містяться в ґрунті; і (2) взаємозв'язки, які мають місце, головним чином неполярні. В результаті, ці кореляції: (1) не застосовуються або лише в деякій мірі застосовуються до полярних речовин, і (2) не застосовуються у випадках, коли вміст органічних речовин у ґрунті дуже малий (12). Крім того, хоча між P та адсорбцією були знайдені задовільні кореляції (19), цього ow

не можна  сказати  про  зв'язок  між  розчинністю  води  і  рівнем
адсорбції (19)(21); на даний час дослідження дуже суперечливі.

3. Деякі приклади кореляцій між коефіцієнтом адсорбції та коефіцієнтом розділення октанол/вода, а також розчинністю води наведені в Таблицях 1 та 2, відповідно.

Таблиця 1

Приклади кореляцій між коефіцієнтом адсорбції та коефіцієнтом розділення октанол/вода; подальші приклади містяться у (12) (68).

------------------------------------------------------------------------------
|      Речовини       |            Кореляції            |       Автори       |
|---------------------+---------------------------------+--------------------|
|Заміщена сечовина    |log K   = 0,69 + 0,52 log P      |Бріггс (1981) (39)  |
|                     |     om                    ow    |                    |
|---------------------+---------------------------------+--------------------|
|Ароматичні хлористі  |log K   = - 0,779 + 0,904 log P  |Чіу та інші (1983)  |
|речовини             |     oc                        ow|(65)                |
|---------------------+---------------------------------+--------------------|
|Різні пестициди      |log K   = 4,4 + 0,72 log P       |Герстль та          |
|                     |     om                   ow     |Мінгельгрін (1984)  |
|                     |                                 |(66)                |
|---------------------+---------------------------------+--------------------|
|Ароматичні вуглеводні|log K   = - 2,53 + 1,15 log P    |Ваувелс та Мантура  |
|                     |     oc                      ow  |(1987) (67)         |
------------------------------------------------------------------------------

Таблиця 2

Приклади кореляцій між коефіцієнтом розповсюдження адсорбції та розчинністю води; подальші приклади містяться у (68) (69).

------------------------------------------------------------------------------
|      Речовини       |             Кореляції           |       Автори       |
|---------------------+---------------------------------+--------------------|
|Різні пестициди      |log K   = 3,8 - 0,561 log S      |Герстль та          |
|                     |     om                    w     |Мінгельгрін (1984)  |
|                     |                                 |(66)                |
|---------------------+---------------------------------+--------------------|
|Аліфатичні,          |log K   = (4,040 +/- 0,038) -    |Чіу та інші (1979)  |
|ароматичні хлористі  |     om                          |(65)                |
|речовини             |(0,557 +/- 0,012) log S          |                    |
|                     |                       w         |                    |
|---------------------+---------------------------------+--------------------|
|б-нафтол             |log K   = 4,273 - 0,686 log S    |Хассет та інші      |
|                     |     oc                      w   |(1981) (71)         |
|---------------------+---------------------------------+--------------------|
|Циклічні, аліфатичні |log K   = - 1,405 - 0,921 log S  |Карікхофф (1981)    |
|ароматичні речовини  |     oc                        w |(72)                |
|                     |- 0,00953 (mp-25)                |                    |
|---------------------+---------------------------------+--------------------|
|Різні сполуки        |log K   = 2,75 - 0,45 log S      |Мореаль ван Блейд   |
|                     |     om                    w     |(1982) (73)         |
------------------------------------------------------------------------------

Доповнення 4

РОЗРАХУНКИ ДЛЯ ВИЗНАЧЕННЯ УМОВ ЦЕНТРИФУГУВАННЯ

1. Час центрифугування розраховується за нижчезазначеною формулою, яка ґрунтується на сферичних частинках:

9             ета
     t = --- (-----------------------) ln (R /R )              (1)
          2        2   2                    b  t
              омега  rp  (ро  - ро  )
                            s     aq

З метою спрощення всі параметри описані не в одиницях SI (г, см).

де:

-1 омега = швидкість обертання (= 2 пі rpm/60), рад. с

rpm = обертів на хвилину

-1 -1 ета = в'язкість розчину, г с см

rp = радіус частинки, см

-3 ро = щільність ґрунту, г см s

-3 ро = щільність розчину, г см aq

R = відстань від центру ротора центрифуги до поверхні

розчину в барабані центрифуги, см

R = відстань від центру ротора центрифуги до дна в барабані

центрифуги, см

R - R = довжина суміші ґрунту/розчину в барабані

b t

центрифуги, см.

Зазвичай для забезпечення повної сепарації використовується розрахований час, помножений на два.

2. Рівняння (1) можна ще спростити, якщо прийняти в'язкість (ета) та щільність (ро ) розчину такими, що дорівнюють в'язкості aq

та щільності   води   при   температурі  25  град.С;  таким  чином
               -3    -1   -1                  -3
ета = 8,95 x 10   г с   см   і ро   = 1,0 г см  .
                                 aq

За допомогою рівняння (2) одержуємо час центрифугування:

R
                3,7                 b
     t = --------------------- ln ----                         (2)
              2    2               R
         (rpm)  · r  (ро  - 1)      t
                   p    s

3. З рівняння (2) стає очевидним, що для визначення умов центрифугування, тобто часу (t) та швидкості (об./хв.), для досягнення сепарації частинок певного розміру (в нашому випадку, радіусом 0,1 мікрона) важливі два параметри: (1) щільність ґрунту та (2) довжина суміші в барабані центрифуги R -R , тобто відстань, b t

яку   частинка  ґрунту  проходить  від  поверхні  розчину  до  дна
барабана;  очевидно,  що  для  певного  об'єму  довжина  суміші  в
барабані залежатиме від квадрату радіусу барабана.

4. На рисунку 1 показана залежність часу центрифугування (t) від швидкості центрифугування (об./хв.) для ґрунтів різної щільності (ро ) (рис. 1а) та різної довжини суміші в барабані s

центрифуги (рис.  2а).  Судячи з рис.  1а,  вплив щільності ґрунту
виглядає очевидним;  наприклад,  для класичного центрифугування зі
швидкістю 3 000  об./хв.  час  центрифугування  складає  приблизно
240 хв.  для  ґрунту  щільністю  1,2 г куб.см,  тоді як для ґрунту
щільністю 2,0 г куб.см - лише 50 хв. Подібним чином, судячи з рис.
1b,  для класичного центрифугування зі швидкістю 3 000 об./хв. час
центрифугування складає приблизно 50 хв.  при довжині суміші 10 см
і лише 7 хв.  - при довжині 1 см.  Однак важливо знайти оптимальне
співвідношення між центрифугуванням (для  якого  потрібна  якомога
менша   довжина)   та   легким   способом  сепарування  фаз  після
центрифугування.

5. Більше того, при визначенні експериментальних умов сепарації фаз ґрунту та розчину важливо врахувати можливу наявність "псевдо-фази", колоїдів. Ці частинки, з розміром менше ніж 0,2 мікрона, можуть серйозно вплинути на весь механізм адсорбції речовини в ґрунтовій суспензії. Якщо центрифугування проводиться як описано вище, колоїди залишаються у водній фазі і аналізуються разом з водною фазою. Таким чином, інформація про їх вплив втрачається.

Якщо в лабораторії, яка проводить експеримент, наявні можливості для ультрацентрифугування або ультрафільтрації, адсорбцію/десорбцію речовини в ґрунті можна вивчити більш глибоко, включаючи одержання інформації про адсорбцію речовини в колоїдах. У цьому випадку, для сепарування трьох фаз - ґрунту, колоїдів та розчину - потрібно застосувати ультрацентрифугування зі швидкістю 60 000 об./хв. або ультрафільтрацію з проникністю фільтра 100 000 дальтон. Протокол дослідження також потрібно змінити відповідним чином для відображення аналізу всіх трьох фаз.

Рис. 1a. ( 994_b14 )

Залежність часу центрифугування (t) від швидкості центрифугування (об./хв.) для ґрунтів різної щільності (ро ). s -3 -1 -1

R  = 10 см, R -R  = 10 см, ета = 8,95 x 10   г с   см   та  ро   =
 t           b  t                                             aq
        -3
1,0 г см   при 25 град.C.

Рис. 1b. (994_b14 )

Залежність часу центрифугування (t) від швидкості центрифугування (об./хв.) для різної довжини суміші в барабані -3 -1 -1 центрифуги (R -R ) = L; R = 10 см, ета = 8,95 x 10 г с см , b t t

-3 -3

ро   = 1,0 г см   та 25 град.C та ро  = 2,0 г см  .
  aq                                s

Додаток 5

РОЗРАХУНОК АДСОРБЦІЇ А (%) ТА ДЕСОРБЦІЇ D (%)

Часова схема процесу наступна:

дельта t дельта t дельта t дельта t 1 2 n-1 n

---------------------.......-------------------------------->

t         t         t                 t          t      Час t
      0         1         2                 n-2        n-1

Для всіх розрахунків передбачається, що тестова речовина стала і не адсорбується значним чином у стінки контейнера.

АДСОРБЦІЯ А (А%)

а) Паралельний метод

Відсоткова частка адсорбції розраховується для кожної тестової трубки (і) та кожного моменту часу (t ) за таким i

рівнянням:

ads
           m   (t ) · 100
            s    i
     A   = -------------- (%)                                  (1)
      t         m
       i         0

Дані цього рівняння можуть бути розраховані наступним чином:

m  = C  · V  (мю g)                                       (2)
      0    0    0

ads             ads
     m   (t ) = m  - C   (t ) · V                              (3)
      s    i     0    aq   i     0

де:

A = відсоткова частка адсорбції (%) на часовий момент t

t                                                       i
       i

ads

m = маса тестової речовини на ґрунті у момент t , коли

s                                                   i
проводиться аналіз (мкг)

m = маса тестової речовини в тестовій трубці на початок

тестування (мкг)

C = первинна масова концентрація тестового розчину в

0 -3

контакті з ґрунтом (мкг см  )

ads

C = масова концентрація речовини у водній фазі на час t ,

aq                                                        i
                               -3
коли проводиться аналіз (мкг см  );  ця концентрація  визначається
аналітично, при цьому враховуються контрольні показники

V = первинний об'єм тестового розчину в контакті з ґрунтом

(куб.см)

Складається графік з показниками відсоткової частки адсорбції ads

А   або C   (ti)  та часу і,  таким чином, визначається час, після
 t       aq
  i
якого досягається сорбційна  рівновага.  Приклади  таких  графіків
наведені на мал. 1 та мал. 2 відповідно.

Мал. 1

Графік адсорбційної рівноваги ( 994_b14 )

Мал. 2 Графік залежності між масовою концентрацією в тестовій речовині у водній фазі (С ) та часом aq ( 994_b14 )

b) Серійний метод

В наступних рівняннях враховується те, що процес адсорбції проводиться вимірюванням тестової речовини в малих аліквотах водної фази у визначені проміжки часу.

Протягом кожного з проміжків часу кількість речовини, адсорбованої на ґрунті, розраховується наступним чином:

- для першого часового проміжку Дельта t = t - t 1 1 0

V
      ads                    ads          0
     m   (Дельта t ) = m  - m   (t ) · (----)                  (4)
      s           1     0    m    1       A
                                         V
                                          a

- для другого часового проміжку Дельта t  = t  - t
                                             2    2    1

A
                                V                  V  - V
  ads               ads          0      ads         0    a
 m   (Дельта t ) = m   (t ) · (----) - m   (t ) · (-------)    (5)
  s           2     m    1       A      m    2        A
                                V                    V
                                 a                    a

для третього часового проміжку Дельта t  = t  - t
                                            3    3    2

A                          A
                               V  - V                 V  - 2 · V
  ads               ads         0    a     ads         0        a
 m   (Дельта t ) = m   (t ) · (-------) - m   (t ) · (------------) (6)
  s           3     m    2        A        m    3          A
                                 V                        V
                                  a                        a

для n-го часового проміжку Дельта t  = t  - t
                                        n    n    n-1

A                                A
                                 V  - (n - 2) · V                 (V  - (n -1) · V )
  ads               ads           0              a     ads          0             a
 m   (Дельта t ) = m   (t   ) · (-----------------) - m   (t ) · (------------------)  (7)
  s           n     m    n-1             A             m    n             A
                                        V                                V
                                         a                                a

Відсоткова частка адсорбції за певний проміжок часу А розраховується за допомогою такого рівняння: Дельта t i ads m (Дельта t ) s i

А          = --------------- · 100 (%)                    (8)
      Дельта t         m
              i         0

тоді як відсоткова частка адсорбції (А ) на часовий момент t i

ti знаходиться за рівнянням:

Дельта t
                    i      ads
                S         m   (j)
                           s
            j = Дельта t
                        i
      A   = ---------------------                              (9)
       t           m
        i           0

S - знак суми

Значення адсорбції А або А (з огляду на потреби t Дельта t i i

дослідження)  відкладаються  на  графіку  залежності  від  часу  і
визначається час, після якого досягається сорбційна рівновага.

На час встановлення рівноваги t  :
                                    eq

- маса тестової речовини, адсорбованої на ґрунті, становить:

ads            n        ads
     m   (eq) =      S       m   (Дельта t )                  (10)
      s         Дельта t = 1  s           i
                        i

S - знак суми

- маса тестової речовини у розчині становить:

ads                 n        ads
     m   (eq) = m  -      S       m   (Дельта t )             (11)
      aq         0   Дельта t = 1  s           i
                             i

S - знак суми

- та відсоткова частка адсорбції за рівноваги становить:

ads
           m   (eq)
            s
     A   = --------- · 100 (%)                                (12)
      eq     m
              0

Використані вище параметри є такими:

ads              ads                   ads

m (Дельта t ), m (Дельта t ), ..., m (Дельта t ) = маса

s 1 s 2 s n

адсорбованої на ґрунті речовини протягом проміжків часу Дельта t ,
                                                                1
Дельта t , ...., Дельта t  відповідно (мкг);
        2                n

ads        ads              ads

m (t ), m (t ), ...., m (t ) = маса речовини,

m    1     m    2                n

A
виміряної в  аліквоті  V  в часові моменти t ,  t ,  t  відповідно
                        a                   1    2    n

(мкг);

ads

m (eq) = маса адсорбованої на ґрунті речовини за

адсорбційної рівноваги (мкг);

ads

m (eq) = маса речовини в розчині за адсорбційної рівноваги

(мкг);

V = об'єм аліквоти, за якої досліджується тестова речовина

(куб.см);

A = відсоткова частка адсорбції, що відповідає

Дельта t i

проміжку часу Дельта t  (%);
                      1

A = відсоткова частка адсорбції за адсорбційної рівноваги

(%).

ДЕСОРБЦІЯ D (А %)

Часом t , що є початком експерименту на кінетику десорбції, 0

вважається  момент,  коли  максимальний відновлений об'єм тестової
речовини (після того,  як було досягнуто  адсорбційної  рівноваги)
заміщається рівним об'ємом 0,01 М розчину CaCl .
                                              2

(а) Паралельний метод

У момент часу t маса тестової речовини вимірюється у водній i i

фазі,  що взята з  трубки  і  (V ),  при  цьому  десорбована  маса
                                t
розраховується за таким рівнянням:

V
      des        des          0      A
     m   (t ) = m   (t ) · (----) - m                         (13)
      aq   i     m    i       i      aq
                             V
                              r

des        des
     За десорбційної рівноваги t  = t  , звідси m   (t ) = m   (eq)
                                i    eq          aq   i     aq

Маса тестової речовини, десорбованої протягом часового проміжку (Дельта t ), визначається за рівнянням: i

des               des       i=1    des
     m   (Дельта t ) = m   (t ) -  S    m   (j)               (14)
      aq          i     aq   i    j=1    aq

S - знак суми

Відсоткова частка розраховується:

у момент часу t з рівняння: i

des
           m   (t )
            aq   i
     D   = -------- · 100 (%)                                 (15)
      t     ads
       i   m   (eq)
            s

та протягом часового проміжку (Дельта t ) з рівняння:
                                            i

des
                  m   (Дельта t )
                   aq          i
     D          = --------------- · 100 (%)                   (16)
      Дельта t     ads
              i   m   (eq)
                   s

де:

D = відсоткова частка десорбції на часовий момент t (%)

t                                                   i
       i

D = відсоткова частка десорбції, що відповідає

Дельта t i

часовому інтервалу Дельта t  (%)
                           i

des

m (t ) = маса тестової речовини, десорбованої у часовий

aq 1

момент t  (мкг)
        i

des

m (Дельта t ) = маса тестової речовини, десорбованої

aq 1

протягом часового інтервалу Дельта t  (мкг)
                                    i

des

m (t ) = маса тестової речовини, визначена аналітично на

m i i

час t  в розчині об'ємом V , що взято для аналізу (мкг)
     i                    t

m = маса тестової речовини, що залишилася від адсорбційної

рівноваги внаслідок неповного заміщення об'єму (мкг)

V  - V
      A     ads         0    R
     m   = m   (eq) · (-------)                               (17)
      aq    m             V
                           0

ads

m (eq) = маса тестової речовини в розчині за адсорбційної

рівноваги (мкг)

V = об'єм надосадової рідини, видаленої з трубки після

досягнення адсорбційної рівноваги та заміщеної таким самим об'ємом
0,01 М розчину CaCl  (куб.см)
                   2
      i

V = об'єм речовини, взятої з трубки (і) для проведення

вимірювання тестової речовини в експерименті на кінетику десорбції
(куб.см).

Значення десорбції D або D (відповідно до потреб t Дельта t i i

дослідження)  відкладаються  на  графіку  залежності  від  часу  і
визначається час, після якого досягається десорбційна рівновага.

(b) Серійний метод

В наступних рівняннях враховується те, що попередній процес адсорбції проводився вимірюванням тестової речовини в малих A

аліквотах  (V )  водної  фази (серійний метод у пункті "Проведення
             a
тестування" 1,9). При цьому приймається, що: (а) об'єм надосадової
рідини,   видаленої   з  трубки  після  експерименту  на  кінетику
десорбції,  був заміщений таким самим об'ємом 0,01 М розчину CaCl
                                                                 2
(V ), та (b) загальний об'єм водної фази в контакті з ґрунтом (V )
  R                                                             T
протягом експерименту на кінетику десорбції залишається  постійним
та описується наступним рівнянням:

n  A
     V  = V  -  S V (i)                                       (18)
      T    0   i=1 a

На часовий момент t :
                        i

D
     - маса  тестової речовини вимірюється в малій аліквоті (V ) і
                                                              a
десорбована маса розраховується за наступним рівнянням:

D
                             V              (V  - (i - 1) · v )
      des        des          T      A        T              a
     m   (t ) = m   (t ) · (----) - m   · (--------------------)  (19)
      aq   i     m    i       D      aq            V
                             v                      T
                              a

des        des
     - За десорбційної рівноваги t  = t  , звідси m   (t ) = m   (eq)
                                  i    eq          aq   i     aq

- Відсоткова частка десорбції D розраховується за наступним t i

рівнянням:

des
           m   (t )
            aq   i
     D   = --------- · 100 (%)                                (20)
      t     ads
       i   m   (eq)
            s

На часовий проміжок (Дельта t ):
                                  i

Для кожного з проміжків часу кількість десорбованої речовини розраховується наступним чином:

- для першого часового проміжку Дельта t = t - t 1 1 0

V des des T A des aq des

m   (Дельта t ) = m   (t ) · (----) - m   та m   (t ) = m  (eq) - m   (Дельта t )  (21)
      aq          1     m    1       D      aq     s    1     s         aq          1
                                    v
                                     a

- для другого часового проміжку Дельта t  = t  - t
                                             2    2    1

D                  D
                                    V                         V  - v            (V  - v )
      des               des          T      des                T    a     A       T    a
     m   (Дельта t ) = m   (t ) · (----) - m   (Дельта t ) · (-------) - m   · (---------) та
      aq          2     m    2       D      aq          2        V        aq       V
                                    v                             T                 T
                                     a

des        ads         des               des
     m   (t ) = m   (eq) - (m   (Дельта t ) + m   (Дельта t ))    (22)
      s    2     s           aq          1     aq          2

- для n-го часового проміжку Дельта t  = t  - t
                                          n    n    n-1

D                            D
                                     V             (V  - (n - 1) · v )          (V  - (n - i) · v )
      des                des          T      A       T              a      n-1    T              a     des
     m   (Дельта t ) = (m   (t ) · (----) - m   · (-------------------) -   S  (------------------- · m   (Дельта t ))
      aq          n      m    n       D      aq           V                i=1,         V              aq          i
                                     v                     T               n=/1          T
                                      a

des        ads        n   des
     та m   (t ) = m   (eq) - S   m   (Дельта t )             (23)
         s    n     s         i=1  aq          i
                              n=/1

S - знак суми

Нарешті, відсоткова частка десорбції за певний проміжок часу, D , розраховується за допомогою такого рівняння: Дельта t i

des
                  m   (Дельта t )
                   aq          i
     D          = --------------- · 100 %                     (24)
      Дельта t     ads
              i   m   (eq)
                   s

тоді як  відсоткова частка десорбції D   на часовий момент t
                                           t                     i
                                            i
знаходиться за рівнянням:

Дельта t
                    i     des
                S        m   (j)           des
           j = Дельта t   aq              m   (t )
                       i                   aq   i
     D   = ---------------------- · 100 = -------- · 100 (%)  (25)
      t           ads                      ads
       i         m   (eq)                 m   (eq)
                  s                        s

S - знак суми

де використані вище параметри є такими:

des               des                       des

m (Дельта t ), m (Дельта t ), ...., m (Дельта t ) =

s           1     s            2            s           n
маса  речовини,  що  залишається  адсорбованою  на  ґрунті   після
проміжків часу Дельта t ,  Дельта t ,......., Дельта t  відповідно
                       1           2                   n

(мкг)

des               des                      des

m (Дельта t ), m (Дельта t ), ...., m (Дельта t ) =

aq          1     aq          2            aq          n
маса  тестової  речовини,  десорбованої  протягом  проміжків  часу
Дельта t , Дельта t ,...., Дельта t  відповідно (мкг)
        1          2               n

des               des                      des

m (Дельта t ), m (Дельта t ), ...., m (Дельта t ) =

m           1     m           2            m           n
                                           D
маса  речовини,  виміряної  в  аліквоті  (v ) в часові моменти t ,
                                           a                    1
t ,...., t  відповідно (мкг)
 2        n

V = загальний об'єм водної фази в контакті з ґрунтом (V )

T                                                         T
протягом  експерименту на кінетику десорбції,  виконаного в рамках
серійного методу (куб.см)

m = маса тестової речовини, що залишилася від адсорбційної

рівноваги внаслідок неповного заміщення об'єму (мкг)

n  A
             (V  -  S V (i)) - V
      A        0   i=1 a        R    ads
     m   = (--------------------) · m   (eq)                  (26)
      aq             n  A            aq
              (V  -  S V  (i))
                0   i=1 a

S - знак суми

V = об'єм надосадової рідини, видаленої з трубки після

досягнення адсорбційної рівноваги та заміщеної таким самим об'ємом
0,01 М розчину CaCl  (куб.см)
                   2

V = об'єм аліквоти, взятої для аналітичних цілей з трубки

(i), протягом експерименту на кінетику десорбції, виконаного в рамках серійного методу (куб.см)

D
     V  <= 0,02 · V                                           (27)
      a            T

Додаток 6

АДСОРБЦІЯ-ДЕСОРБЦІЯ В ҐРУНТІ: ЗВІТНІ ТАБЛИЦІ

Протестована речовина:

Протестований ґрунт:

Вміст сухої маси у ґрунті (105 град.С, 12 год.):........... %

Температура: ......................................... град.С

Відповідність аналітичного методу

------------------------------------------------------------------
|Зважений ґрунт                            |      г       |      |
|------------------------------------------+--------------+------|
|Ґрунт: суха маса                          |      г       |      |
|------------------------------------------+--------------+------|
|Об'єм р-ну CaCl                           |     куб.см   |      |
|               2                          |              |      |
|------------------------------------------+--------------+------|
|Розрахунковий концентр. кінцевий р-н      |         -3   |      |
|                                          |   мкг см     |      |
|------------------------------------------+--------------+------|
|Аналітичний концентр. кінцевий р-н        |         -3   |      |
|                                          |   мкг см     |      |
------------------------------------------------------------------

Принцип застосування аналітичного методу:

Калібрування в аналітичному методі:

Протестована речовина:

Протестований ґрунт:

Вміст сухої маси у ґрунті (105 град.C, 12 год.): ......... %

Температура: ......................................... град.С

Застосована методика виконання аналітичного методу:

---                ---             ---            ---
     Непряма | |     Паралельна | |     Серійна | |      Пряма | |
             ---                ---             ---            ---

Тестування на адсорбцію: тестові зразки

--------------------------------------------------------------------------------------
|                 |Символ|Одиниці|    Час     |    Час     |    Час     |    Час     |
|                 |      |       |встановлення|встановлення|встановлення|встановлення|
|                 |      |       | рівноваги  | рівноваги  | рівноваги  | рівноваги  |
|-----------------+------+-------+------------+------------+------------+------------|
|Трубка N         |      |       |     |      |     |      |     |      |     |      |
|-----------------+------+-------+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------|
|Зважений ґрунт   |   -  |   г   |     |      |     |      |     |      |     |      |
|-----------------+------+-------+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------|
|Ґрунт: суха маса | m    |   г   |     |      |     |      |     |      |     |      |
|                 |  soil|       |     |      |     |      |     |      |     |      |
|-----------------+------+-------+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------|
|Об'єм води у     | V    |куб.см |     |      |     |      |     |      |     |      |
|зваженому ґрунті |  WS  |       |     |      |     |      |     |      |     |      |
|(розраховано)    |      |       |     |      |     |      |     |      |     |      |
|-----------------+------+-------+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------|
|Об'єм 0,01 М     |      |куб.см |     |      |     |      |     |      |     |      |
|р-ну CaCl  для   |      |       |     |      |     |      |     |      |     |      |
|         2       |      |       |     |      |     |      |     |      |     |      |
|врівноваження    |      |       |     |      |     |      |     |      |     |      |
|ґрунту           |      |       |     |      |     |      |     |      |     |      |
|-----------------+------+-------+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------|
|Об'єм базового   |      |куб.см |     |      |     |      |     |      |     |      |
|розчину          |      |       |     |      |     |      |     |      |     |      |
|-----------------+------+-------+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------|
|Загальний об'єм  | V    |куб.см |     |      |     |      |     |      |     |      |
|водної фази в    |  0   |       |     |      |     |      |     |      |     |      |
|контакті з       |      |       |     |      |     |      |     |      |     |      |
|ґрунтом          |      |       |     |      |     |      |     |      |     |      |
|-----------------+------+-------+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------|
|Початкова        | C    | мкг · |     |      |     |      |     |      |     |      |
|концентрація     |  0   |   -3  |     |      |     |      |     |      |     |      |
|тестового розчину|      | см    |     |      |     |      |     |      |     |      |
|-----------------+------+-------+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------|
|Маса тестової    | m    | мкг   |     |      |     |      |     |      |     |      |
|речовини         |  0   |       |     |      |     |      |     |      |     |      |
|на початку       |      |       |     |      |     |      |     |      |     |      |
|тестування       |      |       |     |      |     |      |     |      |     |      |
--------------------------------------------------------------------------------------

Після перемішування та центрифугування

----------------------------------------------------------------------------------------------------------
|                                             НЕПРЯМИЙ МЕТОД                                             |
|--------------------------------------------------------------------------------------------------------|
|                                            Паралельний метод                                           |
|--------------------------------------------------------------------------------------------------------|
|Концентрація тест.  |  ads        |       -3 |       |       |       |      |      |      |      |      |
|р-ни у водній фазі, | C   (t )    | мкг см   |       |       |       |      |      |      |      |      |
|включаючи           |  aq   i     |          |       |       |       |      |      |      |      |      |
|контрольну поправку |             |          |       |       |       |      |      |      |      |      |
|--------------------------------------------------------------------------------------------------------|
|                                             Серійний метод                                             |
|--------------------------------------------------------------------------------------------------------|
|Виміряна маса тест. |   ads       |          |       |       |       |      |      |      |      |      |
|                 A  |  m   (t )   |    мкг   |       |       |       |      |      |      |      |      |
|р-ни в аліквоті V   |   m    i    |          |       |       |       |      |      |      |      |      |
|                 a  |             |          |       |       |       |      |      |      |      |      |
|--------------------------------------------------------------------------------------------------------|
|                                              ПРЯМИЙ МЕТОД                                              |
|--------------------------------------------------------------------------------------------------------|
|Маса тестової       |   ads       |          |       |       |       |      |      |      |      |      |
|речовини,           |  m   (t )   |    мкг   |       |       |       |      |      |      |      |      |
|адсорбованої на     |   s    i    |          |       |       |       |      |      |      |      |      |
|ґрунті              |             |          |       |       |       |      |      |      |      |      |
|--------------------------------------------------------------------------------------------------------|
|                                          Розрахунок адсорбції                                          |
|--------------------------------------------------------------------------------------------------------|
|Адсорбція           |     A       |    %     |       |       |       |      |      |      |      |      |
|                    |      t      |          |       |       |       |      |      |      |      |      |
|                    |       i     |          |       |       |       |      |      |      |      |      |
|--------------------+-------------+----------+-------+-------+-------+------+------+------+------+------|
|                    |  A          |    %     |       |       |       |      |      |      |      |      |
|                    |   Дельта t  |          |       |       |       |      |      |      |      |      |
|                    |           i |          |       |       |       |      |      |      |      |      |
|--------------------+-------------+----------+---------------+--------------+-------------+-------------|
|Спосіб              |             |          |               |              |             |             |
|--------------------+-------------+----------+---------------+--------------+-------------+-------------|
|Коефіцієнт адсорбції|      K      |        -1|       |       |       |      |      |      |      |      |
|                    |       d     |куб.см г  |       |       |       |      |      |      |      |      |
|--------------------+-------------+----------+---------------+--------------+-------------+-------------|
|Спосіб              |             |          |               |              |             |             |
|--------------------+-------------+----------+---------------+--------------+-------------+-------------|
|Коефіцієнт адсорбції|     K       |        -1|       |       |       |      |      |      |      |      |
|                    |      oc     |куб.см г  |       |       |       |      |      |      |      |      |
|--------------------+-------------+----------+---------------+--------------+-------------+-------------|
|Спосіб              |             |          |               |              |             |             |
----------------------------------------------------------------------------------------------------------

Протестована речовина:

Протестований ґрунт:

Вміст сухої маси у ґрунті (105 град.С, 12 год.): .......... %

Температура: ......................................... град.С

Тестування на адсорбцію: нульові проби та контроль

------------------------------------------------------------------------------
|                         | Символ |  Одиниці | Нульова |  Нульова |Контроль |
|                         |        |          |  проба  |  проба   |         |
|-------------------------+--------+----------+---------+----------+---------|
|Трубка N                 |        |          |    |    |     |    |    |    |
|-------------------------+--------+----------+----+----+-----+----+----+----|
|Зважений ґрунт           |        |    г     |    |    |     |    |  0 |  0 |
|-------------------------+--------+----------+----+----+-----+----+----+----|
|Об'єм води у зваженому   |        |  куб.см  |    |    |     |    |  - |  - |
|ґрунті (розраховано)     |        |          |    |    |     |    |    |    |
|-------------------------+--------+----------+----+----+-----+----+----+----|
|Об'єм 0,01 М доданого    |        |  куб.см  |    |    |     |    |    |    |
|р-ну CaCl                |        |          |    |    |     |    |    |    |
|         2               |        |          |    |    |     |    |    |    |
|-------------------------+--------+----------+----+----+-----+----+----+----|
|Об'єм базового розчину   |        |  куб.см  |  0 |  0 |     |    |    |    |
|доданої тестової речовини|        |          |    |    |     |    |    |    |
|-------------------------+--------+----------+----+----+-----+----+----+----|
|Загальний об'єм водної   |        |  куб.см  |    |    |     |    |  - |  - |
|фази (розраховано)       |        |          |    |    |     |    |    |    |
|-------------------------+--------+----------+----+----+-----+----+----+----|
|Початкова концентрація   |        |       -3 |    |    |     |    |    |    |
|тестової речовини в      |        | мкг см   |    |    |     |    |    |    |
|водній фазі              |        |          |    |    |     |    |    |    |
|----------------------------------------------------------------------------|
|                   Після перемішування та центрифугування                   |
|----------------------------------------------------------------------------|
|Концентрація в водній    |        |       -3 |    |    |     |    |    |    |
|фазі                     |        | мкг см   |    |    |     |    |    |    |
------------------------------------------------------------------------------

Примітка: за необхідності додайте інші колонки

Протестована речовина:

Протестований ґрунт:

Вміст сухої маси у ґрунті (105 град.С, 12 год.): .......... %

Температура: ......................................... град.С

Масовий баланс

------------------------------------------------------------------
|                           |    Символ   |  Одиниці |  |  |  |  |
|---------------------------+-------------+----------+--+--+--+--|
|Трубка N                   |             |          |  |  |  |  |
|---------------------------+-------------+----------+--+--+--+--|
|Зважений ґрунт             |      -      |     г    |  |  |  |  |
|---------------------------+-------------+----------+--+--+--+--|
|Ґрунт: суха маса           |    m        |     г    |  |  |  |  |
|                           |     soil    |          |  |  |  |  |
|---------------------------+-------------+----------+--+--+--+--|
|Об'єм води у зваженому     |    V        |    мл    |  |  |  |  |
|ґрунті (розраховано)       |     WS      |          |  |  |  |  |
|---------------------------+-------------+----------+--+--+--+--|
|Об'єм 0,01 М р-ну CaCl     |             |    мл    |  |  |  |  |
|                      2    |             |          |  |  |  |  |
|для врівноваження          |             |          |  |  |  |  |
|ґрунту                     |             |          |  |  |  |  |
|---------------------------+-------------+----------+--+--+--+--|
|Об'єм базового розчину     |             |  куб.см  |  |  |  |  |
|---------------------------+-------------+----------+--+--+--+--|
|Загальний об'єм водної фази|    V        |  куб.см  |  |  |  |  |
|в контакті з ґрунтом       |     0       |          |  |  |  |  |
|---------------------------+-------------+----------+--+--+--+--|
|Початкова концентрація     |    C        |       -3 |  |  |  |  |
|тестового розчину          |     0       | мкг см   |  |  |  |  |
|---------------------------+-------------+----------+--+--+--+--|
|Час встановлення рівноваги |      -      |  год.    |  |  |  |  |
|----------------------------------------------------------------|
|             Після перемішування та центрифугування             |
|----------------------------------------------------------------|
|Концентрація тестової      |  ads        |       -3 |  |  |  |  |
|речовини у водній фазі за  | C   (eq)    | мкг см   |  |  |  |  |
|адсорбційної рівноваги,    |  aq         |          |  |  |  |  |
|включаючи контрольну       |             |          |  |  |  |  |
|поправку                   |             |          |  |  |  |  |
|---------------------------+-------------+----------+--+--+--+--|
|Час встановлення рівноваги |     t       |   год.   |  |  |  |  |
|                           |      eq     |          |  |  |  |  |
|----------------------------------------------------------------|
|                  1-е розбавлення розчинником                   |
|----------------------------------------------------------------|
|Видалений об'єм у водній   |  V    (t )  |  куб.см  |  |  |  |  |
|фазі                       |   rec   i   |          |  |  |  |  |
|---------------------------+-------------+----------+--+--+--+--|
|Доданий об'єм розчинника   |  Дельта V   |  куб.см  |  |  |  |  |
|----------------------------------------------------------------|
|                1-й відбір з допомогою розчинника               |
|----------------------------------------------------------------|
|Імпульс, аналізований у    |     S       |  різн.   |  |  |  |  |
|розчиннику                 |      E1     |          |  |  |  |  |
|---------------------------+-------------+----------+--+--+--+--|
|Концентрація тестової р-ни |     C       |       -3 |  |  |  |  |
|в розчиннику               |      E1     | мкг см   |  |  |  |  |
|---------------------------+-------------+----------+--+--+--+--|
|Маса речовини, відібраної з|     m       |    мкг   |  |  |  |  |
|ґрунту та стінок посудини  |      E1     |          |  |  |  |  |
|----------------------------------------------------------------|
|                  2-е розбавлення розчинником                   |
|----------------------------------------------------------------|
|Видалений об'єм розчинника |  Дельта V   |  куб.см  |  |  |  |  |
|                           |          s  |          |  |  |  |  |
|---------------------------+-------------+----------+--+--+--+--|
|Доданий об'єм розчинника   |  Дельта V'  |  куб.см  |  |  |  |  |
|----------------------------------------------------------------|
|                2-й відбір з допомогою розчинника               |
|----------------------------------------------------------------|
|Імпульс, аналізований у    |     S       |  різн.   |  |  |  |  |
|розчинній фазі             |      E2     |          |  |  |  |  |
|---------------------------+-------------+----------+--+--+--+--|
|Концентрація тестової р-ни |     C       |       -3 |  |  |  |  |
|в розчиннику               |      E2     | мкг см   |  |  |  |  |
|---------------------------+-------------+----------+--+--+--+--|
|Маса речовини, відібраної з|     m       |   мкг    |  |  |  |  |
|ґрунту та стінок посудини  |      E2     |          |  |  |  |  |
|---------------------------+-------------+----------+--+--+--+--|
|Загальна маса тестової     |      m      |   мкг    |  |  |  |  |
|речовини, відібраної у два |       E     |          |  |  |  |  |
|етапи                      |             |          |  |  |  |  |
|---------------------------+-------------+----------+--+--+--+--|
|Масовий баланс             |      МВ     |    %     |  |  |  |  |
------------------------------------------------------------------

Протестована речовина:

Протестований ґрунт:

Вміст сухої маси у ґрунті (105 град.С, 12 год.): .......... %

Температура: ......................................... град.С

Ізотерми адсорбції

------------------------------------------------------------------
|                    | Символ |  Одиниці |  |  |  |  |  |  |  |  |
|--------------------+--------+----------+--+--+--+--+--+--+--+--|
|Трубка N            |        |          |  |  |  |  |  |  |  |  |
|--------------------+--------+----------+--+--+--+--+--+--+--+--|
|Зважений ґрунт      |    -   |    г     |  |  |  |  |  |  |  |  |
|--------------------+--------+----------+--+--+--+--+--+--+--+--|
|Ґрунт: суха маса    |    Е   |    г     |  |  |  |  |  |  |  |  |
|--------------------+--------+----------+--+--+--+--+--+--+--+--|
|Об'єм води у        |   V    |  куб.см  |  |  |  |  |  |  |  |  |
|зваженому ґрунті    |    WS  |          |  |  |  |  |  |  |  |  |
|(розраховано)       |        |          |  |  |  |  |  |  |  |  |
|--------------------+--------+----------+--+--+--+--+--+--+--+--|
|Об'єм 0,01 М р-ну   |        |  куб.см  |  |  |  |  |  |  |  |  |
|CaCl  для           |        |          |  |  |  |  |  |  |  |  |
|    2               |        |          |  |  |  |  |  |  |  |  |
|врівноваження ґрунту|        |          |  |  |  |  |  |  |  |  |
|--------------------+--------+----------+--+--+--+--+--+--+--+--|
|Об'єм доданого      |        |  куб.см  |  |  |  |  |  |  |  |  |
|базового розчину    |        |          |  |  |  |  |  |  |  |  |
|--------------------+--------+----------+--+--+--+--+--+--+--+--|
|Загальний об'єм     |    V   |  куб.см  |  |  |  |  |  |  |  |  |
|водної фази в       |     0  |          |  |  |  |  |  |  |  |  |
|контакті з ґрунтом  |        |          |  |  |  |  |  |  |  |  |
|(розраховано)       |        |          |  |  |  |  |  |  |  |  |
|--------------------+--------+----------+--+--+--+--+--+--+--+--|
|Концентрація розчину|    C   |       -3 |  |  |  |  |  |  |  |  |
|                    |     0  | мкг см   |  |  |  |  |  |  |  |  |
|--------------------+--------+----------+--+--+--+--+--+--+--+--|
|Час встановлення    |    -   |   год.   |  |  |  |  |  |  |  |  |
|рівноваги           |        |          |  |  |  |  |  |  |  |  |
|----------------------------------------------------------------|
|             Після перемішування та центрифугування             |
|----------------------------------------------------------------|
|Концентрація        | ads    |       -3 |  |  |  |  |  |  |  |  |
|речовини у водній   |C   (eq)| мкг см   |  |  |  |  |  |  |  |  |
|фазі, включаючи     | aq     |          |  |  |  |  |  |  |  |  |
|контрольну поправку |        |          |  |  |  |  |  |  |  |  |
|--------------------+--------+----------+--+--+--+--+--+--+--+--|
|Температура         |        |  град.C  |  |  |  |  |  |  |  |  |
|--------------------+--------+----------+--+--+--+--+--+--+--+--|
|Адсорбована маса на | ads    |       -1 |  |  |  |  |  |  |  |  |
|одиницю ґрунту      |C   (eq)|  мкг г   |  |  |  |  |  |  |  |  |
|                    | s      |          |  |  |  |  |  |  |  |  |
------------------------------------------------------------------

Регресійний аналіз:

ads значення K : F

значення l/n:

2 коефіцієнт регресії r :

Протестована речовина:

Протестований ґрунт:

Вміст сухої маси у ґрунті (105 град.С, 12 год.): .......... %

Температура: ......................................... град.С

Застосована методика виконання аналітичного методу:

---                     ---                       ---
     Непряма | |          Паралельна | |               Серійна | |
             ---                     ---                       ---

Тестування на десорбцію

----------------------------------------------------------------------------
|              |     Символ    |Одиниці|Проміжок|Проміжок|Проміжок|Проміжок|
|              |               |       |  часу  |  часу  |  часу  |  часу  |
|--------------+---------------+-------+--------+--------+--------+--------|
|Трубка N,     |               |       |        |        |        |        |
|взята з етапу |               |       |        |        |        |        |
|адсорбції     |               |       |        |        |        |        |
|--------------+---------------+-------+--------+--------+--------+--------|
|Маса          | ads           |мкг    |        |        |        |        |
|речовини,     |m   (eq)       |       |        |        |        |        |
|адсорбованої  | s             |       |        |        |        |        |
|на ґрунті за  |               |       |        |        |        |        |
|адсорбційної  |               |       |        |        |        |        |
|рівноваги     |               |       |        |        |        |        |
|--------------+---------------+-------+--------+--------+--------+--------|
|Видалений     |V              |куб.см |        |        |        |        |
|об'єм у       | R             |       |        |        |        |        |
|водній фазі,  |               |       |        |        |        |        |
|заміщений     |               |       |        |        |        |        |
|0,01 М CaCl   |               |       |        |        |        |        |
|           2  |               |       |        |        |        |        |
|--------------+---------------+-------+--------+--------+--------+--------|
|Загальний|ПМ  |V              |куб.см |        |        |        |        |
|об'єм    |    | O             |       |        |        |        |        |
|водної   |----+---------------+-------+--------+--------+--------+--------|
|фази у   |СМ  |V              |куб.см |        |        |        |        |
|контакті |    | T             |       |        |        |        |        |
|з ґрунтом|    |               |       |        |        |        |        |
|--------------+---------------+-------+--------+--------+--------+--------|
|Маса тест.    | A             |мкг    |        |        |        |        |
|р-ни, що      |m              |       |        |        |        |        |
|залишилася від| aq            |       |        |        |        |        |
|адсорбційної  |               |       |        |        |        |        |
|рівноваги     |               |       |        |        |        |        |
|внаслідок     |               |       |        |        |        |        |
|неповного     |               |       |        |        |        |        |
|заміщення     |               |       |        |        |        |        |
|об'єму        |               |       |        |        |        |        |
|--------------------------------------------------------------------------|
|                          Кінетика десорбції                              |
|--------------------------------------------------------------------------|
|Виміряна маса | des           |мкг    |        |        |        |        |
|речовини,     |m   (t )       |       |        |        |        |        |
|десорбованої  | m    i        |       |        |        |        |        |
|з ґрунту на   |               |       |        |        |        |        |
|час t         |               |       |        |        |        |        |
|     i        |               |       |        |        |        |        |
|--------------+---------------+-------+--------+--------+--------+--------|
|Об'єм      |ПМ| i             |куб.см |        |        |        |        |
|розчину,   |  |V              |       |        |        |        |        |
|взятого    |  | r             |       |        |        |        |        |
|трубки (i) |--+---------------+-------+--------+--------+--------+--------|
|для        |СМ| D             |куб.см |        |        |        |        |
|вимірювання|  |v              |       |        |        |        |        |
|тестової   |  | a             |       |        |        |        |        |
|речовини   |  |               |       |        |        |        |        |
|--------------+---------------+-------+--------+--------+--------+--------|
|Маса речовини,| des           |мкг    |        |        |        |        |
|десорбованої  |m   (t )       |       |        |        |        |        |
|з ґрунту на   | aq   i        |       |        |        |        |        |
|час t         |               |       |        |        |        |        |
|     i        |               |       |        |        |        |        |
|(розраховано) |               |       |        |        |        |        |
|--------------+---------------+-------+--------+--------+--------+--------|
|Маса речовини,| des           |мкг    |        |        |        |        |
|десорбованої  |m   (Дельта t )|       |        |        |        |        |
|з ґрунту      | aq          i |       |        |        |        |        |
|протягом      |               |       |        |        |        |        |
|часового      |               |       |        |        |        |        |
|проміжку      |               |       |        |        |        |        |
|Дельта t      |               |       |        |        |        |        |
|        i     |               |       |        |        |        |        |
|(розраховано) |               |       |        |        |        |        |
|--------------------------------------------------------------------------|
|                      Відсоткова частка десорбції                         |
|--------------------------------------------------------------------------|
|Десорбція на  |D              |   %   |        |        |        |        |
|час t         | t             |       |        |        |        |        |
|     i        |  i            |       |        |        |        |        |
|--------------+---------------+-------+--------+--------+--------+--------|
|Десорбція у   |D              |   %   |        |        |        |        |
|часовий       | Дельта t      |       |        |        |        |        |
|проміжок      |         i     |       |        |        |        |        |
|Дельта t      |               |       |        |        |        |        |
|        i     |               |       |        |        |        |        |
|--------------+---------------+-------+--------+--------+--------+--------|
|Коефіцієнт    |K              |       |        |        |        |        |
|видимої       | des           |       |        |        |        |        |
|десорбції     |               |       |        |        |        |        |
----------------------------------------------------------------------------

ПМ: паралельний метод

СМ: серійний метод

С.19. ВИЗНАЧЕННЯ КОЕФІЦІЄНТА АДСОРБЦІЇ (К ) OC НА ҐРУНТІ ТА НА ОСАДІ СТІЧНИХ ВОД З ВИКОРИСТАННЯМ ВИСОКОЕФЕКТИВНОЇ РІДИННОЇ ХРОМАТОГРАФІЇ (ВЕРХ)

1. МЕТОД

Цей метод дублюється з TG 121 ОЕСР (2001).

1.1. ВСТУП

Сорбційна реакція речовин у ґрунтах або осаді стічних вод може бути описана через параметри, визначені експериментально шляхом тестування за методом С.18. Важливим параметром є коефіцієнт адсорбції, що визначається як відношення між концентрацією речовини в ґрунті/осаді та концентрацією речовини в водній фазі за адсорбційної рівноваги. Коефіцієнт адсорбції, нормалізований до вмісту в ґрунті органічного вуглеводню, К , є ОС

корисним показником  в'яжучої  властивості  хімічної  речовини  на
органічному  матеріалі  ґрунту  або  осаду стічних вод та дозволяє
порівнювати різні хімічні речовини.  Цей параметр може визначатися
через  кореляції  з  розчинністю  у  воді та коефіцієнт розділення
n-октанол/вода (1)(2)(3)(4)(5)(6)(7).

Експериментальним методом, описаним у цьому тесті, для визначення коефіцієнта адсорбції К у ґрунті та осаді стічних вод ОС

використовується ВЕРХ (8).  Таке визначення є більш надійним,  ніж
показники,  отримані  з  розрахунків  кількісного   співвідношення
структура-активність  (9).  У  якості  метода  оцінки ним не можна
повністю  замінити  комплексні  експерименти  на   рівновагу,   що
застосовуються  в  методі  тестування С.18.,  проте оцінюваний К
                                                                ОС
може бути корисний при виборі  відповідних  параметрів  тестування
для  досліджень  адсорбції/десорбції  згідно  з методом тестування
С.18.,  з  розрахунком  K   (коефіцієнта  розподілення)   або   K
                         d                                       f
(коефіцієнт  адсорбції  Фрейндліха) відповідно до рівняння 3 (див.
Розділ 1.2).

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ

K : коефіцієнт розподілення визначається як відношення

рівноважних  концентрацій  С  розчиненої   тестової   речовини   у
двохфазній  системі,  що  складається з сорбенту (ґрунту або осаду
стічних  вод)  та  водної  фази;  це  безвимірна  величина,   коли
концентрації   в   обох   фазах   виражені  на  основі  відношення
"вага/вага".  У випадку,  якщо концентрація у водній фазі виражена
                                                       -1
на основі відношення "вага/об'єм", одиницею її є мл · г  · K  може
                                                            d
різнитися  за  властивостями  сорбенту  та   може   залежати   від
концентрації.

C         С
           soil      sludge
     K  = ----- або -------                                    (1)
      d    C          C
            aq         aq

де:

C = концентрація тестової речовини у ґрунті за рівноваги

soil -1

(мкг · г )

C = концентрація тестової речовини в осаді за рівноваги

sludge -1

(мкг · г )

C = концентрація тестової речовини в водній фазі за

aq -1 -1

рівноваги (мкг · г  , мкг · мл  ).

K : коефіцієнт адсорбції Фрейндліха визначається як

концентрація тестової речовини у  ґрунті  або  осаді  стічних  вод
(x/m),  коли  рівноважна  концентрація  C   у водній фазі дорівнює
                                         aq
                            -1
одиниці; одиницями є мкг · г   сорбенту. Значення може змінюватися
за властивостями сорбенту.

x              1
     log --- = log K  + --- log C                              (2)
          m         f    n       aq

де:

x/m = кількість тестової речовини х (мкг), адсорбована у кількість сорбенту m (г) за рівноваги

l/n = нахил ізотерми адсорбції Фрейндліха

C = концентрація тестової речовини в водній фазі за

aq -1

рівноваги (мкг · мл  ).

K : коефіцієнт розподілення (K ) або коефіцієнт адсорбції

oc                            d
Фрейндліха  (K ),  нормалізований до вмісту органічного вуглеводню
              f

(f ) сорбенту; зокрема, для неіонізованих хімічних речовин він є oc

приблизним  показником межі адсорбції між речовиною та сорбентом і
дозволяє порівнювати різні хімічні речовини.  Залежно від  значень
K  та K K   може  бути  безвимірною   величиною або  мати одиницею
 d     f oc
      -1           -1
мл · г   чи мкг · г   органічного матеріалу.

K                                   -1   K
         d   (безвимірна величина або мл · г  )   f          -1
 K   = -----            або                     ---- (мкг · г  )  (3)
  oc    f                                        f
         oc                                       oc

Відношення між К та К не завжди лінійне і тому значення oc d

К   для різних ґрунтів можуть відрізнятися, але їхня варіативність
 oc
значно менша порівняно зі значеннями К  або К .
                                      d      f

Коефіцієнт адсорбції (К ) вираховується з коефіцієнта oc

ємкості (k')  з  використанням  калібрувальної  кривої  залежності
log k' від log К   вибраних еталонних компонентів.
                oc

t  - t
                                 R    0
                           k' = -------                        (4)
                                   t
                                    0

де:

t = час відстоювання тестової та еталонної речовин при ВЕРХ

(хвилини);

t = час простою при ВЕРХ (хвилини) (див. Розділ 1.8.2).

P : коефіцієнт розділення октанол-вода визначається як

відношення концентрацій розчиненої речовини в n-октанолі та  воді;
це безвимірна величина.

C
                            octanol
                     P   = --------- (= K  )                   (5)
                      OW      C          OW
                               aq

1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ

Структурна формула, ступінь чистоти та константа дисоціації (за необхідності) мають бути відомі до застосування методу. Корисною є інформація про розчинність у воді та органічних розчинниках, а також коефіцієнт розділення октанол-вода та характеристики гідролізу.

Для приведення виміряного показника відстоювання тестової речовини при ВЕРХ у відповідність з її коефіцієнтом адсорбції К oc необхідно побудувати калібрувальну криву залежності log К від oc

log k'.  Має застосовуватися щонайменше шість розрахункових точок,
при цьому  принаймні  одна  з  них  знаходиться  вище  очікуваного
значення  для  тестової речовини,  а одна - нижче такого значення.
Точність  методу  значно  підвищиться   у   випадку   використання
еталонних  речовин,  подібних  за структурою до тестової речовини.
Якщо таких даних немає в наявності, належні калібрувальні речовини
обираються  користувачем  на його власний розсуд.  У цьому випадку
має застосовуватися більш загальний набір структурно  гетерогенних
речовин.   Речовини   та   показники   К  ,   що  є  можливими  до
                                        oc
застосування,  перераховані в  Додатку  до  Таблиці  1  для  осаду
стічних  вод  та Таблиці 3 для ґрунту.  Вибір інших калібрувальних
речовин має обґрунтовуватися.

1.4. ПРИНЦИП ЗАСТОСУВАННЯ МЕТОДУ ТЕСТУВАННЯ

ВЕРХ виконується на аналітичних колонках, запакованих у доступний у продажу ціанопропіл у твердій фазі, що містить ліпофільні та полярні частки. Використовується помірно полярна нерухома фаза на основі кремнієвої матриці:

- O - Si       - CH  - CH  - CH         - CN
                       2     2     2
    кремній        неполярна ділянка        полярна частка

Принцип проведення тестування подібний до методу тестування А.8. (Коефіцієнт розділення, метод ВЕРХ). Під час проходження через колонку у рухомій фазі тестова речовина взаємодіє з нерухомою фазою. В результаті розділення між рухомою та нерухомою фазами тестова речовина сповільнюється. Двоїстий склад нерухомої фази, що включає полярні та неполярні частки, дозволяє взаємодію полярних та неполярних груп молекул подібно до того, як це відбувається у випадку з органічним матеріалом у ґрунті або осаді стічних вод. Це сприяє встановленню зв'язку між часом відстоювання в колонці та коефіцієнтом адсорбції на органічному матеріалі.

Показник pH має значний вплив на сорбційну реакцію, зокрема, для полярних речовин. Для сільськогосподарських ґрунтів або резервуарів систем очищення стічних вод показник рН зазвичай варіюється між 5,5 та 7,5. Для іонізованих речовин слід провести два тестування - в іонізованій та неіонізованій формах у відповідних буферних розчинах, але лише у випадках, коли щонайменше 10% тестового компонента розкладеться при показникові рН у межах 5,5-7,5.

Оскільки для оцінки використовується лише зв'язок між відстоюванням у колонці ВЕРХ та коефіцієнтом адсорбції, в цьому випадку не вимагається кількісного аналітичного методу, необхідне лише визначення часу відстоювання. У випадку, якщо доступний відповідний набір еталонних речовин і можуть бути застосовані стандартні експериментальні умови, метод забезпечує швидкий та ефективний спосіб визначення коефіцієнту адсорбції К . oc

1.5. МОЖЛИВІСТЬ ЗАСТОСУВАННЯ ТЕСТУ

Метод ВЕРХ застосовується до хімічних речовин (немічених або мічених), для яких доступна відповідна система виявлення (наприклад, спектрофотометр, детектор радіоактивності) та які достатньо стабільні протягом проведення експерименту. Це може бути особливо корисним для хімічних речовин, що є важкодосліджуваними в інших експериментальних системах (тобто для летучих речовин; речовин, нерозчинних у воді при концентрації, що може бути визначена аналітично; речовин з високою спорідненістю з поверхнею термостатних систем). Метод може застосовуватися до сумішей, які утворюють полоси елюювання, що не розпадаються. У такому випадку мають вказуватися верхня та нижня межі значень log К компонентів oc

тестової суміші.

Домішки можуть іноді викликати проблеми у тлумаченні результатів ВЕРХ, але вони не є суттєвими, якщо тестова речовина може бути аналітично чітко ідентифікована відділена від домішок.

Метод діє для речовин, перерахованих у Таблиці 1 до Додатку, а також застосовувався до ряду інших хімічних речовин, що належать до наступних хімічних класів:

- ароматичні аміни (наприклад, трифлуралін, 4-хлороанілін, 3,5-динітроанілін, 4-метиланілін, N-метиланілін, 1-нафтиламін),

- ефіри ароматичної карбонової кислоти (наприклад, метиловий ефір бензойної кислоти, етиловий ефір 3,5-динітробензойної кислоти),

- ароматичні вуглеводні (наприклад, толуен, ксилен, етилбензен, нітробензен),

- ефіри арилоксифеноксипропіонової кислоти (наприклад, диклофоп-метил, феноксапроп-етил, феноксапроп-P-етил),

- бензимідазольні та імідазольні фунгіциди (наприклад, карбендазим, фуберидазол, триазоксид),

- аміди карбонової кислоти (наприклад, 2-хлоробензамід, N,N-диметилбензамід, 3,5-динітробензамід, N-метилбензамід, 2-нітробензамід, 3-нітробензамід),

- хлоровані вуглеводні (наприклад, ендосульфан, ДДТ, гексахлоробензен, хінтозен, 1,2,3-трихлоробензен),

- органофосфорні інсектициди (наприклад, азинфос-метил, дисульфотон, фенаміфос, ізофенфос, піразофос, сульпрофос, триазофос),

- феноли (наприклад, фенол, 2-нітрофенол, 4-нітрофенол, пентахлорофенол, 2,4,6-трихлорофенол, 1-нафтол),

- похідні феніл сечовини (наприклад, ізопротурон, монолінурон, пенсикурон),

- пігменти, або фарбувальні речовини (наприклад, кислотний жовтий 219, основний синій 41, конго червоний 81),

- поліароматичні вуглеводні (наприклад, аценафтен, нафтален),

- 1,3,5-триазин гербіциди (наприклад, прометрин, пропазин, симазин, тербутрин),

- похідні триазолу (наприклад, тебуконазол, триадимефон, триадименол, триапетенол).

Метод не застосовується до речовин, які реагують з елюентом або нерухомою фазою. Він також не застосовується до речовин, які взаємодіють в особливий спосіб з неорганічними компонентами (наприклад, утворення кластерних комплексів з глинистими мінералами). Метод може не спрацювати для поверхнево активних речовин, неорганічних компонентів та помірних або сильних органічних кислот і основ. Можуть бути визначені значення log К , oc що лежать у межах від 1,5 до 5,0. Іонізовані речовини мають вимірюватися з використанням рухомої фази з буферним розчином, але необхідно слідкувати за тим, щоб уникнути осадження буферних компонентів або тестової речовини.

1.6. КРИТЕРІЇ ЯКОСТІ

1.6.1. Точність

Зазвичай коефіцієнт адсорбції тестової речовини може бути визначений з точністю до +- 0,5 log одиниці показника, визначеного методом групової рівноваги (див. Таблицю 1 у Додатку). Вищу точність можна отримати за умови, якщо еталонні речовини, що використовувалися, структурно подібні до тестової речовини.

1.6.2. Повторюваність

Виміри мають проводитися щонайменше з повторами. Значення log К , отримані при індивідуальних вимірюваннях, мають

знаходитися в межах 0,25 log одиниці.

1.6.3. Відтворюваність

Досвід, отриманий в результаті застосування методу, свідчить про його надійність. Дослідженнями ВЕРХ-методу з використанням 48 речовин (більшість із яких - пестициди), для яких були доступні достовірні дані про К на ґрунтах, встановлено коефіцієнт oc

кореляції R = 0,95 (10)(11).

З метою удосконалення та підтвердження методу проводилося міжлабораторне порівняльне тестування за участі 11 лабораторій (12). Результати наведені в Таблиці 2 Додатку.

1.7. ОПИС МЕТОДУ ТЕСТУВАННЯ

1.7.1. Попередня оцінка коефіцієнта адсорбції

Коефіцієнт розділення октанол-вода P (= К ) та, до певної ow ow

міри,  розчинність  у  воді,  можуть застосовуватися як індикатори
розміру адсорбції,  зокрема,  для неіонізованих речовин,  і  таким
чином   можуть   бути  використані  для  знаходження  попереднього
діапазону.  Для деяких груп хімічних речовин було оприлюднено  ряд
корисних кореляцій (1)(2)(3)(4)(5)(6)(7).

1.7.2. Прилад

Необхідно мати рідинний хроматограф з безімпульсним насосом та відповідний індикаторний прилад. Рекомендується використання інжекційного клапана та петельного дозатора. Застосовуються доступні у продажу ціанопропілові хімічно зв'язані смоли на основі кремнію (наприклад, "Гіперсил" та "Зорбакс CN"). Між інжекційною системою та аналітичною колонкою може бути розміщена захисна колонка з такого самого матеріалу. Колонки різних постачальників можуть значно відрізнятися за ефективністю очищення. Бажано, щоб досягалися наступні коефіцієнти ємкості k': log k' > 0,0 для log K = 3,0 та log k' > - 0,4 для log K = 2,0 при застосуванні

oc                                  oc
метанолу/води 55/45% у якості рухомої фази.

1.7.3. Рухомі фази

Було протестовано кілька рухомих фаз, із них рекомендується такі дві:

- метанол/вода (в об'ємному співвідношенні 55/45%)

- метанол/0,01 М цитратного буферу pH 6,0 (в об'ємному співвідношенні 55/45%)

Для приготування елюенту для ВЕРХ використовується чистий метанол та дистильована вода або цитратний буфер. Перед використанням суміш дегазується. Має застосовуватися ізократичне елюювання. У випадку, якщо суміші метанол/вода не підходять, можна спробувати інші суміші з органічних розчинників та води, наприклад, суміш етанол/вода або ацетонітрил/вода. Для іонізованих компонентів рекомендується застосування буферного розчину для стабілізації рН. Необхідно слідкувати за тим, щоб уникати випадіння сольового осаду та пошкодження колонки, що може трапитися при використанні деяких сумішей з органічної фази/буферу.

Не слід застосовувати жодних добавок, таких як іон-парні реагенти, оскільки вони можуть впливати на сорбційні властивості нерухомої фази. Такі зміни в нерухомій фазі можуть бути незворотними. Внаслідок цього є обов'язковим, щоб експерименти з застосуванням добавок проводилися на окремих колонках.

1.7.4. Розчинені речовини

Тестові та еталонні речовини мають бути розчинені в рухомій фазі.

1.8. ПРОВЕДЕННЯ ТЕСТУВАННЯ

1.8.1. Умови тестування

Протягом вимірювань має фіксуватися температура. Настійливо рекомендується застосування камери для колонок з терморегуляцією з метою забезпечення сталих умов протягом проведення калібрування та оцінки, а також вимірювання тестової речовини.

1.8.2. Визначення часу простою t 0

Для визначення часу простою t може застосовуватися два 0

різних методи (див. також Розділ 1.2).

1.8.2.1. Визначення часу простою t  через гомологічний ряд
                                       0

З допомогою цієї процедури отримуються достовірні та стандартизовані значення t . Детальніше метод описаний в Методі 0

тестування    А.8.:    Коефіцієнт   розділення   (n-октанол/вода),
ВЕРХ-метод.

1.8.2.2. Визначення часу простою t з допомогою інертних 0

речовин, які не затримуються в колонці

Цей метод базується на введенні розчинів формаміду, сечовини або нітрату натрію. Вимірювання виконуються щонайменше двічі.

1.8.3. Визначення тривалості відстоювання t R

Еталонні речовини мають підбиратися таким чином, як це описано в Розділі 1.3. Вони можуть вводитися як змішаний зразок для визначення тривалості їх відстоювання, за умови, що попередньо було встановлено відсутність впливу на тривалість відстоювання кожної з речовин з боку інших присутніх еталонних зразків. Калібрування має проводитися через регулярні проміжки часу щонайменше двічі на день, щоб мати можливість відслідковувати неочікувані зміни в показниках колонки. Для підвищення ефективності калібрувальні впорскування мають здійснюватися до та після впорскування тестової речовини з метою підтвердження того, що не відбулося зміщення у тривалості відстоювання. Тестові речовини вводяться окремо у кількостях настільки малих, наскільки це можливо (для уникнення перевантаження колонки), і визначається тривалість їх відстоювання.

З метою збільшення точності вимірювання має виконуватися принаймні два заміри. Значення log K , отримані при oc

індивідуальних вимірюваннях,  мають  бути  в  діапазоні  0,25  log
одиниці.

1.8.4. Оцінка

Коефіцієнти ємкості k' розраховуються з часу простою t та 0

тривалості відстоювання t  обраних еталонних речовин відповідно до
                         R
рівняння 4 (див.  Розділ 1.2).  Далі дані log k' еталонних речовин
наносяться на графік залежно від їхніх значень log K  ,  отриманих
                                                    oc
при експериментах   на   періодичну   рівновагу,   що  наведені  в
Таблицях 1 та 3 Додатку.  На основі цього графіка значення log  k'
тестової  речовини потім застосовується для визначення її значення
log K  .  Якщо фактичні результати показують,  що log K   тестової
     oc                                                oc
речовини знаходиться за межами діапазону калібрування,  тестування
має  бути  повторене  з  використанням  інших,  більш  відповідних
еталонних речовин.

2. ДАНІ ТА ЗВІТНІСТЬ

Звіт має включати таку інформацію:

- специфікація тестової та еталонної речовин і ступінь їх чистоти, а також, за необхідності, значення pK , a

- опис обладнання та робочих умов, наприклад, тип і розмір аналітичної (та захисної) колонки, засоби виявлення, рухома фаза (співвідношення компонентів та рН), температурний діапазон протягом вимірювань,

- час простою та метод, використаний для його визначення,

- кількість тестової та еталонної речовин, введених у колонку,

- тривалість відстоювання еталонних компонентів, що використовуються для калібрування,

- дані відповідної лінії регресії (log К' проти log К ) та oc

крива регресії,

- середні показники відстоювання та визначене значення d log K для тестового компонента, oc

- хроматограми.

3. ПОСИЛАННЯ

(1) W.J.Lyman, W.F.Reehl, D.H.Rosenblatt (ed), (1990) Handbook of chemical property estimation methods, chapt. 4, McGraw-Hill, New York.

(2) J.Hodson, N.A.Williams, (1988) The estimation of the adsorption coefficient (K ) for soils by HPLC. Chemosphere, 17, oc

p. 167.

(3) G.G.Briggs, (1981) Theoretical and experimental relationships between soil adsorption, octanol-water partition coefficients, water solubilities, bioconcentration factors, and the parachor. J. Agric. Food Chem., 29, p. 1050-1059.

(4) C.T.Chiou, P.E.Porter, D.W.Schmedding, (1983) Partition equilibria of nonionic organic compounds between soil organic matter and water. Environ. Sci. Technol., 17, p. 227-231.

(5) Z.Gerstl, U.Mingelgrin (1984) Sorption of organic substances by soils and sediment. J. Environm. Sci. Health, B19, p. 297-312.

(6) C.T.Chiou, L.J.Peters, V.H.Freed, (1979) A physical concept of soil water equilibria for nonionic organic compounds, Science, 106, p. 831-832.

(7) S.W.Karickhoff, (1981) Semi-empirical estimation of sorption of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils. Chemosphere, 10, p. 833-846.

(8) W.Kordel, D.Hennecke, M.Herrmann, (1997) Application of the HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on sewage sludges. Chemosphere, 35(1/2), p. 121-128.

(9) M.Mueller, W.Kordel (1996) Comparison of screening methods for the estimation of adsorption coefficients on soil. Chemosphere, 32(12), p. 2493-2504.

(10) W.Kordel, J.Stutte, G.Kotthoff (1993) HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient in soil-comparison of different stationary phases, Chemosphere, 27(12), p. 2341-2352.

(11) B. von Oepen, W.Kordel, W.Klein (1991) Sorption of nonpolar and polar compounds to soils: Processes, measurements and experience with the applicability of the modified OECD Guideline 106, Chemosphere, 22, p. 285-304.

(12) W.Kordel, G.Kotthoff, J.Muller (1995) HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on soil-results of a ring test. Chemosphere, 30(7), p. 1373-1384.

Додаток Таблиця 1

Порівняння показників К для ґрунтів та осаду oc стічних вод, а також розраховані показники за методом ВЕРХ-сканування (1), (2)

--------------------------------------------------------------------------
|    Речовина    |  N CAS  |log K  |log K  |Дельта|log K  |log K  |Дельта|
|                |         |     oc|     oc|      |     oc|     oc|      |
|                |         | осаду |  ВЕРХ |      |ґрунтів|  ВЕРХ |      |
|                |         |стічних|       |      |       |       |      |
|                |         |  вод  |       |      |       |       |      |
|----------------+---------+-------+-------+------+-------+-------+------|
|Атразин         |1912-24-9|  1,66 |  2,14 | 0,48 |  1,81 |  2,20 | 0,39 |
|----------------+---------+-------+-------+------+-------+-------+------|
|Лінурон         |330-55-2 |  2,43 |  2,96 | 0,53 |  2,59 |  2,89 | 0,30 |
|----------------+---------+-------+-------+------+-------+-------+------|
|Фентіон         |55-38-9  |  3,75 |  3,58 | 0,17 |  3,31 |  3,40 | 0,09 |
|----------------+---------+-------+-------+------+-------+-------+------|
|Монурон         |150-68-5 |  1,46 |  2,21 | 0,75 |  1,99 |  2,26 | 0,27 |
|----------------+---------+-------+-------+------+-------+-------+------|
|Фенантрен       |85-01-8  |  4,35 |  3,72 | 0,63 |  4,09 |  3,52 | 0,57 |
|----------------+---------+-------+-------+------+-------+-------+------|
|Феніловий ефір  |93-99-2  |  3,26 |  3,03 | 0,23 |  2,87 |  2,94 | 0,07 |
|бензойної       |         |       |       |      |       |       |      |
|кислоти         |         |       |       |      |       |       |      |
|----------------+---------+-------+-------+------+-------+-------+------|
|Бензамід        |55-21-0  |  1,60 |  1,00 | 0,60 |  1,26 |  1,25 | 0,01 |
|----------------+---------+-------+-------+------+-------+-------+------|
|4-нітробензамід |619-80-7 |  1,52 |  1,49 | 0,03 |  1,93 |  1,66 | 0,27 |
|----------------+---------+-------+-------+------+-------+-------+------|
|Ацетанілід      |103-84-4 |  1,52 |  1,53 | 0,01 |  1,26 |  1,69 | 0,08 |
|----------------+---------+-------+-------+------+-------+-------+------|
|Анілін          |62-53-3  |  1,74 |  1,47 | 0,27 |  2,07 |  1,64 | 0,43 |
|----------------+---------+-------+-------+------+-------+-------+------|
|2,5-дихлоранілін|95-82-9  |  2,45 |  2,59 | 0,14 |  2,55 |  2,58 | 0,03 |
|------------------------------------------------------------------------|
|(1) W.Kordel, D.Hennecke, M.Herrmann, (1997) Application of the         |
|HPLC-screening method for the determination of the adsorption           |
|coefficient on sewage sludges. Chemosphere, 35(1/2), p. 121-128.        |
|(2) W.Kordel, D.Hennecke, C.Franke, (1997) Determination of the         |
|adsorption-coefficients of organic substances on sewage sludges.        |
|Chemosphere, 35(1/2), p. 107-119.                                       |
--------------------------------------------------------------------------

Таблиця 2

Результати міжлабораторного порівняльного тестування (11 лабораторій-учасниць), виконаного для удосконалення та підтвердження ВЕРХ-методу (1)

------------------------------------------------------------------
|    Речовина   |    N CAS   |  log K     |    K       | log K   |
|               |            |       oc   |     oc     |      oc |
|               |            |------------+----------------------|
|               |            | (ОЕСР 106) |     (ВЕРХ-метод)     |
|---------------+------------+------------+----------------------|
|Атразин        |  1912-24-9 |    1,81    |  78 +- 16  |  1,89   |
|---------------+------------+------------+------------+---------|
|Монурон        |  150-68-5  |    1,99    |  100 +- 8  |  2,00   |
|---------------+------------+------------+------------+---------|
|Тріапентенол   | 77608-88-3 |    2,37    |  292 +- 58 |  2,47   |
|---------------+------------+------------+------------+---------|
|Лінурон        |  330-55-2  |    2,59    |  465 +- 62 |  2,67   |
|---------------+------------+------------+------------+---------|
|Фентіон        |  55-38-9   |    3,31    | 2062 +- 648|  3,31   |
|----------------------------------------------------------------|
|(1)  W.Kordel, G.Kotthoff, J.Muller (1995) HPLC-screening       |
|method for the determination of the adsorption coefficient on   |
|soil-results of a ring test. Chemosphere, 30(7), p. 1373-1384.  |
------------------------------------------------------------------

Таблиця 3

Рекомендовані еталонні речовини для методу ВЕРХ-сканування на основі даних про адсорбцію ґрунтів

------------------------------------------------------------------
|    Еталонна    |  N CAS   |log K  | Кількість |log S.D.|Джерело|
|    речовина    |          |     oc| даних K   |        |       |
|                |          |       |        oc |        |       |
|----------------+----------+-------+-----------+--------+-------|
|Ацетанілід      | 103-84-4 |  1,25 |     4     |  0,48  |  (a)  |
|----------------+----------+-------+-----------+--------+-------|
|Фенол           | 108-95-2 |  1,32 |     4     |  0,70  |  (a)  |
|----------------+----------+-------+-----------+--------+-------|
|2-нітробензамід | 610-15-1 |  1,45 |     3     |  0,90  |  (b)  |
|----------------+----------+-------+-----------+--------+-------|
|N,N-            | 611-74-5 |  1,52 |     2     |  0,45  |  (a)  |
|диметилбензамід |          |       |           |        |       |
|----------------+----------+-------+-----------+--------+-------|
|4-метилбензамід | 619-55-6 |  1,78 |     3     |  1,76  |  (a)  |
|----------------+----------+-------+-----------+--------+-------|
|Метилбензоат    |  93-58-3 |  1,80 |     4     |  1,08  |  (a)  |
|----------------+----------+-------+-----------+--------+-------|
|Атразин         |1912-24-9 |  1,81 |     3     |  1,08  |  (c)  |
|----------------+----------+-------+-----------+--------+-------|
|Ізопротурон     |34123-59-6|  1,86 |     5     |  1,53  |  (c)  |
|----------------+----------+-------+-----------+--------+-------|
|3-нітробензамід | 645-09-0 |  1,95 |     3     |  1,31  |  (b)  |
|----------------+----------+-------+-----------+--------+-------|
|Анілін          |  62-53-3 |  2,07 |     4     |  1,73  |  (a)  |
|----------------+----------+-------+-----------+--------+-------|
|3,5-            | 121-81-3 |  2,31 |     3     |  1,27  |  (b)  |
|динітробензамід |          |       |           |        |       |
|----------------+----------+-------+-----------+--------+-------|
|Карбендазим     |10605-21-7|  2,35 |     3     |  1,37  |  (c)  |
|----------------+----------+-------+-----------+--------+-------|
|Триадименол     |55219-65-3|  2,40 |     3     |  1,85  |  (c)  |
|----------------+----------+-------+-----------+--------+-------|
|Триазоксид      |72459-58-6|  2,44 |     3     |  1,66  |  (c)  |
|----------------+----------+-------+-----------+--------+-------|
|Триазофос       |24017-47-8|  2,55 |     3     |  1,78  |  (c)  |
|----------------+----------+-------+-----------+--------+-------|
|Лінурон         | 330-55-2 |  2,59 |     3     |  1,97  |  (c)  |
|----------------+----------+-------+-----------+--------+-------|
|Нафтален        |  91-20-3 |  2,75 |     4     |  2,20  |  (a)  |
|----------------+----------+-------+-----------+--------+-------|
|Ендосульфан-діол|2157-19-9 |  3,02 |     5     |  2,29  |  (c)  |
|----------------+----------+-------+-----------+--------+-------|
|Метіокарб       |2032-65-7 |  3,10 |     4     |  2,39  |  (c)  |
|----------------+----------+-------+-----------+--------+-------|
|Кислотний жовтий|63405-85-6|  3,16 |     4     |  2,83  |  (a)  |
|219             |          |       |           |        |       |
|----------------+----------+-------+-----------+--------+-------|
|1,2,3-          |  87-61-6 |  3,16 |     4     |  1,40  |  (a)  |
|трихлоробензен  |          |       |           |        |       |
|----------------+----------+-------+-----------+--------+-------|
|г-ізомер ГХЦГ   |  58-89-9 |  3,23 |     5     |  2,94  |  (a)  |
|----------------+----------+-------+-----------+--------+-------|
|Фентіон         |  55-38-9 |  3,31 |     3     |  2,49  |  (c)  |
|----------------+----------+-------+-----------+--------+-------|
|Конго червоний  |2610-11-9 |  3,43 |     4     |  2,68  |  (a)  |
|81              |          |       |           |        |       |
|----------------+----------+-------+-----------+--------+-------|
|Піразофос       |13457-18-6|  3,65 |     3     |  2,70  |  (c)  |
|----------------+----------+-------+-----------+--------+-------|
|б-ендосульфан   | 959-98-8 |  4,09 |     5     |  3,74  |  (c)  |
|----------------+----------+-------+-----------+--------+-------|
|Диклофоп-метил  |51338-27-3|  4,20 |     3     |  3,77  |  (c)  |
|----------------+----------+-------+-----------+--------+-------|
|Фенантрен       |  85-01-8 |  4,09 |     4     |  3,83  |  (a)  |
|----------------+----------+-------+-----------+--------+-------|
|Основний синій  |26850-47-5|  4,89 |     4     |  4,46  |  (a)  |
|41 (змішаний)   |          |       |           |        |       |
|                |----------+-------+-----------+--------+-------|
|                |12270-13-2|       |           |        |       |
|----------------+----------+-------+-----------+--------+-------|
|ДДТ             |  50-29-3 |  5,63 |     1     |    -   |  (b)  |
|----------------------------------------------------------------|
|(a) W.Kordel, J.Muller (1994). Bestimmung des                   |
|Adsorptionskoeffizienten organischer Chemikalien mit der HPLC.  |
|UBA R & D Report No. 106 01 044 (1994).                         |
|(b)  B.V.Oepen, W.Kordel, W.Klein., (1991) Chemosphere, 22,     |
|p. 285-304.                                                     |
|(с)  Дані отримані під час виробничого процесу.                 |
------------------------------------------------------------------

С.20. ТЕСТУВАННЯ РЕПРОДУКТИВНОЇ ФУНКЦІЇ ДАФНІЇ МАГНА (DAPHNIA MAGNA)

1. МЕТОД

Цей метод тестування впливу токсичності на репродуктивну функцію дублюється з TG 211 ОЕСР (1998).

1.1. ВСТУП

Первинною метою тестування є оцінка впливу хімічних речовин на репродуктивну функцію Daphnia magna.

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ ТА ОДИНИЦІ

Материнські особини: самки дафнії, які є в наявності на початок тестування та репродуктивна функція яких є об'єктом дослідження.

Потомство: молоді особини дафнії, народжені материнськими особинами у ході тестування.

Найнижча спостережена ефективна концентрація (НСЕК): це найнижча концентрація при тестуванні, за якої речовина має статистично значимий вплив на репродуктивну функцію та смертність материнських особин (при р < 0,05), у порівнянні з контрольним зразком, за встановлений час дії такої речовини. Проте всі тестові концентрації, які є вищими за НСЕК, повинні мати шкідливий вплив, що дорівнює або вищий за той, який спостерігається при НСЕК. У випадку, якщо ці дві умови не можуть бути задоволені, має надаватися детальне пояснення того, яким чином було обрано НСЕК (а також КНВЕ).

Концентрація, що не призводить до видимих ефектів (КНВЕ): це тестова концентрація, значення якої лежить безпосередньо під НСЕК і яка, в порівнянні з контрольним зразком, не має статистично значимого впливу (при р < 0,05) за встановлений час дії.

ЕК : це концентрація тестової речовини, розчиненої у воді, що x

має результатом скорочення репродуктивної функції Daphnia magna на
х% за встановлений час дії.

Швидкість експоненціального росту: критерій вимірювання зростання популяції, що об'єднує коефіцієнт розмноження та повіковий коефіцієнт смертності (20)(21)(22). В популяціях, що знаходяться в положенні рівноваги, вона дорівнює нулю. Для зростаючих популяцій показник є позитивним, а для популяцій, чисельність яких скорочується, він негативний. Зрозуміло, що останній не є стійким і в кінцевому рахунку призводить до вимирання популяції.

Межа виявлення: це найнижча концентрація, яка може бути виявлена, але не виражена в кількісній формі.

Межа визначення: це найнижча концентрація, яка може бути виражена в кількісній формі.

Смертність: особина фіксується як мертва у випадку, якщо вона нерухома, тобто якщо вона не здатна плавати або якщо не спостерігається руху відростків або задньої частини черевця протягом 15 секунд після легкого збовтування тестового контейнера. (Якщо використовується інше визначення, воно має наводитися разом з посиланням).

1.3. ПРИНЦИП ЗАСТОСУВАННЯ МЕТОДУ ТЕСТУВАННЯ

Молоді самки дафнії (материнські особини), що віком менше 24 годин на початок тестування, поміщаються в тестову речовину, додану до води згідно діапазону показників концентрації. Тестування триває 21 день. По закінченню тестування оцінюється загальна кількість живого потомства на одну материнську особину, що залишилася живою на кінець тестування. Це означає, що мальки, народжені дорослими особинами, які померли протягом періоду тестування, не включаються до розрахунків. Коефіцієнт розмноження материнських особин може виражатися іншими способами (наприклад, кількість живого потомства, народженого особиною за день, починаючи з першого дня, коли було помічено потомство), але їх слід вказувати додатково до загальної кількості мальків, народжених материнською особиною, що залишилася живою на кінець тестування. Коефіцієнт розмноження особин, що спостерігався у тестовій речовині, порівнюється з аналогічним показником контрольного зразка (зразків) з метою визначення найнижчої спостереженої ефективної концентрації (НСЕК) та, відповідно, концентрації, що не призводить до видимих ефектів (КНВЕ). Крім того, наскільки це можливо, дані аналізуються з застосуванням регресійної моделі для оцінки концентрації, що спричинила б зменшення коефіцієнта розмноження на х% (наприклад, ЕК , ЕК або 50 20

ЕК  ).
  10

Також необхідно вказувати виживаність материнських особин та час народження першого виводку. Крім того, можуть досліджуватися також інші фактори впливу речовини на параметри, такі як зростання (наприклад, довжина) та, можливо, швидкість експоненціального росту.

1.4. ІНФОРМАЦІЯ ПРО ТЕСТОВУ РЕЧОВИНУ

Мають бути доступні результати тестування на гостру токсичність (див. Метод С.2., частина 1), проведеного для Daphnia magna. Результат може бути корисним при відборі відповідного діапазону тестових показників концентрації у тестуванні репродуктивної функції. Мають бути відомі розчинність у воді та поверхневе натягнення тестової речовини, а також доступний для застосування надійний аналітичний метод для розрахунку кількості речовини у тестових розчинах із вказаною відновною ефективністю та межа визначення.

Інформація про тестову речовину, яка може бути корисна при встановленні тестових умов, включає структурну формулу, ступінь чистоти речовини, стійкість на світлі, стійкість в умовах тестування, рК , Р та результати тестування на повний біорозпад a ow

(див. Метод С.4.).

1.5. НАДІЙНІСТЬ ТЕСТУВАННЯ

Для підтвердження надійності тесту в контрольних зразках мають бути дотримані такі робочі критерії:

- смертність материнських особин (самок дафнії) не перевищує 20% на кінець тестування;

- середня чисельність живого потомства, народжена материнською особиною, що залишилася живою на кінець тестування, становить >= 60.

1.6. ОПИС МЕТОДУ ТЕСТУВАННЯ

1.6.1. Прилад

Посуд та інші прилади для проведення тестування, які будуть контактувати з тестовими розчинами, мають бути виготовлені цілком зі скла або іншого хімічно інертного матеріалу. Зазвичай у якості ємностей для тестування використовують мензурки.

Крім того, необхідно мати дещо з наступного обладнання:

- оксиметр (з мікроелектродом або іншим відповідним обладнанням для вимірювання розчиненого кисню у зразках малого об'єму),

- належний прилад для температурного контролю,

- вимірювач рН,

- обладнання для визначення жорсткості води,

- обладнання для визначення загальної концентрації органічного вуглецю (КОВ) у воді або обладнання для визначення хімічної потреби в кисні (ХПК),

- належний прилад для контролю режиму освітлення та вимірювання інтенсивності світла.

1.6.2. Тестові організми

Вид дафній, що використовується у тестуванні, має назву Daphnia magna Straus. Можуть також використовуватися інші види дафній, за умови, що вони відповідають встановленим критеріям надійності (до дафній має відноситися критерій надійності, що стосується репродуктивної функції у контрольних зразках). У випадку використання інших видів дафній вони мають бути чітко ідентифіковані, а їхнє використання обґрунтоване.

Бажано, щоб клон був ідентифікований шляхом генотипування. Дослідження (1) показало, що репродуктивна функція Клону А (що походить з Інституту досліджень з прикладної хімії у Франції) (3) постійно відповідає критерію надійності щодо середньої чисельності потомства >= 60 на живу материнську особину у випадку його культури в умовах, описаних у цьому методі. Проте використання інших клонів також можливе за умови, що культура дафній відповідає критеріям надійності для тестування.

На початку тестування особини мають бути віком менше 24 днів і не повинні належати до потомства першого виводку. Вони мають походити зі здорового роду (тобто не мати жодних негативних ознак, таких як висока смертність, присутність самців та ефіпіуму, затримок у народженні першого виводку, знебарвлених особин тощо). Дафнії мають утримуватися в умовах культивування (світло, температура, середовище, корм і кількість особин на одиницю об'єму) подібних до тих, що мають забезпечуватися під час тесту. Якщо середовище для культури дафній, що має забезпечуватися під час тестування, відрізняється від того, що зазвичай використовується у культурі дафній, добре було б включити переддослідний період акліматизації тривалістю близько 3 тижнів (тобто одне покоління) з метою уникнення стресового навантаження на материнські особини.

1.6.3. Тестове середовище

Рекомендується використовувати для цього тесту середовище визначеного складу. Це допоможе уникнути використання додаткових компонентів (наприклад, морських водоростей, ґрунтових витяжок тощо), які складно характеризувати, а також підвищить можливості стандартизації між лабораторіями. Встановлено, що середовища Елендт М4 (4) та М7 (див. Додаток 1) відповідають цій меті. Проте інші середовища (наприклад, (5) (6)) також прийнятні за умови, що характеристики культури дафній відповідають критеріям надійності для тестування.

Якщо використовуються середовища, що включають невизначені компоненти, такі компоненти мають чітко описуватися, при цьому в звіті про тестування має наводитися інформація про склад, зокрема щодо вмісту вуглецю, оскільки цей фактор може вплинути на передбачений раціон. Рекомендується визначити загальну концентрацію органічного вуглецю (КОВ) та/або хімічну потребу в кисні (ХПК) при приготуванні суміші органічної добавки, а також зробити розрахунок результуючого впливу на КОВ/ХПК у тестовому середовищі. Рекомендується, щоб рівні КОВ у середовищі (тобто перед додаванням водоростей) становили менше 2 мг/л (7).

При тестуванні речовин, що містять метали, важливо розпізнати, що властивості тестового середовища (наприклад, жорсткість, здатність до хелатоутворення) можуть мати відношення до токсичності тестової речовини. Внаслідок цього бажано мати повністю визначене середовище. Проте на даний час єдиним повністю визначеним середовищем, яке, як доведено, підходить для довготривалого культивування Daphnia magna, є Елендт М4, а також М7. Обидва типи середовища містять хелатуючий агент етилендіамінтетраоцтову кислоту. Дослідження показали (2), що "очевидна токсичність" кадмію зазвичай нижча у випадку, якщо тестування на репродуктивну функцію проводиться у середовищах М4 та М7, ніж у середовищах, що не містять ЕДТК. Внаслідок цього М4 та М7 не рекомендуються для тестування речовин, що містять метали, а також слід уникати інших середовищ, що містять відомі хелатуючі агенти. Для металовмісних речовин можна порадити використовувати альтернативне середовище, наприклад, рекомбіновану жорстку прісну воду АСТМ (7), яка не містить ЕДТК, з додаванням витяжки морських водоростей (8). Такий комплекс рекомбінованої жорсткої прісної води АСТМ та витяжки морських водоростей також підходить для довготривалої культури та тестування Daphnia magna (2), хоча він все-таки проявляє слабку хелатуючу дію завдяки органічному компоненту у доданій витяжці морських водоростів.

На початку та протягом тестування концентрація розчиненого кисню має перевищувати 3 мг/л. Рівень рН має знаходитися в межах діапазону 6-9, при цьому протягом виконання тесту він не повинен коливатися більш, ніж на 1,5 одиниці. Рекомендується жорсткість вище 140 мг/л (як СаСО ). Тести на такому рівні та вище вважаються 3

такими, що продемонстрували характеристики репродуктивної функції,
що відповідають критеріям надійності (9) (10).

1.6.4. Тестові розчини

Тестові розчини встановленої концентрації зазвичай готуються розведенням базового розчину. Бажано, щоб базові розчини готувалися розведенням речовини в тестовому середовищі.

В деяких випадках може вимагатися використання органічних розчинників та дисперсантів з метою отримання базового розчину належної концентрації, але необхідно докласти всіх зусиль для уникнення використання таких матеріалів. Прикладами належних розчинників є ацетон, етанол, метанол, диметилформамід та триетиленгліколь. Прикладами належних дисперсантів є Кремофор RH40, метилцелюлоза 0,01% та НСО-40. У будь-якому випадку, тестова речовина у тестових розчинах не повинна перевищувати межу розчинності у тестовому середовищі.

Розчинники використовуються для отримання базового розчину, який може бути точно дозований у воді. За рекомендованої концентрації розчинника у кінцевому тестовому середовищі (тобто <= 0,1 мл/л) розчинники, перераховані вище, не будуть токсичними і не підвищать ступінь розчинності речовини у воді.

Дисперсанти можуть сприяти точному дозуванню та розсіюванню. За рекомендованої концентрації у кінцевому тестовому середовищі (тобто <= 0,1 мл/л) дисперсанти, перераховані вище, не будуть токсичними і не підвищать ступінь розчинності речовини у воді.

1.7. ПЛАН ТЕСТУВАННЯ

Обробка ємностей для тестування, а також всі подальші операції з ємностями для тестування мають здійснюватися у довільному порядку. Невиконання цієї умови може мати наслідком похибки, що могли б тлумачитися як вплив розміру концентрації. Зокрема, якщо маніпуляції з експериментальними одиницями проводяться в порядку обробки або концентрації, у цьому випадку деякі фактори, що відносяться до часу, наприклад, втома виконавця або інша помилка, можуть призвести до серйозніших наслідків при вищих концентраціях. Крім цього, якщо є ознаки того, що результати тестування піддалися впливу початкових умов або стану навколишнього середовища при тестуванні, наприклад, розташування в лабораторії, має бути розглянуто питання про блокування тесту.

1.8. ПОРЯДОК ВИКОНАННЯ

1.8.1. Умови проведення

1.8.1.1. Тривалість

Процес тестування триває 21 день.

1.8.1.2. Наповнення

Материнські особини утримуються окремо, одна особина на одну ємність для тестування, з 50-100 мл середовища в кожній ємності.

Іноді можуть бути необхідні більші об'єми з метою дотримання вимог аналітичного методу, що застосовується для визначення концентрації тестової речовини, хоча групування зразків для хімічного аналізу також допускається. Якщо використовуються об'єми, вищі за 100 мл, раціон, що надається дафніям, може потребувати збільшення з метою забезпечення належного рівня доступності корму та відповідності з критеріями надійності. Для тестування у проточному режимі з технічних причин можуть братися до уваги альтернативні плани (наприклад, чотири групи з 10 особин у більшому об'ємі тестової речовини), але будь-які зміни до плану тестування мають вказуватися у звіті.

1.8.1.3. Кількість особин

Для тестування у напівстатичному режимі щонайменше 10 особин утримуються поодинці у кожній із тестових концентрацій та щонайменше 10 особин окремо утримується в контрольних зразках.

Для тестування у проточному режимі встановлено, що належить використовувати 40 особин, розділених на чотири групи по 10 особин на кожну тестову концентрацію (1). Може використовуватися менша кількість тестових організмів, при цьому рекомендується мінімально 20 особин на один тип концентрації, що розділені на два чи більше зразків з рівною кількістю особин (наприклад, чотири зразки по п'ять особин у кожному). Зверніть увагу, що у випадку з тестами, де тварини утримуються в групах, буде неможливо виразити коефіцієнт розмноження як загальну чисельність живого потомства, народженого материнською особиною, що є живою по завершенню тестування, якщо материнські особини помирають. У таких випадках коефіцієнт розмноження має виражатися як "загальна чисельність живого потомства, народженого материнською особиною, що є в наявності на початок тестування".

1.8.1.4. Корм

В умовах тестування у напівстатичному режимі бажано, щоб корм надавався щоденно, але щонайменше три рази на тиждень (тобто відповідно до змін середовища). Відхилення від такого режиму (наприклад, в умовах тестування в проточному режимі) мають вказуватися у звіті.

Протягом тестування раціон материнських особин має складатися з живих клітин водоростей одного чи більшої кількості наступних видів: Chlorella sp, Selenastrum capricornutum (зараз Pseudokirchneriella subcapitata (11)) та Scenedesmus subspicatus. Передбачений раціон має ґрунтуватися на кількості органічного вуглецю (С), що надається кожній материнській особині. Дослідження (12) показали, що для Daphnia magna кількості корму в діапазоні 0,1-0,2 мг С/Daphnia/день достатньо, щоб досягнути рівня розмноження, який вимагається з метою відповідності критеріям надійності тестування. Раціон може забезпечуватися або у відповідному розмірі протягом періоду тестування, або, за бажанням, може бути надано менший розмір на початку і далі поступово збільшуватися з урахуванням зростання материнських особин. Проте і в цьому випадку раціон має залишатися у межах рекомендованого діапазону 0,1-0,2 мг С/Daphnia/день протягом всього часу виконання тестування.

Якщо для забезпечення встановленого об'єму корму (тобто для зручності, оскільки вимірювання вмісту вуглецю є досить трудомістким процесом) застосовуються компоненти-замінники, наприклад, кількість клітин водоростей або поглинання світла, кожною з лабораторій має бути виготовлено власну номограму, що стосується компоненту-замінника вуглецю водоростевої культури (див. Додаток 2 для роз'яснення процесу підготовки номограми). Номограми мають перевірятися принаймні раз на рік та частіше, якщо умови культивування водоростей змінювалися. Встановлено, що світлопоглинання є кращим замінником вмісту вуглецю, ніж кількість клітин (13).

Для мінімізації об'єму середовища культури водоростей, що вводиться в ємності для тестування, слід згодовувати дафніям концентровану суспензію з водоростей. Концентрація водорості може досягатися центрифугуванням, після якого проводиться повторним розведенням у дистильованій, деіонізованій воді або середовищі культури дафній.

1.8.1.5. Освітлення

16-годинне освітлення з інтенсивністю, що не перевищує -2 -1

15-20 мкЕ · м   · с  .

1.8.1.6. Температура

Температура тестового середовища має бути в діапазоні 18-22 град.С. Проте у межах одного тесту температура не повинна, по можливості, варіюватися більш ніж на 2 град.С у вказаному діапазоні (наприклад, 18-20, 19-21 або 20-22 град.С). Може бути необхідно використовувати додаткову ємність для тестування з метою забезпечення температурного контролю.

1.8.1.7. Аерація

Ємності для проведення тестування не повинні піддаватися аерації протягом проведення тестування.

1.8.2. Тестова концентрація

Зазвичай має бути передбачено щонайменше п'ять видів тестової концентрації на основі геометричного ряду, коефіцієнт розділення якого не перевищує 3.2, при цьому слід використовувати відповідну кількість екземплярів для тестової концентрації кожного з видів (див. Розділ 1.8.1.3). Має бути надано пояснення у випадку, якщо застосовується менш, ніж п'ять видів тестових концентрацій. Речовини не слід тестувати за концентрацій вищих, ніж встановлена для них межа розчинності у тестовому середовищі.

При визначенні показників концентрації необхідно пам'ятати про таке:

Якщо метою є досягнення НСЕК/КНВЕ, найнижча тестова концентрація має бути достатньо низькою для того, щоб загальна плодовитість за такої концентрації не була значно нижчою, ніж у контрольному зразку. Якщо цього не відбувається, тестування має бути повторене зі зниженою мінімальною концентрацією.

Якщо метою є досягнення НСЕК/КНВЕ, найвища тестова концентрація має бути достатньо високою для того, щоб загальна плодовитість за такої концентрації була суттєво нижчою, ніж у контрольному зразку. Якщо цього не відбувається, тестування має бути повторене зі збільшеною максимальною концентрацією.

Якщо визначається ЕК для впливу на репродуктивну функцію, x

бажано,   щоб   використовувалися   концентрації,   достатні   для
визначення  ЕК   з  належним  ступенем  вірогідності.  У   випадку
              x
визначення  ЕК    для впливу на репродуктивну функцію бажано,  щоб
              50
найвища тестова концентрація була більшою,  ніж цей показник ЕК  .
                                                               50
В  іншому  випадку,  хоча  визначити  ЕК   буде можливо,  довірчий
                                        50
інтервал для ЕК   буде занадто широким і може виявитися неможливим
               50
оцінити на задовільному рівні відповідність підібраної моделі.

Бажано, щоб показники тестових концентрацій не включали будь-які концентрації, що мають статистично значний вплив на тривалість життя дорослої особини, оскільки це змінить характер тесту з простого тестування репродуктивної функції на комбіноване тестування репродуктивної функції та рівня смертності, що вимагає більш комплексного статистичного аналізу.

Попередні відомості про токсичність тестової речовини (наприклад, з тестування на гостру токсичність та/або дослідження з визначення діапазону доз) можуть допомогти у підборі належних тестових концентрацій.

У випадку, якщо при приготуванні тестових розчинів застосовується розчинник або дисперсант (див. Розділ 1.6.4), його кінцева концентрація в ємностях для тестування не повинна перевищувати 0,1 мл/л і має бути однаковою в усіх ємностях для тестування.

1.8.3. Контрольні зразки

Крім тестової серії має бути приготовано одну контрольну серію на основі тестового середовища, а також, за необхідності, контрольну серію, що містить розчинник або дисперсант. У такому випадку концентрація розчинника або дисперсанта має бути такою самою, як та, що застосовується у ємностях із тестовою речовиною. Слід використовувати належну кількість екземплярів (див. Розділ 1.8.1.3).

Загалом, при успішно проведеному тестуванні коефіцієнт варіації навколо середньої чисельності живого потомства, народженого материнською особиною в контрольному зразку (зразках), має становити <= 25% і це має бути вказано в звіті для дослідних зразків з використанням індивідуально утримуваних тварин.

1.8.4. Поновлення тестового середовища

Частота поновлення середовища залежатиме від стійкості тестової речовини, але має проводитися щонайменше тричі на тиждень. Якщо з попереднього тестування на стійкість (див. Розділ 1.4) очевидно, що концентрація тестової речовини не є стійкою (тобто знаходиться за межами діапазону 80-120% номінальної величини або нижча 80% виміряної первинної концентрації) протягом максимального періоду поновлення (тобто 3 дні), необхідно розглянути можливість частішого поновлення середовища або проведення тестування у проточному режимі.

Якщо поновлення середовища проводиться під час тестування у напівстатичному режимі, готується друга серія ємностей для тестування і материнські особини пересаджуються до них, наприклад, скляною піпеткою відповідного діаметру. Слід мінімізувати об'єм середовища, що переноситься разом із дафніями.

1.8.5. Спостереження

Результати спостережень, отримані протягом тестування, мають фіксуватися у протоколі результатів (див. приклади в Додатках 3 та 4). Якщо вимагаються інші вимірювання (див. 1.3 та 1.8.8), можуть бути необхідні додаткові примітки.

1.8.6. Потомство

Бажано, щоб потомство, народжене кожною з материнських особин, видалялося та перераховувалося щоденно від моменту появи першого виводку з метою попередження споживання ним корму, призначеного для дорослої особини. Для цілей цього методу необхідно розраховувати лише чисельність живого потомства, але слід вказувати у звіті наявність недорозвинених яєць або мертвого потомства.

1.8.7. Рівень смертності

Бажано, щоб рівень смертності серед материнських особин фіксувався щоденно, щонайменше у той самий час, коли підраховується чисельність потомства.

1.8.8. Інші параметри

Хоча метод призначений головним чином для оцінки впливів на репродуктивну функцію, інші параметри також можливо розраховувати в достатньому об'ємі для проведення статистичного аналізу. Настійно рекомендується проводити вимірювання росту, оскільки це надає інформацію про можливі сублетальні впливи, що може бути більш корисним, ніж саме визначення репродуктивної функції; рекомендується вимірювання довжини материнських особин (тобто довжина тіла, за виключенням анального відростку) по закінченню тестування. Інші параметри, які можуть бути виміряні або розраховані, включають час народження першого виводку (а також наступних виводків), чисельність та розмір особин у виводку на одну дорослу тварину, кількість недорозвинених яєць, наявність самців або ефіпіуму та швидкість експоненціального росту популяції.

1.8.9. Частота аналітичних визначень та вимірювань

Показники концентрації кисню, температури, жорсткості та рівня рН мають вимірюватися щонайменше раз на тиждень, у свіжому та старому середовищах, у контрольних зразках та за найвищої концентрації тестової речовини.

Протягом тестування концентрації тестової речовини встановлюються з рівними проміжками.

При тестуванні в напівстатичному режимі, де очікується, що концентрація тестової речовини залишатиметься у межах +- 20% від номінального показника (тобто в межах діапазону 80-120% - див. 1.4 та 1.8.4), рекомендується аналізувати щонайменше найвищу та найнижчу тестові концентрації у свіжому розчині, а також під час поновлення один раз протягом першого тижня тестування (тобто аналіз має проводитися на зразку з того самого розчину - на щойно приготованому та при поновленні). Далі такі визначення слід повторювати принаймні з тижневим інтервалом.

Для тестування, де очікується, що концентрація тестової речовини не залишатиметься у межах +- 20% від номінального показника, необхідно аналізувати всі тестові концентрації, щойно приготовані та поновлені. Проте для таких тестувань, де виміряна первинна концентрація тестової речовини не знаходиться в діапазоні +- 20% від номінального показника, але можуть бути надані достатні докази того, первинні концентрації є повторюваними та стійкими (тобто знаходяться в межах діапазону 80-120% первинних концентрацій), визначення хімічного складу можуть бути скорочені на 2 та 3 тиждень тестування до вимірювання найвищої та найнижчої тестових концентрацій. При цьому у всіх випадках проводити визначення концентрації тестової речовини необхідно лише в одному з екземплярів ємностей для кожного з видів тестових концентрацій.

У випадку застосування тестування в проточному режимі підходить принцип взяття проби, подібний до описаного для тестування в напівстатичному режимі (але заміри "старих" розчинів у цьому випадку не виконуються). Проте може бути корисно збільшити кількість взяття проб протягом першого тижня (наприклад, три цикли вимірів) для підтвердження того, що тестові концентрації залишаються сталими. В тестуванні такого типу витрати розчинника та тестової речовини слід перевіряти щоденно.

Якщо є підтвердження того, що концентрація речовини, що тестується, утримується на задовільному рівні у діапазоні +- 20% від номінальної або виміряної первинної концентрації протягом всього тестування, в такому випадку результати можуть ґрунтуватися на номінальному або виміряному первинному показнику. Якщо відхилення від номінальної або виміряної первинної концентрації становить більше +- 20%, результати слід виражати часовим зваженим коефіцієнтом (див. Додаток 5).

2. ДАНІ ТА ЗВІТНІСТЬ

2.1. ОБРОБКА РЕЗУЛЬТАТІВ

Метою тестування є визначення впливу тестової речовини на загальну чисельність живого потомства, народженого материнською особиною, що залишилася живою на кінець тестування. Загальна чисельність живого потомства на материнську особину має бути розрахована для кожної тестової ємності (тобто для кожного екземпляра). Якщо протягом тестування у якійсь із ємностей материнська особина помирає або виявляється, що це самець, у такому випадку цей екземпляр виключається з аналізу. При цьому аналіз буде проводитися на скороченій кількості екземплярів.

Щоб оцінити НСЕК, а звідси КНВЕ, для впливів хімічної речовини на репродуктивну функцію, необхідно розрахувати середнє значення коефіцієнта розмноження серед зразків для кожної з концентрацій та узагальнене залишкове стандартне відхилення, що може бути виконано з застосуванням дисперсійного аналізу. Далі середнє значення кожної концентрації має порівнюватися з контрольним середнім значенням із застосуванням відповідного методу множинного порівняння. Можуть бути корисними тести Даннета або Вільямса (14)(15)(16)(17). Необхідно перевірити, чи підтримується припущення дисперсійного аналізу про однорідність дисперсій. Рекомендується, щоб це було виконано в графічній формі, а не шляхом формальної перевірки за критерієм значимості (18); у якості альтернативи можна провести тестування за Бартлеттом. Якщо припущення не підтверджується, слід розглянути можливість перетворення даних з метою забезпечення однорідності дисперсій до проведення дисперсійного аналізу, або можливість проведення зваженого дисперсійного аналізу. Має бути розрахований та вказаний у звіті розмір впливу, можливий для виявлення при використані дисперсійного аналізу (тобто мінімальна значима різниця).

Для оцінки концентрації, що може спричинити 50% скорочення репродуктивної функції (тобто ЕК ), на підставі даних має бути 50

побудована   відповідна  крива,  наприклад,  логістична  крива,  з
застосуванням  статистичного  методу,  зокрема,  методу  найменших
квадратів.  Крива може бути параметризована таким чином,  щоб ЕК
                                                                50
та його стандартна похибка  могли  оцінюватися  безпосередньо.  Це
значно  полегшить  розрахунок  довірчого інтервалу для ЕК  .  Слід
                                                         50
вказувати двосторонній довірчий інтервал у межах  95%  у  випадку,
якщо  немає  обґрунтованих  підстав  віддати перевагу іншому рівню
довірчого інтервалу.  Бажано,  щоб процедура  підбору  за  точками
передбачала  засіб для оцінки значимості невідповідності.  Це може
бути  виконано  графічно  або  шляхом  ділення   залишкової   суми
квадратів  на  значення  "невідповідності"  та "компоненти дійсної
похибки" та  проведення  перевірки  за  критерієм  значимості  для
невідповідності.   Оскільки   методи  обробки,  які  дають  високу
плодовитість,  частіше за все мають вищу дисперсію  в  численності
народженого   потомства,  ніж  методи  обробки,  що  дають  низьку
плодовитість,  слід  розглянути  можливість  зважування  отриманих
значень  з  метою  відображення  різних  дисперсій у різних групах
обробки (див. довідкову інформацію пос. 18).

В аналізі даних з тестування за принципом кільцевої проби (2) логістична крива була побудована з використанням наступної моделі, хоча можуть використовуватися й інші відповідні моделі:

c
                         Y = ------------
                                    x  b
                              1 + (---)
                                    x
                                     0

де:

Y = загальна чисельність потомства на материнську особину, що залишилася живою по закінченню тестування (розраховано для кожної ємності)

x = концентрація речовини

c = очікувана чисельність потомства, якщо х = 0

x = ЕК у популяції

0 50

b = нахил кривої

Ця модель спрацьовує у більшості ситуацій, але можуть траплятися тести, для яких вона не підходить. Слід проводити перевірку надійності моделі, як вказано вище. У деяких випадках може бути доцільним використання моделі гормезису, у якій низькі концентрації дають посилений вплив (19).

Інші ефективні концентрації, наприклад, ЕК або ЕК , також 10 20

можуть оцінюватися,  хоча  бажано  використовувати  параметризацію
моделі іншу, ніж ту, що застосовується для оцінки ЕК  .
                                                    50

2.2. ЗВІТ ПРО ТЕСТУВАННЯ

Звіт про тестування має включати таку інформацію:

2.2.1. Тестова речовина:

- фізична природа та відповідні фізико-хімічні властивості,

- дані щодо хімічної ідентифікації, включаючи ступінь чистоти.

2.2.2. Тестові види:

- клон (незалежно від того, чи був він генетично типізований), постачальник або джерело (якщо відомо), а також умови культивування, що застосовувалися. Якщо використовувався інший вид Daphnia magna, це має бути вказано в звіті та обґрунтовано.

2.2.3. Умови тестування:

- застосований порядок тестування (наприклад, у напівстатичному або проточному режимі, об'єм, наповнення у кількості дафній на літр),

- світловий день та інтенсивність освітлення,

- план проведення тестування (наприклад, кількість екземплярів, кількість материнських особин на один екземпляр),

- відомості про використовуване для культивування середовище,

- якщо такі застосовувалися, добавки з органічного матеріалу, включаючи склад, джерело, метод приготування, КОВ/ХПК базових розчинів, оцінка остаточних показників КОВ/ХПК в тестовому середовищі,

- детальна інформація про корм, включаючи розмір (у мг С/Daphnia/день) та режим (наприклад, тип корму, включаючи особливі назви (види) водоростей та, якщо відомо, штам, умови розведення),

- метод приготування базових розчинів і частота поновлення (розчинник або дисперсант, при цьому має вказуватися його концентрація).

2.2.4. Результати:

- результати будь-яких попередніх досліджень щодо стійкості тестової речовини,

- номінальні тестові концентрації та результати всіх аналізів на визначення концентрації тестової речовини у ємностях для тестування (див. приклад протоколу результатів у Додатку 4); також мають бути вказані відновна ефективність методу та межі визначення,

- якість води у межах ємностей для тестування (наприклад, рівень рН, температура та концентрація розчиненого кисню, КОВ і/або ХПК та жорсткість, за необхідності) (див. приклад протоколу результатів у Додатку 3),

- повна реєстрація живого потомства від кожної материнської особини (див. приклад протоколу результатів у Додатку 3),

- кількість померлих тварин серед материнських особин та дні, коли це траплялось (див. приклад протоколу результатів у Додатку 3),

- коефіцієнт варіації для контрольної плодовитості (що ґрунтується на загальній кількості живого потомства на одну живу материнську особину по закінченню тестування),

- графік залежності загальної кількості живого потомства на одну живу материнську особину (для кожного повтору) по закінченню тестування від концентрації тестової речовини,

- найнижча спостережена ефективна концентрація (НСЕК) для розмноження, включаючи опис використовуваних статистичних методів та вказівку ефекту, розмір якого може бути визначено, а також Концентрація, що не призводить до видимих ефектів (КНВЕ) у розмноженні; за можливості також вказується НСЕК/КНВЕ для смертності материнських особин,

- за можливості, ЕК для розмноження та довірчі інтервали, а x

також  графік відповідної моделі,  використаної для її розрахунку,
нахил кривої залежності від дози та стандартна похибка,

- інші біологічні ефекти або виміри: у звіт вносяться будь-які інші біологічні ефекти, які спостерігалися або були виміряні (наприклад, зростання дорослих особин), включаючи будь-яке відповідне обґрунтування,

- пояснення будь-яких відхилень від Методу тестування.

3. ПОСИЛАННЯ

(1) OECD Test Guideline Programme, Report of the Workshop on the Daphnia magna Pilot Ring Test, Sheffield University, UK, 20-21 March 1993.

(2) OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No 6. Report of the Final Ring Test of the Daphnia magna Reproduction Test Paris. 1997.

(3) Baird D.J., Barber J., Bradley M.C., Soares A.M.V.M. and Calow P. (1991) A comparative study of genotype sensitivity to acute toxic stress using clones of Daphnia magna Strauss. Ecotoxicology and Environmental Safety, 21, p. 257-265.

(4) Elendt B.P., (1990) Selenium deficiency in Crustacea; An ultrastructural approach to antennal damage in Daphnia magna Straus. Protoplasma, 154, p. 25-33.

(5) EPA (1993) Methods for Measuring the Acute Toxicity of Effluents and Receiving Waters to Freshwater and Marine Organisms. (Fourth ed.). EPA/600/4-90/027F. C.I.Weber (ed), USEPA, Cincinnati, Ohio.

(6) Vigano L., (1991) Suitability of commercially available spring waters as standard medium for culturing Daphnia magna. Bull. Environ. Contam. Toxicol., 47, p. 775-782.

(7) ASTM (1988) Standard Guide for Conducting Acute Toxicity Tests with Fishes, Macroinvertebrates and Amphibians. E729-88a. American Society for Testing and Materials, Philadelphia P.A. p. 20.

(8) Baird D.J., Soares A.M.V.M., Girling A., Barber J., Bradley M. C. and Calow P., (1989) The long term maintenance of Daphnia magna Straus for use in ecotoxicological tests; problems and prospects. In: Proceedings of the 1st European Conference on Ecotoxicology. Copenhagen 1988 (H.Lokke, H.Tyle & F.Bro-Rasmussen. Eds.) p. 144-148.

(9) Parkhurst B.R., Forte J.L. and Wright G.P., (1981) Reproducibility of a life-cycle toxicity test with Daphnia magna. Bull. Environ. Contam. and Toxicol., 26, p. 1-8.

(10) Cowgill U.M. and Milazzo D.P., (1990) The sensitivity of two cladocerans to water quality variables: salinity and hardness. Arch. Hydrobiol., 120(2), p. 185-196.

(11) Korshikov (1990) Pseudokirchneriella subcapitata Hindak, F-1990. Biologice Prace, 36, p. 209.

(12) Sims I.R., Watson S. and Holmes D., (1993) Toward a standard Daphnia juvenile production test. Environmental Toxicology and Chemistry, 12, p. 2053-2058.

(13) Sims I., (1993) Measuring the growth of phytoplankton: the relationship between total organic carbon with three commonly used parameters of algal growth. Arch. Hydrobiol., 128, 459-466.

(14) Dunnett C.W., (1955) A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc., 50, p. 1096-1121.

(15) Dunnett C.W., (1964) New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20, p. 482-491.

(16) Williams D.A., (1971) A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27, p. 103-117.

(17) Williams D.A., (1972) The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28, p. 510-531.

(18) Draper N.R. and Smith H., (1981) Applied Regression Analysis, second edition, Wiley, N.Y.

(19) Brain P. and Cousens R., (1989) An equation to describe dose responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, p. 93-96.

(20) Wilson E.O. and Bossert, W.H., (1971) A Primer of Population Biology. Sinauer Associates Inc. Publishers.

(21) Poole R.W., (1974) An Introduction to quantitative Ecology. Mc Graw Hill Series in Population Biology, New York, p. 532.

(22) Meyer J.S., Ingersoll C.G., McDonald L.L. and Boyce M.S., (1986) Estimating uncertainty in population growth rates: Jackknife vs bootstrap techniques. Ecology, 67, p. 1156-1166.

Додаток 1

ПРИГОТУВАННЯ ПОВНІСТЮ СПЕЦИФІКОВАНИХ СЕРЕДОВИЩ ЕЛЕНДТ М7 ТА М4

Адаптація до середовищ Елендт М7 та М4

Деякі лабораторії мали труднощі з прямим перенесенням дафній у середовища М4 (I) та М7. Проте було досягнуто певних успіхів з поетапною адаптацією, тобто перенесенням з власного середовища до 30% Елендту, потім до 60% Елендту і, нарешті, до 100% Елендту. Адаптація може потребувати періоду тривалістю до одного місяця.

ПРИГОТУВАННЯ

Домішкові елементи

Окремі базові розчини (I) індивідуальних домішкових елементів спочатку готуються у воді відповідної чистоти, наприклад, деіонізованій, дистильованій або очищеній методом зворотного осмосу. З цих різних базових розчинів (I) готується другий єдиний базовий розчин (II), що містить всі домішкові елементи (комбінований розчин), а саме:

----------------------------------------------------------------------
| Базовий розчин I |    Кількість,   |  Концентрація   |     Для     |
| (єдина речовина) | додана до води, |    (відносно    | приготування|
|                  |       мг/л      | середовища М4), |комбінованого|
|                  |                 |    кратність    |   базового  |
|                  |                 |                 |  розчину II |
|                  |                 |                 |    додати   |
|                  |                 |                 |   наступну  |
|                  |                 |                 |  кількість  |
|                  |                 |                 |   базового  |
|                  |                 |                 |  розчину I  |
|                  |                 |                 |   у воду,   |
|                  |                 |                 |     мл/л    |
|                  |                 |                 |  М 4   М 7  |
|------------------+-----------------+-----------------+-------------|
|H BO              |      57 190     |      20 000     |  1,0 | 0,25 |
| 3  3             |                 |                 |      |      |
|------------------+-----------------+-----------------+------+------|
|MnCl  · 4 H O     |      7 210      |      20 000     |  1,0 | 0,25 |
|    2      2      |                 |                 |      |      |
|------------------+-----------------+-----------------+------+------|
|LiCl              |      6 120      |      20 000     |  1,0 | 0,25 |
|------------------+-----------------+-----------------+------+------|
|RbCl              |      1 420      |      20 000     |  1,0 | 0,25 |
|------------------+-----------------+-----------------+------+------|
|SrCl  · 6 H O     |      3 040      |      20 000     |  1,0 | 0,25 |
|    2      2      |                 |                 |      |      |
|------------------+-----------------+-----------------+------+------|
|NaBr              |       320       |      20 000     |  1,0 | 0,25 |
|------------------+-----------------+-----------------+------+------|
|Na MoO  · 2 H O   |      1 260      |      20 000     |  1,0 | 0,25 |
|  2   4      2    |                 |                 |      |      |
|------------------+-----------------+-----------------+------+------|
|CuCl  · 2 H O     |       335       |      20 000     |  1,0 | 0,25 |
|    2      2      |                 |                 |      |      |
|------------------+-----------------+-----------------+------+------|
|ZnCl              |       260       |      20 000     |  1,0 |  1,0 |
|    2             |                 |                 |      |      |
|------------------+-----------------+-----------------+------+------|
|CoCl  · 6 H O     |       200       |      20 000     |  1,0 |  1,0 |
|    2      2      |                 |                 |      |      |
|------------------+-----------------+-----------------+------+------|
|Kl                |        65       |      20 000     |  1,0 |  1,0 |
|------------------+-----------------+-----------------+------+------|
|Na SeO            |      43,8       |      20 000     |  1,0 |  1,0 |
|  2   3           |                 |                 |      |      |
|------------------+-----------------+-----------------+------+------|
|NH VO             |      11,5       |      20 000     |  1,0 |  1,0 |
|  4  3            |                 |                 |      |      |
|------------------+-----------------+-----------------+------+------|
|Na EDTA · 2 H O   |      5 000      |      2 000      |  -   |  -   |
|  2          2    |                 |                 |      |      |
|------------------+-----------------+-----------------+------+------|
|FeSO  · 7 H O     |      1 991      |      2 000      |  -   |  -   |
|    4      2      |                 |                 |      |      |
|--------------------------------------------------------------------|
|Розчин Na EDTA та розчин FeSO  готуються окремо, виливаються разом і|
|         2                   4                                      |
|негайно піддаються обробці в автоклаві. Це дає:                     |
|--------------------------------------------------------------------|
|21 Fe-EDTA розчин |                 |  1 000-кратний  | 20,0 |  5,0 |
----------------------------------------------------------------------

Середовища М4 та М7

Середовища М4 та М7 готуються на основі вихідного розчину II, із наступним вмістом макронутрієнтів та вітамінів:

----------------------------------------------------------------------------
|                  |  Кількість, що   | Концентрація при |    Кількість    |
|                  | додається у воду |    згортанні     |    вихідного    |
|                  |       мг/л       |  (відноситься до |   розчину, що   |
|                  |                  |  середовища М4)  |використовується |
|                  |                  |                  |для приготування |
|                  |                  |                  |    середовища   |
|                  |                  |                  |      мл/л       |
|                  |                  |                  |                 |
|                  |                  |                  |   М4      М7    |
|------------------+------------------+------------------+-----------------|
|Вихідний розчин II|                  |20                |50      |50      |
|комбінованих      |                  |                  |        |        |
|мікроелементів    |                  |                  |        |        |
|--------------------------------------------------------------------------|
|Вихідні розчини макронутрієнтів (окрема речовина)                         |
|--------------------------------------------------------------------------|
|CaCl  · 2 O29380  |      293 800     |1000              |1,0     |1,0     |
|    2             |                  |                  |        |        |
|------------------+------------------+------------------+--------+--------|
|MgSO  · 7 H O     |      246 600     |2 000             |0,5     |0,5     |
|    4      2      |                  |                  |        |        |
|------------------+------------------+------------------+--------+--------|
|KCl               |     58 00010     |10 000            |0,1     |0,1     |
|------------------+------------------+------------------+--------+--------|
|NaHCO             |      64 800      |1 000             |1,0     |1,0     |
|     3            |                  |                  |        |        |
|------------------+------------------+------------------+--------+--------|
|Na SiO  · 9 H O   |      00 0050     |5 000             |0,2     |0,2     |
|  2   3      2    |                  |                  |        |        |
|------------------+------------------+------------------+--------+--------|
|NaNO              |      2 740       |10 000            |0,1     |0,1     |
|    3             |                  |                  |        |        |
|------------------+------------------+------------------+--------+--------|
|KH PO             |      1 430       |1 000             |0,1     |0,1     |
|  2  4            |                  |                  |        |        |
|------------------+------------------+------------------+--------+--------|
|K HPO             |      1 840       |1 000             |0,1     |0,1     |
| 2   4            |                  |                  |        |        |
|------------------+------------------+------------------+--------+--------|
|Реакційна маса    |        -         |10 000            |0,1     |0,1     |
|комбінованих      |                  |                  |        |        |
|вітамінів         |                  |                  |        |        |
|--------------------------------------------------------------------------|
|Вихідний розчин комбінованих вітамінів готується за допомогою додавання   |
|3 вітамінів на 1 літр як показано нижче:                                  |
|--------------------------------------------------------------------------|
|Тіаміну           |750               |10 000            |-       |-       |
|гідрохлорид       |                  |                  |        |        |
|------------------+------------------+------------------+--------+--------|
|Цианокобаламін    |10                |10 000            |-       |-       |
|(B12)             |                  |                  |        |        |
|------------------+------------------+------------------+--------+--------|
|Біотин            |7,5               |10 000            |-       |-       |
|--------------------------------------------------------------------------|
|Реакційна маса комбінованих вітамінів зберігається в замороженому вигляді |
|у формі маленьких аліквотних проб. Вітаміни додаються до середовища       |
|незадовго до його використання.                                           |
|Примітка 1: Щоб уникнути випадання солей в осад під час приготування      |
|кінцевого середовища, слід додати аліквотні проби вихідних розчинів до    |
|приблизно 500-800 мл деонізованної води, а потім довести до 1 літра.      |
|Примітка 2: Перший друкований опис середовища М4 можна знайти у           |
|Б.П.Елендта (1990 р.) Нестача селену у ракоподібних; ультраструктурний    |
|підхід до антенального порушення у Daphnia magna Straus. Протоплазма, 154,|
|ст. 25-33.                                                                |
----------------------------------------------------------------------------

Додаток 2

АНАЛІЗ ЗАГАЛЬНОГО ОРГАНІЧНОГО ВУГЛИЦЮ (ЗОВ) ТА СТВОРЕННЯ НОМОГРАМИ ВМІСТУ ЗОВ У ВОДОРОСТЕВІЙ ПІДКОРМЦІ

Загальновизнаним є той факт, що зазвичай вміст вуглецю у водоростевій підкормці не можливо виміряти прямо із співвідношень (тобто номограм) із сурогатними вимірами, такими як кількість клітин у водоростях або їхня здатність поглинати світло.

ЗОВ правильніше вимірювати через окиснення при високих температурах, ніж через ультрафіолетове випромінювання або персульфатні методи. (Див. Ефективне визначення загального органічного вуглецю, загальної потреби кисню та схожих складових 1979 р., HMSO 1980 р.; 49 Хай Холборн, Лондон WC1V 6HB).

Для створення номограми, водорості слід відділити від живильного середовища за допомогою центрифугування з послідуючим повторним підвішуванням у дистильованій воді. Виміряйте сурогатний коефіцієнт та концентрацію ЗОВ в трьох екземплярах кожного зразку. Слід проаналізувати чисті зразки дистильованої води та концентрацію ЗОВ, відраховану від концентрації ЗОВ зразків водоростей.

Номограма має бути лінією, що проходить через потрібну область концентрацій вуглецю. Нижче наведені приклади номограм.

Примітка: Ці приклади не слід використовувати для перерахувань; важливим є те, щоб лабораторії готували свої власні номограми.

( 994_b14 )

Додаток 3

ЗРАЗОК ЛИСТА ДАНИХ ДЛЯ РЕЄСТРАЦІЇ ВІДНОВЛЕННЯ СЕРЕДОВИЩА, ФІЗИЧНИХ/ХІМІЧНИХ ПОТОЧНИХ ДАНИХ, ПІДКОРМКИ, РЕПРОДУКЦІЇ DAPHNIA ТА СМЕРТНОСТІ СЕРЕД ДОРОСЛИХ ОСОБИН

N                 Дата            Копія:      Середовище:     Тип                 Тестова         Номінальна
 експерименту:     початку:                                    харчування:         речовина:       концентрація:
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
|День         | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10| 11| 12| 13| 14| 15| 16| 17| 18| 19| 20| 21|         |         |
|-------------+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---------+---------|
|Відновлення  |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |         |         |
|середовища   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |         |         |
|(відмітити)  |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |         |         |
|-------------+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---------+---------|
|PH(1)        |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |новий    |         |
|             |---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---------+---------|
|             |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |старий   |         |
|-------------+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---------+---------|
|O  мг/л(1)   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |новий    |         |
| 2           |---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---------+---------|
|             |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |старий   |         |
|-------------+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---------+---------|
|Температура  |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |новий    |         |
|(град.C)(1)  |---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---------+---------|
|             |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |старий   |         |
|-------------+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---------+---------|
|Передбачене  |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |         |         |
|харчування   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |         |         |
|(відмітити)  |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |         |         |
|-------------+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---------+---------|
|Кількість    |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |         |Загалом  |
|живих        |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |         |         |
|нащадків(2)  |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |         |         |
|-------------+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---------+---------|
|Посудина 1   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |         |         |
|-------------+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---------+---------|
|2            |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |         |         |
|-------------+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---------+---------|
|3            |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |         |         |
|-------------+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---------+---------|
|4            |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |         |         |
|-------------+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---------+---------|
|5            |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |         |         |
|-------------+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---------+---------|
|6            |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |         |         |
|-------------+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---------+---------|
|7            |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |         |         |
|-------------+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---------+---------|
|8            |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |         |         |
|-------------+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---------+---------|
|9            |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |         |         |
|-------------+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---------+---------|
|10           |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |         |         |
|-------------+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---------+---------|
|             |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |Загалом  |         |
|-----------------+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---------+---------|
|Сукупна          |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |         |         |
|смертність       |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |         |         |
|серед дорослих   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |         |         |
|особин(3)        |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |   |         |         |
|-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------|
|(1) Вкажіть, яка посудина використовувалась для експерименту.                                                            |
|(2) Відмічайте смерть будь-якого дорослого живого організму літерою "С" у відповідній клітинці.                          |
|(3) Відмічайте втрачене потомство літерами "ВП" у відповідній клітинці.                                                  |
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Додаток 4

ЗРАЗОК ЛИСТА ДАНИХ ДЛЯ РЕЄСТРАЦІЇ РЕЗУЛЬТАТІВ ХІМІЧНОГО АНАЛІЗУ

(а) Виміряні концентрації

------------------------------------------------------------------
| Номінальна  | Зразок тижня 1 | Зразок тижня 2 | Зразок тижня 3 |
|концентрація:|----------------+----------------+----------------|
|             | Свіжий | Старий| Свіжий | Старий| Свіжий | Старий|
|-------------+--------+-------+--------+-------+--------+-------|
|             |        |       |        |       |        |       |
|-------------+--------+-------+--------+-------+--------+-------|
|             |        |       |        |       |        |       |
|-------------+--------+-------+--------+-------+--------+-------|
|             |        |       |        |       |        |       |
|-------------+--------+-------+--------+-------+--------+-------|
|             |        |       |        |       |        |       |
|-------------+--------+-------+--------+-------+--------+-------|
|             |        |       |        |       |        |       |
------------------------------------------------------------------

(b) Виміряні концентрації у процентному співвідношенні до номінальної

------------------------------------------------------------------
| Номінальна  | Зразок тижня 1 | Зразок тижня 2 | Зразок тижня 3 |
|концентрація:|----------------+----------------+----------------|
|             | Свіжий | Старий| Свіжий | Старий| Свіжий | Старий|
|-------------+--------+-------+--------+-------+--------+-------|
|             |        |       |        |       |        |       |
|-------------+--------+-------+--------+-------+--------+-------|
|             |        |       |        |       |        |       |
|-------------+--------+-------+--------+-------+--------+-------|
|             |        |       |        |       |        |       |
|-------------+--------+-------+--------+-------+--------+-------|
|             |        |       |        |       |        |       |
|-------------+--------+-------+--------+-------+--------+-------|
|             |        |       |        |       |        |       |
------------------------------------------------------------------

Додаток 5

РОЗРАХУНОК СЕРЕДНЬОЇ ХРОНОЛОГІЧНОЇ ВЕЛИЧИНИ

Середня хронологічна величина

Відомо, що протягом часу між відновленням середовища концентрація пробної речовини може знижуватися, тому необхідно визначити, яку концентрацію обрати в якості зразка із ряду концентрацій, в яких перебувала материнська Daphnia. Вибір має засновуватися як на біологічних, так і на статистичних засадах. Наприклад, якщо вважається, що на репродукцію більш впливає максимальна концентрація, тоді слід використовувати максимальну концентрацію. Хоча, якщо важливішим вважається сумарний чи більш довгостроковий ефект токсичної речовини, тоді доречнішою буде середня концентрація. У цьому випадку, підходящим для використання середнім значенням буде середня хронологічна величина концентрації, так як вона враховує коливання у поточній концентрації протягом певного часу.

Малюнок 1: Зразок середньої хронологічної величини ( 994_b14 )

Малюнок 1 показує зразок (спрощеного) випробування тривалістю в сім днів з відновленням середовища на 0, 2 та 4 днях.

Тонка зигзагоподібна лінія відображає концентрацію в будь-який момент часу. Припускається, що зниження концентрації слідує за процесом експоненціального розпаду.

Шість точок на графіку відображають концентрації, що спостерігаються при вимірюванні на початку та в кінці кожного періоду відновлення.

Товста суцільна лінія вказує на положення середньої хронологічної величини.

Середня хронологічна величина розраховується так, щоб площа під середньою хронологічною величиною дорівнювала площі під кривою концентрації. Розрахунки для вищенаведеного зразку проілюстровані у Таблиці 1.

Таблиця 1: розрахунки середньої хронологічної величини

-------------------------------------------------------------------------------------------------
|Відновлення|  Дні |Концентрація 0|Концентрація 1|Ln (Концентрація 0)|Ln (Концентрація 1)| Площа|
|     N     |(days)|   (Conc 0)   |   (Conc 1)   |                   |                   |(Area)|
|-----------+------+--------------+--------------+-------------------+-------------------+------|
|     1     |  2   |    10,000    |    4,493     |       2,303       |       1,503       |13,767|
|-----------+------+--------------+--------------+-------------------+-------------------+------|
|     2     |  2   |    11,000    |    6,037     |       2,398       |       1,798       |16,544|
|-----------+------+--------------+--------------+-------------------+-------------------+------|
|     3     |  3   |    10,000    |    4,066     |       2,303       |        1,403      |19,781|
|--------------------------------------------------------------------+-------------------+------|
|Загальна кількість днів: 7                                          |Загальна площа     |50,091|
|                                                                    |-------------------+------|
|                                                                    |Середня            |7,156 |
|                                                                    |хронологічна       |      |
|                                                                    |величина           |      |
-------------------------------------------------------------------------------------------------

Days - кількість днів у періоді відновлення.

Conc 0 - концентрація, виміряна на початку кожного періоду відновлення.

Conc 1 - концентрація, виміряна в кінці кожного періоду відновлення.

Ln (Conc 0) - натуральний логарифм від Концентрації 0.

Ln (Conc 1) - натуральний логарифм від Концентрації 1.

Area - площа під експоненціальною кривою для кожного періоду відновлення. Вона вираховується за формулою:

Conc 0 - Conc 1
    Area = ------------------------- x Days
           Ln (Conc 0) - Ln (Conc 1)

Середня хронологічна величина дорівнює загальній площі розділеній назагальну кількість днів.

Звичайно, для дослідження з визначення репродуктивності Daphnia таблицю слід розширити до 21 дня.

Зрозуміло, що коли спостереження робляться тільки на початку та в кінці кожного періоду відновлення, то неможливо підтвердити, що процес розпаду, фактично, є експоненціальним. Інша крива призведе до інших розрахунків Площі. Хоча процес експоненціального розпаду не є неможливим та, вірогідно, за відсутності іншої інформації ця крива є найбільш придатною для використання.

Хоча, якщо в процесі хімічного аналізу не було знайдено жодної речовини в кінці періоду відновлення, слід провести контрольне випробування. Поки не вдасться визначити, як швидко речовина зникає із рідини, неможливо буде отримати реалістичну площу під кривою, а отже, і прийнятну середню хронологічну величину.

C.21. ҐРУНТОВІ МІКРООРГАНІЗМИ: ДОСЛІДЖЕННЯ ТРАНСФОРМАЦІЇ АЗОТУ

1. МЕТОД

Метод цього дослідження повторює метод OECD TG 216 (2000).

1.1. ВСТУП

Цей метод дослідження описує лабораторний метод, створений для дослідження довгострокових впливів хімікатів, за умови їх одноразової дії, на активність трансформації азоту ґрунтовими мікроорганізмами. Дослідження, головним чином, засноване на рекомендаціях Європейської та Середземноморської організації із захисту рослин (1). Хоча, інші інструкції, що включають рекомендації Німецького біологічного федерального відомства (2), Управління охорони навколишнього середовища США (3), Товариства токсикології та хімії навколишнього середовища (4) та Міжнародної організації із стандартизації (5), теж слід брати до уваги. На семінарі Організації економічного співробітництва та розвитку (OECD) з питань відбору ґрунтів/мулів, який проходив у Бельджирате, Італія в 1995 р. (6), була погоджена кількість та тип ґрунтів, які можна застосовувати у цьому випробуванні. Рекомендації стосовно збору, обробки та зберігання зразків ґрунтів засновуються на Інструктивному документі МОС (7) та рекомендаціях семінару в Бельджирате. При встановленні та оцінці токсичних характеристик пробних речовин може вимагатись визначення їх впливів на мікробну активність в ґрунтах, наприклад, коли потрібні дані про можливі побічні дії пестицидів на мікрофлору ґрунтів, або коли очікується, що ґрунтові мікроорганізми можуть зазнати впливу не пестицидів, а інших хімікатів. Дослідження трансформації азоту проводиться з метою визначення впливів таких хімікатів на мікрофлору ґрунтів. При дослідженнях агрохімікатів (наприклад, пестицидів, добрив, лісохімічних продуктів) проводяться дослідження як трансформації азоту, так і трансформації вуглецю. При випробуванні не агрохімікатів достатньо буде лише дослідження трансформації азоту. Хоча, якщо при проведенні дослідження трансформації азоту для таких хімікатів значення EK потрапляє у 50

діапазон  значень  для інгібіторів нітрифікації,  які випускаються
серійно,  (наприклад,  нітрапірін),  то можна провести дослідження
трансформації вуглецю з метою збору додаткової інформації.

Ґрунти складаються із живих та неживих компонентів, які існують у складних та неоднорідних сумішах. Мікроорганізми відіграють важливу роль у розпаді та трансформації органічного субстрату в родючих ґрунтах, в яких багато видів мікроорганізмів впливають на різні аспекти родючості ґрунтів. Будь-яке довгострокове втручання в ці біохімічні процеси може потенційно завадити кругообігу поживних речовин і це може змінити родючість ґрунту. Трансформація вуглецю та азоту відбувається у всіх родючих ґрунтах. Хоча скупчення мікробів, відповідальних за ці процеси, різняться для кожного ґрунту, трансформації проходять по суті однаково.

Описуваний метод дослідження створений для того, щоб визначати довгострокові несприятливі впливи речовини на процес трансформації азоту в аеробному верхньому шарі ґрунтів. Метод дослідження також дозволяє оцінювати впливи речовин на трансформацію вуглецю мікрофлорою ґрунту. Утворення нітрату являється результатом розпаду хімічних зв'язків вуглець-азот. Отже, якщо в обробленому та контрольному ґрунтах виявляються однакові рівні виробництва нітрату, досить вірогідним є той факт, що основні процеси розпаду вуглецю проходять нормально та активно. Поживне середовище для дослідження (мелене люцернове борошно) має сприятливе співвідношення вуглецю до азоту (зазвичай між 12/1 та 16/1). Завдяки цьому, нестача вуглецю зменшується протягом дослідження та, якщо скупчення мікробів будуть ушкоджені хімікатом, то вони зможуть відновитися протягом 100 днів.

Дослідження, із яких був розроблений цей метод дослідження, спочатку були створені для речовин, в яких можна було передбачити, яка їх кількість проникне у ґрунт. Наприклад, як у випадку з пестицидами, для яких встановлена норма використання. Для агрохімікатів достатнім є дослідження двох доз відповідно до очікуваних чи передбачуваних норм використання. Агрохімікати можуть випробуватися як активні речовини (а.р.) або як вироблені продукти. Хоча, дослідження не обмежується лише агрохімікатами. Змінюючи кількість пробної речовини, що застосовується до ґрунту, разом із способом оцінки даних, дослідження можливо також застосовувати до хімікатів, в яких не можна передбачити ту їх кількість, що проникне в ґрунт. Таким чином, при роботі з хімікатами, що не є агрохімікатами, визначаються впливи ряду концентрацій на трансформацію азоту. Дані цих випробувань використовуються для побудови кривої залежності "доза-ефект" та розрахунку значень EK , деx визначається у % впливу. x

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ

Трансформація азоту: це повне розкладання мікроорганізмами органічної речовини, що містить азот, яке відбувається через процес амоніфікації та нітрифікації, до відповідного неорганічного кінцевого продукту у вигляді нітрату.

ЕК (ефективна концентрація): це така концентрація пробної x

речовини у ґрунті, що дає x процент затримки трансформації азоту в
нітрат.

ЕК (середнє значення ефективної концентрація): це така 50

концентрація пробної речовини у ґрунті,  що дає 50 процентів (50%)
затримки трансформації азоту в нітрат.

1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ

Відсутні.

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

До просіяного ґрунту додається мелене рослинне борошно, а також він або обробляється пробною речовиною, або залишається не обробленим (контрольний зразок). Якщо випробовуються агрохімікати, рекомендується взяти щонайменше дві пробні концентрації, і їх слід обирати орієнтуючись на найвищу концентрацію, застосування якої очікується в полі. Після 0, 7, 14 днів та 28 днів інкубації, зразки обробленого та контрольного ґрунтів екстрагуються через додавання відповідного розчинника, і у витягах визначаються кількості нітрату. Рівень утворення нітрату в оброблених зразках порівнюється із рівнем в контрольних зразках, і вираховується процентне відхилення рівня оброблених зразків від рівня контрольних. Всі дослідження тривають щонайменше 28 днів. Якщо на 28-й день різниця між обробленим та необробленими ґрунтами дорівнює або більша за 25%, вимірювання продовжуються протягом ще 100 днів. Якщо випробовуються не агрохімікати, ряд концентрацій пробної речовини додається до зразків ґрунту, та після 28 днів інкубації вимірюються кількості утвореного в оброблених та контрольних зразках нітрату. Результати випробувань з декількома концентраціями аналізуються за допомогою моделі регресії, та розраховуються значення EK (тобто EK , EK та/або EK ). Див. x 50 25 10

визначення.

1.5. ДОСТОВІРНІСТЬ ДОСЛІДЖЕННЯ

Оцінка результатів дослідження агрохімікатів засновуються на порівняно незначних різницях (тобто середнє значення +- 25%) між концентраціями нітрату в оброблених та контрольних зразках ґрунтів, відповідно великі розходження між контрольними зразками можуть вказувати на неправильні результати. Тому, розходження між повторними пробами контрольних зразків має бути меншим за +- 15%.

1.6. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

1.6.1. Обладнання

Використовуються склянки для дослідження, зроблені з хімічно інертного матеріалу. Вони повинні мати підходящу місткість у відповідності до процедури, що використовується для інкубації ґрунтів, тобто для загальної інкубації або як ряду окремих зразків ґрунту (Див. Розділ 1.7.1.2). Слід подбати про зменшення втрати води та надати можливість газообміну відбуватися під час дослідження (наприклад, можна накрити склянки для дослідження пористою поліетиленовою плівкою). Коли випробовуються леткі речовини, слід використовувати герметичні та газонепроникні склянки. Вони повинні мати такий розмір, щоб приблизно одна четверть їх об'єму була заповнена зразком ґрунту.

Використовується стандартне лабораторне обладнання, включаючи наступне:

- змішувальний апарат: механічний змішувач або подібне обладнання;

- центрифуга (3000 г) або фільтр (з фільтрувальним папером без нітрату);

- інструмент з відповідною чутливістю та відтворюваністю для аналізу нітрату.

1.6.2. Відбір ґрунтів та їх кількість

Використовується один єдиний тип ґрунту. Рекомендовані наступні характеристики ґрунту:

- вміст піску: не менше ніж 50% і не більше ніж 75%,

- водневий показник: 5,5-7,5,

- вміст органічного вуглецю: 0,5-1,5%,

- слід виміряти мікробіальну біомасу (8)(9) і вміст у ній вуглецю має бути не меншим за 1% від загального вмісту органічного вуглецю в ґрунті.

У більшості випадках, ґрунт з такими характеристиками представляє найгірший варіант, так як поглинання пробного хімікату є мінімальним, а його доступність для мікрофлори є максимальною. Відтак, дослідження з іншими ґрунтами загалом не потрібні. Хоча, в деяких випадках може виникнути необхідність використати додатковий ґрунт - наприклад, коли очікується значне використання пробної речовини на певних типах ґрунтів, як то на кислотних лісних ґрунтах, або коли хімікати є електростатично зарядженими.

1.6.3. Збір та зберігання зразків ґрунту

1.6.3.1. Збір

Слід отримати доступ до детальної інформації стосовно історії місця, з якого збирається пробний ґрунт. Інформація має включати точне розташування, рослинний покрив, дати обробок пестицидами, обробки органічними та неорганічними добривами, додавання біологічних матеріалів чи випадкові забруднення. Місце, обране для збору ґрунту, має бути одним з таких, що можуть використовуватись протягом тривалого часу. Підходять багаторічні пасовища, поля, які щорічно засіваються зерновими культурами (крім кукурудзи), або густо засіяні зелені компостні купи. Обране місце для збору зразків не повинно оброблятися пестицидами щонайменше протягом одного року до збору зразків. Також, не повинно застосовуватися жодного органічного добрива щонайменше протягом шести останніх місяців. Відповідно до вимог, використання мінерального добрива допускається лише за умови, що зразки посівів та ґрунту не будуть братися щонайменше протягом трьох місяці з моменту застосування добрива. Не слід використовувати ґрунт, оброблений добривами з відомими біоцидними ефектами (наприклад, цианомідом кальцію).

Не слід брати зразки під час або відразу після довгих періодів (більше за 30 днів) посухи чи підтоплення. У випадку орних ґрунтів зразки збираються з глибини від 0 до 20 см. У випадку луки (пасовища) або інших ґрунтів, які не орються протягом більш довгих періодів часу (щонайменше один посівний сезон), максимальна глибина збору зразків може бути дещо більшою за 20 см (напр., до 25 см).

Зразки ґрунту слід транспортувати, використовуючи такі склянки та за таких температурних умов, які б гарантували, що початкові якості ґрунту не зазнають значних змін.

1.6.3.2. Зберігання

Бажаним є використання свіжозібраних ґрунтів. Якщо не можливо уникнути зберігання у лабораторії, ґрунти можна зберігати в темряві при температурі в 4 +- 2 град.C максимум протягом трьох місяців. Під час зберігання ґрунтів потрібно забезпечити аеробні умови. Якщо ґрунти збираються в районах, де вони перебувають в замерзлому стані щонайменше протягом трьох місяців на рік, слід розглянути можливість їх зберігання при температурі від мінус 18 град.C до мінус 22 град.C. Мікробіотична біомаса ґрунту, що зберігається, вимірюється перед початком кожного експерименту, і вміст вуглецю в біомасі має бути не меншим за 1% від загального вмісту органічного вуглецю в ґрунті (Див. Розділ 1.6.2).

1.6.4. Обробка та приготування ґрунту до дослідження

1.6.4.1. Підготовка до інкубації

Якщо ґрунт зберігався (Див. Розділ 1.6.3.2.), рекомендується провести його підготовку до інкубації протягом періоду від двох до 28 днів. Температура та вологість ґрунту під час підготовки до інкубації мають бути такими, як і під час дослідження (Див. Розділ 1.6.4.2 та 1.7.1.3).

1.6.4.2. Фізико-хімічні властивості

Ґрунт вручну очищується від великих предметів (напр., каміння, частин рослин, тощо), потім просіюється із зволоження для запобігання надмірному пересиханню до розміру часточок менше чи рівному 2 мм. Вміст вологи у зразку ґрунту має бути доведений за допомогою дистильованої або деіонізованої води до значення між 40% та 60% максимально можливої здатності утримувати воду.

1.6.4.3. Збагачення органічними речовинами

Ґрунт слід збагатити підходящою органічною речовиною, напр., меленим зеленим люцерновим борошном (основна складова: Medicago sativa), із співвідношенням C/N між 12/1 та 16/1. Рекомендоване співвідношення люцерна-ґрунт - 5 г люцерни на кілограм ґрунту (сухої ваги).

1.6.5. Приготування пробної речовини для застосування на ґрунті

Зазвичай пробну речовину застосовують, використовуючи середовище-носій. Цим середовищем може бути вода (для водорозчинних речовин) або інертна тверда речовина як, наприклад, сухий кварцовий пісок (розмір часточки: 0,1-0,5 мм). Не слід використовувати інші рідинні середовища-носії, окрім води (напр., органічні розчинники такі як ацетон, хлороформ), адже вони можуть зашкодити мікрофлорі. Якщо в якості середовища-носія використовується пісок, то його можна наситити пробною речовиною, розчиненою або підвішеною у відповідному розчиннику. В таких випадках розчинник слід видалити за допомогою випаровування перед змішування із ґрунтом. Для оптимального розповсюдження пробної речовини у ґрунті рекомендується дотримуватися співвідношення 10 г піску на кілограм ґрунту (сухої ваги). Контрольні зразки обробляються лише відповідною кількістю води та/або кварцового піску.

При випробуванні летких хімікатів слід, на скільки це можливо, під час обробки ґрунту уникати втрат речовини та слід намагатися забезпечити однорідне розповсюдження речовини в ґрунті (напр., пробну речовину слід ввести в ґрунт в декількох місцях).

1.6.6. Пробні концентрації

При випробуванні агрохімікатів слід використовувати хоча б дві концентрації. Найнижча концентрація має відображати щонайменше максимальну кількість, яка може потрапити до ґрунту за звичайних умов, тоді як найвища концентрація має бути подвоєною найнижчою концентрацією. Концентрації пробних речовин, які додаються до ґрунту, розраховуються з припущенням, що проникнення на глибину в 5 см відбуватиметься рівномірно, а розрахункова густина ґрунту дорівнює 1,5. Для агрохімікатів, які застосовуються безпосередньо до ґрунту, або для хімікатів, для яких кількість, що досягне ґрунту, можливо передбачити, рекомендуються максимальні концентрації Прогнозованої концентрації в навколишньому середовищі (ПКНС) та в п'ять разів більша концентрація. Речовини, які планується застосовувати до ґрунтів декілька разів на сезон, слід випробовувати при концентраціях, отриманих шляхом множення ПКНС на максимально очікувану кількість застосувань речовини. Хоча, найвища пробна концентрація не повинна перевищувати максимальну одноразову концентрацію більше ніж у 10 разів. Якщо випробовуються не агрохімікати, то використовується геометричний ряд щонайменше з п'яти концентрацій. Пробні концентрації повинні включати такий діапазон, щоб можливо було визначити значення ЕК . x

1.7. ПРОВЕДЕННЯ ДОСЛІДЖЕННЯ

1.7.1. Умови впливу

1.7.1.1. Обробка і контроль

Якщо випробовуються агрохімікати, то ґрунт розділяється на три рівні порції. Дві порції змішуються з середовищем-носієм, що містить продукт, а третя порція змішується з середовищем-носієм без продукту (контрольний зразок). Рекомендується мінімум три повторні проби як для оброблених так і для необроблених ґрунтів. Якщо випробовуються не агрохімікати, то ґрунт розділяється на шість рівних порцій. П'ять зразків перемішуються із середовищем-носієм, що містить пробну речовину, а шостий зразок перемішується з середовищем-носієм без хімікату. Рекомендується три повторні проби оброблених та контрольних зразків. Слід подбати про забезпечення однорідного розповсюдження пробної речовини в оброблених зразках ґрунту. Під час перемішування слід уникати пресування та злипання ґрунту.

1.7.1.2. Інкубація зразків ґрунту

Інкубація зразків ґрунту може проводитися двома способами: загальна інкубація всіх оброблених і необроблених зразків ґрунту або ряд окремих, однакових за розміром оброблених і необроблених частин зразків ґрунту. Хоча, коли випробовуються леткі речовини, дослідження слід проводити лише з рядом окремих частин зразків. Коли проводиться загальна інкубація ґрунтів, готуються великі об'єми оброблених та необроблених ґрунтів, та, якщо це потрібно в процесі дослідження, беруться частини зразків для аналізу. Кількість ґрунту, що спочатку готується для обробки та контролю, залежить від розміру частин зразків, кількості повторних проб, що використовуються для аналізу, та передбачувана максимальна кількість відбору зразків. При загальній інкубації, ґрунти слід ретельно перемішати перед вибіркою частин зразків. При інкубації ряду окремих зразків ґрунту, кожен оброблений та необроблений ґрунт розділяється на потрібну кількість частин зразків, і вони належним чином обробляються. В експериментах, в яких кількість відбору зразків ґрунту може перевищувати два рази, слід підготувати достатню кількість частин зразків, щоб вистачило на всі повторні проби та всі рази відбору ґрунту. Слід проводити інкубацію за аеробних умов щонайменше трьох повторних проб зразків ґрунту (Див. Розділ 1.7.1.1). При випробуванні летких хімікатів дослідження слід проводити лише з рядом окремих частин зразків.

1.7.1.3. Умови дослідження та тривалість

Дослідження проводиться в темряві та при кімнатній температурі 20 +- 2 град.C. Під час дослідження вміст вологи в зразках ґрунту має підтримуватися на рівні між 40% та 60% максимально можливої здатності ґрунту утримувати воду (Див. Розділ 1.6.4.2), з можливою поправкою на +- 5%. У разі потреби можна додавати дистильовану, деіонізовану воду.

Мінімальна тривалість дослідження 28 днів. Якщо випробовуються агрохімікати, то порівнюються рівні утворення нітрату в оброблених та контрольних зразках. Якщо вони різняться більше ніж на 25% на 28 день, то дослідження продовжується поки не буде досягнута різниця рівна або менша ніж 25%, або максимально протягом 100 днів. Для не агрохімікатів, дослідження закінчується через 28 днів. На 28 день визначається кількість нітрату в оброблених та контрольних зразках ґрунту та розраховуються значення ЕК . x

1.7.2. Відбір проб та аналіз грунтів

1.7.2.1. Розклад відбору проб

Якщо досліджуються агрохімічні речовини, проби ґрунтів аналізують на нітрат на 0-ий, 7-ий, 14-ий та 28-ий день. Якщо дослідження тривале, подальші вимірювання необхідно робити через кожні два тижні після 28-денного терміну.

Якщо досліджуються неагрохімічні речовини, використовують щонайменше 5 концентрацій, а проби ґрунтів аналізують на нітрат на початку (день 0) та наприкінці тестування (28 днів). Якщо необхідно, можна зробити проміжні вимірювання, наприклад, на сьомий день. Дані, які отримали у 28-й день, використовують для визначення величини ефективної концентрації для хімічної речовини. При потребі можна використати дані, отримані зі зразка нульового дня, для звіту про початкову кількість нітрату у ґрунті.

1.7.2.2. Аналіз проб ґрунту

Кількість нітрату, який утворюється в кожній дослідній та контрольній повторній пробі, визначається в однаковий час вибірки. Нітрат видобувається з ґрунту завдяки струшуванню проб з відповідним екстракційним розчинником, наприклад, 0,1 моль хлоридно-калієвого розчинника. Рекомендується співвідношення 5 мл KCl розчинника на 1 г сухої ваги ґрунту. Щоб провести ефективну екстракцію, об'єм ґрунту та екстракційного розчинника не повинен перевищувати половину ємкості. Суміші струшуються зі швидкістю 150 обертів за хвилину протягом години. Далі вони проходять центрифугування або фільтрацію, і рідкі фази аналізуються на нітрат. Однорідні рідкі екстракти можна зберігати до проведення аналізу при температурі 20 +- 5 град.C до шести місяців.

2. ДАНІ

2.1. ОБРОБКА РЕЗУЛЬТАТІВ

Якщо досліджуються агрохімічні речовини, необхідно записувати кількість нітрату, який утворився в усіх повторних пробах ґрунту, а середні значення усіх повторних проб подавати у формі таблиці. Рівень трансформації нітрогену треба визначити за відповідними і загальноприйнятими статистичними методами (напр., F-критерій, 5% рівня значущості). Кількість утвореного нітрату виражається в мг нітрату/кг сухої ваги ґрунту/день. Рівень утворення нітрату в кожній дослідній пробі порівнюється з рівнем нітрату у контрольній пробі, і підраховується процент відхилення від останньої.

Якщо досліджуються неагрохімічні речовини, необхідно визначити кількість нітрату, який утворюється в усіх повторних пробах, і побудувати криву залежності доза-ефект для визначення величин ефективної концентрації. Кількість нітрату (тобто мг нітрату/кг сухої ваги ґрунту), який знайдено в дослідних пробах після 28 днів, порівнюється з кількістю нітрату у контрольних пробах. За допомогою цих даних визначаються процентні показники пригнічення для кожної дослідної концентрації. Ці процентні співвідношення показують залежність від концентрації, а потім за допомогою статичних методів розраховуються величини ефективної концентрації. Довірчі границі (p = 0,95) для розрахованої ефективної концентрації також визначаються за допомогою стандартних методів (10)(11)(12).

Досліджувані речовини, які містять багато нітрогену, можуть впливати на кількість нітрату, що утворюється протягом дослідження. Якщо ці речовини досліджуються у високих концентраціях (наприклад, хімічні речовини, які використовуватимуться повторно), треба брати додаткові контрольні проби (тобто ґрунт плюс досліджувана речовина, але без рослинної муки). Для розрахунку ефективної концентрації необхідно враховувати дані, отримані в процесі контрольних заходів.

2.2. ІНТЕРПРЕТАЦІЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

Коли визначені результати досліджень з агрохімічними речовинами, а різниця між співвідношенням показників утворення нітрату нижньої проби (тобто максимально очікувана концентрація) та контрольної проби дорівнює або менше 25% у будь-який час вибірки після 28-ого дня, продукт реакції можна оцінити як такий, що не має довгострокового впливу на трансформацію нітрогену в ґрунтах. Коли визначаються результати досліджень неагрохімічних речовин, то використовуються показники ефективної концентрації EK , EK та/чи EK . 50 25 10

3. ЗВІТ

Звіт дослідження має включати наступну інформацію:

Повна ідентифікація досліджуваного ґрунту містить дані про:

- географічні координати місця забору (широта, довгота),

- інформація про історію місця (тобто рослинний покрив, обробка речовинами для захисту сільськогосподарських культур, удобрювання, випадкове забруднення тощо),

- характер використання (наприклад, сільськогосподарські угіддя, ліс тощо),

- глибина відбору проб (см),

- вміст піску/мулу/глини (% сухої ваги),

- pH (води),

- вміст органічного вуглецю (% сухої ваги),

- вміст нітрогену (% сухої ваги),

- початкова концентрація нітрату (мг нітрату/кг сухої ваги),

- об'єм катіонування (мкмоль/кг),

- мікробна біомаса по відношенню до проценту усього органічного вуглецю,

- довідка про методи, які використовувались для визначення кожного параметру,

- уся інформація, що пов'язана із збиранням та зберіганням проб ґрунту,

- деталі попередньої інкубації ґрунту, якщо є.

Досліджувана речовина:

- фізична природа і, де необхідно, фізико-хімічні властивості,

- хімічні ідентифікаційні дані, де необхідно, зокрема структурна формула, чистота (наприклад, процент активного інгредієнта для продукції, що захищає сільськогосподарські культури), вміст нітрогену.

Субстрат:

- джерело субстрату,

- склад (тобто люцернова мука, люцернова зелена мука),

- вміст вуглецю, азоту (% сухої ваги),

- діаметр отворів решета (мм).

Умови дослідження:

- деталі поліпшення ґрунту органічним субстратом,

- кількість використаних досліджуваних хімічних речовин і, де необхідно, оцінка вибраних концентрацій,

- деталі нанесення досліджуваної речовини на ґрунт,

- інкубаційна температура,

- показник вологості ґрунту на початку і протягом дослідження,

- метод інкубації ґрунту (тобто великими партіями чи серією підвибірок),

- кількість повторних проб,

- час вибірки,

- метод, що використовується для екстракції нітрату з ґрунту.

Результати:

- аналітичний метод і оснащення для аналізу нітрату,

- табличні дані, які містять індивідуальні й середні показники для вимірювань нітрату,

- різниця між повторними дослідними й контрольними пробами,

- пояснення корекцій в підрахунках, якщо необхідно,

- процентна різниця у показниках утворення нітрату у кожний час відбору, чи, якщо можливо, показник ефективної концентрації EK з 95% довірчою границею, інші показники ефективної 50

концентрації (тобто EK   чи EK  ) з довірчим інтервалом,  і графік
                      25      10
кривої залежності доза-ефект,

- статистична обробка результатів,

- уся інформація та спостереження, які можуть бути корисними для тлумачення результатів.

4. ПОСИЛАННЯ

(1) EPPO, (1994) Decision-Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: Soil Microflora. EPPO Bulletin 24: 1-16, 1994.

(2) BBA, (1990) Effects on the Activity of the Soil Microflora. BBA Guidelines for the Official Testing of Plant Protection Products, VI, 1-1 (2nd eds., 1990).

(3) EPA (1987) Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40 CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Guidelines; Proposed rule. September 28, 1987.

(4) SETAC-Europe, (1995) Procedures for assessing the environmental fate and ecotoxicity of pesticides, Ed. M.R. Lynch, Pub. SETAC-Europe, Brussels.

(5) ISO/DIS 14238 (1995) Soil Quality - Determination of Nitrogen Mineralisation and Nitrification in Soils and the Influence of Chemicals on these Processes. Technical Committee ISO/TC 190/SC 4: Soil Quality - Biological Methods.

(6) OECD, (1995) Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 18-20 January 1995.

(7) ISO 10381-6 (1993) Soil quality - Sampling. Guidance on the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.

(8) ISO 14240-1, (1997) Soil quality - Determination of soil microbial biomass - Part 1: Substrate-induced respiration method.

(9) ISO 14240-2, (1997) Soil quality - Determination of soil microbial biomass - Part 2: Fumigation-extraction method.

(10) Litchfield, J.T. and Wilcoxon F., (1949) A simplified method of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, p. 99-113.

(11) Finney, D.J., (1971) Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, London and New-York.

(12) Finney, D.J., (1978) Statistical Methods in biological Assay. Griffin, Weycombe, UK

C.22. ГРУНТОВІ МІКРООРГАНІЗМИ: ДОСЛІДЖЕННЯ ТРАНСФОРМАЦІЇ ВУГЛЕЦЮ

1. МЕТОД

Цей метод є повторенням OECD TG 217 (2000) (Нормативи досліджень ОЕСР N 217 (2000)

1.1. ВСТУП

Цей метод дослідження описує лабораторний метод, розроблений для вивчення довгострокового потенційного впливу одного контакту продукції для захисту сільськогосподарських культур та можливо інших хімічних речовин на активність трансформації вуглецю ґрунтових мікроорганізмів. Дослідження в основному базується на рекомендаціях Європейської та середземноморської організації захисту рослин (1). Однак, бралися до уваги й інші нормативи, зокрема нормативи німецької біологічної служби (2), американського Агентства захисту навколишнього середовища (3) та Міжнародної спілки з токсикології та хімії навколишнього середовища (4). На Семінарі з добору ґрунту/осаду, що проводився у Белгіраті (Італія) у 1995 році, було визначено, яку кількість і який тип ґрунтів потрібні для цього випробовування. Рекомендації стосовно збирання, оброблення та зберігання ґрунтів базуються на нормативному документі ISO (6) й рекомендаціях з семінару у Белгіраті.

При оцінюванні токсичних властивостей досліджуваних речовин може виникнути потреба у визначенні впливу на ґрунтову мікробну активність, наприклад тоді, коли необхідна інформація про можливі побічні ефекти продукції для захисту сільськогосподарських культур на ґрунтову мікрофлору, або коли очікується контакт ґрунтових мікроорганізмів з іншим, відмінними від продукції для захисту сільськогосподарських культур хімічними речовинами. Дослідження трансформації вуглецю проводиться для визначення впливу таких хімічних речовин на ґрунтову мікрофлору. Якщо вивчаються агрохімічні речовини (наприклад, продукція для захисту продукції для захисту сільськогосподарських культур, добрива, хімічні речовини, які використовуються у лісовому господарстві), то проводяться дослідження трансформації як вуглецю, так і нітрогену. Якщо вивчаються неагрохімічні речовини, достатньо дослідження трансформації нітрогену. Однак, якщо показники середньої ефективної концентрації дослідження трансформації нітрогену починають потрапляти у вказаний діапазон доступних інгібіторів (напр., нітрапирін), можна провести дослідження трансформації вуглецю, щоб отримати подальшу інформацію.

Ґрунти складаються з живих і неживих компонентів, які існують у складних і гетерогенних сумішах. Мікроорганізми відіграють важливу роль у розкладі та трансформації органічного матеріалу в родючих ґрунтах, і багато біологічних видів впливають на різні аспекти родючості ґрунту. Будь-яке довгострокове втручання у ці біохімічні процеси може змінити цикл живлення ґрунту, а це в свою чергу може змінити його родючість. Трансформація вуглецю і нітрогену відбувається в усіх родючих ґрунтах. Хоча види мікробів, що відповідають за ці процеси, різні у різних ґрунтах, процес трансформації практично однаковий.

Цей метод дослідження розроблений для визначення довгострокового шкідливого впливу речовини на процес трансформації вуглецю в аеробному пласті ґрунту. Дослідження визначає зміни у розмірах і активності мікробних угрупувань, які відповідають за трансформацію вуглецю, оскільки вони піддаються як хімічному впливу, так і вуглецевому голодуванню. Використовують піщаний ґрунт з низьким вмістом органічного матеріалу. Ґрунт обробляється досліджуваною речовиною і зберігається за умов, які сприяють швидкому мікробному метаболізму. За цих умов джерела загальнодоступного вуглецю в ґрунті швидко виснажуються. Це спричиняє вуглецеве голодування, яке вбиває мікробні клітини і викликає стан спокою і/чи споруляцію. Якщо дослідження триває більше, ніж 28 днів, сума цих реакцій може бути визначена за допомогою контрольних проб (з необробленого ґрунту) як прогресивна втрата метаболічно активної мікробної біомаси (7). Якщо на біомасу у виснаженому безвуглецевому ґрунті, за умов дослідження, впливає хімічна речовина, біомаса може не повернутись до того ж рівня, як і в контрольній пробі. Отже, зміни, викликані досліджуваною речовиною протягом дослідження, часто є незворотними.

Дослідження, на основі яких був створений цей дослідний метод, спочатку розроблялося для речовин, кількість потрапляння яких у ґрунт можна було передбачити. Наприклад, це стосується продукції для захисту сільськогосподарських культур, оскільки відомо, скільки її застосовується в реальних умовах. Для агрохімічних речовин достатньо двох порцій тієї кількості, яка буде використовуватись за попередніми прогнозами. Агрохімічні речовини можна досліджувати як активні інгредієнти (a.i.) чи як складені продукти. Однак, дослідження не обмежується речовинами з прогнозованою концентрацією у навколишньому середовищі. Змінивши як кількість досліджуваної речовини в ґрунті, так і спосіб оцінювання даних, дослідження також може проводитись для хімічних речовин, кількість яких у ґрунті не є відомою. Отже, для неагрохімічних речовин треба визначати вплив серії концентрацій на трансформацію вуглецю. Дані цих досліджень використовуються для побудови кривої залежності доза-ефект й розрахунку значень ефективної концентрації EK , деx визначається процентом впливу. x

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ

Трансформація вуглецю - це виродження мікроорганізмів органічного матеріалу для утворення неорганічного кінцевого продукту - діоксиду вуглецю.

EK (ефективна концентрація) - це концентрація досліджуваної x

речовини в  ґрунті,  яка виражається в  x%  затримки трансформації
вуглецю в діоксид вуглецю.

EK (середня ефективна концентрація) - це концентрація 50

досліджуваної речовини   в   ґрунті,  яка  дорівнює  50%  затримки
трансформації вуглецю в діоксид вуглецю.

1.3. ЕТАЛОННА РЕЧОВИНА

Немає.

1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

Просіяний крізь решето ґрунт обробляється досліджуваною речовиною або залишається необробленим (для контрольної проби). Якщо досліджуються агрохімічні речовини, рекомендується мати мінімум дві досліджувані концентрації, і їх треба забирати з урахуванням найвищої концентрації, яка прогнозується в реальних умовах. Після 0-ого, 7-ого, 14-ого і 28-ого дня інкубації, проби з обробленим та контрольним ґрунтами змішують з глюкозою, після чого протягом 12 годин вимірюють частоту дихання, спричиненого глюкозою. Частота дихання виражається як вивільнений діоксид вуглецю (мг діоксиду вуглецю/кг сухого ґрунту/год) або спожитий кисень (мк кисню/кг ґрунту/год). Середня частота дихання в пробах обробленого ґрунту порівнюється з рівнем в контрольній пробі, і підраховується процентне відхилення дослідної проби від контрольної. Всі дослідження тривають щонайменше 28 днів. Якщо на 28-ий день різниця між обробленим і контрольним ґрунтами дорівнює або більша за 25%, вимірювання тривають з двотижневим інтервалом максимум 100 днів. Якщо досліджуються неагрохімічні речовини, ряд концентрацій досліджуваної речовини додається до проб ґрунтів, і частота дихання, викликаного глюкозою, вимірюється через 28 днів (тобто середнє число об'єму утвореного діоксиду вуглецю чи спожитого кисню). Результати досліджень ряду концентрацій аналізуються з використанням регресивної моделі, і розраховуються показники ефективної концентрації (тобто EK , EK і/чи EK ). 50 25 10 Див. ВИЗНАЧЕННЯ.

1.5. ДОСТОВІРНІСТЬ ДОСЛІДЖЕННЯ

Оцінювання результатів дослідження агрохімічних речовин базується на відносно невеликій різниці (тобто середнє значення: +- 25%) між вивільненим діоксидом вуглецю чи спожитим киснем в дослідній і контрольній пробах, отже, значні коливання в повторних контрольних пробах можуть привести до неправильних результатів. Тому різниця між однаковими контрольними пробами має бути меншою, ніж +- 15%.

1.6. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

1.6.1. Обладнання

Використовуються контейнери, зроблені з хімічно інертного матеріалу. Вони повинні мати ємність, яка відповідає методу, що використовується для інкубації ґрунтів, тобто інкубацію великими партіями чи серією ґрунтових проб (див. Розділ 1.7.1.2). Необхідно мінімізувати втрату води та забезпечити умови для газового обміну протягом дослідження (наприклад, контейнери можна покрити пористою поліетиленовою плівкою). Коли досліджуються леткі речовини, необхідно використовувати ущільнюванні та газонепроникні контейнери. Вони мають бути такого розміру, щоб одна чверть об'єму була заповнена пробою ґрунту.

Для визначення дихання, спричиненого глюкозою, необхідні інкубаційні системи та інструменти для вимірювання утвореного діоксиду вуглецю чи спожитого кисню. Приклади таких систем та інструментів можна знайти в літературі (8)(9)(10)(11).

1.6.2. Добір і кількість ґрунту

Використовується один і той самий ґрунт. Рекомендовані характеристики ґрунту є такими:

- вміст піску: не менше, ніж 50% і не більше, ніж 75%,

- pH: 5,5-7,5,

- вміст органічного вуглецю: 0,5-1,5%,

- необхідно виміряти мікробну біомасу (12)(13) і вміст вуглецю у ній має бути принаймні 1% від загальної кількості ґрунтового органічного вуглецю.

У більшості випадків ґрунт із такими характеристиками - це найгірший ґрунт, оскільки адсорбція досліджуваної речовини є мінімальною, а її вплив на мікрофлору - максимальний. Відповідно, дослідження інших ґрунтів є загалом непотрібним. Однак за деяких обставин, наприклад, коли досліджувану речовину часто використовують на певному виді ґрунту (кислотні лісові ґрунти), чи для електростатично заряджених хімічних речовин, воно може бути необхідним для заміни додаткового ґрунту.

1.6.3. Збирання і зберігання проб ґрунту

1.6.3.1. Збирання

Необхідно зібрати детальну інформацію про історію території, звідки буде забраний досліджуваний ґрунт. Вона має охоплювати такі деталі, як місце розташування, рослинний покрив, дати оброблення продукцією для захисту сільськогосподарських культур, оброблення органічними й неорганічними добривами, додавання біологічних речовин чи випадкове забруднення. Місце, обране для забору ґрунту, має бути придатним для довгострокового використання. Підходять постійні пасовища, поля з щорічними зерновими культурами (крім кукурудзи) чи поля, добре удобрювані сидератом. Обране місце забору проб не має бути оброблене продукцією для захисту сільськогосподарських культур щонайменше за рік до відбору. Також за півроку до відбору не має використовуватись органічне добриво. Використання мінерального добрива можливе лише тоді, коли відповідно до потреб культур і ґрунту, проби не можуть бути відібрані, поки не мине принаймні три місяці після удобрювання. Не можна використовувати ґрунт, який оброблявся добривом з біоцидним впливом (наприклад, ціанамід кальцію).

Не можна відбирати проби протягом чи одразу після довготривалих (більше 30 днів) засух чи повеней. Із зораного ґрунту проби забираються з глибини 0-20 см. З пасовища чи інших ґрунтів, де земля не ореться протягом довгого часу (принаймні протягом одного вегетаційного періоду), глибина забору може бути трохи більшою за 20 см (напр., 25 см). Проби ґрунту перевозяться у контейнерах за температури, яка гарантує, що початкові властивості ґрунту не будуть докорінно змінені.

1.6.3.2. Зберігання

Краще використовувати свіже забрані у реальних умовах ґрунти. Якщо не можна уникнути зберігання в лабораторії, то ґрунти треба зберігати в темному місці за температури 4 +- 2 град.C максимум протягом трьох місяців. Під час зберігання необхідно дотримуватись аеробних умов. Якщо ґрунти забираються з території, де вони замерзають щонайменше на три місяці в рік, то їх можна зберігати протягом півроку за температури мінус 18 град.C. Мікробну біомасу відданих на зберігання ґрунтів вимірюють перед кожним експериментом, і вуглець у біомасі повинен складати принаймні 1% від загального вмісту органічного вуглецю у ґрунті (див. Розділ 1.6.2).

1.6.4. Оброблення та підготовка ґрунту до дослідження

1.6.4.1. Попередня інкубація

Якщо ґрунт використовується не одразу після відбору (див. Розділи 1.6.4.2 і 1.7.1.3), рекомендується провести попередню інкубацію на період від 2 до 28 днів. Температура та вологість ґрунту під час попередньої інкубації мають бути такими ж як і протягом дослідження (див. Розділи 1.6.4.2 і 1.7.1.3).

1.6.4.2. Фізично-хімічні властивості

Руками ґрунт очищується від великих предметів (наприклад, каміння, частин рослин тощо), а тоді вологим просівається крізь сито без значного висушування до часточок, розмір яких менше або дорівнює 2 мм. Вміст вологи у пробі ґрунту повинен регулюватись за допомогою дистильованої чи деіонізованої води так, щоб рівень вологи був від 40% до 60% максимальної вологомісткості.

1.6.5. Підготовка досліджуваної речовини для оброблення ґрунту

Досліджувана речовина зазвичай наноситься за допомогою носія. Носієм може бути вода (для водорозчинних речовин) або інертне тверде тіло, наприклад, дрібний кварцовий пісок (розмір часточок: 0,1-0,5 мм). Краще не використовувати інші рідкі носії (наприклад, такі органічні розчинники, як ацетон, хлороформ), оскільки вони можуть нанести шкоду мікрофлорі. Якщо носієм є пісок, його можна покрити досліджуваною речовиною, яка розчинилась чи випала в осад у відповідному розчиннику. У такому випадку необхідно випарувати розчинник перед обробленням ґрунту. Для оптимального розподілу досліджуваної речовини у ґрунті рекомендується співвідношення 10 г піску на кілограм ґрунту (суха вага). Контрольні проби обробляються такою ж кількістю води та/чи кварцового піску.

Коли досліджуються леткі речовини, необхідно уникати втрат під час оброблення і забезпечити їх однорідний розподіл у ґрунті (наприклад, досліджувана речовина упорскується у ґрунт у декількох місцях).

1.6.6. Досліджувані концентрації

Якщо досліджується продукція для захисту сільськогосподарських культур чи інші хімічні речовини з прогнозованою концентрацією у навколишньому середовищі, необхідно мати принаймні дві концентрації. Нижча концентрація повинна відповідати максимальній кількості речовин у ґрунті за реальних умов, а вища концентрація має у декілька разів перевищувати нижчу. Концентрації досліджуваної речовини, які додаються у ґрунт, визначаються за такими уніфікованими показниками: глибина забору - 5 см, щільність ґрунту - 1,5. Для агрохімічних речовин, які наносяться безпосередньо на ґрунт, рекомендовані досліджувані концентрації - це Прогнозована концентрація в навколишньому середовищі (РЕС) і концентрація, більша її у 5 разів. Речовини, що наносяться на ґрунти декілька разів за сезон, повинні досліджуватись за допомогою концентрацій, які є добутками РЕС на максимально прогнозовану кількість нанесень. Однак, найвища досліджувана концентрація не має перевищувати десять максимальних об'ємів нанесеної речовини за один раз.

Якщо досліджуються неагрохімічні речовини, застосовується геометрична прогресія принаймні п'яти концентрацій. Досліджувані концентрації мають охоплювати область, необхідну для визначення показників ефективної концентрації.

1.7. ПРОВЕДЕННЯ ДОСЛІДЖЕННЯ

1.7.1. Умови впливу

1.7.1.1. Перемішування і контроль

Якщо досліджуються агрохімічні речовини, ґрунт ділиться на три рівні порції. Дві порції перемішуються з носієм, який містить речовину, а остання перемішується з носієм без речовини (контрольна проба). Рекомендується мати щонайменше три повторні проби до кожної дослідної і контрольної проб. Якщо досліджуються неагрохімічні речовини, ґрунт ділиться на шість рівних порцій. П'ять порцій перемішуються з носієм, який містить речовину, а остання перемішується з носієм без речовини (контрольна проба). Рекомендується мати щонайменше три повторні проби до кожної дослідної і контрольної проб. Важливо забезпечити однорідний розподіл досліджуваної речовини у дослідних пробах ґрунту. Під час перемішування необхідно уникати ущільнення ґрунту чи перетворення його на грудку.

1.7.1.2. Інкубація проб ґрунту

Інкубацію проб ґрунту можна провести двома способами: як велику партію дослідних і контрольних проб чи як ряд окремих і однакових за розміром підвибірок кожної дослідної і контрольної проб ґрунту. Однак, коли досліджуються леткі речовини, дослідження проводиться лише з рядом окремих підвибірок. Коли ґрунти інкубуються у великій партії, треба підготувати багато обробленого й необробленого ґрунту, а підвибірки, які мають аналізуватись, беруться за необхідності в процесі дослідження. Кількість підготованих початкових дослідних і контрольних проб залежить від розміру підвибірок, кількості повторних проб для аналізу та прогнозованого максимального часу отримання вибірки. Ґрунти, які інкубуються у великій партії, необхідно ретельно перемішати перед підвибіркою. Коли ґрунти інкубуються як ряд окремих проб ґрунту, кожна партія обробленого й необробленого ґрунту ділиться на необхідну кількість підвибірок, які використовуються за необхідності. У дослідженнях, де прогнозується більше двох заборів вибірок, необхідно підготувати достатню кількість підвибірок, щоб їх вистачило на всі повторні проби і всі забори вибірок. Щонайменше три повторні проби досліджуваного ґрунту повинні інкубуватись за аеробних умов (див. Розділ 1.7.1.1). Протягом усіх досліджень необхідно використовувати відповідні контейнери з достатнім повітряним прошарком, щоб запобігти утворенню анаеробних умов. Коли досліджуються леткі речовини, дослідження проводиться лише з рядом окремих підвибірок.

1.7.1.3. Умови і тривалість дослідження

Дослідження проводиться у темному місці за кімнатної температури 20 +- 2 град.C. Вміст вологи у пробах ґрунту протягом дослідження повинен підтримуватись на рівні 40-60% від максимальної вологомісткості ґрунту (див. Розділ 1.6.4.2) з відхиленням +- 5%. За необхідності можна додати дистильовану, деіонізовану воду.

Мінімальна тривалість досліджень становить 28 днів. Якщо досліджуються агрохімічні речовини, в дослідних та контрольних пробах порівнюється кількість вивільненого діоксиду вуглецю чи спожитого кисню. Якщо ці показники на 28-ий день відрізняються більш, ніж на 25%, випробовування продовжується, доки різниця не дорівнюватиме або буде меншою за 25%, чи максимум протягом 100 днів. Якщо досліджуються неагрохімічні речовини, випробовування закінчується після 28 днів. На 28-ий день визначається кількість вивільненого діоксиду вуглецю чи спожитого кисню в дослідних та контрольних пробах ґрунту і розраховуються показники ефективної концентрації.

1.7.2. Вибірка та аналіз ґрунтів

1.7.2.1. Розклад відбору проб

Якщо досліджуються агрохімічні речовини, проби ґрунтів аналізують на дихання, спричинене глюкозою на 0-ий, 7-ий, 14-ий та 28-ий день. Якщо дослідження тривале, подальші вимірювання необхідно робити через кожні два тижні після 28-денного терміну.

Якщо досліджуються неагрохімічні речовини, використовують щонайменше 5 концентрацій, а проби ґрунтів аналізують на частоту дихання, спричинене глюкозою, на початку (день 0) та наприкінці тестування (28 днів). Якщо необхідно, можна зробити проміжні вимірювання, наприклад, на сьомий день. Дані, які отримали у 28-й день, використовують для визначення величини ефективної концентрації для хімічної речовини. Якщо вимагається, то можна використати дані, отримані зі зразка нульового дня, для визначення початкової кількості метаболічно активної мікробної біомаси у ґрунті про початкову кількість нітрату у ґрунті (12).

1.7.2.2. Вимірювання частоти дихання, спричиненого глюкозою

Частота дихання, спричиненого глюкозою, в кожній дослідній та контрольній повторній пробі визначається в однаковий час вибірки. Проби ґрунту перемішуються з достатньою кількістю глюкози, щоб виявити негайну максимальну дихальну реакцію. Кількість глюкози, необхідної, щоб викликати максимальну дихальну реакцію у даному ґрунті, можна визначити за допомогою попереднього дослідження з використанням ряду концентрацій глюкози (14). Для піщаних ґрунтів з 0,5-1,5% вмістом органічного вуглецю достатньо від 2 000 мг до 4 000 мг глюкози на кг сухої ваги ґрунту. Глюкозу можна перемолоти до стану пудри разом із чистим кварцовим піском (10 г піску/кг сухої ваги ґрунту) і рівномірно перемішати з ґрунтом.

Проби ґрунту з глюкозою інкубуються у відповідному приладі, який може вимірювати частоту дихання постійно, кожну годину, кожні дві години (див. Розділ 1.6.1) за температури 20 +- 2 град.C. Кількість вивільненого діоксиду вуглецю чи спожитого кисню вимірюється постійно протягом 12 годин, і вимірювання повинні розпочатися якнайшвидше, тобто протягом однієї чи двох годин після додавання глюкози. Протягом 12 годин вимірюється загальна кількість вивільненого діоксиду вуглецю чи спожитого кисню і визначається середня частота дихання.

2. ДАНІ

2.1. ОБРОБКА РЕЗУЛЬТАТІВ

Якщо досліджуються агрохімічні речовини, необхідно записувати кількість вивільненого діоксиду вуглецю чи спожитого кисню в усіх повторних пробах ґрунту, а середні значення усіх повторних проб подати у формі таблиці. Результати необхідно визначити за відповідними і загальноприйнятими статистичними методами (напр., F-критерій, 5% рівня значущості). Частота дихання, спричиненого глюкозою, виражається в мг діоксиду вуглецю/кг сухої ваги ґрунту/день чи мг кисню/кг сухої ваги ґрунту/день. Середній рівень утворення діоксиду вуглецю чи середній рівень споживання кисню в кожній дослідній пробі порівнюється з рівнем у контрольній пробі, і підраховується процент відхилення від останньої.

Якщо досліджуються неагрохімічні речовини, необхідно визначити кількість вивільненого діоксиду вуглецю чи спожитого кисню в усіх повторних пробах, і побудувати криву залежності доза-ефект для визначення величин ефективної концентрації. Частота дихання, спричиненого глюкозою, (тобто мг діоксиду вуглецю/кг сухої ваги ґрунту/день чи мг кисню/кг сухої ваги ґрунту/день), який виявлено в дослідних пробах після 28 днів, порівнюється з кількістю у контрольних пробах. За допомогою цих даних визначають процентні показники пригнічення для кожної дослідної концентрації. Ці процентні співвідношення показують залежність від концентрації, а потім за допомогою статичних методів розраховуються величини ефективної концентрації. Довірчі границі (p = 0,95) для розрахованої ефективної концентрації також визначаються за допомогою стандартних методів (15)(16)(17).

2.2. ІНТЕРПРЕТАЦІЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

Коли визначені результати досліджень з агрохімічними речовинами, а різниця між співвідношенням частоти дихання нижньої проби (тобто максимально очікувана концентрація) та контрольної проби дорівнює або менше 25% у будь-який час вибірки після 28-ого дня, продукт реакції можна оцінити як такий, що не має довгострокового впливу на трансформацію вуглецю в ґрунтах. Коли визначаються результати досліджень неагрохімічних речовин, то використовують показники ефективної концентрації EK , EK та/чи 50 25

EK  .
  10

3. ЗВІТУВАННЯ

ЗВІТ ПРО ДОСЛІДЖЕННЯ

Звіт про дослідження повинен містити наступні дані:

Повна інформація про ґрунт, що використовується, включаючи:

- географічні координати місця (широта, довгота),

- дані про історію місця (тобто, рослинний покрив, обробка засобами для захисту врожаїв, внесення добрив, випадки забруднення тощо),

- історія використання (напр. сільськогосподарські землі, ліси тощо),

- глибина відбору проб (см),

- вміст піску/мулу/глини (% від сухої ваги),

- рН (у воді),

- вміст органічного вуглецю (% від сухої ваги),

- вміст азоту (% від сухої ваги),

- ємність катіонного обміну (ммоль/кг),

- початкова мікробна біомаса у процентах від загального вмісту органічного вуглецю,

- посилання на методи, що використовувались для визначення кожного параметру,

- вся інформація про збирання та зберігання проб ґрунту,

- відомості про попереднє витримування ґрунту, якщо відбувалось.

Дослідна речовина:

- фізична природа та, якщо потрібно, фізико-хімічні властивості,

- дані про хімічну ідентифікацію, включаючи, якщо потрібно, структурну формулу, чистоту (тобто, процентний вміст активної речовини для засобів для захисту врожаїв), вміст азоту.

Умови дослідження:

- відомості про меліорацію органічними субстратами,

- кількість концентрацій дослідної речовини та, якщо потрібно, обґрунтування обраних концентрацій,

- дані про введення дослідної речовини у ґрунт,

- температура витримування,

- вміст вологи у ґрунті на початку та під час дослідження,

- метод витримування ґрунту, що використовувався (тобто, чи ґрунт витримувався в одному контейнері, чи розділявся на окремі підпроби),

- кількість дублюючих проб,

- час відбору проб.

Результати:

- метод та обладнання, що використовувались для вимірювання інтенсивності дихання,

- табличні дані, що включають окремі та середні значення кількості кисню чи вуглекислого газу,

- розбіжності між дублюючими дослідними та контрольними пробами,

- пояснення виправлень у розрахунках, якщо робились,

- процентне коливання інтенсивності глюкозного дихання під час кожного періоду відбору проб, та, якщо застосовується, значення EC з довірчою межею 95%, інші значення EC (тобто EC 50 x 25 або EC ) з довірчими інтервалами та графік кривої дози-реакції,

- статистична обробка результатів, якщо застосовувалась,

- будь-яка інформація та спостереження, що можуть допомогти у поясненні результатів.

4. ПЕРЕЛІК ДОВІДКОВОЇ ЛІТЕРАТУРИ

(1) EPPO, (1994) Decision-Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: Soil Microflora. EPPO Bulletin 24: 1-16, 1994.

(2) BBA, (1990) Effects on the Activity of the Soil Microflora. BBA Guidelines for the Official Testing of Plant Protection Products, VI, 1-1 (2nd eds., 1990).

(3) EPA, (1987) Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40 CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Guidelines; Proposed rule. September 28, 1987.

(4) SETAC-Europe, (1995) Procedures for assessing the environmental fate and ecotoxicity of pesticides, Ed. M.R. Lynch, Pub. SETAC-Europe, Brussels.

(5) OECD, (1995) Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 18-20 January 1995.

(6) ISO 10381-6, (1993) Soil quality - Sampling. Guidance on the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.

(7) Anderson, J.P.E., (1987) Handling and Storage of Soils for Pesticide Experiments, in 'Pesticide Effects on Soil Microflora'. Eds. L. Somerville and M.P. Greaves, Chap. 3: 45-60.

(8) Anderson, J.P.E., (1982) Soil Respiration, in 'Methods of Soil Analysis - Part 2: Chemical and Microbiological Properties'. Agronomy Monograph No 9. Eds. A.L. Page, R.H. Miller and D.R. Keeney. 41: 831-871.

(9) ISO 11266-1, (1993) Soil Quality - Guidance on Laboratory Tests for Biodegradation in Soil: Part 1. Aerobic Conditions.

(10) ISO 14239, (1997E) Soil Quality - Laboratory incubation systems for measuring the mineralisation of organic chemicals in soil under aerobic conditions. 31.5.2008 EN Official Journal of the European Union L 142/707

(11) Heinemeye r O., Insam, H., Kaiser, E.A, and Walenzik, G., (1989) Soil microbial biomass and respiration measurements; an automated technique based on infrared gas analyses. Plant and Soil, 116: 77-81.

(12) ISO 14240-1, (1997) Soil quality - Determination of soil microbial biomass - Part 1: Substrateinduced respiration method.

(13) ISO 14240-2, (1997) Soil quality - Determination of soil microbial biomass - Part 2: Fumigationextraction method.

(14) Malkomes, H.-P., (1986) Einflu von Glukosemenge auf die Reaktion der Kurzzeit-Atmung im Boden Gegenber Pflanzenschutzmitteln, Dargestellt am Beispiel eines Herbizide. (Influence of the Amount of Glucose Added to the Soil on the Effect of Pesticides in Short-Term Respiration, using a Herbicide as an Example). Nachrichtenbl. Deut. Pflanzenschutzd., Braunschweig, 38: 113-120.

(15) Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F., (1949) A simplified method of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, 99-113.

(16) Finney, D.J., (1971) Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, London and New-York.

(17) Finney D.J., (1978) Statistical Methods in biological Assay. Griffin, Weycombe, UK.

C.23. АЕРОБНЕ ТА АНАЕРОБНЕ ПЕРЕТВОРЕННЯ В ГРУНТІ

1. МЕТОД

Даний метод є ідентичним методу OECD TG 307 (2002).

1.1. ВСТУП

Даний метод базується на існуючих посібниках (1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9). Описаний далі метод було розроблено для оцінки аеробних та анаеробних перетворень хімічних елементів у ґрунті. Метою дослідів є визначення (i) інтенсивності перетворення дослідної речовини та (ii) природи та інтенсивності накопичення та виведення продуктів перетворення, які можуть впливати на рослини та ґрунтові організми. Такі дослідження повинні застосовуватись до хімічних речовин, які безпосередньо вводяться в ґрунт, або можуть потрапити в ґрунтове середовище. Результати таких досліджень можуть також використовуватись для складання протоколів проведення аналізів та відбору проб для відповідних польових досліджень.

Аеробні та анаеробні дослідження одного типу ґрунту зазвичай дозволяють оцінити шляхи перетворення (8)(10)(11). Інтенсивність перетворення необхідно визначати у принаймні трьох додаткових ґрунтах (8)(10).

Під час Семінару ОЕСР з питань підбору ґрунтів та осадових порід, що відбувся в Бельджирате, Італія у 1995 році (10) було зокрема погоджено кількість та типи ґрунтів для використання у даному дослідженні. Типи ґрунтів повинні відтворювати навколишні умови того місця, де можуть використовуватись або утилізуватись хімічні речовини. Наприклад, хімічні речовини, що можуть утилізуватись на території від субтропічних до тропічних кліматичних зон, повинні досліджуватись за допомогою ґрунтів типу Ferrasol або Nitosol (за системою Продовольчої та сільськогосподарської організації ООН (FAO)). Під час Семінару були також запропоновані вказівки щодо збору, обробки та зберігання зразків ґрунту, на основі Посібника ISO (15). Використання суглинку (рисового ґрунту) також розглядається у даному методі.

1.2. ОЗНАЧЕННЯ

Дослідна речовина: будь-яка речовина, що може бути як початковою, так і відповідним продуктом розпаду.

Продукти розпаду: будь-які сполуки, що утворюються внаслідок біотичних або абіотичних реакцій перетворення дослідної сполуки, включаючи СО та продукти зв'язаних залишків. 2

Зв'язані залишки: "Зв'язані залишки" є сполуками в ґрунті, рослинах чи тваринах, що залишаються у ґрунтовій основі у формі початкової речовини або її метаболіту (метаболітів) чи продуктів розпаду, після екстрагування. Метод, що використовується для екстрагування, не повинен суттєво впливати на компоненти чи структуру основи. Природа зв'язку може бути частково встановлена методом екстрагування зі зміною ґрунтової основи або використання складних аналітичних методик. На сьогоднішній день таким чином були визначені ковалентні йонні та адсорбційні зв'язки, а також захоплення. Загалом, утворення зв'язаних залишків суттєво зменшує біологічну доступність та сприйнятливість.

Аеробне перетворення: реакції, що відбуваються за присутності молекулярного кисню (14).

Анаеробне перетворення: реакції, що відбуваються за відсутності молекулярного кисню (14).

Ґрунт: суміш мінеральних та органічних компонентів, населена дрібними (у більшості, мікроскопічними) організмами. Органічні компоненти містять сполуки з високим вмістом вуглецю та нітрогену та високими молекулярними масами. Ґрунт можна обробляти у двох станах:

(а) з непорушеною структурою, тобто такою, що утворилася з часом у характерних шарах багатьох видів ґрунту;

(b) з порушеною структурою, тобто такою, що спостерігається на території орних земель або коли проби для даного методу відбираються шляхом викопування;

Мінералізація: повний розпад органічної сполуки на СО та Н О 2 2 у аеробних умовах та СН , СО та Н О в анаеробних. В контексті 4 2 2 14 даного методу, якщо використовуються мічені ізотопи С, мінералізація означає активний розпад, під час якого мічений атом 14

вуглецю окислюється з утворенням відповідної кількості   СО  (14).
                                                           2

Період напіврозпаду: t час, протягом якого відбувається 0,5

перетворення 50% дослідної сполуки, за умови що перетворення можна
описати за допомогою кінетики  першого  порядку;  це  значення  не
залежить від концентрації.

DT (Час зникнення 50): це час, протягом якого концентрація 50

дослідної речовини зменшується на 50%; дане значення відрізняється
від   періоду   напіврозпаду   t   ,    якщо    перетворення    не
                                0,5
підпорядковується кінетиці першого порядку.

DT (Час зникнення 75): це час, протягом якого концентрація 75

дослідної речовини зменшується на 75%.

DT (Час зникнення 90): це час, протягом якого концентрація 90

дослідної речовини зменшується на 90%.

1.3. КОНТРОЛЬНІ РЕЧОВИНИ

Контрольні речовини потрібно використовувати для опису та/або визначення продуктів перетворення за допомогою спектрографії або хроматографії.

1.4. СФЕРА ЗАСТОСУВАННЯ ДОСЛІДЖЕННЯ

Даний метод застосовується для всіх хімічних речовин (що містять або не містять мічені ізотопи), для яких створено належний аналітичний метод з достатньою чутливістю та точністю. Він застосовується для слаболетких, нелетких, розчинних та нерозчинних у воді сполук. Дослідження не можна застосовувати для сполук, що мають високу леткість у ґрунті (напр. засобів для окурювання, органічних розчинників), і які тому не можуть утримуватись в ґрунті в умовах даного дослідження.

1.5. ІНФОРМАЦІЯ ПРО РЕЧОВИНУ

Для вимірювання інтенсивності перетворення можуть використовуватись дослідні речовини, що містять або не містять мічені ізотопи. Мічені речовини потрібні для дослідження шляху перетворення і для встановлення балансу мас. Рекомендується 14

використовувати  мічені  атоми    С,   хоча   використання   інших
                    13    15    3    32
ізотопів,  таких як   С,    N,   H,    P,  теж може бути корисним.
Наскільки це  можливо,  мітка  повинна  розміщуватись  у  найбільш
стабільній   частині  (частинах)  молекули(1).  Чистота  дослідної
речовини повинна становити не менше, ніж 95%.

----------------

(1) Наприклад, якщо речовина має одне кільце, вимагається маркувати його; якщо ж речовина має два або більше кілець, необхідно провести окремі дослідження для визначення перетворення кожного міченого кільця і для отримання більш докладної інформації про утворення продуктів перетворення.

Перед виконанням дослідження аеробного та анаеробного перетворення у ґрунті, необхідно отримати такі дані про дослідну речовину:

(а) розчинність у воді (Метод А.6);

(b) розчинність в органічних розчинниках;

(с) тиск пари (Метод А.4) та константа закону Генрі;

(d) коефіцієнт розподілу в н-октанолі/воді (Метод А.8);

(e) хімічна стабільність в темряві (гідроліз) (Метод С.7);

(f) рК , якщо молекула схильна до приєднання та відриву a

протонів (Посібник ОЕСР 112) (16).

Також може бути корисною інформація про токсичність дослідної речовини для ґрунтових мікроорганізмів (методи дослідження С.21 та С.22) (16).

В наявності також повинні бути аналітичні методи (включаючи методи екстрагування та очищення) для кількісного визначення та ідентифікації дослідної речовини.

1.6. ПРИНЦИП МЕТОДУ

Зразки ґрунту обробляються дослідною сполукою і витримуються у темряві у колбах того ж типу, що використовуються для біологічного визначення, або у проточних системах, в лабораторних умовах, що контролюються (при постійній температурі та вологості ґрунту). Після відповідних інтервалів часу, проби ґрунту дістаються та аналізуються на вміст початкової сполуки та продуктів перетворення. Леткі продукти також збираються для аналізу за допомогою відповідних пристроїв. За допомогою речовин, 14

що  містять  мічені  ізотопи    С,  можна  визначити різні ступені
                                                          14
мінералізації дослідної речовини,  шляхом затримки атомів   СО , а
                                                              2
також   встановити  баланс  мас,  включаючи  формування  зв'язаних
залишків у ґрунті.

1.7. КРИТЕРІЇ ЯКОСТІ

1.7.1. Відновлення

Аналіз принаймні двох проб одразу після додавання дослідної сполуки дає перші свідчення про повторюваність аналітичного методу та про однорідність застосування процедури для дослідної речовини. Значення відновлення для подальших фаз досліду подаються за відповідними значеннями балансу мас. Показники відновлення для речовин, що містять мічені ізотопи повинні знаходитись в межах від 90% до 100%, а для речовин, що не містять останніх - в межах від 70% до 110% (3).

1.7.2. Повторюваність та чутливість аналітичного методу

Повторюваність аналітичного методу (не враховуючи ефективності першого аналізу) під час кількісного визначення дослідної сполуки та продуктів розпаду можна перевірити за допомогою повторного аналізу одного зразка ґрунту, витриманого протягом достатнього часу для утворення продуктів розпаду.

Межа визначення аналітичного методу (LOD) для дослідної сполуки та продуктів розпаду повинна щонайменше становити -1

0,01 мг · кг   грунту (дослідної сполуки)  або  1%  від  дози,  що
застосовується,  залежно  від того,  яке значення є нижчим.  Також
необхідно вказати межу кількісного визначення (LOQ).

1.7.3. Точність даних про перетворення

Аналіз концентрації дослідної сполуки за регресією в залежності від часу дозволяє отримати відповідні дані про вірогідність кривої перетворення та дозволяє підрахувати довірчі межі для періодів напіврозпаду (у випадку кінетики псевдо-першого порядку) або значення DT та, якщо потрібно, значення DT та 50 75

DT  .
  90

1.8. ОПИС МЕТОДУ

1.8.1. Обладнання та хімічні реагенти

Ґрунт витримується у статичних закритих або прийнятних проточних системах (7)(17). Приклади прийнятного обладнання проточного типу та колба для біологічного визначення зображені на малюнках 1 та 2 відповідно. Обидві зазначені системи для витримування мають переваги та обмеження (7)(17).

Використовується звичайне лабораторне обладнання, зокрема, наступне:

- аналітичні прилади, зокрема, обладнання для газорідинної, високоефективної рідинної та тонкошарової хроматографії, а також системи для виявлення та аналізу речовин, що містять або не містять мічені ізотопи, або системи для методу зворотного розбавлення ізотопів,

- прилади для ідентифікації (напр. МС, ГХ-МС, ВЕРХ-МС, ЯМР тощо),

- рідкий сцинтилятор,

- окисник для згорання радіоактивних речовин,

- центрифуга,

- прилади для екстрагування (напр. центрифужні пробірки для холодного екстрагування або екстрактор Сокслета)

- обладнання для концентрування розчинів та екстрактів (напр. роторний випарювач),

- водна баня,

- механічний пристрій для змішування (напр. змішувач для тіста або барабанний змішувач).

Хімічні реагенти, що використовуються, можуть включати:

-3 - NaOH, аналітичної якості, 2 моль · дм , або інший придатний луг (напр. KOH або етаноламін),

-3 - H SO , аналітичної якості, 0,05 моль · дм , 2 4

- етилен гліколь, аналітичної якості,

- твердий абсорбент, такий як натрове вапно або поліуретанові заглушки,

- органічні розчинники, аналітичної якості, такі як ацетон, метанол тощо,

- рідина для сцинтиляції.

1.8.2. Застосування дослідної речовини

Перед додаванням до ґрунту для кращого розповсюдження дослідну сполуку необхідно розчинити у воді (дейонізованій або дистильованій) або за необхідності, у мінімальних кількостях ацетону або інших органічних розчинників (6), у яких дослідна сполука залишається достатньо стабільною та розчинною. Проте, обрана кількість розчинника не повинна суттєво впливати на мікробну активність у ґрунті (див. Розділи 1.5 та 1.9.2-1.9.3). Бажано уникати використання розчинників, що гальмують діяльність мікробів, таких як хлороформ, дихлорметан або інші галогенізовані розчинники.

Дослідна речовина може також додаватись у твердому вигляді, напр. перемішуватися з кварцовим піском або у складі висушеної та стерилізованої підпроби дослідного ґрунту. Якщо використовується розчинник, йому необхідно дозволити випаруватись перед тим, як оброблену дослідною речовиною підпробу буде додано до основної нестерильної проби.

Якщо досліджуються звичайні хімічні сполуки, що потрапляють в ґрунт через осад стічних вод або в результаті використання у сільському господарстві, дослідну речовину потрібно спочатку додати до осаду, а потім ввести у зразок ґрунту. (див. Розділи 1.9.2 та 1.9.3).

Використання вказаних продуктів не є строго визначеним, проте, для дослідних речовин з низькою розчинністю використання зазначених речовин може бути прийнятним варіантом.

1.8.3. Ґрунти

1.8.3.1. Вибір ґрунту

Для визначення шляхів перетворення можуть використовуватись характерні ґрунти; піщаний суглинок, мулистий суглинок або глина або глинистий пісок (відповідно до класифікації FAO та USDA (18)), що мають рекомендований рівень рН 5,5-8,0, вміст органічного вуглецю 0,5-0,2% та частку мікробної біомаси принаймні 1% від загального вмісту органічного вуглецю (10).

Для дослідження інтенсивності перетворення потрібно використовувати принаймні ще три додаткових зразки, що є показовими для відповідного ряду ґрунтів. Зразки повинні відрізнятись за вмістом органічного вуглецю, рівнем рН, вмістом глини та мікробної біомаси (10).

Усі ґрунти потрібно охарактеризувати принаймні за структурою (% піску, % мулу %, % глини) (відповідно до класифікації FAO та USDA (18)), рН, ємністю катіонного обміну, вмістом органічного вуглецю, загальною густиною, здатністю до затримання вологи (1) та мікробною біомасою (тільки для аеробного дослідження). Додаткова інформація про властивості ґрунту може бути корисною під час пояснення результатів. Для визначення властивостей ґрунту можуть використовуватись методи, запропоновані у довідковій літературі (19)(20)(21)(22)(23). Мікробну біомасу потрібно визначати методом вимірювання субстратного дихання (SIR) (25)(26) або іншими методами (20).

----------------

(1) Здатність до затримання вологи може вимірюватись як нормальна вологоємність, вологоутримувальна здатність або водоструменевий тиск (pF). Детальніше у Додатку 1. У звіті потрібно вказати, чи здатність до затримки води та загальна густина вимірювались у зразках з непорушеною чи порушеною структурою.

1.8.3.2. Збирання, обробка та зберігання ґрунтів

В наявності повинна бути докладна інформація про історію місця, звідки відбирається проби ґрунту. Вона повинна включати точне розташування, рослинний покрив, дані про обробку хімікатами, органічними та неорганічними добривами, додавання біологічних матеріалів чи інші види забруднення. У випадку, якщо ґрунти оброблялись дослідною сполукою або її структурними аналогами протягом останніх чотирьох років, зразок не можна використовувати для дослідження перетворення (10)(15).

Ґрунт повинен бути свіже зібраним з поля (з горизонту А або верхнього шару товщиною 20 см) і містити таку кількість вологи, що сприяє просіюванню. Для ґрунтів крім суглинку необхідно уникати відбору проб під час або безпосередньо після тривалих періодів (> 30 днів) засухи, заморозків або повені (14). Зразки необхідно транспортувати таким чином, щоб мінімізувати зміни у вмісті вологи у ґрунті, та зберігати у темряві з вільним доступом повітря, наскільки це можливо. Загалом, для таких цілей підходить нещільно зав'язаний поліетиленовий мішок.

Обробку ґрунту необхідно провести якомога швидше після отримання проби. Рослинність, крупнішу ґрунтову фауну та камінці необхідно видалити перед пропусканням ґрунту крізь сито з вічком 2 мм для усунення дрібного каміння, часток рослин та фауни. Перед просіюванням необхідно запобігати надмірного висушування та подрібнення ґрунту (15).

У випадках, коли відбір зразків у полі ускладнюється в зимову пору року (ґрунт заморожений або покритий снігом), їх можна отримати з ґрунту, що зберігався у теплиці під шаром рослинності (напр. злакових або злаково-бобових рослин). Суттєва перевага надається дослідженню ґрунтів, свіже зібраних з польових ділянок, але якщо зібраний та оброблений ґрунт доводиться зберігати перед дослідженням, умови зберігання повинні бути придатними, а зберігання тривати лише протягом певного часу (не більше, ніж 3 місяці при температурі (4 +- 2 град.С) для підтримання життєдіяльності мікроорганізмів(1). Детальні вказівки щодо збирання, обробки та зберігання ґрунтів для використання у дослідах на біологічне перетворення можна знайти у (8)(10)(15)(26)(27).

----------------

(1) Як показали останні дослідження, ґрунти з помірних температурних зон можуть також зберігатись при температурі - 20 град.C протягом більше, ніж трьох місяців, без суттєвої шкоди для мікроорганізмів.

Перед використанням обробленого ґрунту в даному дослідженні, його необхідно попередньо витримати протягом достатнього часу для проростання та видалення насіння і для повторного встановлення рівноваги мікробного метаболізму після переходу від умов зберігання до умов витримування. Загалом, період попереднього витримування протягом від двох до 28 днів при температурі та вологості, що наближаються до дослідних, вважається прийнятним. Загальний час зберігання та попереднього витримування не повинен перевищувати 3 місяці.

1.9. ВИКОНАННЯ ДОСЛІДЖЕННЯ

1.9.1. Дослідні умови

1.9.1.1. Дослідна температура

Впродовж усього періоду дослідження ґрунти повинні зберігатись у темряві при постійній температурі, яка є характерною для місця, де відбуватиметься використання або утилізація. Для усіх дослідних речовин, що можуть потрапити в ґрунт у зонах з помірним кліматом рекомендується температура 20 +- 2 град.С. Температуру необхідно контролювати.

Для хімічних речовин, що застосовуються або утилізуються в зонах з холоднішим кліматом (напр. у північних країнах протягом осінньо-зимового періоду), необхідно ввести додаткові зразки ґрунту, які витримуються при нижчих температурах (напр. 10 +- 2 град.С).

1.9.1.2. Вміст вологи

Для досліджень перетворення у аеробних умовах, вміст вологи у ґрунті(2) повинен бути встановлений та підтримуватись на рівні pF між 2,0 та 2,5 (3). Вміст вологи виражається у масі води, поділеній на масу сухого ґрунту, і повинна постійно контролюватись (напр. раз у 2 тижні) шляхом зважування колби для витримування і компенсування втрат вологи додаванням води (бажано, стерилізованої та фільтрованої проточної води). Необхідно звернути увагу на те, щоб за можливості зменшити втрати дослідної сполуки та/або продуктів перетворення через випаровування та/або фоторозпад (якщо відбувається) під час додавання вологи.

----------------

(2) Для підтримання потрібного рівня аерації та живлення ґрунтової мікрофлори, ґрунти не повинні бути ані надто вологими, ані надто сухими. Вміст вологи, що рекомендується для оптимального росту мікроорганізмів становить від 40-60% вологоутримувальної здатності (WHC) та від 0,1-0,33 бар (6). Останній діапазон дорівнює діапазону pF 2,0-2,5. Типовий вміст вологи у різних ґрунтах подається в Додатку 2.

Для дослідження перетворення в анаеробних умовах чи суглинках, ґрунт насичується водою шляхом затоплення.

1.9.1.3. Аеробні умови витримування

У проточних системах аеробні умови підтримуються шляхом періодичного промивання або безперервного вентилювання зволоженим повітрям. У колбах для біологічного визначення обмін повітря підтримується дифузією.

1.9.1.4. Стерильні умови витримування

Для того, щоб отримати дані про відповідність абіотичного перетворення дослідної сполуки, зразки ґрунту можна стерилізувати (для інформації про методи стерилізації див. 16 та 29), обробляти стерильною дослідною речовиною (напр. шляхом подачі розчину крізь фільтр для стерилізації) та провітрювати стерильним зволоженим повітрям, як зазначено у Розділі 1.9.1.6.

1.9.1.5. Анаеробні умови витримування

Для встановлення та підтримання анаеробних умов, зразок ґрунту після обробки дослідною речовиною та витримування в аеробних умовах протягом 30 днів або одного періоду напіврозпаду, або DT50 (залежно від того, який період коротший) затоплюється водою (шар води 1-3 см), а система для витримування продувається інертним газом (напр. нітрогеном або аргоном)(1). Дослідна система повинна дозволяти вимірювати рівень рН, концентрацію кисню, окислювально-відновлювальний потенціал та мати пристрої для затримки летких сполук. Система з використанням колби для біологічного визначення повинна бути ізольованою для запобігання потрапляння повітря через дифузію.

----------------

(1) Аеробні умови превалюють у поверхневих та навіть підповерхневих шарах ґрунту, за результатами дослідного проекту, профінансованого ЄС (K. Takagi et al. (1992). Microbial diversity and activity in subsoil: Methods, field site, seasonal variation in subsoil temperatures and oxygen contens. Proc. Internat. Symp. Environm. Aspects Pesticides Microbiol., 270-277, 17-21 August 1992, Sigtuna, Sweden). Анаеробні умови можуть виникати періодично під час повені, після сильних злив або в результаті затоплення рисових полів.

1.9.1.6. Умови витримування для суглинків

Для вивчення перетворення у суглинкових (рисових) ґрунтах, ґрунт затоплюється шаром води товщиною приблизно 1-5 см а дослідна речовина вводиться у водну фазу (9). Рекомендується глибина ґрунту принаймні 5 см. Система провітрюється аналогічно до аеробних умов. Необхідно контролювати та фіксувати рівень рН, концентрацію кисню та окисно-відновний потенціал водного шару. Попередній період витримування перед початком дослідження перетворення повинен становити не менше, ніж два тижні (див. Розділ 1.8.3.2).

1.9.1.7. Тривалість дослідження

Зазвичай, тривалість дослідження інтенсивності та шляхів перетворення не повинна перевищувати 120 днів(2) (3)(6)(8), оскільки після цього періоду в лабораторній системі, ізольованій від природного відновлення, очікується спад активності ґрунтових мікроорганізмів. За необхідності охарактеризувати розкладання дослідної сполуки, а також утворення та розкладання основних продуктів перетворення, дослідження можна продовжити (напр. на 6 або 12 місяців) (8). Збільшення періодів витримування повинне обґрунтовуватись у звіті про дослідження та супроводжуватись вимірюваннями біомаси на початку та в кінці витримування.

----------------

(2) Аеробні дослідження можуть бути припинені задовго до закінчення терміну 120 днів, за умови що кінцевий шлях перетворення та кінцева мінералізація були чітко встановлені. Дослідження можна припинити після закінчення 120 днів або коли відбулось перетворення щонайменше 90% дослідної сполуки, але лише за умови що утворилось мінімум 5% CO . 2

1.9.2. Виконання дослідження

Приблизно від 50 до 200 грамів ґрунту (сухої ваги) поміщуються у кожну колбу для витримування (див. Малюнки 1 та 2 у Додатку 3) і обробляються дослідною речовиною відповідно до одного з методів, описаних у Розділі 1.8.2. У випадку використання органічних розчинників для введення дослідної речовини, їх необхідно видалити з ґрунту шляхом випарювання. Потім ґрунт потрібно ретельно перемішати лопаткою, або струшуючи колбу. Якщо дослідження проводиться в умовах для суглинку, воду та ґрунт необхідно ретельно змішати після введення дослідної речовини. Маленькі аліквоти (напр. 1 г) обробленого ґрунту потрібно проаналізувати на наявність дослідної речовини з метою перевірки рівномірності розподілення останньої. Інший можливий метод подано далі.

Інтенсивність обробки ґрунту повинна відповідати найвищій концентрації застосування засобу для захисту врожаю, вказаній в інструкції з використання, та глибині рівномірного розподілення речовини в польових умовах (напр. верхній шар ґрунту, товщиною 10 см(3)). Наприклад, для сполук, що наносяться на листя або на ґрунт без введення, глибина, що використовуватиметься для обчислення кількості дослідної сполуки, яку потрібно додати у кожну колбу, становитиме 2,5 см. Для сполук, що вводяться в ґрунт, відповідна глибина береться з інструкції з використання. Для звичайних хімічних сполук інтенсивність введення обчислюється на основі найбільш типового шляху потрапляння в ґрунт; наприклад, якщо сполука найчастіше потрапляє в ґрунт через стічний осад, її необхідно ввести в осад, встановивши концентрацію, що відповідатиме її звичайній концентрації в осаді, а потім додати осад до ґрунту в кількості, що відображає нормальний вміст осаду в ґрунті.

----------------

(3) Початкову концентрацію на одиницю площі можна підрахувати за наступним рівнянням:

6
                               A (kg/ha) · 10  (mg/kg)
     C     = (mg/kg    ) = ----------------------------------
      soil         soil             4   2                  3
                           l(m) · 10  (m /ha) · d (kg    /m )
                                                     soil

-1
     C     = Початкова концентрація в ґрунті (мг·кг  )
      soil

-1
     A = Інтенсивність введення (кг·га  ); l = товщина шару ґрунту
                                                        -3
в польових умовах (м); d = загальна густина ґрунту (кг·м  ).

-1
     Як показує практика, інтенсивність завантаження 1 кг·га   дає
                                        -3
концентрацію  в  ґрунті приблизно 1 кг·м   на 10-сантиметровий шар
                                                            -3
ґрунту (якщо допустити, що загальна густина становить 1 г·см  ).

Якщо така концентрація є недостатньою для визначення основних продуктів перетворення, корисними можуть виявитись додаткові зразки ґрунту з вищою інтенсивністю обробки, проте, необхідно уникати концентрацій, що впливають на функції мікроорганізмів у ґрунті (див. Розділи 1.5 та 1.8.2).

Як варіант, більша кількість ґрунту (тобто, 1-2 кг) може піддаватись обробці дослідною сполукою, ретельно перемішуватись у відповідному приладі для змішування, а потім розбиватись на менші частини від 20 до 200 г і поміщуватись у колби для витримування (за допомогою, наприклад, розщеплювача для проб). Малі аліквоти (напр. 1 г) обробленого ґрунту повинні аналізуватись на наявність дослідної речовини з метою перевірки рівномірності розподілення. Такій процедурі надається перевага, оскільки вона забезпечує більш рівномірне розподілення дослідної речовини у ґрунті.

Крім того, необроблені зразки ґрунту витримуються в умовах (аеробних), ідентичних тим, у яких перебувають зразки, оброблені дослідною речовиною. Вони використовуються для вимірювання біомаси під час та в кінці дослідження.

У випадку, якщо дослідна речовина вводиться у зразки, розчинені в органічному розчиннику (розчинниках), зразки ґрунту, оброблені такою ж кількістю розчинника, витримуються в умовах (аеробних), ідентичних тим, у яких перебувають зразки, оброблені дослідною речовиною. Ці зразки використовуються для вимірювання біомаси на початку, під час та в кінці дослідження, з метою визначення впливу розчинника на мікробну біомасу.

Колби з обробленим ґрунтом приєднуються до проточної системи, показаною на Малюнку 1, або закриваються абсорбційною колонкою, зображеною на Малюнку 2 (див. Додаток 3).

1.9.3. Відбір проб та вимірювання

Через встановлені інтервали часу проби ґрунту екстрагуються з додаткових колб за допомогою розчинників з різною полярністю та перевіряються на вміст дослідної речовини та/або продуктів розпаду. Добре розрахований план дослідження повинен передбачати достатню кількість колб, таким чином, щоб дозволити використання двох колб під час кожного відбору проб. Абсорбційні розчини та тверді абсорбенти також дістаються через різні інтервали часу (раз у 7 днів протягом першого місяця та раз у 17 днів пізніше) на початку та під час кожного витримування і перевіряються на вміст летких сполук. Крім проби ґрунту, що перевіряється одразу після введення (нульова проба), потрібно встановити ще п'ять періодів відбору проб. Інтервали часу повинні давати змогу визначити схему розкладання дослідної сполуки та схеми утворення та розкладання продуктів перетворення (напр. 0, 1, 3, 7 день; 2, 3 тижні; 1, 2, 3 місяці тощо).

У випадку використання дослідних речовин, що містять мічені 14

ізотопи     С,   залишкова   радіоактивність  визначається  шляхом
спалювання,  і для кожного  періоду  відбору  проб  розраховується
баланс мас.

У випадку анаеробного або суглинкового витримування, ґрунт та вода можуть або розділятись перед екстрагуванням та перевіркою, або аналізуватись разом на наявність дослідної сполуки або продуктів перетворення.

1.9.4. Додаткові дослідження

Дослідження в аеробному нестерильному режимі з додатковими значеннями температури та вологості ґрунту можуть бути корисними для оцінки впливу температури та вологості на інтенсивність перетворення дослідної речовини та/або її похідних в ґрунті.

Можна спробувати виконати подальший аналіз залишкової радіоактивності, використовуючи, наприклад, метод суперкритичної флюїдної екстракції.

2. ДАНІ

2.1. ОБРОБКА РЕЗУЛЬТАТІВ

Кількість дослідної сполуки, продуктів розпаду, летких сполук (обов'язково у відсотках), а також залишкових продуктів повинна подаватись у відсотках від початкової введеної концентрації і, де -1

потрібно,  у  мг·кг    ґрунту  (сухої  ваги)  для  кожного періоду
відбору проб.  Графік концентрації дослідної сполуки в  залежності
від  часу  дозволяє  підрахувати період її піврозпаду перетворення
або DT  .
      50

Основні продукти перетворення потрібно ідентифікувати, а їх концентрації нанести в залежності від часу для відображення інтенсивності їх утворення та розкладання. Основним продуктом розпаду вважається будь-яка сполука, кількість якої перевищує 10% від введеної дози у будь-який час протягом дослідження.

Затримані леткі речовини свідчать про здатність до випаровування дослідної речовини або її похідних у ґрунті.

Більш точні значення періодів напіврозпаду або DT та, якщо 50

застосовуються,  DT    та  DT     отримуються   шляхом   виконання
                   75        90
розрахунків  за відповідною кінетичною моделлю.  Період піврозпаду
та DT   повинні фіксуватись у звіті,  так само як опис моделі,  що

використовується,  кінетичний  порядок  та  коефіцієнт  визначення
  2

(r ). Перевага надається кінетиці першого порядку до тих пір, поки 2

r  < 0,7. За можливості, розрахунки повинні також виконуватись для
основних  продуктів  перетворення.  Приклади  відповідних  моделей
описуються в посиланнях 31-35.

У випадку, якщо дослідження виконуються при різних температурах, інтенсивність перетворення повинна описуватись як функція температури в межах дослідного діапазону, використовуючи залежність Ареніуса, що має такий вигляд:

-B/T                  B
     k = A · e     or ln k = 1nA - ---
                                    T

де ln A та В - константи регресії, отримані з вільного члена та кута нахилу кривої найбільшої відповідності, побудованої за лінійною регресією ln k в залежності від 1/Т, k - константа інтенсивності за температури Т і Т - температура в Кельвінах. Необхідно звернути увагу на те, що рівняння Ареніуса справджується лише для певного діапазону температури, у випадку, якщо перетворення зумовлюється дією мікроорганізмів.

2.2. ОЦІНКА ТА ПОЯСНЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

Хоча дослідження виконується в лабораторних умовах, його результати дозволяють оцінювати інтенсивність перетворення дослідної сполуки, а також інтенсивність утворення та розкладання її похідних у польових умовах (36)(37).

Дослідження шляхів перетворення сполуки дає інформацію про те, яких структурних змін зазнає дослідна речовина у ґрунті під дією хімічних та мікробних реакцій.

3. ЗВІТУВАННЯ

ЗВІТ ПРО ДОСЛІДЖЕННЯ

Звіт про дослідження повинен включати наступні дані:

Дослідна речовина:

- загальна назва, хімічна назва, номер CAS, структурна формула (розташування міток, якщо використовуються мічені ізотопи) та відповідні фізико-хімічні властивості (див. Розділ 1.5),

- чистота (домішки) дослідної речовини,

- радіохімічна чистота мічених елементів та питома радіоактивність (якщо використовується).

Стандартні речовини

- хімічна назва та структура стандартних речовин, що використовуються для аналізу та/або визначення продуктів перетворення.

Дослідні ґрунти

- відомості про місце відбору зразків,

- дату і процедуру відбору зразків ґрунту,

- характеристики ґрунту, такі як рН, вміст органічного вуглецю, структура (% піску, % мулу, % глини), здатність до катіонового обміну, об'ємна густину, властивості щодо утримання вологи і мікробна біомаса,

- довжина складування ґрунту і умови складування (якщо він складується).

Умови досліду:

- дати проведення дослідів,

- об'єм дослідної речовини, що використовувалась,

- розчини, що використовувались і метод застосування дослідної речовини,

- вага ґрунту, що піддавався початковій обробці і з якого відбирались зразки в кожний з визначених періодів для аналізу,

- опис інкубаційної системи, що використовувалась,

- рівні потоку повітря (тільки для повітря, що проходило через систему),

- температура експериментальної настройки,

- вміст вологи в ґрунті впродовж інкубації,

- об'єм мікробної біомаси на початку, впродовж і після завершення аеробних дослідів,

- концентрація рН, кисню і окисно-відновлюваного потенціалу на початку, впродовж і після завершення анаеробних дослідів і дослідів на рисовому полі,

- метод (методи) добування,

- метод кількісного аналізу та ідентифікації дослідної речовини і основних продуктів трансформації в ґрунті та абсорбуючих матеріалах,

- кількість повторів і контролів.

Результати:

- результати визначення мікробної активності,

- повторюваність і чутливість аналітичних методів, що використовувались,

- ступінь відновлення (% значення для досліду зазначені в секції 1.7.1),

- таблиці результатів, виражених у вигляді % від застосованої -1

початкової дози,  якщо необхідно,  як мг·кг   ґрунту (на  підставі
ваги в сухому стані),

- баланс мас впродовж і після закінчення дослідів,

- характеристика невід'ємної (прив'язаної) радіоактивності або залишків в ґрунті,

- кількісна оцінка викиду СО та інших летючих складових, 2

- відношення концентрації ділянок ґрунту до часу,

- необхідного для дослідної речовини і, якщо необхідно, для основних продуктів перетворення,

- період напіврозпаду DT , DT і DT для дослідної 50 75 90

речовини і,  якщо необхідно,  для основних продуктів перетворення,
включаючи межі достовірності,

- оцінка рівня абіотичної деградації в стерильних умовах,

- оцінка кінетики трансформації для дослідної речовини і, якщо необхідно, для основних продуктів трансформації, запропоновані шляхи трансформації, якщо необхідно,

- обговорення та інтерпретація результатів,

- вихідні дані (наприклад, хроматограми зразку, розрахунки щодо рівня трансформації зразка і засоби для ідентифікації продуктів трансформації).

4. ПОСИЛАННЯ

(1) US - Environmental Protection Agency, (1982) Pesticide Assessment Guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environmental Fate.

(2) Agriculture Canada, (1987) Environmental Chemistry and Fate. Guidelines for registration of pesticides in Canada.

(3) European Union (EU), (1995) Commission Directive 95/36/EC of 14 July 1995 amending Council Directive 91/414/EEC concerning the placing of plant protection products on the market. Annex II, Part A and Annex III, Part A: Fate and Behaviour in the Environment.

(4) Dutch Commission for Registration of Pesticides, (1995) Application for registration of a pesticide. Section G: Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air.

(5) BBA, (1986) Richtlinie fur die amtliche Prufung von Pflanzenschutzmitteln, Teil IV, 4-1. Verbleib von Pflanzenschutzmitteln im Boden - Abbau, Umwandlung und Metabolismus.

(6) ISO/DIS 11266-1, (1994) Soil Quality - Guidance on laboratory tests for biodegradation of organic chemicals in soil - Part 1: Aerobic conditions.

(7) ISO 14239, (1997) Soil Quality - Laboratory incubation systems for measuring the mineralisation of organic chemicals in soil under aerobic conditions.

(8) SETAC, (1995) Procedures for Assessing the Environmental Fate and Ecotoxicity of Pesticides. Mark R. Lynch, Ed.

(9) MAFF - Japan 2000 - Draft Guidelines for transformation studies of pesticides in soil - Aerobic metabolism study in soil under paddy field conditions (flooded).

(10) OECD, (1995) Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/Sediments. Belgirate, Italy, 18-20 January 1995.

(11) Guth, J.A., (1980) The study of transformations. In Interactions between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, Ed.), Academic Press, p. 123-157.

(12) DFG: Pesticide Bound Residues in Soil. Wiley - VCH (1998).

(13) T.R. Roberts: Non-extractable pesticide residue in soils and plants. Pure Appl. Chem. 56, 945-956 (IUPAC 1984).

(14) OECD Test Guideline 304 A: Inherent Biodegradability in Soil (adopted 12 May 1981).

(15) ISO 10381-6 (1993) Soil Quality - Sampling - Part 6: Guidance on the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.

(16) Appendix V to Directive 67/548/EEC.

(17) Guth, J.A., (1981) Experimental approaches to studying the fate of pesticides in soil. In Progress in Pesticide Biochemistry. D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds. J. Wiley & Sons. Vol 1, 85-114.

(18) Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 26:305 (1962).

(19) Methods of Soil Analysis (1986) Part 1, Physical and Mineralogical Methods. A. Klute, Ed.) Agronomy Series No 9, 2nd Edition.

(20) Methods of Soil Analysis (1982) Part 2, Chemical and Microbiological Properties. A.L. Page, R.H. Miller and D.R. Kelney, Eds. Agronomy Series No 9, 2nd Edition.

(21) ISO Standard Compendium Environment (1994) Soil Quality - General aspects; chemical and physical methods of analysis; biological methods of analysis. First Edition.

(22) Muckenhausen, E., (1975) Die Bodenkunde und ihre geologischen, geomorphologischen, mineralogischen und petrologischen Grundlagen. DLG-Verlag, Frankfurt, Main.

(23) Scheffer, F., Schachtschabel, P., (1975) Lehrbuch der Bodenkunde. F. Enke Verlag, Stuttgart.

(24) Anderson, J.P.E., Domsch, K.H., (1978) A physiological method for the quantitative measurement of microbial biomass in soils. Soil Biol. Biochem. 10, p. 215-221.

(25) ISO 14240-1 and 2 (1997) Soil Quality - Determination of soil microbial biomass - Part 1: Substrateinduced respiration method. Part 2: fumigation-extraction method.

(26) Anderson, J.P.E., (1987) Handling and storage of soils for pesticide experiments. In Pesticide Effects on Soil Microflora. L. Somerville, M.P. Greaves, Eds. Taylor & Francis, 45-60.

(27) Kato, Yasuhiro. (1998) Mechanism of pesticide transformation in the environment: Aerobic and biotransformation of pesticides in aqueous environment. Proceedings of the 16th Symposium on Environmental Science of Pesticide, p. 105-120.

(28) Keuken O., Anderson J.P.E., (1996) Influence of storage on biochemical processes in soil. In Pesticides, Soil Microbiology and Soil Quality, 59-63 (SETAC-Europe).

(29) Stenberg B., Johansson M., Pell M., Sjodahl-Svensson K., Stenstrom J., Torstensson L. (1996) Effect of freeze and cold storage of soil on microbial activities and biomass. In Pesticides, Soil Microbiology and Soil Quality, 68-69 (SETAC-Europe).

(30) Gennari, M., Negre, M., Ambrosoli, R., (1987) Effects of ethylene oxide on soil microbial content and some chemical characteristics. Plant and Soil 102, p. 197-200.

(31) Anderson, J.P.E. (1975) Einfluss von Temperatur und Feuchte auf Verdampfung, Abbau und Festlegung von Diallat im Boden. Z. PflKrankh Pflschutz, Sonderheft VII, p. 141-146.

(32) Hamaker, J.W., (1976) The application of mathematical modelling to the soil persistence and accumulation of pesticides. Proc. BCPC Symposium: Persistence of Insecticides and Herbicides, p. 181-199.

(33) Goring, C.A.I., Laskowski, D.A., Hamaker, J.W., Meikle, R.W., (1975) Principles of pesticide degradation in soil. In 'Environmental Dynamics of Pesticides'. R. Haque and V.H. Freed, Eds., p. 135-172.

(34) Timme, G., Frehse, H., Laska, V., (1986) Statistical interpretation and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues. II. Pflanzenschutz - Nachrichten Bayer 39, p. 188-204.

(35) Timme, G., Frehse, H., (1980) Statistical interpretation and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues. I. Pflanzenschutz - Nachrichten Bayer 33, p. 47-60.

(36) Gustafson D.I., Holden L.R., (1990) Non-linear pesticide dissipation in soil; a new model based on spatial variability. Environm. Sci. Technol. 24, p. 1032-1041.

(37) Hurle K., Walker A., (1980) Persistence and its prediction. In Interactions between Herbicides and the Soil R.J. Hance, Ed.), Academic Press, p. 83-122.

Додаток 1

ВОДЯНИЙ ТИСК, ПОЛЬОВА ВОЛОГОЄМНІСТЬ (FC) І ЗДАТНІСТЬ ДО ВОДОУТРИМАННЯ (WHC)(1)

------------------------------------------------------------------
| Висота водного стовпа |pF(а)|  bar(b)  |       Примітки        |
|          (см)         |     |          |                       |
|-----------------------+-----+----------+-----------------------|
|  7                    |     |  4       |                       |
|10                     |7    |10        |Сухий грунт            |
|-----------------------+-----+----------+-----------------------|
|      4                |     |          |                       |
|1,6·10                 |4,2  |16        |Точка в'янення         |
|-----------------------+-----+----------+-----------------------|
|  4                    |     |          |                       |
|10                     |4    |10        |                       |
|-----------------------+-----+----------+-----------------------|
|  3                    |     |          |                       |
|10                     |3    |1         |                       |
|-----------------------+-----+----------+-----------------------|
|    2                  |     |          |                       |
|6·10                   |2,8  |0,6       |                       |
|-----------------------+-----+----------+-----------------------|
|      2                |     |          |                       |
|3,3·10                 |2,5  |0,33(с)   |                       |
|-----------------------+-----+----------|                       |
|  2                    |     |          |  Діапазон польової    |
|10                     |2    |0,1       |} вологоємності(d)     |
|-----------------------+-----+----------|                       |
|60                     |1,8  |0,06      |                       |
|-----------------------+-----+----------|                       |
|33                     |1,5  |0,033     |                       |
|-----------------------+-----+----------+-----------------------|
|10                     |1    |0,01      |WHC (приблизно)        |
|-----------------------+-----+----------+-----------------------|
|1                      |0    |0,001     |Грунт, насичений водою |
------------------------------------------------------------------

----------------

(а) pF = логарифм см водного стовпа.

5 (b) bar = 10 Па.

(с) Відповідає приблизному вмісту води 10% в піску, 35% в глинистому піску, 45% в глині.

(d) Польова вологоємність не є сталою величиною, а змінюється в діапазоні pF від 1,5 до 2,5.

Водяний тиск вимірюється в см водного стовпа або в барах. Через велике значення капілярного тиску він виражається просто як значення pF, еквівалентне логарифму водного стовпа.

Польова вологоємність визначається як обсяг води, що може зберігатись, не зважаючи на природну гравітацію землі впродовж двох днів після тривалого періоду опадів або після відповідного поливу. Визначається в непорушеному ґрунті in situ на полі. Ці виміри, однак, не можуть застосовуватись до порушених лабораторних зразків ґрунту. Значення FC, визначені в порушеному ґрунті, можуть виявити більш значні систематичні відхилення.

Здатність до водоутримання (WHC) визначається в лабораторії з використанням порушеного і непорушеного ґрунту шляхом насичення водою стовпа ґрунту завдяки капілярному руху. Цей показник зокрема застосовується для порушеного ґрунту і його значення можу бути до 30% більшим від польової вологоємності(1). Визначення цього показника експериментальним шляхом є легшим від визначення достовірної величини FC.

Примітки.

(1) Muckenhausen, E., (1975) Die Bodenkunde und ihre geologischen, geomorphologischen, mineralogischen und petrologischen Grundlagen. DLG-Verlag, Frankfurt, Main.

Додаток 2

ВМІСТ ВОЛОГИ В ҐРУНТІ (г води на 100 г сухого ґрунту) РІЗНИХ ТИПІВ ҐРУНТУ В РІЗНИХ КРАЇНАХ

------------------------------------------------------------------
|       Тип ґрунту       |  Країна  |  Вміст вологи в ґрунті при |
|                        |          |----------------------------|
|                        |          | WHC(1) |pF = 1,8 |pF = 2,5 |
|------------------------+----------+--------+---------+---------|
|          Пісок         |Німеччина |  28,7  |   8,8   |   3,9   |
|------------------------+----------+--------+---------+---------|
|    Глинистий пісок     |Німеччина |  50,4  |  17,9   |  12,1   |
|------------------------+----------+--------+---------+---------|
|    Глинистий пісок     |Швейцарія |  44,0  |  35,3   |   9,2   |
|------------------------+----------+--------+---------+---------|
|Мулисто-глинистий ґрунт |Швейцарія |  72,8  |  56,6   |  28,4   |
|------------------------+----------+--------+---------+---------|
|    Важкий суглинок     | Бразилія |  69,7  |  38,4   |  27,3   |
|------------------------+----------+--------+---------+---------|
|    Важкий суглинок     |  Японія  |  74,4  |  57,8   |  31,4   |
|------------------------+----------+--------+---------+---------|
|    Пісковий суглинок   |  Японія  |  82,4  |  59,2   |  36,0   |
|------------------------+----------+--------+---------+---------|
|Мулисто-глинистий ґрунт |    США   |  47,2  |  33,2   |  18,8   |
|------------------------+----------+--------+---------+---------|
|    Пісковий суглинок   |    США   |  40,4  |  25,2   |  13,3   |
|----------------------------------------------------------------|
|(1) Здатність до водо утримання.                                |
------------------------------------------------------------------

Додаток 3

Малюнок 1

Приклад проточного апарату для дослідження трансформації хімічних речовин в ґрунті(1) (2) ( 994_b14 )

Малюнок 2

Приклад біометро-подібної колби для дослідження трансформації хімічних речовин в ґрунті ( 994_b14 )

----------------

(1) Guth, J.A., (1980) The study of transformations. In Interactions between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, Ed.), Academic Press, p. 123-157.

(2) Guth, J.A., (1981) Experimental approaches to studying the fate of pesticides in soil. In Progress in Pesticide Biochemistry. D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds. J. Wiley & Sons. Vol 1, p. 85-114.

(3) Anderson, J.P.E., (1975) Einfluss von Temperatur und Feuchte auf Verdampfung, Abbau und Festlegung von Diallat im Boden. Z. PflKrankh Pflschutz, Sonderheft VII, p. 141-146.

С.24. АЕРОБНІ І АНАЕРОБНІ ТРАНСФОРМАЦІЇ В СИСТЕМІ ВОДНИХ ОСАДІВ

1. МЕТОД

Цей дослід є копією OECD TG 308 (2002).

1.1. ВСТУП

Хімічні речовини можуть потрапляти в поверхневі або глибинні води такими шляхами як безпосереднє попадання, знос розпилення, стікання, дренаж, видалення відходів або стокових вод і атмосферне осідання. Цей метод дослідження описує лабораторний метод оцінки аеробних і анаеробних трансформацій органічних хімікатів в системі водних осадів. Він базується на існуючих вказівках (1)(2)(3)(4)(5)(6). На Семінарі OECD, присвяченому питанням вибору грунтів та осадів, що проводився в м. Белджірате, Італія в 1995 р. (7), було досягнуто згоди про кількість і тип осадів для використання в цьому досліді. На семінарі також було надано рекомендації щодо збору, утримання і зберігання зразків осадів, на підставі вказівок ISO (8). Такі досліди є обов'язковими для хімікатів, що безпосередньо контактують з водою, або які можуть потрапити в водне середовище шляхами, що описані вище.

Умови в природних системах водних осадів є часто аеробними в верхній водній фазі. Поверхневий шар осаду може бути аеробним або анаеробним, в той час, коли більш глибокі осади є звичайно анаеробними для реалізації цих можливостей в цьому документі описані як аеробний, так і анаеробний досліди. Аеробний дослід моделює аеробний водяний стовп над аеробним шаром осаду, під яким знаходиться анаеробний градієнт. Анаеробний дослід повністю моделює анаеробну систему водних осадів. Якщо обставини вимагають необхідності значно відхилитись від цих рекомендацій, наприклад, у випадку використання проб неушкодженого осаду або осадів, що могли взаємодіяти з дослідною речовиною, для цих цілей можна використовувати інші методи (9).

1.2. ВИЗНАЧЕННЯ

В будь-якому випадку необхідно використовувати Стандартні Міжнародні Одиниці виміру (SI).

Дослідна речовина: будь-яка речовина, батьківське сполучення або відповідні продукти трансформації.

Продукти трансформації: всі речовини, що утворились внаслідок біотичних або абіотичних реакцій дослідної речовини включаючи СО 2 або зв'язані залишки.

Зв'язані залишки: "Зв'язані залишки" представляють собою зв'язки в ґрунті, рослинах або тваринах, які залишаються в матриці в формі батьківської речовини або її метаболіту (метаболітів) після екстракції. Метод екстракції не повинен значно змінювати самі складники або структуру матриці. Структура зв'язку може бути частково пояснена за допомогою методів екстракції зміни матриці і складних аналітичних технік. До теперішнього часу, наприклад, таким способом були ідентифіковані ковалентні іонні і сорбційні зв'язки і вловлювачі. Взагалі утворення зв'язаних залишків значно знижує біодоступність і біопристосовуваність (10) (модифіковано з IUPAC 1984 911)).

Аеробні трансформації: (окислення): реакція, що відбувається в присутності молекулярного кисню (12).

Анаеробні трансформації: (відновлення): реакція, що відбувається за відсутністю молекулярного кисню (12).

Природні води: поверхневі води ставків, річок, джерел, і т.ін.

Осад: суміш мінеральних і органічних хімічних складових, при чому останні містять зв'язки з високим вмістом вуглецю і азоту зі значними молекулярними масами. Вони відкладається поблизу природних вод і формують поверхню розділу з водою.

Мінералізація: повний розклад органічної складової на СО і 2

Н О  в  аеробних  умовах і СН ,  СО  і Н О в анаеробних умовах,  В
 2                           4     2    2
контексті цього методу проведення досліду,  якщо  використовується
мічений  радіо-ізотоп,  мінералізація означає екстенсивний розклад
молекули впродовж якого  атом  міченого  вуглецю  окислюється  або
                                                             14
відновлюється  кількісно  з виділенням відповідної кількості   СО
                                                                 2
    14
або   СН  відповідно.
        4

Період напіврозпаду, t - це час, необхідний для 50% 0,5

перетворення  дослідної  речовини,  якщо  трансформація  може бути
описана кінетикою першого порядку;  ця величина  не  залежить  від
початкової концентрації.

DT (Час видалення 50): це час, впродовж якого початкова 50

концентрація дослідної речовини зменшується на 50%.

DT (Час видалення 75): це час, впродовж якого початкова 75

концентрація дослідної речовини зменшується на 75%.

DT (Час видалення 90): це час, впродовж якого початкова 90

концентрація дослідної речовини зменшується на 90%.

1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ

Еталонні речовини використовуються для ідентифікації і кваліфікації продукті в трансформації за допомогою спектроскопічних і хроматографічних методів.

1.4. ІНФОРМАЦІЯ ЩОДО ДОСЛІДНОЇ РЕЧОВИНИ

Для вимірювання діапазону трансформації може використовуватись немічена або мічена ізотопом дослідна речовина, однак, перевагу віддається міченому матеріалу. Мічений матеріал є обов'язковим для вивчення шляху трансформації і для встановлення 14

масового балансу.  Рекомендується    С-мічення,  але  використання
                             13    15    3    32
інших  ізотопів,  таких  як    С,    N,   Н,    Р  також може бути
корисним.  Наскільки це можливо, мічення розташовується в найбільш
стабільній   частині   (частинах)   молекули(1).   Хімічна   і/або
радіохімічна чистота дослідної речовини повинна складати принаймні
95%.

----------------

(1) Наприклад, якщо речовина містить одне кільце, маркування цього кільця є необхідним; якщо дослідна речовина містить два або більше кілець, може виникнути необхідність в проведенні декількох дослідів для оцінювання процесів, що відбуваються в кожному окремому кільці і для отримання необхідної інформації щодо формування продуктів трансформації.

До початку досліду необхідно отримати наступну інформацію щодо дослідної речовини:

(а) розчинність в воді (Метод А.6);

(b) розчинність в органічних розчинниках;

(с) тиск пари (Метод А.4) і постійна закону Генрі;

(d) коефіцієнт розподілу n-октанолу/води (Метод А.8);

(е) коефіцієнт адсорбції (K , K або K якщо необхідно) d f oc

(Метод С.18);

(f) гідроліз (Метод С.7);

(g) постійна дисоціації (рК ) (Вказівки OECD 112) (13); a

(h) хімічна структура дослідної речовини і положення міченого ізотопу (ізотопів), якщо необхідно.

Примітка: в звіті необхідно зазначити температуру, при якій проводились виміри.

Інша корисна інформація може включати в себе дані щодо токсичності дослідної речовини для мікроорганізмів, дані щодо повного і/або внутрішнього біорозпаду, а також дані щодо аеробних і анаеробних трансформацій в ґрунті.

Необхідно використовувати аналітичні методи (включаючи методи екстракції та очищення) для ідентифікації і кваліфікації дослідної речовини і продуктів трансформації в воді і осаді (дивіться Розділ 1.7.2.).

1.5. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ

В методі, описаному в цьому досліді використовуються аеробні та анаеробні системи водних осадів (дивіться Додаток 1), які дозволяють:

- виміряти діапазон трансформації дослідної речовини в системі водного осаду,

- виміряти діапазон трансформації дослідної речовини в осаді,

- виміряти діапазон мінералізації дослідної речовини і/або 14

продуктів  трансформації  (при  використанні   С-міченої дослідної
речовини),

- здійснити ідентифікацію і кількісну оцінку продуктів в водній і осадовій фазах, включаючи масовий баланс (при використання міченої речовини),

- виміряти розподілення дослідної речовини і продуктів її трансформації між двома фазами впродовж періоду інкубації в темному місці (для уникнення, наприклад, цвітіння води) при постійній температурі. Значення періодів напіврозпаду DT , DT і 50 75 DT визначаються там, де це підтверджується даними, але не 90

повинні екстраполюватись далеко за експериментальні межі (дивіться
Розділ 1.2.).

Використовується принаймні два осади і пов'язані з ними види води для аеробного і анаеробного досліду відповідно (7). Однак, в деяких випадках, якщо необхідно використовувати більше двох осадів, наприклад, для хімічної речовини, що може бути присутньою в прісноводному і/або морському середовищі.

1.6. ЗАСТОСУВАННЯ ДОСЛІДУ

Взагалі метод може застосовуватись для хімічних речовин (з ізотопним міченням або без нього), для яких може бути застосовано аналітичний метод з достатньою чутливістю і точністю. Метод можна застосовувати до слабо летючих або не летючих зв'язків, що розчиняються або не розчиняються в воді. Дослід не повинен застосовуватись до хімічних речовин з високим ступенем летючості з води (наприклад: фуміганти, органічні розчинники), які не можуть бути затримані в воді і/або осаді в експериментальних умовах досліду.

Цей метод застосовувався для вивчення трансформації хімічних речовин в прісних водах і осадах, але в принципі, його також можна застосовувати для естуарних/морських систем. Моделювання цих умов в проточній воді (наприклад, в річках) або у відкритому морі є недоцільним.

1.7. ЯКІСНІ КРИТЕРІЇ

1.7.1. Відновлення

Екстракція та аналіз принаймні подвійних проб вод і осадів негайно після додання дослідної речовини дає першу вказівку щодо повторюваності аналітичного методу і однорідності процедури, що застосовується для дослідної речовини. Відновлення на більш пізніх стадіях експериментів визначаються відповідними масовими балансами (при використанні міченого матеріалу). Рівень відновлюваності повинен складати від 90% до 11% для мічених хімічних речовин (6) і від 70% до 110% для не мічених хімічних речовин.

1.7.2. Повторюваність і чутливість аналітичного методу

Повторюваність аналітичного методу (за виключенням початкової ефективності екстракції) для кількісної оцінки дослідної речовини і продуктів трансформації перевіряється за допомогою подвійного аналізу того самого екстракту зразків води або осаду, що пройшли достатньо тривалу інкубацію для утворення продуктів трансформації.

Нижня межа чутливості (LOD) аналітичного методу для дослідної речовини і для продуктів трансформації повинна складати принаймні -1

0,01 мг·кг   в воді або осаді (для дослідної речовини) або 1%  від
початкового  об'єму,  що  застосовується для дослідної системи.  В
залежності від  того,  яке  значення  є  меншим.  Необхідно  також
зазначити межу кількісного визначення (LOQ).

1.7.3. Точність даних трансформації

Регресивний аналіз концентрацій дослідної речовини як функція часу надає відповідну інформацію щодо точності кривої трансформацій і дозволяє виконати розрахунки меж достовірності для періодів напіврозкладу (якщо застосовується псевдо кінетика першого рівня) або значень DT , і якщо необхідно DT і DT . 50 75 90

1.8. ОПИС МЕТОДУ

1.8.1. Дослідна система і апарат

Дослід проводиться в скляних контейнерах (наприклад, пляшках, центрифужних пробірках), окрім випадків, коли попередня інформація (наприклад, коефіцієнт розподілу n-октанолу, дані щодо сорбції) вказує на те, що дослідна речовина може прилипати до скла, в цьому випадку, необхідно розглянути можливість використання альтернативного матеріалу (такого як тефлон). Якщо дослідна речовина відома як така, що прилипає до скла, цю проблему можна зменшити одним або декількома з нижченаведених методів:

- визначити масу дослідної речовини і продуктів трансформації, що абсорбуються склом,

- після закінчення досліду промити розчином всі скляні поверхні,

- використовувати продукти з розробленою рецептурою (також дивіться Розділ 1.9.2.),

- використовувати в системі додатковий об'єм допоміжного розчинника з дослідною речовиною; якщо використовується допоміжний розчинник, він повинен бути таким, що не розщеплює дослідну речовину.

Прикладами типових дослідних апаратів можуть бути системи проточного і біометричного типу, які показані в Додатках 2 і 3 відповідно (14). Інші прийнятні інкубаційні системи описані в посилання 15. Конструкція експериментального апарату повинна дозволяти обмін повітря або азоту і вловлювання летючих продуктів. Габарити апарату повинні відповідати вимогам щодо проведення досліду (дивіться Розділ 1.9.1). Вентиляція забезпечується або слабким барботуванням або пропусканням повітря або азоту через поверхню води. В останньому випадку рекомендується незначне помішування води згори для кращого розподілу кисню або азоту в воді. Повітря, вільне від СО не може використовуватись в досліді, 2

оскільки  це  може  призвести  до  підвищення  рівня рН в воді.  В
будь-якому випадку порушення осаду є небажаним  і  його  необхідно
уникати, наскільки це можливо. Хімічні речовини, що мають незначну
летючість можуть досліджуватись в  системі  біометричного  типу  з
незначним помішуванням поверхні води.  Замкнені посудини, що мають
повітряний або азотних шар вгорі, або азотні і внутрішні скляночки
для вловлювання летючих продуктів можуть також використовуватись в
досліді (16).  Регулярний обмін верхнього газу є обов'язковим  при
проведенні  аеробних дослідів з метою компенсації поглинання кисню
біомасою.

Відповідні вловлювачі для збирання летючих продуктів -3

трансформації включають але не обмежуються 1 моль· дм    розчинами
гідроксиду  калію  або  гідроксиду натрію для діоксиду вуглецю(1),
етиленгліколю,  етанол  аміну  або  2%  парафіну  в  ксилоні   для
органічних складових. Летючі, сформовані в анаеробних умовах, такі
як метан,  можуть збиратись,  наприклад,  в молекулярні сита. Такі
летючі можуть перетворюватись, наприклад, в СО  шляхом пропускання
                                              2
газу через  кварцову  трубу,   заповнену   CuO   при   температурі
900 град.С  і вловлювання СО ,  що утворився в абсорбері з основою
                            2

(17).

----------------

(1) Оскільки ці лужні абсорбуючі розчини також поглинають двоокис вуглецю з вентиляційного повітря, і повітря, що утворюється в наслідок дихання, в аеробних експериментах, їх необхідно регулярно змінювати для уникнення сатурації, що в свою чергу може призвести до втрати абсорбуючих властивостей.

Виконання лабораторних досліджень для хімічного аналізу дослідної речовини і продуктів трансформації (наприклад, хроматографії з рідким газом (GLC), високоефективної рідинної хроматографії (HPLC), тонкошарової хроматографії (TLC), мас-спектроскопії (MS), газ-хроматографії-мас-спектроскопії (GC-MS), рідинної хроматографії - мас-спектрометрії (LC-MS), ядерного агнітного резонансу (NMR), і т.ін.), включаючи системи визначення для хімічних речовин з радіо-міченням або без нього, в залежності від вимог. Якщо використовується матеріал з радіо-міченням, використання рідинного сцинтиляційного лічильника і окислювача згоряння (для спалювання зразків осаду до аналізу радіоактивності) також може бути необхідним.

Використання іншого стандартного лабораторного обладнання для визначення фізико-хімічних і біологічних характеристик (дивіться Розділ Таблицю 1, Розділ 1.8.2.2), скляних приладів, хімікатів і реагентів є доцільним.

1.8.2. Вибір і кількість водних осадів

Місця для відбору зразків вибираються у відповідності до мети досліду в кожній конкретній ситуації. При виборі місць для відбору зразків, необхідно врахувати історію можливого впливу сільськогосподарської, промислової або місцевої діяльності на стан верхів'я водних джерел. Осади не можуть використовуватись, якщо вони забруднені дослідною речовиною або її структурними аналогами впродовж попередніх чотирьох років.

1.8.2.1. Вибір осаду

Для аеробних дослідів звичайно використовується два осади (7). Осади повинні відрізнятись за вмістом органічного вуглецю і структурою. Один осад повинен мати високий вміст органічного вуглецю (2,6-7,5%) і тонкозернисту структуру, інший осад повинен мати низький вміст органічного вуглецю (0,5-2,5%) і крупнозернисту структуру. Звичайно різниця між вмістом органічного вуглецю повинна складати принаймні 2%. "Тонкозерниста структура" визначається як структура, вміст (глини+мулу)(1), якої > 50%, а крупнозерниста структура визначається як структура, вміст (глини+мулу), якої < 50%. Різниця між вмістом (глини+мулу) двох осадів повинна складати принаймні 20%. У ВИПАДКАХ, коли хімічна речовина може також потрапляти до морських вод, принаймні одна з систем водного осаду повинна мати морське походження.

----------------

(1) (глина + мул) є мінеральною фракцією осаду з розміром часток < 50 мю м.

Для анаеробного дослідження стерильності зразки двох осадів (включаючи пов'язану з ними воду) повинні відбиратись з анаеробних зон відкритих водоймищ (7). Фази як осаду так і води необхідно зберігати і транспортувати обережно, виключаючи потрапляння кисню.

При виборі осадів можуть мати значення також інші параметри, які необхідно враховувати в окремих випадках. Наприклад, рівень рН в осаді може бути важливим для дослідження хімічних речовин для яких трансформація і /або сорбція може залежати від рН. Залежність сорбції від рН відображується рК дослідної речовини. a

1.8.2.2. Визначення характеристик зразків водного осаду

Основні параметри води і осаду вимірюється і включаються у звіт (з посиланням на метод, що застосовувався), а фаза досліду, на якій ці параметри мають бути визначені пізніше зводяться в Таблицю. Для інформації, методи визначення цих параметрів надаються в посиланнях (18)(19)(20)(21).

Крім того, в деяких випадках може виникнути необхідність у визначенні і внесені до звіту інших параметрів (наприклад, для прісної води: наявність часток, лужність, твердість, провідність, NO /PO (відношення і значення); для осадів: здатність до 3 4

катіонного  обміну,  здатність  до   водоутримання,  вміст,  вміст
вуглекислої  солі,  загальний  вміст  азоту і фосфору;  для систем
морської води: вміст солі). Аналіз осадів і води на вміст нітрату,
сульфату,  біодоступного  заліза,  і  можливо,  інших  електронних
акцепторів   може    бути    корисним    для    оцінювання    умов
окислювально-відновного   процесу,  зокрема,  відносно  анаеробної
трансформації.

Визначення параметрів для складання характеристик
                зразків водного осаду (7)(22)(23)

----------------------------------------------------------------------------------------------
|    Параметр      |                        Фаза процесу дослідження                         |
|                  |-------------------------------------------------------------------------|
|                  |   Відбір  |  Подальше |   Початок   |  Початок  |  Під час  | Закінчення|
|                  | зразків в |перенесення|акліматизації|дослідження|дослідження|дослідження|
|                  |натуральних|           |             |           |           |           |
|                  |   умовах  |           |             |           |           |           |
|--------------------------------------------------------------------------------------------|
|Вода                                                                                        |
|--------------------------------------------------------------------------------------------|
|Походження/джерело|    Х      |           |             |           |           |           |
|------------------+-----------+-----------+-------------+-----------+-----------+-----------|
|Температура       |    Х      |           |             |           |           |           |
|------------------+-----------+-----------+-------------+-----------+-----------+-----------|
|рН                |    Х      |           |      Х      |     Х     |     Х     |     Х     |
|------------------+-----------+-----------+-------------+-----------+-----------+-----------|
|ТОС               |           |           |      Х      |     Х     |     Х     |     Х     |
|------------------+-----------+-----------+-------------+-----------+-----------+-----------|
|Концентрація О (*)|    Х      |           |      Х      |     Х     |     Х     |     Х     |
|              2   |           |           |             |           |           |           |
|------------------+-----------+-----------+-------------+-----------+-----------+-----------|
|Потенціал         |           |           |      Х      |     Х     |     Х     |     Х     |
|окислювально-     |           |           |             |           |           |           |
|відновлювального  |           |           |             |           |           |           |
|процесу(*)        |           |           |             |           |           |           |
----------------------------------------------------------------------------------------------

----------------------------------------------------------------------------------------------
|     Параметр     |                        Фаза процесу дослідження                         |
|                  |-------------------------------------------------------------------------|
|                  |   Відбір  |  Подальше |   Початок   |  Початок  |  Під час  | Закінчення|
|                  | зразків в |перенесення|акліматизації|дослідження|дослідження|дослідження|
|                  |натуральних|           |             |           |           |           |
|                  |   умовах  |           |             |           |           |           |
|--------------------------------------------------------------------------------------------|
|Осад                                                                                        |
|--------------------------------------------------------------------------------------------|
|Походження/джерело|    Х      |           |             |           |           |           |
|------------------+-----------+-----------+-------------+-----------+-----------+-----------|
|Глибина шару      |    Х      |           |             |           |           |           |
|------------------+-----------+-----------+-------------+-----------+-----------+-----------|
|рН                |           |     Х     |      Х      |     Х     |     Х     |     Х     |
|------------------+-----------+-----------+-------------+-----------+-----------+-----------|
|Розподіл розміру  |           |     Х     |             |           |           |           |
|часток            |           |           |             |           |           |           |
|------------------+-----------+-----------+-------------+-----------+-----------+-----------|
|ТОС               |           |     Х     |      Х      |     Х     |           |     Х     |
|------------------+-----------+-----------+-------------+-----------+-----------+-----------|
|Мікробна біомаса  |           |     Х     |             |     Х     |           |     Х     |
|(*)               |           |           |             |           |           |           |
|------------------+-----------+-----------+-------------+-----------+-----------+-----------|
|Потенціал         |Огляд      |           |      Х      |     Х     |     Х     |     Х     |
|окислювально-     |(колір/    |           |             |           |           |           |
|відновлювального  |запах)     |           |             |           |           |           |
|процесу(*)        |           |           |             |           |           |           |
----------------------------------------------------------------------------------------------

----------------

(**) Метод частоти мікробіологічної респірації (26), метод фумігації (27) або визначення кількості мікроорганізмів посівом (наприклад, бактерій, актиноміцетів, грибків і загальних колоній) для аеробних дослідів рівень метаногенезу для анаеробних дослідів.

(**) Останні дослідження показують, що виміри концентрації кисню в воді і потенціалу окисно-відновлювальної реакції не можуть бути ані автоматизовані, ані передбачені, оскільки при здійсненні цих вимірів необхідно враховувати розвиток популяцій мікробів в відкритих водоймищах (24)(25). Визначення необхідного об'єму біохімічного кисню (BOD, при виборі зразків в натуральних умовах, початок і закінчення досліду) і концентрації мікро/макро поживних речовин Са, Mg і Mn (на початку і на закінченні досліду) в воді і визначення загального вмісту NiP в осадах (при відборі зразків в природних умовах і на закінченні досліду) може виявитись кращим засобом для тлумачення і оцінювання рівнів і шліхів аеробної біотрансформації.

1.8.3. Збір, транспортування і зберігання

1.8.3.1. Збір

Для відбору зразків осаду застосовується проект інструкції ISO щодо відбору зразків водних осадів (8). Зразки осаду відбираються з усього верхнього шару осаду, товщина якого складає від 5 до 10 см. Вода, пов'язана з цим осадом відбирається з того самого місця або місцевості і в той самий час, що і осад. Для анаеробних дослідів осад і пов'язана з ним вода відбираються і транспортуються без кисню (28) (дивіться Розділ 1.8.2.1). Деякі прилади для відбору зразків описані в літературі (8)(23).

1.8.3.2. Транспортування

Осад відділяється від води шляхом фільтрації і просіюється в мокрому стані через 2 мм сито з вживанням надлишку місцевої води, яку потім виливають. Наступні відомі кількості осадів і води змішуються з відповідною швидкістю (дивіться Розділ 1.9.1.) в інкубаційних колбах і підготовлюються впродовж періоду акліматизації (дивіться Розділ 1.8.4). Для анаеробних дослідів всі заходи щодо транспортування повинні виконуватись без кисню (29)(30)(31)(32)(33).

1.8.3.3. Зберігання

Необхідно використовувати свіжий зразок осаду і води, однак, якщо зберігання є необхідним, осад і вода просіюються як описано вище і зберігаються разом, покриті водою (товщина шару води 6-10 см) в темному місці при температурі 4 +- 2 град.С впродовж максимум чотирьох тижнів (7)(8)(23). Зразки, що мають бути використані, для аеробних дослідів зберігаються при вільному доступі повітря (наприклад, у відкритих контейнерах), а зразки для анаеробних дослідів - при відсутності кисню. Не можна допускати замерзання осаду і води, а також висихання осаду впродовж транспортування і зберігання.

1.8.4. Підготовка зразків осаду/води для проведення досліду

Дослідна речовина додається після закінчення періоду акліматизації, при цьому зразки осаду/води поміщаються в інкубаційних колбах, які потім використовуються в основному досліді, акліматизація проводиться в тих самих умовах, що і дослідна інкубація (дивіться Розділ 1.9.1.). Період акліматизації - це час, необхідний для досягнення системою відповідної стабільності, яка відображується в вигляді концентрації рН і кисню в воді, потенціалу окисно-відновлювального процесу в воді і макроскопічного відокремлення фаз. Період акліматизації звичайно триває від одного до двох тижнів і не повинен тривати більше чотирьох тижнів. Результати, отримані впродовж цього періоду мають бути включені до звіту.

1.9. ВИКОНАННЯ ДОСЛІДУ

1.9.1. Умови проведення досліду

Дослід проводиться в інкубаційному апараті (дивіться Розділ 1.8.1.) з відношенням "вода-осад" в межах 3:1 - 4:1 і товщиною шару осаду 2,5 см (+- 0,5 см). (1) Рекомендується використовувати кількість осаду 50 г (суха вага) для інкубаційної ємності.

----------------

(1) Нещодавні дослідження показали, що зберігання при 4 град.C може призвести до зменшення вмісту органічного вуглецю в осаді, що, можливо може призвести до зниження мікробної активності (34).

Дослід проводиться в темноті при постійній температурі в діапазоні 10-30 град.С. Температура (20 +- 2) град.С є прийнятною. Якщо необхідно, в деяких випадках можна розглянути нижчі рівні температур (наприклад, 10 град.С), в залежності від того, яку інформацію необхідно отримати в результаті досліду. Температура інкубації відстежується і включаться до звіту.

1.9.2. Обробка і застосування дослідної речовини

Використовується один дослідний рівень концентрації хімікату(2). Для хімікатів, призначених для захисту рослин, хімікати вводяться безпосередньо до водоймищ, максимальна доза мічення приймається як максимальний застосовуваний рівень, розрахований на підставі площі води в дослідній посудині. В усіх інших випадках концентрація, що використовується, визначається на підставі очікуваних викидів в навколишнє середовище. Необхідно звернути увагу на використання відповідної концентрації дослідної речовини для характеризування шляху трансформації, формування і відхилення продуктів трансформації. Може виявитись необхідним використання більш значних доз (наприклад, в 10 разів більших) в тих ситуаціях, коли концентрації дослідної речовини є близькими до межі визначення на початку досліду і/або коли основні продукти трансформації не можуть бути виявлені, якщо рівень застосовуваної дослідної речовини складає 10%. Однак, при використанні вищих дослідних концентрацій, вони не повинні викликати значного шкідливого ефекту на мікробну діяльність системи водного осаду. Для досягнення постійної концентрації дослідної речовини можна розглянути можливість регулювання кількості матерілу, що застосовується в посудинах різних розмірів, на підставі глибини водного стовпа в посудині відносно глибини води в певному місці (стандартним значенням глибини є 100 см, однак можна використовувати інші значення глибини). Дивіться Додаток 4 для ознайомлення з прикладами розрахунків.

----------------

(2) Дослід з другою концентрацією може бути корисним для хімікатів, що потрапляють в поверхневі води різними шляхами, призводячи до значних відхилень концентрації, оскільки більш низька концентрація може бути проаналізована з відповідною точністю.

В ідеальному випадку дослідна речовина застосовується в якості водного розчину в водній фазі дослідної системи. Якщо використання незначних кількостей розчинників, що змішуються з водою (наприклад, ацетону, етанолу) уникнути неможливо, дозволяється їх використання для покращення розподілу дослідної речовини, але об'єм цих речовин не повинен перевищувати 1% v/v і вони не повинні мати шкідливий ефект на мікробіологічну активність дослідної системи. При підготовці водних розчинів дослідної речовини необхідно вживати певних заходів безпеки - використання генераторних труб і попереднє змішування може бути доцільним для забезпечення повної гомогенності. Після додавання водного розчину до дослідної системи, рекомендується легке помішування водної фази, але при цьому рух осаду має бути мінімально можливим.

Використання продуктів з розробленою рецептурою, звичайно не рекомендується, оскільки інгредієнти рецептури можуть впливати на розподіл дослідної речовини і/або продукти трансформації між фазами води і осаду. Однак, для дослідних речовин, що слабо розчиняються в воді, використання матеріалів з розробленою рецептурою є прийнятною альтернативою.

Кількість інкубаційних пробірок залежить від кількості відбору зразків (дивіться Розділ 1.9.3). Необхідно використовувати достатню кількість дослідних систем, для того, щоб дві системи можна було знищити при кожному відборі зразків. Якщо використовуються контрольні прилади для кожної системи водних осадів, вони не повинні взаємодіяти з дослідною речовиною. Контрольні прилади можуть використовуватись для визначення мікробної біомаси осаду і загального вмісту органічного вуглецю в воді і осаді після завершення досліду. Два контрольних прилади (наприклад, один контрольний прилад для кожної водної системи) можуть використовуватись для відстеження необхідних параметрів в осаді і воді впродовж періоду акліматизації (дивіться таблицю в Розділі 1.8.2.2.) Необхідно використовувати два додаткових контрольних прилади у випадку, коли дослідна речовина потрапляє через розчин, для визначення шкідливого ефекту на мікробні активність дослідної системи.

1.9.3. Тривалість досліду і відбір зразків

Тривалість експерименту звичайно не повинна перевищувати 100 днів (6), експеримент повинен тривати до визначення шляху розпаду і схеми розподілу води/осаду або до тих пір, поки 90% дослідної речовини зникає внаслідок трансформації і/або випаровування. Необхідно виконати принаймні шість відборів зразків (включаючи нульовий відбір) з можливим проведенням попереднього досліду (дивіться Розділ 1.9.4) для встановлення відповідного режиму відбору зразків і тривалості досліду, окрім випадків, коли в результаті попередніх дослідів були отримані відповідні дані. Для гідрофобних дослідних речовин додаткові точки відбору зразків впродовж початкового періоду досліду можуть бути необхідними для визначення рівня розподілу між фазами води і осаду.

У відповідний час відбору зразків всі інкубаційні пробірки (при повторних дослідах) забираються для аналізу. Осад і вода, що знаходилась над ним, аналізуються окремо(1). Необхідно обережно вилити поверхневу воду, щоб якнайменше потурбувати осад. Екстракція і характеризування дослідної речовини і продуктів трансформації здійснюється після відповідних аналітичних процедур. Необхідно звернути увагу на необхідність усунення матеріалу, що можливо абсорбувався до інкубаційної пробірки або до з'єднувальних труб, що використовуються для уловлення летючих.

----------------

(1) У випадках, коли існує вірогідність швидкої ре-оксидації анаеробних продуктів трансформації, необхідно підтримувати анаеробні умови впродовж відбору зразків і аналізу.

1.9.4. Факультативний попередній дослід

Якщо тривалість досліду і режим відбору зразків не можуть бути встановлені на підставі інших відповідних аналізів дослідної речовини, проведення попереднього досліду може бути доцільним, при якому застосовуються ті самі дослідні умови, що і в основному досліді. Відносні експериментальні умови і результати попереднього досліду, якщо він проводився, мають бути включені в звіт в скороченій формі.

1.9.5. Виміри і аналіз

Концентрація дослідної речовини і продуктів трансформації в час відбору зразків в воді і осаді вимірюється і включається в звіт (як концентрація і як відсоток). Взагалі продукти трансформації визначені при >= 10% радіоактивності в загальній системі "вода - осад" підлягають ідентифікації, окрім випадків, коли доведено протилежне. Необхідно розглянути можливість ідентифікації продуктів трансформації, для яких концентрація постійно збільшується впродовж досліду, навіть у випадку, коли їхня концентрація не перевищує меж, визначених вище, оскільки це може вказувати на тривалість. Остання розглядається індивідуальну у відповідності до випадку з відповідними поясненнями, які включаються до звіту.

Результати, що стосуються систем вловлювання газів/летючих (СО та інших, наприклад, органічних складових) повинні включатись 2

в   звіт   при   кожному   відборі  зразків.  Рівні  мінералізації
включаються  до  звіту.  Залишки  в  осаді,  що  не  екстрагуються
(зв'язані) включаються до звіту при кожному відборі зразків.

2. ДАНІ

2.1. ПРЕДСТАВЛЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

Загальний масовий баланс або відновлення (дивіться Розділ 1.7.1) доданої радіоактивності розраховується при кожному відборі зразків, Результати включаються до звіту у вигляді відсотка доданої радіоактивності. Розподіл радіоактивності між водою і осадом включається до звіту в вигляді концентрації і процентного відношення при кожному відборі зразків.

Період напірозкладу DT , і якщо необхідно DT і DT 50 75 90 дослідної речовини визначається разом з межами достовірності (дивіться Розділ 1.7.3). Інформація щодо рівня розчинення дослідної речовини в воді і осаді можу бути отримана за допомогою використання відповідних засобів оцінювання. Вони можуть включати в себе застосування псевдо-кінетики першого порядку, техніки емпіричних кривих, які застосовують графічні або числові рішення, а також більш складні способи оцінки, наприклад, одно- або багато- камерні моделі. Подальша наступна детальна інформація може бути отримана з відповідної літератури (35)(36)(37).

Всі підходи мають свої сильні і слабкі сторони і різний ступінь складності. Застосування кінетики першого рівня може бути надмірним спрощенням процесів розкладу і розподілу, але там, де це можливо, дає термін (константу швидкості процесу або період напіврозпаду), який може бути легко зрозумілий і важливий для моделювання і розрахунку очікуваної навколишньої концентрації. Емпіричні підходи або лінійні трансформації можуть призвести до більш щільного прилягання кривих до даних, що в свою чергу дозволить краще оцінити значення періодів напіврозкладу DT , і 50

якщо необхідно DT   і DT  . Використання похідних констант, однак,
                 75     90
є обмеженим.  Камерні моделі можуть дати певну кількість постійних
величин  корисних  для  оцінювання  ризику,  які  описують  рівень
розкладу в різних  камерах  і  розподіл  хімічної  речовини.  Вони
можуть   також   бути  використані  для  оцінки  показників  рівня
утворення і  розпаду  основних  продуктів  трансформації.  В  усіх
випадках  вибраний  метод  має  бути  обґрунтованим,  а  дослідник
повинен продемонструвати графічно і/або статистично  відповідність
отриманих результатів прогнозам.

3. ЗВІТНІСТЬ

3.1. ЗВІТ З ДОСЛІДУ

Звіт повинен включати в себе наступну інформацію:

Дослідна речовина:

- загальна назва, хімічна назва, номер CAS, структурна формула (з зазначенням розташування мічення, якщо використовується матеріал з радіоактивним міченням) і відповідні фізико-хімічні властивості,

- чистота (забруднення) дослідної речовини,

- радіохімічна чистота міченого хімікату і молярна активність (якщо застосовується).

Еталонні речовини:

- хімічна назва і структура еталонних речовин, що використовуються для складання характеристик і/або ідентифікації продуктів трансформації.

Дослідні осади і води:

- розташування і опис місця для відбору зразків водних осадів, включаючи, якщо це можливо, історію забруднення,

- всю інформацію стосовно збору, зберігання (якщо необхідно) і акліматизації систем водних осадів,

- характеристики зразків водних осадів, зазначених в таблиці Розділу 1.8.2.2.

Умови досліду:

- дослідна система, що використовувалась (наприклад, проточна система, біометр, спосіб вентиляції, метод змішування, об'єм води, маса осаду, товщина шарів води і осаду, габарити дослідних посудин, і т.ін.),

- застосування дослідної речовини в дослідній системі: дослідні концентрації, що використовуються, кількість повторів і контролів, спосіб застосування дослідної речовини (наприклад, використання розчину, якщо використовується), і т.ін.,

- температура інкубації,

- час відбору зразків,

- методи екстракції і ефективність, а також аналітичні методи і визначення меж,

- методи визначення характеристик/ідентифікації продуктів трансформації,

- відхилення від дослідного протоколу або дослідних умов впродовж проведення досліду.

Результати:

- необроблені числові дані презентаційного аналізу (всі необроблені дані повинні зберігатись в архіві GLP),

- повторюваність і чутливість аналітичних методів, що використовувались,

- рівні відновлення (% значення дійсного досліду зазначене в розділі 1.7.1),

- таблиці результатів, виражені як % дози, що -1

застосовувалась, в мг·кг   в воді, осаді і всій системі (тільки %)
для  дослідної  речовини,  і   якщо   необхідно,   для   продуктів
трансформації і радіоактивності, що не підлягає екстракції,

- баланс мас впродовж і після закінчення дослідів,

- графічне представлення трансформації в фракціях води і осаду і в усій системі (включаючи мінералізацію),

- рівні мінералізації,

- значення періодів напірозкладу DT , і якщо необхідно DT 50 75 і DT дослідної речовини, і якщо необхідно основних продуктів

90
трансформації,  включаючи межі достовірності в воді,  осаді і всій
системі,

- оцінка кінетики трансформації дослідної речовини і, якщо необхідно, основних продуктів трансформації,

- запропонований шлях трансформації, якщо необхідно,

- обговорення результатів.

4. ПОСИЛАННЯ

(1) BBA-Guidelines for the examination of plant protectors in the registration process., (1990) Part IV, Section 5-1: Degradability and fate of plant protectors in the water/sediment system. Germany.

(2) Commission for registration of pesticides: Application for registration of a pesticide., (1991) Part G. Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air, Section G.2.1 (a). The Netherlands.

(3) MAFF Pesticides Safety Directorate., (1992) Preliminary guideline for the conduct of biodegradability tests on pesticides in natural sediment/water systems. Ref No SC 9046. United-Kingdom.

(4) Agriculture Canada: Environmental chemistry and fate., (1987) Guidelines for registration of pesticides in Canada. Aquatic (Laboratory) - Anaerobic and aerobic. Canada. p. 35-37.

(5) US-EPA: Pesticide assessment guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environmental fate (1982) Section 162-3, Anaerobic aquatic metabolism.

(6) SETAC-Europe publication., (1995) Procedures for assessing the environmental fate and ecotoxicity ofpesticides. Ed. Dr Mark R. Lynch. SETAC-Europe, Brussels.

(7) OECD Test Guidelines Programme., (1995) Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/sediments, Belgirate, Italy, 18-20 January 1995.

(8) ISO/DIS 5667-12., (1994) Water quality - Sampling - Part 12:Guidance on sampling of bottomsediments.

(9) US-EPA (1998a) Sediment/water microcosm biodegradation test. Harmonised Test Guidelines (OPPTS835.3180). EPA 712-C-98-080.

(10) DFG: Pesticide Bound Residues in Soil. Wiley-VCH (1998).

(11) T.R.Roberts: Non-extractable pesticide residues in soils and plants. Pure Appl. Chem. 56, 945-956 (IUPAC 1984).

(12) OECD Test Guideline 304A: Inherent Biodegradability in Soil (adopted 12 May 1981).

(13) OECD (1993): Guidelines for Testing of Chemicals. Paris. OECD (1994-2000): Addenda 6-11 to Guidelines for the Testing of Chemicals.

(14) Scholz, K., Fritz R., Anderson C. and Spiteller M. (1988) Degradation ofpesticides in an aquatic modelecosystem. BCPC - Pests and Diseases, 3B-4, p. 149-158.

(15) Guth, J.A., (1981) Experimental approaches to studying the fate of pesticides in soil. In Progress in Pesticide Biochemistry (D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds.), Vol. 1, 85-114. J. Wiley & Sons.

(16) Madsen, T., Kristensen, P. (1997) Effects of bacterial inoculation and non-ionic surfactants on degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons in soil. Environ. Toxicol. Chem. 16, p. 631-637.

(17) Steber, J., Wierich, P. (1987) The anaerobic degradation of detergent range fatty alcohol ethoxylates. Studies with 14C-labelled model surfactants. Water Research 21, p. 661-667.

(18) Black, C.A. (1965). Methods of Soil Analysis. Agronomy Monograph No 9. American Society of Agronomy, Madison.

(19) APHA (1989) Standard Methods for Examination of Water and Wastewater (17th edition). AmericanPublic Health Association, American Water Works Association and Water Pollution Control Federation, Washington D.C.

(20) Rowell, D.L. (1994) Soil Science Methods and Applications. Longman.

(21) Light, T.S., (1972). Standard solution for redox potential measurements. Anal. Chemistry 44, p. 1038-1039.

(22) SETAC-Europe publication (1991) Guidance document on testing procedures for pesticides in freshwater mesocosms. From the Workshop 'A Meeting of Experts on Guidelines for Static Field Mesocosms Tests', 3-4 July 1991.

(23) SETAC-Europe publication. (1993) Guidance document on sediment toxicity tests and bioassays forfreshwater and marine environments. From the Workshop on Sediment Toxicity Assessment (WOSTA),8-10 November 1993. Eds.: I.R.Hill, P.Matthie sen and F.Heimbach.

(24) Vink, J.P.M., van der Zee, S.E.A.T.M. (1997) Pesticide biotransformation in surface waters: multivariate analyses of environmental factors at field sites. Water Research 31, p. 2858-2868.

(25) Vink, J.P.M., Schraa, G., van der Zee, S.E.A.T.M. (1999) Nutrient effects on microbial transformation of pesticides in nitrifying waters. Environ. Toxicol, p. 329-338.

(26) Anderson, T.H., Domsch, K.H. (1985) Maintenance carbon requirements of actively-metabolising microbial populations under in-situ conditions. Soil Biol. Biochem. 17, p. 197-203.

(27) ISO-14240-2., (1997) Soil quality - Determination of soil microbial biomass - Part 2: Fumigationextraction method.

(28) Beelen, P. Van and F. Van Keulen., (1990), The Kinetics of the Degradation of Chloroform and Benzene in Anaerobic Sediment from the River Rhine. Hydrobiol. Bull. 24 (1), p. 13-21.

(29) Shelton, D.R. and Tiedje, J.M. (1984) General method for determining anaerobic biodegradation potential. App. Environ. Microbiol. 47, p. 850-857.

(30) Birch, R.R., Biver, C., Campagna, R., Gledhill, W.E., Pagga, U., Steber, J., Reust, H. and Bontinck, W.J.(1989) Screening of chemicals for anaerobic biodegradation. Chemosphere 19, p. 1527-1550.

(31) Pagga, U. and Beimborn, D.B. (1993) Anaerobic biodegradation tests for organic compounds. Chemoshpere 27, p. 1499-1509.

(32) Nuck, B.A. and Federle, T.W., (1986) A batch test for assessing the mineralisation of 14C-radiolabelled compounds under realistic anaerobic conditions. Environ. Sci. Technol. 30, p. 3597-3603.

(33) US-EPA (1998b). Anaerobic biodegradability of organic chemicals. Harmonised Test Guidelines (OPPTS835.3400). EPA 712-C-98-090.

(34) Sijm, Haller and Schrap (1997) Influence of storage on sediment characteristics and drying sediment onsorption coefficients of organic contaminants. Bulletin Environ. Contam. Toxicol. 58, p. 961-968.

(35) Timme, G., Frehse H. and Laska V. (1986) Statistical interpretation and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues II. Pflanzenschutz - Nachrichten Bayer, 39, p. 187-203.

(36) Timme, G., Frehse, H. (1980) Statistical interpretation and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues I. Pflanzenschutz - Nachrichten Bayer, 33, p. 47-60.

(37) Carlton, R.R., and Allen, R., (1994) The use of a compartment model for evaluating the fate of pesticides in sediment/water systems. Brighton Crop Protection Conference - Pest and Diseases, p. 1349-1354.

Додаток 1

КОРОТКИЙ ОПИС СИСТЕМ ДЛЯ АЕРОБНИХ І АНАЕРОБНИХ ДОСЛІДІВ

Система для аеробних дослідів

Система для аеробного досліду, описана для цього методу складається з аеробного шару води (звичайно концентрація кисню -1

повинна складати від 7 до 10 мг·л  ) і шару осаду, який є аеробним
на  поверхні  і  анаеробним  під  поверхнею  (звичайно   потенціал
окислювально-відновлювального  процесу  (E ) в аеробній зоні осаду
                                          h
складає 80-90 mV).  Зволожене повітря пропускається над  поверхнею
води  в  кожній  інкубаційній  ємності для підтримання достатнього
рівню кисню в просторі над рідиною.

Система для анаеробних дослідів

Система і процедура для проведення анаеробних дослідів є приблизно такими самими, як для проведення аеробних дослідів, за винятком того, що замість повітря, зволожений азот пропускається над поверхнею води в кожній інкубаційній ємності для підтримання достатнього рівню азоту в просторі над рідиною. Осад і вода вважаються анаеробними, якщо потенціал окислювально-відновлювального процесу (E ) є меншим за 100 mV. h

В анаеробному досліді оцінювання мінералізації включає в себе визначення об'єму виділеного вуглекислого газу і метану.

Додаток 2

ПРИКЛАД АПАРАТУ ДЛЯ ПРОПУСКАННЯ ГАЗУ ( 994_b14 )

Додаток 3

ПРИКЛАД БІОМЕТРИЧНОГО АПАРАТУ ( 994_b14 )

Додаток 4

ПРИКЛАД ВИЗНАЧЕННЯ ДОЗИ У ВІДПОВІДНОСТІ ДО ДОСЛІДНИХ ПОСУДИН

Внутрішній діаметр циліндру:                           = 8 см

Глибина водного стовпа, не включаючи осад             = 12 см

2
     Площа поверхні: 3,142 х 4                        = 50,3 кв.см

Рівень дози: 500 г дослідної речовини/гектар
                  відповідає 5 мкг/кв.см

Всього мкг: 5 х 50,3                              = 251,5 мкг

Кількість регулюється в залежності від глибини,

яка складає 100 см:

12 х 251,5 / 100                                 = 30,18 мю г

Об'єм водного стовпа: 50,3 х 12 = 603 мл
Концентрація в воді: 30,18 / 603 = 0,050 мг/мл
або 50 мкгл

Про нас

Конфіденційність

Приєднуйтесь.